Summary
Cet article démontre une méthode standardisée pour construire des sphéroïdes tumoraux tridimensionnels. Une stratégie d’observation des sphéroïdes et d’analyse d’apprentissage profond basée sur l’image à l’aide d’un système d’imagerie automatisé est également décrite.
Abstract
Au cours des dernières décennies, en plus des cellules cultivées en monocouche, des sphéroïdes tumoraux tridimensionnels ont été développés comme un outil potentiellement puissant pour l’évaluation des médicaments anticancéreux. Cependant, les méthodes de culture conventionnelles n’ont pas la capacité de manipuler les sphéroïdes tumoraux de manière homogène au niveau tridimensionnel. Pour remédier à cette limitation, dans cet article, nous présentons une méthode pratique et efficace de construction de sphéroïdes tumoraux de taille moyenne. De plus, nous décrivons une méthode d’analyse basée sur l’image utilisant un logiciel d’analyse basé sur l’intelligence artificielle qui peut scanner la plaque entière et obtenir des données sur les sphéroïdes tridimensionnels. Plusieurs paramètres ont été étudiés. En utilisant une méthode standard de construction sphéroïde tumorale et un système d’imagerie et d’analyse à haut débit, l’efficacité et la précision des tests de médicaments effectués sur des sphéroïdes tridimensionnels peuvent être considérablement augmentées.
Introduction
Le cancer est l’une des maladies les plus redoutées par les êtres humains, notamment en raison de son taux de mortalité élevé1. Au cours des dernières années, la possibilité de traiter le cancer a augmenté à mesure que de nouvelles thérapies ont été introduites 2,3,4,5. Des modèles in vitro bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) sont utilisés pour étudier le cancer en laboratoire. Cependant, les modèles 2D ne peuvent pas évaluer immédiatement et avec précision tous les paramètres importants qui indiquent une sensibilité antitumorale; Par conséquent, ils ne représentent pas pleinement les interactions in vivo dans les essais de pharmacothérapie6.
Depuis 2020, le marché mondial de la culture tridimensionnelle (3D) a été considérablement stimulé. Selon un rapport du NASDAQ OMX, la valeur mondiale du marché de la culture cellulaire 3D dépassera 2,7 milliards de dollars d’ici la fin de 2025. Par rapport aux méthodes de culture 2D, la culture cellulaire 3D présente des propriétés avantageuses, qui peuvent être optimisées non seulement pour la prolifération et la différenciation, mais aussi pour la survie à long terme 7,8. Par de tels moyens, les microenvironnements cellulaires in vivo peuvent être simulés pour obtenir une caractérisation plus précise de la tumeur, ainsi qu’un profilage métabolique, afin que les altérations génomiques et protéiques puissent être mieux comprises. Pour cette raison, les systèmes de test 3D devraient maintenant être inclus dans les opérations de développement de médicaments traditionnelles, en particulier celles axées sur le dépistage et l’évaluation de nouveaux médicaments antitumoraux. Les croissances tridimensionnelles de lignées cellulaires établies immortalisées ou de cultures cellulaires primaires dans des structures sphéroïdes possèdent des caractéristiques in vivo de tumeurs telles que l’hypoxie et la pénétration de médicaments, ainsi que l’interaction, la réponse et la résistance cellulaires, et peuvent être considérées comme un modèle rigoureux et représentatif pour effectuer un dépistage in vitro de médicaments 9,10,11.
Cependant, ces modèles de culture 3D souffrent également de plusieurs problèmes qui peuvent prendre un certain temps à résoudre. Les sphéroïdes cellulaires peuvent être formés à l’aide de ces protocoles, mais ils diffèrent par certains détails, tels que le temps de culture ou l’incorporation de gels12, de sorte que ces sphéroïdes cellulaires construits ne peuvent pas être bien contrôlés dans une plage de taille restreinte. La taille des sphéroïdes peut influencer la cohérence du test de viabilité et de l’analyse d’imagerie. Les microenvironnements de croissance et les facteurs de croissance varient également, ce qui peut conduire à des morphologies différentes en raison des différences de différenciation entre les cellules13. Il existe maintenant un besoin évident d’une méthode standard, simple et rentable pour construire tous les types de tumeurs avec des tailles contrôlées.
D’un autre point de vue, bien que des tests homogènes et des approches d’imagerie à haut contenu aient été développés pour évaluer la morphologie, la viabilité et le taux de croissance, le criblage à haut débit des modèles 3D reste un défi pour diverses raisons rapportées dans la littérature, telles que le manque d’uniformité dans la position, la taille et la morphologie des sphéroïdes tumoraux14,15,16.
Dans le protocole présenté ici, nous énumérons chaque étape de la construction de sphéroïdes tumoraux 3D et décrivons une méthode d’observation et d’analyse des sphéroïdes à l’aide d’un système d’imagerie à haut débit et à contenu élevé qui implique l’autofocus, l’auto-imagerie et l’analyse, entre autres caractéristiques avantageuses. Nous montrons comment cette méthode peut produire des sphéroïdes tumoraux 3D de taille uniforme qui conviennent à l’imagerie à haut débit. Ces sphéroïdes démontrent également une grande sensibilité au traitement médicamenteux du cancer, et les changements morphologiques dans les sphéroïdes peuvent être surveillés à l’aide d’une imagerie à haut contenu. En résumé, nous démontrons la robustesse de cette méthodologie comme moyen de générer des constructions tumorales 3D à des fins d’évaluation de médicaments.
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Protocol
1. Construction sphéroïde
- Traitement anti-adhérence de la plaque de culture
- Pipeter 100 μL de réactif anti-adhérence dans chaque puits d’une plaque de 48 puits avec un fond de puits en forme de U, et conserver pendant 10 min. Après 10 min, aspirer le réactif de revêtement et laver deux fois avec du PBS stérilisé.
- Mettre la plaque de culture dans un incubateur (37 °C dans de l’air humidifié avec 5% de CO2) jusqu’à utilisation.
- Préparation, collecte et comptage des cellules
- Utiliser le milieu de culture spécifique aux cellules pour cultiver les cellules dans des flacons de culture cellulaire (tableau supplémentaire 2). Par exemple, les cellules NCI-H23, CT-26 sont cultivées dans RPMI 1640, et les cellules HT-29 sont cultivées dans le milieu 5A de McCoy. Ces deux milieux sont complétés par 10% FBS inactivé par la chaleur et 1% P/S, respectivement.
- Maintenir toutes les cellules dans des conditions de culture standard (37 °C dans de l’air humidifié avec 5% de CO2) pendant la prolifération. Ici, la lignée cellulaire NCI-H23 est utilisée comme exemple dans les étapes suivantes.
- Laver deux fois les cellules cultivées dans une fiole T25 avec 1x PBS pour éliminer le milieu de culture (il est préférable de choisir les cellules dans la phase logarithmique et de faire passer les cellules à une confluence de 80%-90%).
- Traiter les cellules expansées avec 1 mL de trypsine/EDTA à 0,25 % pendant 1 à 2 min dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2. Confirmez la forme de la cellule (normalement circulaire dans ce cas) au microscope, puis arrêtez le traitement par trypsine. Pour ce faire, aspirez la suspension trypsine/EDTA utilisée dans la fiole T25 et lavez les cellules avec 4 mL de milieu frais.
- Transférer toute la suspension (5 ml) dans un tube de 15 ml. Utilisez 1 mL de milieu frais pour laver les cellules résiduelles et l’ajouter au tube. Centrifuger les cellules à 186,48 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant et ajouter 10 ml de milieu frais à la pastille cellulaire, puis pipeter doucement jusqu’à ce que les cellules soient dans une suspension homogène.
- Aspirer 0,1 mL de suspension cellulaire dans un nouveau tube à centrifuger, ajouter 0,9 mL de milieu frais, puis bien pipeter la suspension.
- Extraire 10 μL de la suspension cellulaire pour le comptage cellulaire. Effectuez ce processus deux ou trois fois et prenez une valeur moyenne.
- Diluer la suspension pour atteindre une densité finale d’ensemencement de 50 000 cellules/mL, selon la concentration obtenue par le procédé de comptage cellulaire à l’étape 1.2.7.
- Culture cellulaire et formation de sphéroïdes
- Ajouter 200 μL de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque de fond en U de 48 puits.
- Enrouler le film d’étanchéité autour de la plaque et le centrifuger à 119,35 x g pendant 5 min à température ambiante.
- Retirez délicatement la plaque de la centrifugeuse et retirez le film protecteur. Ensuite, ajoutez 5 à 8 mL d’eau stérilisée dans le canal d’eau entourant les puits (pour éviter l’évaporation) et incuber à 37 °C pendant 5 jours. Ne changez pas / complétez pas d’eau dans le canal d’eau pendant la période.
- Observez l’agrégation cellulaire pendant les 5 jours suivants.
REMARQUE: En général, les cellules commencent à s’agglutiner en colonies dans les 5 jours. Cependant, le processus de construction sphéroïde peut être plus rapide ou plus lent avec différents types de cellules et densités cellulaires. Pour cette raison, les cellules doivent être observées tous les jours en utilisant l’une des trois méthodes possibles. Tout d’abord, les cellules peuvent être observées à travers le fond de la plaque de puits. Lorsque les cellules n’ont pas encore formé de sphéroïde, une seule couche de cellules peut être vue au fond. Lorsque les cellules forment un sphéroïde, une construction 3D dense peut être observée au fond en U de chaque puits. Une autre méthode consiste à vérifier les cellules au microscope. Lorsque les cellules deviennent un sphéroïde tumoral, la construction implique trois couches (une couche proliférante, une couche inactive et un noyau nécrotique, de l’extérieur vers l’intérieur du sphéroïde), qui ont un gradient de transparence. Enfin, la couleur du milieu de culture peut également être utilisée à des fins d’observation. Cela peut être utile lorsque la structure à trois couches ne peut pas être clairement vue, même à l’aide d’un microscope numérique. Lorsque le milieu passe du rouge violet au jaune, le processus d’incorporation des sphéroïdes dans le gel peut commencer. Le milieu ne doit pas être remplacé pendant la période d’agrégation cellulaire.
- Intégration de gel
REMARQUE: Les gels doivent être conservés à une température inférieure à -20 ° C. En particulier, les gels doivent être placés loin de la porte du réfrigérateur pour éviter les fluctuations de température. Notez que les gels sont à l’état congelé à ce stade du processus.- Prenez le gel congelé du réfrigérateur à −20 °C et placez-le sur une glacière pendant toute la durée de l’expérience.
- Observez les sphéroïdes cellulaires au microscope. Avant le début de l’enrobage du gel, l’état des sphéroïdes doit à nouveau être vérifié au microscope numérique.
- Retirer délicatement 150 μL du milieu. La plaque doit également être placée sur la glacière.
- Intégrez chaque sphéroïde dans le gel en ajoutant lentement le gel liquide du côté de la paroi du puits tout en déplaçant l’embout de la pipette prérefroidie autour et à l’intérieur du puits. Attendez 5 minutes et si le gel ne se répand pas uniformément, pipeter doucement le gel avec un embout de pipette de 10 μL. Chaque puits contient un sphéroïde tumoral, 25 μL de gel de 3,5 mg/mL et 50 μL de milieu de culture complet. Ajoutez également 75 μL de milieu aux témoins.
NOTE: Chaque puits contient un sphéroïde. - Incuber la plaque à 37 °C pendant 30 min jusqu’à ce que l’hydrogélification soit complètement terminée. Confirmez l’état de gélification au microscope.
- Superposez 125 μL du milieu frais sur chaque échantillon.
- Culture des sphéroïdes pendant encore 7-10 jours. Préparez des groupes de sphéroïdes avec quatre à six puits chacun et choisissez-en au moins trois pour analyse.
REMARQUE : Si vous effectuez un test de dépistage de drogues, préparez deux groupes pour un échantillon. Un groupe est utilisé pour les tests de viabilité, tandis que l’autre est utilisé pour la capture et l’analyse d’images.
2. Traitement de la toxicomanie
- Dissoudre le médicament selon les instructions du fabricant. Préparez des solutions de travail 100x avec DMSO. Préparez au moins cinq doses du médicament en dilution en série. Ici, le médicament thérapeutique contre le cancer du poumon, AMG 510, est utilisé comme exemple. La composition est indiquée dans le tableau supplémentaire 1.
- Utilisez 0,1 % de DMSO comme témoin positif.
- Ajouter 125 μL de milieu médicamenteux à chaque puits et remettre la plaque dans l’incubateur (37 °C dans de l’air humidifié avec 5% de CO2). À ce stade, chaque puits contient un sphéroïde tumoral, 25 μL de gel de 3,5 mg / mL et 175 μL du milieu. Les commandes contiennent 200 μL du milieu.
3. Viabilité des sphéroïdes
- Mesurez la viabilité du sphéroïde à l’aide d’un kit de dosage Alamar Blue conformément aux directives du fabricant. Mesurer la viabilité à l’aide d’un photomètre à microplaques (absorbance à 570 nm et 600 nm) après le traitement Alamar Blue.
- Mesurer la viabilité au jour 1, au jour 4, au jour 7 et au jour 10 après avoir incorporé les sphéroïdes dans le gel, respectivement, ou comme indiqué.
REMARQUE: Lors de l’utilisation d’un test Alamar Blue, au moins 16 heures de temps de réaction sont nécessaires. Par conséquent, ajoutez 20 μL de bleu d’alamar dans les après-midi du jour 0, du jour 3, du jour 6 et du jour 9. - Aspirer 100 μL du milieu surnageant de chaque puits vers une nouvelle plaque d’essai et ajouter 80 μL de milieu frais à chaque puits de la plaque de culture. Ensuite, remplacez un autre 100 μL du milieu traité par le médicament. Assurez-vous qu’il n’y a pas de restes d’Alamar Blue dans le puits.
REMARQUE: Le remplacement du milieu est effectué chaque fois que la viabilité est testée, et le milieu traité par le médicament des groupes d’imagerie-analyse doit être remplacé le même jour.
4. Observation des sphéroïdes et analyse de l’apprentissage profond à travers des images dans le test de dépistage de drogue
- Imagerie
- Aspirer 100 μL du milieu avant l’imagerie.
- Placez l’assiette sur la scène. Obtenez des images numériques des sphéroïdes à l’aide d’un microscope automatisé avec un objectif 10x (objectif 2x premier). Le microscope peut focaliser et centraliser ces sphéroïdes automatiquement.
REMARQUE: La fonction de mise au point automatique et l’algorithme utilisé ont déjà été signalés par Yazdanfar et al.17. - Attendez l’imagerie automatique. Quatre images sont acquises pour chaque sphéroïde. Une image intégrée est formée et traitée avec le logiciel connecté au système d’imagerie à haut contenu.
- Cliquez sur le bouton « Image patch process » et choisissez les images intégrées dans le logiciel.
- Choisissez « Modèle U-NET » et tapez le taux de conversion (10x les images objectives ont un taux de conversion de 3,966). Cliquez en bas de l’écran ci-dessous pour lancer le traitement de l’image. Ensuite, enregistrez les données de diamètre, de périmètre et de rugosité dans un tableur.
- Calculez l’indice de périmètre excédentaire (EPI). L’EPI est le rapport entre le périmètre sphéroïde (P 0) et le périmètre équivalent (Pe), tel que calculé par Eq. 1. Mesurez l’aire du sphéroïde au plan focal (S) à l’aide de l’image J. Ensuite, calculez le périmètre équivalent du sphéroïde à l’aide de l’équation 2.
PEV = (P o− P e)/Pe (Eq. 1)
(Éq. 2)
REMARQUE: Le périmètre sphéroïde est généré par le logiciel avec des algorithmes d’apprentissage profond basés sur le modèle U-NET développé. - Ajouter 100 μL de milieu frais avec le médicament et remettre la plaque dans l’incubateur (37 °C dans de l’air humidifié avec 5% de CO2).
- Inhibition sphéroïde
- Calculer l’inhibition de la croissance tumorale (TGI) en utilisant Eq. 3. Le volume sphéroïde relatif (RTV) est le volume terminal sur le volume d’origine (Eq. 4). Le volume sphéroïde (V) est calculé automatiquement par le logiciel à l’aide de l’équation 5 en fonction de la sortie du diamètre du sphéroïde.
IGC = (contrôle RTV −traitement RTV)/contrôle RTV × 100 % (Eq. 3)
RTV =borne V/Voriginal (Eq. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (Eq. 5)
NOTE: Le TGI est obtenu en référence à l’inhibition de la croissance in vivo , et les poids tumoraux sont remplacés par RTV. Lecontrôle RTV est le volume sphéroïde relatif du groupe témoin, letraitement RTV est le volume sphéroïde relatif du groupe testé sur le médicament, Vterminal est le volume du sphéroïde le dernier jour, Voriginal est le volume du sphéroïde le premier jour de culture et d représente le diamètre du sphéroïde.
- Calculer l’inhibition de la croissance tumorale (TGI) en utilisant Eq. 3. Le volume sphéroïde relatif (RTV) est le volume terminal sur le volume d’origine (Eq. 4). Le volume sphéroïde (V) est calculé automatiquement par le logiciel à l’aide de l’équation 5 en fonction de la sortie du diamètre du sphéroïde.
(Éq. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1A,B montre le processus utilisé pour construire des sphéroïdes tumoraux dans cette étude. Nous avons d’abord ensemencé les cellules dans une plaque de fond en U de 48 puits. Cette étape est presque la même que celle utilisée en culture cellulaire 2D. Nous avons conservé la plaque dans un incubateur commun avec de l’eau entourant les puits afin que les cellules déposées commencent à former des sphéroïdes dans un processus d’auto-assemblage. Dans des conditions opérationnelles normales, la plupart des types de sphéroïdes tumoraux se sont complètement formés après 5 jours lorsqu’un milieu ciblé a été utilisé (tableau supplémentaire 2). Nous avons vérifié l’état de la construction des sphéroïdes dans les 5 jours avec un microscope numérique (Figure 1D). Une fois le processus de croissance terminé, du gel a été ajouté pour envelopper les sphéroïdes individuels dans chaque puits, produisant une matrice extracellulaire (ECM) in vivo pour chaque sphéroïde. Des tests de dépistage de drogues ont ensuite été effectués. Comme nous avons utilisé un système d’imagerie à haut contenu avec un logiciel d’analyse d’apprentissage profond (Figure 1C), nous avons pu observer clairement la croissance des sphéroïdes individuels (Figure 1E) et obtenir des valeurs pour les paramètres appropriés afin de déterminer les caractéristiques pendant le traitement médicamenteux, y compris la viabilité, le diamètre et la rugosité.
Figure 1 : Formation de sphéroïdes tumoraux et imagerie et analyse automatisées. (A) Schéma montrant la procédure standard de culture sphéroïde tumorale avec la chronologie ci-dessous. (B) Schéma des tests de traitement médicamenteux utilisant des sphéroïdes tumoraux montrant différents niveaux d’invasivité dans les matrices 3D. C) Image d’un système algorithmique basé sur l’apprentissage profond pour l’imagerie et l’analyse automatisées montrant les détails suivants: plate-forme de plaque; condenseur avec source lumineuse; étage motorisé X, Y; module motorisé de l’axe Z; roue d’objectif; roue filtrante; CCD; et ordinateur avec le logiciel système développé. (D) La formation de sphéroïdes tumoraux NCI-H23 à partir de cellules monocouches observées à partir de l’oculaire d’un microscope. La barre d’échelle représente 500 μm. (E) Variation du caractère invasif et de la taille des sphéroïdes NCI-H23 sans traitement médicamenteux sur 10 jours. Les barres d’échelle représentent 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Dans cette étude, nous avons utilisé le médicament antitumoral AMG510 pour tester son effet sur le traitement du cancer du poumon non à petites cellules. Le système d’analyse fournissait des données d’image sans traitement d’image complexe. Les images en fond clair de la figure 2 montrent que la croissance des sphéroïdes NCI-H23 pourrait être inhibée par AMG510. Cela a été indiqué par la diminution de la taille ainsi que l’augmentation de la concentration. En revanche, la taille a augmenté dans le groupe témoin pendant 10 jours. Au cours de cette période, la rugosité du côté du bord, indiquant un caractère envahissant, a également changé. Les sphéroïdes présentaient des bords plats le jour 1 mais des bords rugueux le jour 10. Cependant, il convient de noter que la comparaison de la rugosité à travers des images en fond clair est une tâche difficile. Il convient également de mentionner que la méthode standard implique des sphéroïdes de taille moyenne appropriée. Enfin, nous notons qu’un fond propre a été obtenu en utilisant cette méthode, car peu de cellules adhéraient au fond.
Figure 2 : Images en fond clair de sphéroïdes à cellules NCI-H23 traitées avec différentes concentrations d’AMG510 capturées automatiquement par un microscope à haute teneur. Les colonnes représentent différents jours et les rangées représentent différentes concentrations de médicaments. Les résultats incluent trois sphéroïdes pour chaque condition. Toutes les images ont été automatiquement mises au point à un grossissement de 2x, puis capturées à un grossissement de 10x par le système d’imagerie à haut contenu à l’aide d’un logiciel basé sur l’intelligence artificielle et d’un contrôleur de microenvironnement associé au microscope. Les barres d’échelle représentent 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les résultats de viabilité cellulaire, présentés à la figure 3A, ont démontré une viabilité réduite dans les cultures de 10 jours d’échantillons traités par le médicament à toutes les doses par rapport au témoin. Les échantillons avec des concentrations supérieures à 0,01 μM ont montré une diminution rapide de la viabilité des cellules tumorales, indiquant la sensibilité du traitement AMG510 au cancer du poumon non à petites cellules. Au jour 10, ces échantillons présentaient des niveaux similaires de viabilité finale, avec des valeurs inférieures à 70 %, comme le montre la figure 3B.
Figure 3 : Viabilité sphéroïde tumorale des groupes d’échantillons traités par AMG510. Des médicaments ont été ajoutés le jour 1. (A) La viabilité sphéroïde de la tumeur a été mesurée le jour 1, le jour 4, le jour 7 et le jour 10. (B) Viabilité des cellules terminales des échantillons avec gradients de concentration. Les concentrations de médicament utilisées pour traiter chaque sphéroïde tumoral ont été fixées de 0,001 μM à 5 μM. Toutes les données sont présentées sous forme de MEB moyenne ± (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La figure 4A révèle une tendance similaire en ce qui concerne l’analyse du diamètre des sphéroïdes. Les échantillons dont les concentrations étaient supérieures à 0,01 μM présentaient une réduction évidente du diamètre moyen. L’uniformité de la taille des sphéroïdes a également pu être observée le premier jour du traitement médicamenteux, avec des valeurs d’environ 800 μm. Les rapports de diamètre de ces sphéroïdes (Figure 4B) ont indiqué une contraction au cours de la co-culture AMG510 d’une manière visiblement plus évidente que le test de viabilité. De plus, nous avons calculé les valeurs d’inhibition de la croissance tumorale sphéroïde en termes de diamètres, comme le montre la figure 4C. La valeur de l’IGC est un paramètre d’évaluation relatif, et les valeurs pourraient indiquer une diminution de la croissance en raison des différences d’ensemencement d’origine entre les sphéroïdes; cependant, nous avons de nouveau obtenu le résultat que des concentrations supérieures à 0,01 μM avaient un effet évident sur le succès du traitement AMG510. Dans une étude antérieure, nous avons expérimenté la valeur CI50, qui est un indice significatif pour le dépistage des drogues; cependant, nous avons constaté que les sphéroïdes NCI-H23 sous traitement AMG510 ne présentaient aucun changement dans ce paramètre.
Figure 4 : Taille de la tumeur représentée par les diamètres sphéroïdes dans les groupes d’échantillons témoins et traités par AMG510. (A) Les diamètres des sphéroïdes tumoraux ont été mesurés le jour 1, le jour 4, le jour 7 et le jour 10. (B) Le taux de croissance des sphéroïdes a été défini comme le volume terminal par rapport au volume initial et calculé à l’aide des diamètres des sphéroïdes. (C) Le taux d’inhibition de la croissance sphéroïde a été défini par rapport au volume et calculé à l’aide des diamètres des sphéroïdes. Les concentrations d’AMG510 utilisées pour traiter chaque sphéroïde tumoral ont été fixées de 0,001 μM à 5 μM. Toutes les données sont présentées sous forme de MEB moyenne ± (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Nous avons ensuite effectué une nouvelle évaluation du caractère invasif des sphéroïdes en termes de valeurs de rugosité produites par le logiciel (Figure 5A) et également de l’indice de périmètre excédentaire basé sur les limites sphéroïdes, produit par les mêmes moyens (Figure 5B). Une rugosité plus élevée signifie que plus de cellules migrent du sphéroïde vers le gel, ce qui, par conséquent, représente une invasivité plus élevée. Les résultats des témoins ont été comparés à différents niveaux de concentration de médicaments. Pour NCI-H23, une lignée cellulaire invasive, la rugosité sphéroïde et les valeurs EPI augmentaient toutes deux avec le temps de culture sans aucun traitement médicamenteux18, ce qui pourrait être prouvé par les images en fond clair et l’augmentation du diamètre dans les échantillons témoins. Cependant, la croissance a été atténuée par le traitement par AMG510, entièrement proportionnellement aux variations de taille.
Figure 5 : Reconnaissance des limites tumorales dans les groupes d’échantillons témoins non traités et traités par AMG510. Des médicaments ont été ajoutés le jour 1. (A) La rugosité tumorale a été mesurée par le logiciel le jour 1, le jour 4, le jour 7 et le jour 10, indiquant le caractère invasif des sphéroïdes tumoraux. (B) Le périmètre sphéroïde a été localisé et dessiné par le logiciel à l’aide d’algorithmes d’apprentissage profond. Les zones sphéroïdes au plan focal ont ensuite été mesurées par l’image J, et un indice de périmètre excédentaire a été calculé sur la base de ces données. Les concentrations d’AMG510 utilisées pour traiter chaque sphéroïde tumoral ont été fixées de 0,001 μM à 5 μM. Toutes les données sont présentées sous forme de MEB moyenne ± (n = 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : La composition de la plaque. Le médicament anti-tumeur pulmonaire AMG510 a été utilisé dans l’expérience, et les groupes ont été définis en fonction des gradients de médicament. Deux plaques ont été utilisées : une pour le test de la trousse d’essai de viabilité et une pour l’analyse d’imagerie.
Tableau supplémentaire 2 : Lignées cellulaires utilisées dans la construction tumorale 3D et les tests de médicaments. Veuillez cliquer ici pour télécharger ces tableaux.
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Discussion
Le microenvironnement joue un rôle important dans la croissance tumorale. Il peut affecter la fourniture de matrices extracellulaires, les gradients d’oxygène, la nutrition et l’interaction mécanique et, par conséquent, affecter l’expression des gènes, les voies de signalisation et de nombreuses fonctions des cellules tumorales 19,20,21. Dans de nombreux cas, les cellules 2D ne produisent pas de tels effets ou même produisent des effets opposés, affectant ainsi l’évaluation des traitements médicamenteux. Cependant, l’émergence de modèles 3D a résolu ce problème. Par exemple, notre évaluation de l’effet de l’AMG510 sur un système de traitement du cancer du poumon a été réalisée à l’aide de méthodes 3D. Nous avons construit un modèle 3D tumeur-sphéroïde-ECM (TSE) en créant des sphéroïdes tumoraux intégrés dans un gel pour surveiller le traitement AMG510 sur une lignée cellulaire invasive liée aux poumons. AMG510 est un nouvel inhibiteur qui cible le mutant G12C KRAS22, et son efficacité a été confirmée par notre découverte que le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) a connu chez certains patients répondant à ce mutant. À partir de notre série de données expérimentales et d’analyses, des données très précieuses peuvent être discernées. La sensibilité à AMG510 a été significativement améliorée dans un état sphéroïde 3D, par rapport à la condition 2D, et encore amélioré dans un état hypoxique.
Les modèles construits selon la méthode actuelle offrent plusieurs avantages. Tout d’abord, en tant que modèle 3D, il peut bien simuler la tumeur et la matrice extracellulaire. La méthode simple mais efficace de construction de sphéroïdes tumoraux 3D permet aux cellules de survivre pendant une période de 2 semaines. Après les 5 jours de construction sphéroïde, une période d’environ 10 jours est disponible, ce qui est suffisant pour effectuer tout test de drogue. De plus, la méthode de production de culture cellulaire 3D est presque la même que la méthode 2D, et son coût est bien inférieur à celui de la bio-impression 3D. Par rapport à d’autres méthodes telles que la méthode de la goutte suspendue, la méthode décrite ici aide à produire des sphéroïdes plus uniformes, et la taille des cellules est entièrement contrôlée par le type et la densité des cellules. Enfin, ce modèle s’est avéré applicable à divers types de cellules cancéreuses, et cette flexibilité peut s’avérer particulièrement utile. À l’avenir, les chercheurs engagés dans la formation de sphéroïdes tumoraux pourraient ajouter non seulement des fibroblastes et des cellules endothéliales à leurs suspensions de cellules tumorales, mais aussi des cellules immunitaires telles que les cellules T et les cellules NK pour favoriser la migration des cellules stromales et stimuler les effets immunothérapeutiques des nouveaux médicaments23,24.
Au cours des dernières décennies, peu de rapports se sont concentrés sur la description des techniques et des outils actuellement disponibles pour extraire des données biologiques significatives des modèles 3D25. Ces informations peuvent être considérées comme fondamentales pour le dépistage de médicaments et la découverte thérapeutique à l’aide de modèles de culture cellulaire 3D26. L’étude de Zanoni et al. a décrit un nouveau logiciel open source qui effectue une analyse automatique d’images de colonies tumorales 3D. Les auteurs ont montré que les paramètres morphologiques influençaient la réponse des grands sphéroïdes au traitement médicamenteux et que la taille et la forme des sphéroïdes pouvaient toutes deux être des sources de variabilité27. Cependant, avec des sphéroïdes tumoraux cultivés dans un gel 3D, qui imitent les ECM in vivo, le comportement cellulaire est beaucoup plus complexe et un caractère invasif peut être présenté. Bien que les données ne concernent que la taille et la forme, ces limitations demeureront. De nombreux paramètres fiables et diversifiés peuvent être obtenus à l’aide d’un système d’imagerie à haut contenu. De tels systèmes peuvent non seulement déterminer la viabilité cellulaire et la forme sphéroïde, mais peuvent également détecter et vérifier les caractéristiques des tumeurs et l’effet inhibiteur des médicaments sur les tumeurs. Le caractère invasif peut également être déterminé par de tels moyens. Par exemple, une tumeur invasive peut avoir une valeur de rugosité relativement plus élevée, tandis qu’une tumeur non invasive peut avoir une valeur EPI plus élevée. Les changements dans ces valeurs peuvent indiquer des effets différents du médicament. À l’avenir, nous espérons combiner ces techniques avec des puces microfluidiques pour obtenir des stratégies plus pratiques et efficaces.
La méthode normalisée décrite ici peut répondre aux exigences de la plupart des tests de dépistage et d’évaluation des drogues. Cependant, il y a encore quelques problèmes qui peuvent survenir lors d’expériences futures. Par exemple, les cellules peuvent adhérer aux parois internes des puits après centrifugation, ou le milieu de culture peut ne pas convenir. De plus, le gel utilisé dans le protocole, ainsi que le Matrigel largement utilisé, peuvent facilement gélifier pendant le long processus. Cependant, la plupart de ces problèmes peuvent être résolus par des techniques d’exploitation et d’optimisation standard. Il existe d’autres limitations possibles dans cette méthode. En raison de la structure sphéroïde, les nutriments, l’oxygène et la diffusion des déchets à travers le sphéroïde sont influencés par la taille. La viabilité des cellules dans le noyau sphéroïde peut être compromise lorsque le diamètre du sphéroïde est supérieur à 1 000 μm. À l’inverse, il devient difficile d’observer l’invasion lorsque le diamètre est inférieur à 400 μm.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions tous les membres de nos laboratoires pour leurs commentaires critiques et leurs suggestions. Cette recherche a été soutenue par le projet clé de la Commission de la santé du Jiangsu (K2019030). La conceptualisation a été effectuée par C.W. et Z.C., la méthodologie a été effectuée par W.H. et M.L., l’enquête a été effectuée par W.H. et M.L., la conservation des données a été effectuée par W.H., Z.Z., S.X. et M.L., la préparation de l’ébauche originale a été effectuée par Z.Z., J.Z., S.X., W.H., et X.L., l’examen et la révision ont été effectués par Z.C., l’administration du projet a été effectuée par C.W. et Z.C., et l’acquisition du financement a été effectuée par C.W. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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