Summary
本文演示了一种构建三维肿瘤球体的标准化方法。还描述了使用自动成像系统进行球体观察和基于图像的深度学习分析的策略。
Abstract
近几十年来，除了单层培养细胞外，三维肿瘤球状体已被开发为评估抗癌药物的潜在强大工具。然而，传统的培养方法缺乏在三维水平上以均匀方式操纵肿瘤球状体的能力。为了解决这一局限性，在本文中，我们提出了一种构建平均大小的肿瘤球体的方便有效的方法。此外，我们描述了一种使用基于人工智能的分析软件进行基于图像的分析方法，该软件可以扫描整个板并获得三维球体的数据。研究了几个参数。通过使用肿瘤球体构建的标准方法和高通量成像和分析系统，可以显着提高对三维球状体进行的药物测试的有效性和准确性。
Introduction
癌症是人类最害怕的疾病之一，尤其是因为它的高死亡率1。近年来，随着新疗法的引入，治疗癌症的可能性有所增加2,3,4,5。二维（2D）和三维（3D）体外模型用于在实验室环境中研究癌症。然而，2D模型不能立即准确地评估指示抗肿瘤敏感性的所有重要参数;因此，它们无法完全代表药物治疗测试中的体内相互作用6。
自2020年以来，全球三维（3D）文化市场得到了极大的推动。根据纳斯达克OMX的一份报告，到2025年底，3D细胞培养市场的全球价值将超过27亿美元。与2D培养方法相比，3D细胞培养表现出有利的特性，不仅可以优化增殖和分化，还可以优化长期存活7,8。通过这种方法，可以模拟体内细胞微环境以获得更准确的肿瘤表征，以及代谢分析，从而可以更好地了解基因组和蛋白质的改变。因此，3D测试系统现在应该被纳入主流药物开发业务，特别是那些专注于筛选和评估新型抗肿瘤药物的操作。永生化已建立的细胞系或原代细胞培养物在球状结构中的三维生长具有肿瘤的缺氧和药物渗透等体内特征，以及细胞相互作用、反应和耐药性，可被视为进行体外药物筛选的严格和代表性模型9,10,11。
然而，这些3D文化模型也存在一些可能需要一些时间才能解决的问题。可以使用这些方案形成细胞球状体，但它们在某些细节上有所不同，例如培养时间或包埋凝胶12，因此这些构建的细胞球体不能在有限的尺寸范围内得到很好的控制。微球的大小可能会影响活力测试和成像分析的一致性。生长微环境和生长因子也不同，由于细胞间分化的差异，可能导致不同的形态13。现在显然需要一种标准、简单且具有成本效益的方法来构建具有受控大小的所有类型的肿瘤。
从另一个角度来看，尽管已经开发了均质测定和高内涵成像方法来评估形态、活力和生长速率，但由于文献中报道的各种原因，例如肿瘤球体的位置、大小和形态缺乏均匀性，3D 模型的高通量筛选仍然是一个挑战14,15,16。
在这里介绍的协议中，我们列出了构建3D肿瘤微球的每个步骤，并描述了一种使用高通量，高内涵成像系统的球状体观察和分析方法，该系统涉及自动聚焦，自动成像和分析，以及其他有利特征。我们展示了这种方法如何产生适用于高通量成像的均匀大小的3D肿瘤球体。这些微球还表现出对癌症药物治疗的高敏感性，并且可以使用高内涵成像监测微球的形态变化。总之，我们证明了这种方法作为生成用于药物评估目的的3D肿瘤构建体的手段的稳健性。
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Protocol
1. 球体结构
- 培养板的抗粘连处理
- 将 100 μL 抗粘附试剂移液到具有 U 形孔底的 48 孔板的每个孔中，并保持 10 分钟。10分钟后，吸出涂层试剂，并用无菌PBS洗涤两次。
- 将培养板放入培养箱（37°C在加湿空气中，5%CO2）直至使用。
- 细胞制备、收集和计数
- 使用细胞特异性培养基在细胞培养瓶中培养细胞（补充表2）。例如，NCI-H23，CT-26细胞在RPMI 1640中培养，HT-29细胞在McCoy的5A培养基中培养。这两种培养基分别补充了10%的热灭活FBS和1%的P / S。
- 在增殖过程中将所有细胞保持在标准培养条件（37°C在含5%CO2的潮湿空气中）。在这里，NCI-H23细胞系在以下步骤中用作示例。
- 用1x PBS洗涤在T25烧瓶中培养两次的细胞以除去培养基（最好选择对数期的细胞并以80%-90%的汇合度传代细胞）。
- 用1mL的0.25%胰蛋白酶/ EDTA在37°C，5%CO 2的培养箱中处理扩增的细胞1-2分钟。在显微镜下确认细胞形状（在这种情况下通常是圆形），然后停止胰蛋白酶处理。为此，将用过的胰蛋白酶/EDTA悬浮液吸出在T25烧瓶中，并用4mL新鲜培养基洗涤细胞。
- 将所有悬浮液 （5 mL） 转移到 15 mL 管中。使用 1 mL 新鲜培养基冲洗残留细胞并将其添加到试管中。在室温下以186.48× g 离心细胞5分钟。
- 除去上清液，向细胞沉淀中加入10mL新鲜培养基，然后轻轻移液，直到细胞处于均匀的悬浮液中。
- 将 0.1 mL 细胞悬液吸入新的离心管中，加入 0.9 mL 新鲜培养基，然后充分移液悬浮液。
- 提取 10 μL 细胞悬液进行细胞计数。执行此过程两到三次并取平均值。
- 根据步骤1.2.7中从细胞计数过程中获得的浓度，稀释悬浮液以达到50,000个细胞/ mL的最终接种密度。
- 细胞培养和球状体形成
- 向 48 孔 U 底板的每个孔中加入 200 μL 细胞悬液。
- 将密封膜缠绕在板上，并在室温下以119.35× g 离心5分钟。
- 小心地将板从离心机中取出并拉下保护膜。然后，将5-8mL灭菌水加入孔周围的水通道中（以防止蒸发），并在37°C下孵育5天。在此期间，请勿更换/补充水道的任何水。
- 在接下来的5天内观察细胞聚集。
注意：一般来说，细胞在5天内开始结块为集落。然而，对于不同的细胞类型和细胞密度，球状体构建的过程可能更快或更慢。因此，必须每天使用三种可能的方法之一观察细胞。首先，可以通过孔板底部观察细胞。当细胞尚未形成球体时，可以在底部看到单层细胞。当细胞形成球状体时，可以在每个孔的U底部观察到密集的3D构建体。另一种方法是在显微镜下检查细胞。当细胞变成肿瘤球体时，结构涉及三层（增殖层，非活性层和坏死核心，从球体的外部到内部），它们具有透明梯度。最后，培养基的颜色也可用于观察目的。当三层结构无法清晰看到时，即使使用数码显微镜，这也很有用。当培养基从紫红色变为黄色时，可以将球状体包埋在凝胶中。在细胞聚集期间不应更换培养基。
- 凝胶包埋
注意：凝胶需要在低于-20°C的温度下储存。 特别是，凝胶应远离冰箱门放置，以避免温度波动。请注意，凝胶在该过程的这一阶段处于冷冻状态。- 从-20°C冰箱中取出冷冻凝胶，并在实验过程中将其整个时间放在冰盒上。
- 在显微镜下观察细胞球状体。在凝胶包埋开始之前，应再次用数码显微镜检查球体的状态。
- 小心地去除 150 μL 培养基。盘子也应放在保温箱上。
- 通过从孔壁侧缓慢添加液体凝胶，同时移动预冷的移液器吸头在孔内和孔内，将每个球状体嵌入凝胶中。等待 5 分钟，如果凝胶扩散不均匀，则用 10 μL 移液器吸头轻轻移液凝胶。每个孔包含一个肿瘤球体、25 μL 3.5 mg/mL 凝胶和 50 μL 完全培养基。向对照中加入 75 μL 培养基。
注意：每个孔包含一个球体。 - 将板在37°C孵育30分钟，直到水凝胶完全完成。在显微镜下确认凝胶状态。
- 在每个样品上叠加 125 μL 新鲜培养基。
- 将球状体再培养7-10天。准备每组有四到六个孔的球体，并选择至少三个进行分析。
注意：如果进行药物测试，请为一个样本准备两组。一组用于活性测试，而另一组用于图像捕获和分析。
2. 药物治疗
- 按照制造商的说明溶解药物。使用 DMSO 准备 100 倍的工作解决方案。准备至少五剂连续稀释的药物。这里以肺癌治疗药物AMG 510为例。组成如 补充表1所示。
- 使用0.1%DMSO作为阳性对照。
- 向每个孔中加入 125 μL 药物治疗的培养基，并将板放回培养箱中（37 °C 在加湿空气中，含 5% CO2）。在此阶段，每个孔包含一个肿瘤球体、25 μL 3.5 mg/mL 凝胶和 175 μL 培养基。质控品含有 200 μL 培养基。
3. 球体活力
- 根据制造商的指南，使用Alamar Blue检测试剂盒测量球体活力。在进行Alamar Blue处理后，使用微孔板光度计（570nm和600nm处的吸光度）测量活性。
- 分别在将微球包埋在凝胶中的第1天、第4天、第7天和第10天测量活力，或按指示测量活力。
注意：使用Alamar Blue测定时，至少需要16小时的反应时间。因此，在第 0 天、第 3 天、第 6 天和第 9 天的下午加入 20 μL 阿拉马尔蓝。 - 从每个孔中吸取 100 μL 上清液培养基到新的测试板中，并向培养板的每个孔中加入 80 μL 新鲜培养基。然后，更换另外 100 μL 药物治疗的培养基。确保井中没有阿拉马尔蓝的残留物。
注意：每次测试活力时都要进行培养基更换，并且成像分析组的药物治疗培养基需要在同一天更换。
4. 药物测试中通过图像进行球状体观察和深度学习分析
- 成像
- 成像前吸出 100 μL 培养基。
- 将盘子放在舞台上。使用具有10倍物镜（首先是2倍物镜）的自动显微镜获得微球的数字图像。显微镜可以自动聚焦和集中这些球体。
注意：自动对焦功能和使用的算法之前已由Yazdanfar等人报道过17。 - 等待自动成像。为每个微球获取四个图像。使用连接到高内涵成像系统的软件形成和处理集成图像。
- 单击“映像修补过程”按钮，然后在软件中选择集成映像。
- 选择“U-NET模型”，然后输入转换率（10倍客观图像的转化率为3.966）。单击下方屏幕底部，开始图像处理。然后，将直径、周长和粗糙度数据保存在电子表格软件中。
- 计算超额周长指数 （EPI）。EPI 是球体周长 （P 0） 和等效周长 （Pe） 之间的比率，由公式 1 计算。使用图像J测量焦平面（S）处的球体面积。然后，使用公式 2 计算椭球体的等效周长。
EPI = （P o− P e）/Pe （公式 1）
（公式2）
注意：球体周长由软件使用基于开发的 U-NET 模型的深度学习算法生成。 - 用药物加入100μL新鲜培养基，并将板放回培养箱中（37°C在加湿空气中，5%CO2）。
- 球状体抑制
- 使用公式3计算肿瘤生长抑制（TGI）。相对球体体积 （RTV） 是原始体积（公式 4）上的终端体积。球体体积 （V） 由软件使用公式 5 根据球体直径输出自动计算。
TGI = （室温控制−室温治疗）/室温控制 × 100%（等式3）
RTV = V端子/V原件（等式 4）
V = 4/3π（d/2）3 （公式 5）
注意：TGI是参考 体内 生长抑制获得的，肿瘤重量用RTV替换。RTV对照是对照 组的相对球体体积，RTV处理 是药物测试组的相对球体体积，V端 是最后一天球体的体积，V原 是第一个培养日的球体体积， d 代表球体直径。
- 使用公式3计算肿瘤生长抑制（TGI）。相对球体体积 （RTV） 是原始体积（公式 4）上的终端体积。球体体积 （V） 由软件使用公式 5 根据球体直径输出自动计算。
（公式2）Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1A，B显示了本研究中用于构建肿瘤球体的过程。 我们首先将细胞接种在48孔U底板中。此步骤与2D细胞培养中使用的步骤几乎相同。我们将板保存在一个公共培养箱中，孔周围有水，以便沉积的细胞在自组装过程中开始形成球状体。在正常操作条件下，大多数类型的肿瘤球状体在使用靶向培养基5天后完全形成（补充表2）。我们在5天内用数码显微镜检查了球体结构的状态（图1D）。生长过程完成后，加入凝胶以包裹每个孔中的单个微球，为每个微球产生体内样细胞外基质（ECM）。然后进行药物测试。当我们使用带有深度学习分析软件的高内涵成像系统（图1C）时，我们可以清楚地观察单个球体生长（图1E）并获得合适参数的值，以确定药物治疗期间的特征，包括活力，直径和粗糙度。
图1：肿瘤球状体形成和自动成像和分析 。 （A）显示标准肿瘤球状体培养程序的示意图，时间表如下。（B）使用肿瘤球体进行药物治疗测试的示意图，在3D基质中显示了不同程度的侵入性。（C）用于自动成像和分析的基于深度学习的算法相关系统的图像，显示以下详细信息：板平台;带光源的聚光镜;电动X，Y载物台;电动Z轴模块;物镜轮;滤光轮;CCD;和带有开发系统软件的计算机。（D）从显微镜目镜观察的单层细胞形成NCI-H23肿瘤球体。比例尺代表 500 μm。 （E） 10 天内未经药物治疗的 NCI-H23 球体的侵入性和大小的变化。比例尺代表 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
在这项研究中，我们使用抗肿瘤药物AMG510来测试其治疗非小细胞肺癌的效果。分析系统提供的图像数据无需复杂的图像处理。 图2 中的明场图像显示，AMG510可以抑制NCI-H23球体的生长。这表现为尺寸减小以及浓度增加。相比之下，对照组的大小增加了10天。在此期间，边缘侧的粗糙度（表明侵入性）也发生了变化。球体在第1天表现出平坦的边缘，但在第10天表现出粗糙的边缘。但是，应该注意的是，仅通过明场图像比较粗糙度是一项具有挑战性的任务。还应该提到的是，标准方法涉及适当平均大小的球体。最后，我们注意到使用这种方法获得了干净的背景，因为很少有细胞粘附在底部。
图 2：用高内涵显微镜自动捕获用不同浓度的 AMG510 处理的 NCI-H23 细胞球体的明场图像。 列表示不同的日期，行表示不同的药物浓度。结果包括每个条件的三个球体。所有图像都以2倍放大倍率自动聚焦，然后由高内涵成像系统使用基于人工智能的软件和与显微镜相关的微环境控制器以10倍放大倍率捕获。比例尺代表 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。
如图3A所示的细胞活力结果显示，与对照组相比，所有剂量水平的药物治疗样品的10天培养物的活力降低。浓度超过0.01μM的样品表现出肿瘤细胞活力的快速下降，表明AMG510治疗对非小细胞肺癌的敏感性。在第10天，这些样品表现出相似的最终活力水平，值低于70%，如图3B所示。
图3：AMG510处理的样品组的肿瘤球状体活力。 在第1天添加药物。（A）在第1天，第4天，第7天和第10天测量肿瘤球状体活力。（B）具有浓度梯度的样品的终末细胞活力。用于治疗每个肿瘤球体的药物浓度设定为0.001μM至5μM。所有数据均以平均± SEM （n = 3） 表示。 请点击此处查看此图的大图。
图4A显示了关于球体直径分析的类似趋势。浓度高于0.01 μM的样品平均直径明显减小。在药物治疗的第一天也可以看到球体尺寸的均匀性，值约为800μm。这些球体的直径比（图4B）表明AMG510共培养期间的收缩比活力测试明显更明显。此外，我们根据球状体肿瘤的直径计算了球状体肿瘤生长抑制值，如图4C所示。TGI值是一个相对评估参数，这些值可能表明由于球体之间的原始种子差异而导致生长减少;然而，我们再次获得的结果是，浓度超过0.01μM对AMG510治疗的成功有明显的影响。在早期的研究中，我们尝试了IC50值，这是药物测试的重要指标;然而，我们发现AMG510处理下的NCI-H23球体在该参数上没有变化。
图 4：对照组和 AMG510 处理的样品组中由球体直径表示的肿瘤大小。 （A）在第1天，第4天，第7天和第10天测量肿瘤球体直径。（B）将球体生长比定义为相对于原始体积的终端体积，并使用球体直径计算。（C）相对于体积定义球体生长抑制比，并使用球体直径计算。用于治疗每个肿瘤球体的AMG510浓度设定为0.001μM至5μM。所有数据均以平均± SEM （n = 3） 表示。请点击此处查看此图的大图。
然后，我们根据软件输出产生的粗糙度值（图5A）以及基于球体边界的超额周长指数（图5B）对微球的侵入性进行了进一步评估。较高的粗糙度意味着更多的细胞从球状体迁移到凝胶，因此代表更高的侵入性。比较不同药物浓度水平的对照结果。对于NCI-H23（一种侵入性细胞系），球状体粗糙度和EPI值均随着培养时间的增加而增加，无需任何药物治疗18，这可以通过对照样品中的明场图像和直径增加来证明。然而，AMG510处理抑制了生长，完全与大小的变化成正比。
图5：未处理的对照组和AMG510处理的样品组中的肿瘤边界识别。 在第1天添加药物。（A）在第1天、第4天、第7天和第10天用软件测量肿瘤粗糙度，表明肿瘤球状体的侵袭性。（B）球体周长由软件使用深度学习算法定位和绘制。然后通过图像J测量焦平面上的球体区域，并根据这些数据计算出多余的周长指数。用于治疗每个肿瘤球体的AMG510浓度设定为0.001μM至5μM。所有数据均以平均± SEM （n = 3） 表示。 请点击此处查看此图的大图。
补充表1：板的组成。 实验采用抗肺肿瘤药物AMG510，根据药物梯度设置组别。使用两个板：一个用于活力测定试剂盒测试，一个用于成像分析。
补充表2：已用于3D肿瘤构建和药物测试的细胞系。请按此下载这些表格。
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Discussion
微环境在肿瘤生长中起着重要作用。它可能影响细胞外基质、氧梯度、营养和机械相互作用的提供，从而影响肿瘤细胞的基因表达、信号通路和许多功能19,20,21。在许多情况下，2D细胞不会产生这种效果，甚至不会产生相反的效果，从而影响药物治疗的评估。然而，3D模型的出现解决了这个问题。例如，我们使用3D方法完成了对AMG510对肺癌治疗系统影响的评估。我们通过创建嵌入凝胶中的肿瘤球体来构建3D肿瘤 - 球状体 - ECM（TSE）模型，以监测肺相关侵袭细胞系上的AMG510治疗。AMG510是一种靶向G12C突变体KRAS22的新型抑制剂，我们的发现证实了其有效性，即一些患者对这种突变体有反应的非小细胞肺癌（NSCLC）。从我们一系列的实验数据和分析中，可以辨别出一些非常有价值的数据。与2D条件相比，在3D球体条件下对AMG510的灵敏度显着增强，并且在缺氧条件下进一步提高。
通过该方法构建的模型具有几个优点。首先，作为3D模型，它可以很好地模拟肿瘤和细胞外基质。构建3D肿瘤球体的简单而有效的方法允许细胞存活2周。在球体构建5天后，可以使用大约10天的时间，这足以进行任何药物测试。此外，3D细胞培养生产的方法与2D方法几乎相同，其成本远低于3D生物打印。与悬挂-下降法等其他方法相比，这里描述的方法有助于产生更均匀的球体，并且细胞大小完全由细胞的类型和密度控制。最后，该模型已被证明适用于各种类型的癌细胞，并且这种灵活性可能被证明具有特别高的价值。未来，从事肿瘤球状体形成的研究人员可能不仅在其肿瘤细胞悬液中添加成纤维细胞和内皮细胞，还可能添加T细胞和NK细胞等免疫细胞，以促进基质细胞迁移并提高新药的免疫治疗效果23,24。
近几十年来，很少有报告专注于描述目前可用于从3D模型中提取重要生物数据的技术和工具25。这些信息可以被认为是使用3D细胞培养模型进行药物测试和治疗发现的基础26。Zanoni等人的研究描述了一种新颖的开源软件，该软件可以对3D肿瘤集落进行自动图像分析。作者表明，形态参数影响大球体对药物治疗的反应，并且球体的大小和形状都可能是变异性的来源27。然而，对于在3D凝胶中培养的肿瘤球状体，其模拟 体内的ECM，细胞行为要复杂得多，并且可能表现出侵袭性。虽然数据只与大小和形状有关，但这种限制仍然存在。使用高内涵成像系统可以获得许多可靠和多样化的参数。这种系统不仅可以确定细胞活力和球状体形状，还可以检测和验证肿瘤的特征和药物对肿瘤的抑制作用。侵入性也可以通过这种手段来确定。例如，浸润性肿瘤可能具有相对较高的粗糙度值，而非浸润性肿瘤可能具有较高的EPI值。这些值的变化可以表明不同的药物作用。未来，我们希望将这些技术与微流控芯片相结合，以获得更方便有效的策略。
这里描述的标准化方法可以满足大多数药物筛选和评价测试的要求。但是，在未来的实验中仍然可能会出现一些问题。例如，离心后细胞可能粘附在孔的内壁上，或者培养基可能不合适。此外，方案中使用的凝胶以及广泛使用的基质胶在漫长的过程中很容易凝胶化。但是，这些问题中的大多数都可以通过标准操作和优化技术来解决。此方法还有其他可能的局限性。由于球体结构，营养物质、氧气和通过球体的废物扩散受球体大小的影响。当球体直径超过1,000μm时，球状体核心中细胞的活力可能会受到影响。相反，当直径低于400μm时，很难观察到入侵。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢实验室的所有成员的重要意见和建议。本研究得到了江苏省卫生健康委员会重点项目（K2019030）的支持。概念化由C.W.和Z.C.进行，方法由W.H.和M.L.执行，调查由W.H.和M.L.执行，数据管理由W.H.，Z.Z.，S.X.和M.L.执行，原始草稿准备由Z.Z.，J.Z.，S.X.，W.H.执行， 和X.L.，审查和编辑由Z.C.执行，项目管理由C.W.和Z.C.执行，资金获取由C.W.进行。所有作者均已阅读并同意该手稿的已出版版本。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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