Summary
Dieser Artikel demonstriert eine standardisierte Methode zur Konstruktion dreidimensionaler Tumorsphäroide. Eine Strategie zur Sphäroidbeobachtung und bildbasierten Deep-Learning-Analyse unter Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystems wird ebenfalls beschrieben.
Abstract
In den letzten Jahrzehnten wurden neben monolayerkultivierten Zellen auch dreidimensionale Tumorsphäroide als potenziell leistungsfähiges Werkzeug für die Evaluierung von Krebsmedikamenten entwickelt. Den herkömmlichen Kulturmethoden fehlt jedoch die Möglichkeit, die Tumorsphäroide auf dreidimensionaler Ebene homogen zu manipulieren. Um diese Einschränkung zu beheben, stellen wir in dieser Arbeit eine bequeme und effektive Methode zur Konstruktion von Tumorsphäroiden mittlerer Größe vor. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode der bildbasierten Analyse unter Verwendung einer auf künstlicher Intelligenz basierenden Analysesoftware, die die gesamte Platte scannen und Daten über dreidimensionale Sphäroide erhalten kann. Es wurden mehrere Parameter untersucht. Durch die Verwendung einer Standardmethode zur Konstruktion von Tumorsphäroiden und eines Hochdurchsatz-Bildgebungs- und Analysesystems kann die Effektivität und Genauigkeit von Arzneimitteltests, die an dreidimensionalen Sphäroiden durchgeführt werden, drastisch gesteigert werden.
Introduction
Krebs ist eine der am meisten gefürchteten Krankheiten, nicht zuletzt wegen seiner hohen Sterblichkeitsrate1. In den letzten Jahren hat sich die Möglichkeit, Krebs zu behandeln, durch die Einführung neuer Therapien erhöht 2,3,4,5. Zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle werden verwendet, um Krebs im Labor zu untersuchen. 2D-Modelle können jedoch nicht alle wichtigen Parameter, die auf eine Antitumorsensitivität hinweisen, sofort und genau beurteilen. Daher können sie die In-vivo-Wechselwirkungen in der Arzneimitteltherapieprüfungnicht vollständig abbilden 6.
Seit 2020 hat der globale Markt für dreidimensionale (3D) Kulturen stark zugenommen. Laut einem Bericht von NASDAQ OMX wird der globale Wert des Marktes für 3D-Zellkulturen bis Ende 2025 2,7 Milliarden US-Dollar übersteigen. Im Vergleich zu 2D-Kulturmethoden weist die 3D-Zellkultivierung vorteilhafte Eigenschaften auf, die nicht nur für Proliferation und Differenzierung, sondern auch für das Langzeitüberleben optimiert werden können 7,8. Auf diese Weise können zelluläre Mikroumgebungen in vivo simuliert werden, um eine genauere Tumorcharakterisierung sowie ein metabolisches Profiling zu erhalten, so dass genomische und Proteinveränderungen besser verstanden werden können. Aus diesem Grund sollten 3D-Testsysteme nun in die allgemeine Arzneimittelentwicklung einbezogen werden, insbesondere in solche, die sich auf das Screening und die Bewertung neuartiger Antitumormedikamente konzentrieren. Dreidimensionale Wucherungen von immortalisierten etablierten Zelllinien oder primären Zellkulturen in Sphäroidstrukturen besitzen in vivo Merkmale von Tumoren wie Hypoxie und Wirkstoffpenetration sowie Zellinteraktion, -antwort und -resistenz und können als stringentes und repräsentatives Modell für die Durchführung von In-vitro-Wirkstoff-Screenings angesehen werden9,10,11.
Diese 3D-Kulturmodelle leiden jedoch auch unter mehreren Problemen, deren Lösung einige Zeit in Anspruch nehmen kann. Zellsphäroide können unter Verwendung dieser Protokolle gebildet werden, aber sie unterscheiden sich in bestimmten Details, wie z.B. der Kulturzeit oder dem Einbetten von Gelen12, so dass diese konstruierten Zellsphäroide unter einem begrenzten Größenbereich nicht gut kontrolliert werden können. Die Größe der Sphäroide kann die Konsistenz des Viabilitätstests und der bildgebenden Analyse beeinflussen. Die Wachstumsmikroumgebungen und Wachstumsfaktoren variieren ebenfalls, was aufgrund von Unterschieden in der Differenzierung zwischen den Zellen zu unterschiedlichen Morphologien führen kann13. Es besteht nun ein offensichtlicher Bedarf an einer standardisierten, einfachen und kostengünstigen Methode zur Konstruktion aller Arten von Tumoren mit kontrollierter Größe.
Aus einer anderen Perspektive betrachtet, bleibt das Hochdurchsatz-Screening von 3D-Modellen aus verschiedenen Gründen, wie z. B. der mangelnden Einheitlichkeit in der Position, Größe und Morphologie von Tumorsphäroiden, eine Herausforderung, obwohl homogene Assays und High-Content-Bildgebungsansätze entwickelt wurden, um Morphologie, Viabilität und Wachstumsrate zu bewerten14,15,16.
In dem hier vorgestellten Protokoll listen wir jeden Schritt in der Konstruktion von 3D-Tumorsphäroiden auf und beschreiben eine Methode zur Beobachtung und Analyse von Sphäroiden unter Verwendung eines High-Content-Bildgebungssystems mit hohem Durchsatz, das unter anderem Autofokus, Auto-Imaging und Analyse umfasst. Wir zeigen, wie mit dieser Methode 3D-Tumorsphäroide einheitlicher Größe hergestellt werden können, die für die Hochdurchsatz-Bildgebung geeignet sind. Diese Sphäroide zeigen auch eine hohe Sensitivität gegenüber der Behandlung von Krebsmedikamenten, und morphologische Veränderungen in den Sphäroiden können mit Hilfe von High-Content-Bildgebung beobachtet werden. Zusammenfassend demonstrieren wir die Robustheit dieser Methodik als Mittel zur Generierung von 3D-Tumorkonstrukten für die Wirkstoffbewertung.
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Protocol
1. Sphäroide-Konstruktion
- Anti-Adhäsions-Behandlung der Kulturplatte
- Pipettieren Sie 100 μl Antihaftreagenz in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte mit U-förmigem Well-Boden und bewahren Sie sie 10 Minuten lang auf. Nach 10 Minuten das Beschichtungsreagenz absaugen und zweimal mit sterilisiertem PBS waschen.
- Legen Sie die Kulturplatte bis zur Verwendung in einen Inkubator (37 °C in befeuchteter Luft mit 5 % CO2).
- Zellvorbereitung, -entnahme und -zählung
- Verwenden Sie das für die Zellen spezifische Nährmedium, um die Zellen in Zellkulturflaschen zu kultivieren (Ergänzende Tabelle 2). Zum Beispiel werden NCI-H23- und CT-26-Zellen in RPMI 1640 und HT-29-Zellen in McCoys 5A-Medium kultiviert. Diese beiden Medien werden mit 10 % wärmeinaktiviertem FBS bzw. 1 % P/S ergänzt.
- Halten Sie alle Zellen während der Proliferation unter Standardkulturbedingungen (37 °C in befeuchteter Luft mit 5 % CO2). Hier wird in den folgenden Schritten beispielhaft die NCI-H23-Zelllinie verwendet.
- Waschen Sie die in einem T25-Kolben kultivierten Zellen zweimal mit 1x PBS, um das Nährmedium zu entfernen (es ist besser, Zellen in der logarithmischen Phase auszuwählen und die Zellen mit einer Konfluenz von 80%-90% zu passieren).
- Behandeln Sie die expandierten Zellen mit 1 ml 0,25% Trypsin/EDTA für 1-2 min in einem Inkubator bei 37 °C, 5% CO2. Bestätigen Sie die Zellform (in diesem Fall normalerweise kreisförmig) unter dem Mikroskop und beenden Sie dann die Trypsinbehandlung. Dazu wird die gebrauchte Trypsin/EDTA-Suspension in den T25-Kolben abgesaugt und die Zellen mit 4 ml frischem Medium gewaschen.
- Übertragen Sie die gesamte Suspension (5 ml) in ein 15-ml-Röhrchen. Verwenden Sie 1 ml frisches Medium, um die verbleibenden Zellen abzuspülen, und geben Sie es in das Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 186,48 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie den Überstand und geben Sie 10 ml frisches Medium in das Zellpellet, gefolgt von einem sanften Pipettieren, bis sich die Zellen in einer homogenen Suspension befinden.
- Aspirieren Sie 0,1 ml Zellsuspension in ein neues Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 0,9 ml frisches Medium hinzu und pipettieren Sie dann die Suspension in eine Welle.
- Extrahieren Sie 10 μl der Zellsuspension für die Zellzählung. Führen Sie diesen Vorgang zwei- oder dreimal durch und nehmen Sie einen Durchschnittswert.
- Die Suspension wird verdünnt, um eine endgültige Aussaatdichte von 50.000 Zellen/ml zu erreichen, entsprechend der Konzentration, die bei der Zellzählung in Schritt 1.2.7 erhalten wurde.
- Zellkultur und Sphäroidbildung
- Geben Sie 200 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 48-Well-U-Bodenplatte.
- Wickeln Sie die Siegelfolie um die Platte und zentrifugieren Sie sie bei 119,35 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
- Nehmen Sie die Platte vorsichtig aus der Zentrifuge und ziehen Sie die Schutzfolie ab. Geben Sie dann 5-8 ml sterilisiertes Wasser in den Wasserkanal, der die Brunnen umgibt (um eine Verdunstung zu verhindern) und inkubieren Sie es 5 Tage lang bei 37 °C. Wechseln Sie während des Zeitraums kein Wasser in den Wasserkanal.
- Beobachten Sie die Zellaggregation während der folgenden 5 Tage.
HINWEIS: Im Allgemeinen beginnen die Zellen innerhalb von 5 Tagen als Kolonien zu verklumpen. Der Prozess der Sphäroidkonstruktion kann jedoch bei unterschiedlichen Zelltypen und Zelldichten schneller oder langsamer sein. Aus diesem Grund müssen die Zellen jeden Tag mit einer von drei möglichen Methoden beobachtet werden. Zunächst können die Zellen durch den Boden der Well-Platte beobachtet werden. Wenn die Zellen noch kein Sphäroid gebildet haben, ist unten eine einzelne Zellschicht zu sehen. Wenn die Zellen ein Sphäroid bilden, kann ein dichtes 3D-Konstrukt am U-Boden jeder Vertiefung beobachtet werden. Eine andere Methode besteht darin, die Zellen unter dem Mikroskop zu überprüfen. Wenn die Zellen zu einem Tumorsphäroid werden, besteht die Konstruktion aus drei Schichten (einer proliferierenden Schicht, einer inaktiven Schicht und einem nekrotischen Kern von außen nach innen des Sphäroids), die einen Transparenzgradienten aufweisen. Schließlich kann die Farbe des Nährmediums auch zu Beobachtungszwecken verwendet werden. Dies kann hilfreich sein, wenn der dreischichtige Aufbau auch mit einem Digitalmikroskop nicht deutlich zu erkennen ist. Wenn sich das Medium von violett-rot zu gelb verfärbt, kann der Prozess der Einbettung der Sphäroide in das Gel beginnen. Das Medium sollte während der Zellaggregationsphase nicht ausgetauscht werden.
- Gel-Einbettung
HINWEIS: Die Gele müssen bei einer Temperatur unter −20 °C gelagert werden. Insbesondere sollten Gele weit von der Kühlschranktür entfernt platziert werden, um Temperaturschwankungen zu vermeiden. Beachten Sie, dass sich die Gele in dieser Phase des Prozesses in einem gefrorenen Zustand befinden.- Nehmen Sie das gefrorene Gel aus dem −20 °C warmen Kühlschrank und legen Sie es während des Experiments für die gesamte Zeit auf eine Eisbox.
- Beobachten Sie die Zellsphäroide unter dem Mikroskop. Bevor die Geleinbettung beginnt, sollte der Status der Sphäroide noch einmal mit einem Digitalmikroskop überprüft werden.
- Entfernen Sie vorsichtig 150 μl des Mediums. Der Teller sollte auch auf die Eisbox gestellt werden.
- Betten Sie jedes Sphäroid in das Gel ein, indem Sie das flüssige Gel langsam von der Wandseite der Vertiefung hinzufügen, während Sie die vorgekühlte Pipettenspitze um und in der Vertiefung bewegen. Warten Sie 5 Minuten und wenn sich das Gel nicht gleichmäßig verteilt, pipettieren Sie das Gel vorsichtig mit einer 10-μl-Pipettenspitze. Jede Vertiefung enthält ein Tumorsphäroid, 25 μl 3,5 mg/ml Gel und 50 μl komplettes Nährmedium. Fügen Sie den Kontrollen auch 75 μl Medium hinzu.
HINWEIS: Jede Vertiefung enthält ein Sphäroid. - Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 30 Minuten, bis die Hydrogelierung vollständig abgeschlossen ist. Bestätigen Sie den Gelierstatus unter dem Mikroskop.
- Legen Sie 125 μl des frischen Mediums auf jede Probe.
- Kultur der Sphäroide für weitere 7-10 Tage. Bereiten Sie Gruppen von Sphäroiden mit jeweils vier bis sechs Vertiefungen vor und wählen Sie mindestens drei davon für die Analyse aus.
HINWEIS: Wenn Sie einen Drogentest durchführen, bereiten Sie zwei Gruppen für eine Probe vor. Eine Gruppe wird für Viabilitätstests verwendet, während die andere für die Bildaufnahme und -analyse verwendet wird.
2. Medikamentöse Behandlung
- Lösen Sie das Medikament gemäß den Anweisungen des Herstellers auf. Bereiten Sie 100x funktionierende Lösungen mit DMSO vor. Bereiten Sie mindestens fünf Dosen des Arzneimittels in serieller Verdünnung vor. Als Beispiel dient hier das Lungenkrebs-Therapeutikum AMG 510. Die Zusammensetzung ist in der ergänzenden Tabelle 1 dargestellt.
- Verwenden Sie 0,1 % DMSO als Positivkontrolle.
- Geben Sie 125 μl medikamentös behandeltes Medium in jede Vertiefung und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator (37 °C in befeuchteter Luft mit 5 % CO2). In diesem Stadium enthält jede Vertiefung ein Tumorsphäroid, 25 μl 3,5 mg/ml Gel und 175 μl des Mediums. Die Kontrollen enthalten 200 μL des Mediums.
3. Lebensfähigkeit des Sphäroids
- Messen Sie die Lebensfähigkeit des Sphäroids mit einem Alamarblau-Assay-Kit gemäß den Richtlinien des Herstellers. Messung der Viabilität mit einem Mikrotiterplatten-Photometer (Absorption bei 570 nm und 600 nm) nach der Behandlung mit Alamar Blue.
- Messen Sie die Viabilität an Tag 1, Tag 4, Tag 7 und Tag 10 nach dem Einbetten der Sphäroide in das Gel bzw. wie angegeben.
HINWEIS: Bei Verwendung eines Alamarblau-Assays ist eine Reaktionszeit von mindestens 16 Stunden erforderlich. Fügen Sie daher an den Nachmittagen von Tag 0, Tag 3, Tag 6 und Tag 9 20 μl Alamar Blue hinzu. - Aspirieren Sie 100 μl des überstehenden Mediums aus jeder Vertiefung in eine neue Testplatte und fügen Sie 80 μl frisches Medium in jede Vertiefung der Kulturplatte hinzu. Ersetzen Sie dann weitere 100 μl des medikamentös behandelten Mediums. Stellen Sie sicher, dass sich keine Überreste von Alamar Blue im Brunnen befinden.
HINWEIS: Der Austausch des Mediums wird bei jedem Test der Lebensfähigkeit durchgeführt, und das medikamentös behandelte Medium der Bildgebungs- und Analysegruppen muss am selben Tag ausgetauscht werden.
4. Sphäroid-Beobachtung und Deep-Learning-Analyse durch Bilder im Drogentest
- Bildgebung
- Aspirieren Sie 100 μl des Mediums vor der Bildgebung ab.
- Stellen Sie den Teller auf die Bühne. Erhalten Sie digitale Bilder der Sphäroide mit einem automatisierten Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv (2-fach-Objektiv zuerst). Das Mikroskop kann diese Sphäroide automatisch fokussieren und zentralisieren.
HINWEIS: Die Autofokus-Funktion und der verwendete Algorithmus wurden bereits von Yazdanfar et al.17 beschrieben. - Warten Sie auf die automatische Bildgebung. Für jedes Sphäroid werden vier Bilder aufgenommen. Ein integriertes Bild wird mit der an das High-Content-Imaging-System angeschlossenen Software erstellt und verarbeitet.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche "Image-Patch-Prozess" und wählen Sie die eingebundenen Bilder in der Software aus.
- Wählen Sie "U-NET-Modell" und geben Sie die Konvertierungsrate ein (10x objektive Bilder haben eine Konvertierungsrate von 3,966). Klicken Sie unten auf den Bildschirm, um die Bildverarbeitung zu starten. Speichern Sie dann die Daten zu Durchmesser, Umfang und Rauheit in einer Tabellenkalkulationssoftware.
- Berechnen Sie den Excess Perimeter Index (EPI). Der EPI ist das Verhältnis zwischen dem Sphäroidumfang (P 0) und dem äquivalenten Umfang (Pe), berechnet durch Gleichung 1. Messen Sie die Fläche des Sphäroids in der Fokusebene (S) mit Bild J. Berechnen Sie dann den äquivalenten Umfang des Sphäroids mit Gleichung 2.
EPI = (P o− P e)/Pe (Gl. 1)
(Gl. 2)
HINWEIS: Der Sphäroidumfang wird von der Software mit Deep-Learning-Algorithmen generiert, die auf dem entwickelten U-NET-Modell basieren. - Fügen Sie dem Medikament 100 μl frisches Medium hinzu und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator (37 °C in befeuchteter Luft mit 5% CO2).
- Sphäroid-Hemmung
- Berechnen Sie die Tumorwachstumshemmung (TGI) mit Gl. 3. Das relative Sphäroidvolumen (RTV) ist das Endvolumen über dem ursprünglichen Volumen (Gl. 4). Das Sphäroidvolumen (V) wird von der Software automatisch mit Gl. 5 entsprechend dem ausgegebenen Sphäroiddurchmesser berechnet.
TGI = (RTV-Kontrolle−RTV-Behandlung)/RTV-Kontrolle × 100 % (Gl. 3)
RTV =V-Klemme/VOriginal (Gl. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (Gl. 5)
HINWEIS: Der TGI wird unter Bezugnahme auf die In-vivo-Wachstumshemmung ermittelt und die Tumorgewichte werden durch RTV ersetzt. Die RTV-Kontrolle ist das relative Sphäroidvolumen der Kontrollgruppe, dieRTV-Behandlung ist das relative Sphäroidvolumen der medikamentös getesteten Gruppe, Vterminal ist das Volumen des Sphäroids am letzten Tag, Voriginal ist das Volumen des Sphäroids am ersten Kulturtag und d steht für den Sphäroiddurchmesser.
- Berechnen Sie die Tumorwachstumshemmung (TGI) mit Gl. 3. Das relative Sphäroidvolumen (RTV) ist das Endvolumen über dem ursprünglichen Volumen (Gl. 4). Das Sphäroidvolumen (V) wird von der Software automatisch mit Gl. 5 entsprechend dem ausgegebenen Sphäroiddurchmesser berechnet.
(Gl. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1A,B zeigt den Prozess, der in dieser Studie zur Konstruktion von Tumorsphäroiden verwendet wird. Wir haben die Zellen zunächst in einer 48-Well-U-Bodenplatte ausgesät. Dieser Schritt ist fast derselbe wie bei der 2D-Zellkultur. Wir hielten die Platte in einem gemeinsamen Inkubator mit Wasser, das die Brunnen umgab, so dass die abgelagerten Zellen begannen, in einem Selbstorganisationsprozess Sphäroide zu bilden. Unter normalen Betriebsbedingungen bildeten sich die meisten Arten von Tumorsphäroiden nach 5 Tagen bei Verwendung eines Zielmediums vollständig aus (Ergänzende Tabelle 2). Wir überprüften den Status der Sphäroidekonstruktion innerhalb von 5 Tagen mit einem digitalen Mikroskop (Abbildung 1D). Nachdem der Wachstumsprozess abgeschlossen war, wurde Gel hinzugefügt, um die einzelnen Sphäroide in jeder Vertiefung einzuwickeln, wodurch eine In-vivo-ähnliche extrazelluläre Matrix (EZM) für jedes Sphäroid erzeugt wurde. Anschließend wurden Drogentests durchgeführt. Da wir ein High-Content-Bildgebungssystem mit einer Deep-Learning-Analysesoftware verwendeten (Abbildung 1C), konnten wir das Wachstum einzelner Sphäroide deutlich beobachten (Abbildung 1E) und Werte für geeignete Parameter erhalten, um Eigenschaften während der medikamentösen Therapie zu bestimmen, einschließlich Lebensfähigkeit, Durchmesser und Rauheit.
Abbildung 1: Tumorsphäroidbildung und automatisierte Bildgebung und Analyse . (A) Schematische Darstellung des Standardverfahrens zur Tumorsphäroidkultur mit der Zeitleiste unten. (B) Schematische Darstellung von Medikamentenbehandlungstests unter Verwendung von Tumorsphäroiden, die unterschiedliche Stufen der Invasivität in 3D-Matrizen zeigen. (C) Abbildung eines Deep-Learning-basierten, algorithmusbezogenen Systems für automatisierte Bildgebung und Analyse mit folgenden Details: Plattenplattform; Kondensor mit Lichtquelle; motorisierter X-, Y-Tisch; motorisiertes Z-Achsen-Modul; Objektiv-Rad; Filterrad; CCD; und Computer mit der entwickelten Systemsoftware. (D) Die Bildung von NCI-H23-Tumorsphäroiden aus Monolayer-Zellen, beobachtet durch das Okular eines Mikroskops. Der Maßstabsbalken stellt 500 μm dar. (E) Variation in der Invasivität und Größe der NCI-H23-Sphäroide ohne medikamentöse Behandlung über 10 Tage. Die Maßstabsbalken stellen 200 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In dieser Studie haben wir das Antitumormedikament AMG510 verwendet, um seine Wirkung auf die Behandlung von nicht-kleinzelligem Lungenkrebs zu testen. Das Analysesystem lieferte Bilddaten ohne aufwändige Bildverarbeitung. Die Hellfeldbilder in Abbildung 2 zeigen, dass das Wachstum von NCI-H23-Sphäroiden durch AMG510 gehemmt werden könnte. Dies zeigte sich in der verringerten Größe und der erhöhten Konzentration. Im Gegensatz dazu nahm die Größe in der Kontrollgruppe für 10 Tage zu. In dieser Zeit veränderte sich auch die Rauheit der Kantenseite, die auf Invasivität hinweist. Die Sphäroide zeigten an Tag 1 flache Kanten, an Tag 10 jedoch raue Kanten. Es sollte jedoch beachtet werden, dass der Vergleich der Rauheit allein durch Hellfeldbilder eine schwierige Aufgabe ist. Es sollte auch erwähnt werden, dass es sich bei der Standardmethode um Sphäroide von angemessener durchschnittlicher Größe handelt. Schließlich stellen wir fest, dass mit dieser Methode ein sauberer Hintergrund erzielt wurde, da nur wenige Zellen am Boden hafteten.
Abbildung 2: Hellfeldbilder von NCI-H23-Zellsphäroiden, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von AMG510 behandelt wurden, die automatisch von einem High-Content-Mikroskop aufgenommen wurden. Die Spalten stellen verschiedene Tage dar, und die Zeilen stellen unterschiedliche Arzneimittelkonzentrationen dar. Die Ergebnisse beinhalten drei Sphäroide für jede Erkrankung. Alle Bilder wurden automatisch mit 2-facher Vergrößerung fokussiert und dann mit 10-facher Vergrößerung vom High-Content-Imaging-System unter Verwendung einer auf künstlicher Intelligenz basierenden Software und einem mikroskopbezogenen Mikroumgebungscontroller aufgenommen. Die Maßstabsbalken stellen 200 μm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Die Ergebnisse der Zellviabilität, die in Abbildung 3A dargestellt sind, zeigten eine reduzierte Viabilität in den 10-Tage-Kulturen von medikamentös behandelten Proben bei allen Dosierungsstufen im Vergleich zur Kontrolle. Proben mit Konzentrationen über 0,01 μM zeigten eine rasche Abnahme der Lebensfähigkeit der Tumorzellen, was auf die Sensitivität der AMG510-Therapie gegenüber nicht-kleinzelligem Lungenkrebs hinweist. An Tag 10 wiesen diese Proben mit Werten unter 70 % ein ähnliches Maß an endgültiger Viabilität auf, wie in Abbildung 3B dargestellt.
Abbildung 3: Viabilität des Tumorsphäroids der mit AMG510 behandelten Probengruppen. An Tag 1 wurden Medikamente hinzugefügt. (A) Die Viabilität des Tumorsphäroids wurde an Tag 1, Tag 4, Tag 7 und Tag 10 gemessen. (B) Endzellviabilität der Proben mit Konzentrationsgradienten. Die Wirkstoffkonzentrationen, die zur Behandlung jedes Tumorsphäroids verwendet wurden, wurden von 0,001 μM bis 5 μM eingestellt. Alle Daten werden als Mittelwert ± REM (n = 3) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4A zeigt einen ähnlichen Trend in Bezug auf die Analyse des Sphäroiddurchmessers. Proben mit Konzentrationen über 0,01 μM zeigten eine deutliche Verringerung des durchschnittlichen Durchmessers. Eine Gleichmäßigkeit der Sphäroidgröße zeigte sich auch am ersten Tag der medikamentösen Behandlung mit Werten von etwa 800 μm. Die Durchmesserverhältnisse dieser Sphäroide (Abbildung 4B) zeigten die Kontraktion während der AMG510-Kokultur auf eine deutlich deutlichere Weise als der Viabilitätstest. Darüber hinaus berechneten wir die Hemmungswerte für das Wachstum von Sphäroidtumoren in Bezug auf ihre Durchmesser, wie in Abbildung 4C dargestellt. Der TGI-Wert ist ein relativer Bewertungsparameter, und die Werte könnten auf ein verringertes Wachstum als Folge der ursprünglichen Aussaatunterschiede zwischen den Sphäroiden hinweisen. Wir haben jedoch erneut das Ergebnis erhalten, dass Konzentrationen über 0,01 μM einen offensichtlichen Einfluss auf den Erfolg der AMG510-Behandlung hatten. In einer früheren Studie haben wir mit dem IC50-Wert experimentiert, der ein signifikanter Index für Drogentests ist. Wir fanden jedoch, dass NCI-H23-Sphäroide unter AMG510-Behandlung keine Veränderungen in diesem Parameter aufwiesen.
Abbildung 4: Tumorgröße dargestellt durch Sphäroiddurchmesser in der Kontroll- und AMG510-behandelten Probengruppe. (A) Die Tumor-Sphäroiddurchmesser wurden an Tag 1, Tag 4, Tag 7 und Tag 10 gemessen. (B) Das Sphäroidwachstumsverhältnis wurde als Endvolumen relativ zum ursprünglichen Volumen definiert und unter Verwendung der Sphäroiddurchmesser berechnet. (C) Das Hemmungsverhältnis des Sphäroidwachstums wurde relativ zum Volumen definiert und anhand der Sphäroiddurchmesser berechnet. Die AMG510-Konzentrationen, die zur Behandlung jedes Tumorsphäroids verwendet wurden, wurden von 0,001 μM bis 5 μM eingestellt. Alle Daten werden als Mittelwert ± REM (n = 3) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Anschließend führten wir eine weitere Bewertung der Invasivität der Sphäroide in Bezug auf die von der Software erzeugten Rauheitswerte (Abbildung 5A) und auch den Überschussumfangsindex auf der Grundlage der Sphäroidgrenzen durch, die mit den gleichen Mitteln erzeugt wurden (Abbildung 5B). Eine höhere Rauheit bedeutet, dass mehr Zellen vom Sphäroid zum Gel wandern, was somit eine höhere Invasivität darstellt. Die Ergebnisse der Kontrollen wurden mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen verglichen. Für NCI-H23, eine invasive Zelllinie, stiegen sowohl die Sphäroidrauheit als auch die EPI-Werte mit der Kulturzeit ohne medikamentöse Behandlung an18, was durch die Hellfeldbilder und die Durchmesserzunahme in den Kontrollproben belegt werden konnte. Das Wachstum wurde jedoch durch die Behandlung mit AMG510 gedämpft, ganz proportional zu den Größenschwankungen.
Abbildung 5: Tumorgrenzerkennung in der unbehandelten Kontroll- und AMG510-behandelten Probengruppe. An Tag 1 wurden Medikamente hinzugefügt. (A) Die Tumorrauheit wurde von der Software an Tag 1, Tag 4, Tag 7 und Tag 10 gemessen, was auf die Invasivität der Tumorsphäroide hinweist. (B) Der Sphäroidumfang wurde von der Software mit Hilfe von Deep-Learning-Algorithmen lokalisiert und gezeichnet. Die sphäroiden Bereiche in der Fokusebene wurden dann mit Bild J gemessen und auf der Grundlage dieser Daten ein überschüssiger Umfangsindex berechnet. Die AMG510-Konzentrationen, die zur Behandlung jedes Tumorsphäroids verwendet wurden, wurden von 0,001 μM bis 5 μM eingestellt. Alle Daten werden als Mittelwert ± REM (n = 3) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzende Tabelle 1: Die Zusammensetzung der Platte. Im Experiment wurde das Anti-Lungentumor-Medikament AMG510 verwendet, und die Gruppen wurden nach Medikamentengradienten eingestellt. Es wurden zwei Platten verwendet: eine für den Viabilitäts-Assay-Kit-Test und eine für die bildgebende Analyse.
Ergänzende Tabelle 2: Zelllinien, die bei der 3D-Tumorkonstruktion und bei der Arzneimittelprüfung verwendet wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabellen herunterzuladen.
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Discussion
Die Mikroumgebung spielt eine wichtige Rolle beim Tumorwachstum. Es kann die Bereitstellung extrazellulärer Matrices, Sauerstoffgradienten, Ernährung und mechanische Interaktion beeinflussen und damit die Genexpression, Signalwege und viele Funktionen von Tumorzellen beeinflussen 19,20,21. In vielen Fällen erzeugen 2D-Zellen solche Effekte nicht oder sogar gegenteilige Effekte, was die Bewertung von medikamentösen Behandlungen beeinflusst. Das Aufkommen von 3D-Modellen hat dieses Problem jedoch gelöst. So wurde beispielsweise die Evaluierung der Wirkung von AMG510 auf ein Lungenkrebsbehandlungssystem mit 3D-Methoden durchgeführt. Wir konstruierten ein 3D-Tumor-Sphärooid-ECM (TSE)-Modell, indem wir Tumorsphäroide erzeugten, die in ein Gel eingebettet waren, um die AMG510-Behandlung an einer lungenverwandten invasiven Zelllinie zu überwachen. AMG510 ist ein neuer Inhibitor, der auf die G12C-Mutante KRAS22 abzielt, und seine Wirksamkeit wurde durch unsere Entdeckung bestätigt, dass der nicht-kleinzellige Lungenkrebs (NSCLC) bei einigen Patienten auftritt, die auf diese Mutante ansprechen. Aus unserer Reihe von experimentellen Daten und Analysen lassen sich einige sehr wertvolle Daten erkennen. Die Sensitivität gegenüber AMG510 war unter einer 3D-Sphäroid-Bedingung im Vergleich zur 2D-Bedingung signifikant erhöht und verbesserte sich innerhalb einer Hypoxie-Bedingung noch weiter.
Die Modelle, die mit dem vorliegenden Verfahren konstruiert werden, bieten mehrere Vorteile. Zum einen kann es als 3D-Modell den Tumor und die extrazelluläre Matrix gut simulieren. Die einfache, aber effektive Methode zur Herstellung von 3D-Tumorsphäroiden ermöglicht es den Zellen, über einen Zeitraum von 2 Wochen zu überleben. Nach den 5 Tagen der Sphäroidekonstruktion steht ein Zeitraum von ca. 10 Tagen zur Verfügung, der ausreicht, um etwaige Drogentests durchzuführen. Darüber hinaus ist die Methode der 3D-Zellkulturproduktion fast die gleiche wie die 2D-Methode und ihre Kosten sind weitaus niedriger als die des 3D-Bioprintings. Im Vergleich zu anderen Methoden, wie z. B. der Hanging-Drop-Methode, hilft die hier beschriebene Methode, gleichmäßigere Sphäroide zu erzeugen, und die Zellgröße wird vollständig durch die Art und Dichte der Zellen gesteuert. Schließlich hat sich gezeigt, dass dieses Modell auf verschiedene Arten von Krebszellen anwendbar ist, und diese Flexibilität könnte sich als besonders wertvoll erweisen. In Zukunft könnten Forscher, die sich mit der Bildung von Tumorsphäroiden beschäftigen, ihren Tumorzellsuspensionen nicht nur Fibroblasten und Endothelzellen hinzufügen, sondern auch Immunzellen wie T-Zellen und NK-Zellen, um die Stromazellmigration zu fördern und die immuntherapeutische Wirkung neuer Medikamente zu verstärken23,24.
In den letzten Jahrzehnten konzentrierten sich nur wenige Berichte auf die Beschreibung der Techniken und Werkzeuge, die derzeit zur Verfügung stehen, um aussagekräftige biologische Daten aus 3D-Modellen zu extrahieren25. Diese Informationen können als grundlegend für Arzneimitteltests und therapeutische Entdeckungen unter Verwendung von 3D-Zellkulturmodellen angesehen werden26. In der Studie von Zanoni et al. wurde eine neuartige Open-Source-Software beschrieben, die eine automatische Bildanalyse von 3D-Tumorkolonien durchführt. Die Autoren zeigten, dass Morphologieparameter das Ansprechen großer Sphäroide auf eine medikamentöse Behandlung beeinflussten und dass sowohl die Größe als auch die Form des Sphäroids Quellen der Variabilität sein könnten27. Bei in 3D-Gel kultivierten Tumorsphäroiden, die in vivo EZMs nachahmen, ist das Zellverhalten jedoch viel komplexer und es kann zu Invasivität kommen. Während sich die Daten nur auf Größe und Form beziehen, bleiben solche Einschränkungen bestehen. Viele zuverlässige und vielfältige Parameter können mit einem High-Content-Bildgebungssystem ermittelt werden. Solche Systeme können nicht nur die Zellviabilität und die Sphäroidform bestimmen, sondern auch die Eigenschaften von Tumoren und die hemmende Wirkung von Medikamenten auf Tumore erkennen und verifizieren. Auch die Invasivität kann auf diese Weise festgestellt werden. Zum Beispiel kann ein invasiver Tumor einen relativ höheren Rauheitswert haben, während ein nicht-invasiver Tumor einen höheren EPI-Wert haben kann. Veränderungen solcher Werte können auf unterschiedliche Arzneimittelwirkungen hinweisen. In Zukunft hoffen wir, diese Techniken mit mikrofluidischen Chips kombinieren zu können, um bequemere und effektivere Strategien zu erhalten.
Die hier beschriebene standardisierte Methode kann die Anforderungen der meisten Drogenscreening- und Bewertungstests erfüllen. Es gibt jedoch noch einige Probleme, die bei zukünftigen Experimenten auftreten können. Zum Beispiel können Zellen nach dem Zentrifugieren an den Innenwänden der Vertiefungen haften oder das Nährmedium ist möglicherweise nicht geeignet. Darüber hinaus kann das im Protokoll verwendete Gel sowie das weit verbreitete Matrigel während des langen Prozesses problemlos schwangen. Die meisten dieser Probleme können jedoch durch Standardbetriebs- und Optimierungstechniken gelöst werden. Es gibt noch weitere mögliche Einschränkungen bei dieser Methode. Aufgrund der Sphäroidstruktur werden Nährstoffe, Sauerstoff und Abfalldiffusion durch das Sphäroid durch die Größe beeinflusst. Die Lebensfähigkeit der Zellen im Sphäroidkern kann beeinträchtigt werden, wenn der Sphäroiddurchmesser über 1.000 μm liegt. Umgekehrt wird es schwierig, die Invasion zu beobachten, wenn der Durchmesser unter 400 μm liegt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken allen Mitgliedern unserer Labore für ihre kritischen Anregungen und Anregungen. Diese Forschung wurde durch das Schlüsselprojekt der Jiangsu Commission of Health (K2019030) unterstützt. Die Konzeptualisierung wurde von C.W. und Z.C. durchgeführt, die Methodik wurde von W.H. und M.L. durchgeführt, die Untersuchung wurde von W.H. und M.L. durchgeführt, die Datenkuratierung wurde von W.H., Z.Z., S.X. und M.L. durchgeführt, die ursprüngliche Entwurfserstellung wurde von Z.Z., J.Z., S.X., W.H. durchgeführt. und X.L., die Überprüfung und Redaktion wurde von Z.C. durchgeführt, die Projektverwaltung von C.W. und Z.C. und die Mittelakquise von C.W. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
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