Summary
Denne artikkelen demonstrerer en standardisert metode for konstruksjon av tredimensjonale tumorsfæroider. En strategi for sfæroidobservasjon og bildebasert dyplæringsanalyse ved hjelp av et automatisert bildesystem er også beskrevet.
Abstract
I de siste tiårene, i tillegg til monolayer-kulturerte celler, har tredimensjonale tumor sfæroider blitt utviklet som et potensielt kraftig verktøy for evaluering av kreftmedisiner. Imidlertid mangler de konvensjonelle kulturmetodene evnen til å manipulere tumorsfæroidene på en homogen måte på tredimensjonalt nivå. For å løse denne begrensningen, presenterer vi i dette papiret en praktisk og effektiv metode for å konstruere gjennomsnittlig størrelse tumor sfæroider. I tillegg beskriver vi en metode for bildebasert analyse ved hjelp av kunstig intelligens-basert analyseprogramvare som kan skanne hele platen og få data på tredimensjonale sfæroider. Flere parametere ble studert. Ved å bruke en standardmetode for tumorsfæroidkonstruksjon og et bildebehandlings- og analysesystem med høy gjennomstrømning, kan effektiviteten og nøyaktigheten av legemiddeltester utført på tredimensjonale sfæroider økes dramatisk.
Introduction
Kreft er en av de sykdommene mennesker frykter mest, ikke minst på grunn av den høye dødeligheten1. De siste årene har muligheten for å behandle kreft økt etter hvert som nye terapier har blitt introdusert 2,3,4,5. Todimensjonale (2D) og tredimensjonale (3D) in vitro-modeller brukes til å studere kreft i laboratorieinnstilling. Imidlertid kan 2D-modeller ikke umiddelbart og nøyaktig vurdere alle viktige parametere som indikerer antitumorfølsomhet; Derfor klarer de ikke fullt ut å representere in vivo-interaksjoner i medisineringstesting6.
Siden 2020 har det globale tredimensjonale (3D) kulturmarkedet blitt kraftig styrket. Ifølge en rapport fra NASDAQ OMX vil den globale verdien av 3D-cellekulturmarkedet overstige USD 2,7 milliarder innen utgangen av 2025. Sammenlignet med 2D-kulturmetoder viser 3D-celledyrking fordelaktige egenskaper, som kan optimaliseres ikke bare for spredning og differensiering, men også for langsiktig overlevelse 7,8. På denne måten kan in vivo cellulære mikromiljøer simuleres for å oppnå mer nøyaktig tumorkarakterisering, samt metabolsk profilering, slik at genomiske og proteinendringer kan forstås bedre. På grunn av dette bør 3D-testsystemer nå inkluderes i vanlige legemiddelutviklingsoperasjoner, spesielt de med fokus på screening og evaluering av nye antitumormedisiner. Tredimensjonale vekster av immortaliserte etablerte cellelinjer eller primære cellekulturer i sfæroide strukturer har in vivo egenskaper av svulster som hypoksi og medikamentpenetrasjon, samt celleinteraksjon, respons og motstand, og kan betraktes som en streng og representativ modell for å utføre in vitro legemiddelscreening 9,10,11.
Imidlertid lider disse 3D-kulturmodellene også av flere problemer som kan ta litt tid å løse. Cellesfæroider kan dannes ved hjelp av disse protokollene, men de varierer i visse detaljer, for eksempel kulturtid eller innebygging av geler12, slik at disse konstruerte cellesfæroider ikke kan kontrolleres godt under et begrenset størrelsesområde. Størrelsen på sfæroidene kan påvirke konsistensen av levedyktighetstesten og bildeanalysen. Vekstmikromiljøene og vekstfaktorene varierer også, noe som kan føre til forskjellige morfologier på grunn av forskjeller i differensieringen mellom celler13. Det er nå et åpenbart behov for en standard, enkel og kostnadseffektiv metode for å konstruere alle typer svulster med kontrollerte størrelser.
Fra et annet perspektiv, selv om homogene analyser og bildebehandlingsmetoder med høyt innhold er utviklet for å evaluere morfologi, levedyktighet og veksthastighet, er screening av 3D-modeller med høy gjennomstrømning fortsatt en utfordring av ulike grunner rapportert i litteraturen, for eksempel mangelen på ensartethet i posisjonen, størrelsen og morfologien til tumorsfæroider14,15,16.
I protokollen som presenteres her, lister vi hvert trinn i konstruksjonen av 3D-tumorsfæroider og beskriver en metode for sfæroidobservasjon og analyse ved hjelp av et bildebehandlingssystem med høy gjennomstrømning og høyt innhold som involverer autofokus, autoavbildning og analyse, blant andre fordelaktige egenskaper. Vi viser hvordan denne metoden kan produsere 3D-tumor sfæroider av ensartet størrelse som er egnet for høy gjennomstrømningsavbildning. Disse sfæroidene viser også høy følsomhet for kreftbehandling, og morfologiske endringer i sfæroidene kan overvåkes ved hjelp av bildebehandling med høyt innhold. Oppsummert demonstrerer vi robustheten til denne metoden som et middel til å generere 3D-tumorkonstruksjoner for legemiddelevalueringsformål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sfæroid konstruksjon
- Anti-adhesjonsbehandling av kulturplaten
- Pipette 100 μL anti-adhesjonsreagens i hver brønn i en 48-brønnplate med en U-formet brønnbunn, og hold i 10 minutter. Etter 10 minutter, aspirer beleggreagenset, og vask to ganger med sterilisert PBS.
- Sett dyrkningsplaten i en inkubator (37 °C i fuktet luft med 5 % CO2) til bruk.
- Celleforberedelse, innsamling og telling
- Bruk det dyrkningsmediet som er spesifikt for cellene, til å dyrke cellene i cellekulturflasker (tilleggstabell 2). For eksempel dyrkes NCI-H23, CT-26-celler i RPMI 1640, og HT-29-celler dyrkes i McCoys 5A-medium. Disse to mediene er supplert med henholdsvis 10% varmeinaktivert FBS og 1% P/S.
- Oppretthold alle cellene under standard kulturforhold (37 °C i fuktet luft med 5 % CO2) under spredning. Her brukes NCI-H23-cellelinjen som et eksempel i de følgende trinnene.
- Vask celler dyrket i en T25-kolbe to ganger med 1x PBS for å fjerne kulturmediet (det er bedre å velge celler i den logaritmiske fasen og passere cellene ved en sammenløp på 80% -90%).
- Behandle de utvidede cellene med 1 ml 0,25% trypsin/EDTA i 1-2 minutter i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2. Bekreft celleformen (normalt sirkulær i dette tilfellet) under mikroskopet, og stopp deretter trypsinbehandlingen. For å gjøre dette, aspirer den brukte trypsin / EDTA-suspensjonen i T25-kolben, og vask cellene med 4 ml friskt medium.
- Overfør all suspensjonen (5 ml) til et 15 ml rør. Bruk 1 ml friskt medium til å vaske ned de resterende cellene og legg det til røret. Sentrifuger cellene ved 186,48 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og tilsett 10 ml nytt medium til cellepelleten, etterfulgt av forsiktig pipettering til cellene er i en homogen suspensjon.
- Aspirer 0,1 ml cellesuspensjon til et nytt sentrifugerør, tilsett 0,9 ml friskt medium, og pipetter deretter suspensjonsbrønnen.
- Trekk ut 10 μL av cellesuspensjonen for celletelling. Utfør denne prosessen to eller tre ganger og ta en gjennomsnittsverdi.
- Fortynn suspensjonen for å nå en endelig såtetthet på 50 000 celler / ml, i henhold til konsentrasjonen oppnådd fra celletellingsprosessen i trinn 1.2.7.
- Cellekultur og sfæroiddannelse
- Tilsett 200 μL av cellesuspensjonen til hver brønn i en 48-brønns U-bunnplate.
- Pakk tetningsfilmen rundt platen og sentrifuge den ved 119,35 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Ta platen forsiktig ut av sentrifugen og trekk av beskyttelsesfilmen. Tilsett deretter 5-8 ml sterilisert vann i vannkanalen som omgir brønnene (for å forhindre fordampning) og inkuber ved 37 °C i 5 dager. Ikke skift/tilfør vann til vannkanalen i perioden.
- Observer celleaggregeringen i løpet av de følgende 5 dagene.
MERK: Generelt begynner cellene å klumpe seg som kolonier innen 5 dager. Imidlertid kan prosessen med sfæroid konstruksjon være raskere eller langsommere med forskjellige celletyper og celletettheter. På grunn av dette må cellene observeres hver dag ved hjelp av en av tre mulige metoder. For det første kan cellene observeres gjennom bunnen av brønnplaten. Når cellene ennå ikke har dannet en sfæroid, kan et enkelt lag med celler ses nederst. Når cellene danner en sfæroide, kan en tett 3D-konstruksjon observeres på U-bunnen av hver brønn. En annen metode innebærer å sjekke cellene under et mikroskop. Når cellene blir en tumor sfæroid, involverer konstruksjonen tre lag (et prolifererende lag, et inaktivt lag og en nekrotisk kjerne, fra utsiden til innsiden av sfæroiden), som har en gjennomsiktighetsgradient. Endelig kan fargen på kulturmediet også brukes til observasjonsformål. Dette kan være nyttig når trelagsstrukturen ikke kan ses tydelig, selv ved hjelp av et digitalt mikroskop. Når mediet blir fra lilla rødt til gult, kan prosessen med å legge inn sfæroidene i gelen begynne. Mediet skal ikke byttes ut i celleaggregeringsperioden.
- Gel innebygging
MERK: Gelene må oppbevares ved en temperatur under -20 °C. Spesielt bør geler plasseres langt unna kjøleskapsdøren for å unngå temperatursvingninger. Legg merke til at gelene er i frossen tilstand på dette stadiet av prosessen.- Ta den frosne gelen fra kjøleskapet på -20 °C og legg den på en isboks hele tiden under forsøket.
- Vær oppmerksom på cellesfæroidene under mikroskopet. Før gelinnbyggingen begynner, bør statusen til sfæroidene igjen kontrolleres med et digitalt mikroskop.
- Fjern forsiktig 150 μL av mediet. Platen skal også plasseres på isboksen.
- Legg hver sfæroid i gelen ved å tilsette væskegelen sakte fra veggsiden av brønnen mens du beveger den forkjølte pipettespissen rundt og inne i brønnen. Vent i 5 minutter, og hvis gelen ikke sprer seg jevnt, pipetter du forsiktig gelen med en 10 μL pipettespiss. Hver brønn inneholder en tumorsfæroid, 25 μL 3,5 mg / ml gel og 50 μL komplett kulturmedium. Legg til 75 μL medium til kontrollene også.
MERK: Hver brønn inneholder en sfæroid. - Inkuber platen ved 37 °C i 30 minutter til hydrogeleringen er fullført. Bekreft geleringsstatusen under mikroskopet.
- Legg 125 μL av det ferske mediet på hver prøve.
- Kultur sfæroidene i ytterligere 7-10 dager. Forbered grupper av sfæroider med fire til seks brønner hver og velg minst tre av dem for analyse.
MERK: Hvis du utfører en narkotikatest, må du forberede to grupper for en prøve. En gruppe brukes til levedyktighetstesting, mens den andre brukes til bildeopptak og analyse.
2. Narkotikabehandling
- Løs opp stoffet i henhold til produsentens instruksjoner. Forbered 100x arbeidsløsninger med DMSO. Forbered minst fem doser av legemidlet i seriell fortynning. Her brukes lungekreftterapeutisk legemiddel, AMG 510, som eksempel. Sammensetningen er vist i tilleggstabell 1.
- Bruk 0,1% DMSO som en positiv kontroll.
- Tilsett 125 μL medikamentbehandlet medium til hver brønn og plasser platen tilbake i inkubatoren (37 °C i fuktet luft med 5 % CO2). På dette stadiet inneholder hver brønn en tumor sfæroid, 25 μL 3,5 mg / ml gel og 175 μL av mediet. Kontrollene inneholder 200 μL av mediet.
3. Sfærisk levedyktighet
- Mål sfæroidens levedyktighet ved hjelp av et Alamar Blue-analysesett i henhold til produsentens retningslinjer. Mål levedyktigheten ved hjelp av et mikroplatefotometer (absorbans ved 570 nm og 600 nm) etter at Alamar Blue-behandlingen er utført.
- Mål levedyktigheten på dag 1, dag 4, dag 7 og dag 10 etter at sfæroidene er innebygd i gelen, henholdsvis, eller som angitt.
MERK: Ved bruk av en Alamar Blue-analyse kreves det minst 16 timers reaksjonstid. Tilsett derfor 20 μL Alamar Blue på ettermiddagen dag 0, dag 3, dag 6 og dag 9. - Aspirer 100 μL av supernatantmediet fra hver brønn til en ny testplate og tilsett 80 μL ferskt medium til hver brønn på kulturplaten. Deretter erstatter du ytterligere 100 μL av det legemiddelbehandlede mediet. Forsikre deg om at det ikke er rester av Alamar Blue i brønnen.
MERK: Middels erstatning utføres hver gang levedyktigheten testes, og det medikamentbehandlede mediet til bildeanalysegruppene må byttes ut samme dag.
4. Sfæroid observasjon og dyp læringsanalyse gjennom bilder i narkotikatesten
- Imaging
- Aspirer 100 μL av mediet ut før avbildning.
- Plasser tallerkenen på scenen. Få digitale bilder av sfæroidene ved hjelp av et automatisert mikroskop med et 10x objektiv (2x objektiv først). Mikroskopet kan fokusere og sentralisere disse sfæroidene automatisk.
MERK: Autofokusfunksjonen og algoritmen som brukes er tidligere rapportert av Yazdanfar et al.17. - Vent på automatisk bildebehandling. Fire bilder er anskaffet for hver sfæroid. Et integrert bilde dannes og behandles med programvaren som er koblet til bildebehandlingssystemet med høyt innhold.
- Klikk på "Image patch process" -knappen og velg de integrerte bildene i programvaren.
- Velg "U-NET-modell", og skriv inn konverteringsfrekvensen (10x objektive bilder har en konverteringsfrekvens på 3.966). Klikk nederst på skjermen nedenfor for å starte bildebehandlingen. Deretter lagrer du dataene om diameter, omkrets og ruhet i regnearkprogramvare.
- Beregn overflødig perimeterindeks (EPI). EPI er forholdet mellom sfæroidomkretsen (P 0) og den ekvivalente omkretsen (Pe), som beregnet ved Eq. 1. Mål arealet av sfæroid i fokalplanet (S) ved hjelp av bilde J. Deretter beregner du den ekvivalente omkretsen av sfæroid ved hjelp av Eq. 2.
EPI = (P o− P e)/Pe (Eq. 1)
(Eq. 2)
MERK: Den sfæroide omkretsen genereres av programvaren med dyplæringsalgoritmer basert på den utviklede U-NET-modellen. - Tilsett 100 μL friskt medium med stoffet og sett platen tilbake i inkubatoren (37 ° C i fuktet luft med 5% CO2).
- Sfæroid hemming
- Beregn tumorveksthemming (TGI) ved hjelp av Eq. 3. Det relative sfæroidvolumet (RTV) er terminalvolumet over det opprinnelige volumet (Eq. 4). Sfæroidvolumet (V) beregnes automatisk av programvaren ved hjelp av Eq. 5 i henhold til utgangen med sfæroiddiameter.
TGI = (RTV kontroll − RTVbehandling) / RTVkontroll × 100% (Eq. 3)
RTV =V-terminal/Voriginal (Eq. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (Eq. 5)
MERK: TGI oppnås med henvisning til in vivo veksthemming, og tumorvektene erstattes med RTV. RTV-kontroll er det relative sfæroidvolumet til kontrollgruppen, RTV-behandling er det relative sfæroidvolumet til den legemiddeltestede gruppen,V-terminalen er volumet av sfæroid på den siste dagen, Voriginal er volumet av sfæroid på den første kulturdagen, og d representerer sfæroiddiameteren.
- Beregn tumorveksthemming (TGI) ved hjelp av Eq. 3. Det relative sfæroidvolumet (RTV) er terminalvolumet over det opprinnelige volumet (Eq. 4). Sfæroidvolumet (V) beregnes automatisk av programvaren ved hjelp av Eq. 5 i henhold til utgangen med sfæroiddiameter.
(Eq. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A,B viser prosessen som ble brukt for å konstruere tumorsfæroider i denne studien. Vi sådde først cellene i en 48-brønns U-bunnplate. Dette trinnet er nesten det samme som brukes i 2D-cellekultur. Vi oppbevarte platen i en felles inkubator med vann rundt brønnene, slik at de avsatte cellene begynte å danne sfæroider i en selvmonteringsprosess. Under normale driftsforhold ble de fleste typer tumorsfæroider fullstendig dannet etter 5 dager når et målrettet medium ble brukt (tilleggstabell 2). Vi sjekket status for sfæroidkonstruksjon innen 5 dager med digitalt mikroskop (figur 1D). Etter at vekstprosessen var fullført, ble gel tilsatt for å pakke opp de enkelte sfæroidene i hver brønn, og produserte en in vivo-lignende ekstracellulær matriks (ECM) for hver sfæroid. Deretter ble det gjennomført rusmiddeltesting. Da vi brukte et bildebehandlingssystem med høyt innhold med dyplæringsanalyseprogramvare (figur 1C), kunne vi tydelig observere individuell sfæroidvekst (figur 1E) og oppnå verdier for egnede parametere for å bestemme egenskaper under medisinering, inkludert levedyktighet, diameter og ruhet.
Figur 1 Tumor spheroid dannelse og automatisert avbildning og analyse. (A) Skjematisk viser standard tumor sfæroid kultur prosedyre med tidslinjen nedenfor. (B) Skjematisk av narkotikabehandlingstesting ved bruk av tumorsfæroider som viser forskjellige nivåer av invasivitet i 3D-matriser. (C) Bilde av et dyplæringsbasert algoritmerelatert system for automatisert avbildning og analyse som viser detaljer som følger: plateplattform; kondensator med lyskilde; motorisert x, y stadium; motorisert z-akse modul; objektivt hjul; filter hjul; CCD; og datamaskin med den utviklede systemprogramvaren. (D) Dannelsen av NCI-H23-tumorsfæroider fra monolagsceller observert fra okularet i et mikroskop. Skalalinjen representerer 500 μm. (E) Variasjon i invasivitet og størrelse av NCI-H23 sfæroider uten medikamentell behandling over 10 dager. Skalastengene representerer 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
I denne studien brukte vi antitumormedikamentet AMG510 for å teste effekten på behandling av ikke-småcellet lungekreft. Analysesystemet ga bildedata uten komplisert bildebehandling. Brightfield-bildene i figur 2 viser at veksten av NCI-H23 sfæroider kan hemmes av AMG510. Dette ble indikert av redusert størrelse sammen med økt konsentrasjon. Derimot økte størrelsen i kontrollgruppen i 10 dager. I løpet av denne perioden endret også grovheten på kantsiden, noe som indikerer invasivitet. Sfæroidene viste flate kanter på dag 1, men grove kanter på dag 10. Det skal imidlertid bemerkes at sammenligning av grovhet gjennom lysfeltbilder alene er en utfordrende oppgave. Det skal også nevnes at standardmetoden innebærer sfæroider av passende gjennomsnittlig størrelse. Til slutt bemerker vi at en ren bakgrunn ble oppnådd ved hjelp av denne metoden, da få celler festet seg til bunnen.
Figur 2: Brightfield-bilder av NCI-H23-cellesfæroider behandlet med forskjellige konsentrasjoner av AMG510 automatisk fanget av et mikroskop med høyt innhold. Kolonnene representerer forskjellige dager, og radene representerer forskjellige legemiddelkonsentrasjoner. Resultatene inkluderer tre sfæroider for hver tilstand. Alle bildene ble automatisk fokusert ved 2x forstørrelse og deretter tatt med 10x forstørrelse av bildebehandlingssystemet med høyt innhold ved hjelp av kunstig intelligensbasert programvare og en mikroskopassosiert mikromiljøkontroller. Skalastengene representerer 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Cellens levedyktighetsresultater, vist i figur 3A, viste redusert levedyktighet i 10-dagers kulturer av narkotikabehandlede prøver ved alle doseringsnivåer sammenlignet med kontrollen. Prøver med konsentrasjoner over 0,01 μM viste en rask reduksjon i tumorcellenes levedyktighet, noe som indikerer følsomheten til AMG510-terapi for ikke-småcellet lungekreft. På dag 10 viste disse prøvene lignende nivåer av endelig levedyktighet, med verdier under 70%, som vist i figur 3B.
Figur 3: Tumor spheroid levedyktighet av AMG510-behandlede prøvegrupper. Narkotika ble lagt til på dag 1. (A) Tumor spheroid levedyktighet ble målt på dag 1, dag 4, dag 7 og dag 10. (B) Terminalcelle levedyktighet av prøvene med konsentrasjonsgradienter. Legemiddelkonsentrasjonene som ble brukt til å behandle hver tumor sfæroid ble satt fra 0, 001 μM til 5 μM. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4A viser en lignende trend med hensyn til sfæroiddiameteranalysen. Prøver med konsentrasjoner over 0,01 μM viste en tydelig reduksjon i gjennomsnittlig diameter. Ensartethet i sfæroidstørrelsen kunne også ses på første behandlingsdag, med verdier på ca. 800 μm. Diameterforholdene til disse sfæroidene (figur 4B) indikerte sammentrekning under AMG510-samkulturen på en synlig mer åpenbar måte enn levedyktighetstesten. I tillegg beregnet vi verdiene for sfæroidtumorveksthemming i form av diametre, som vist i figur 4C. TGI-verdien er en relativ evalueringsparameter, og verdiene kan indikere redusert vekst som følge av opprinnelige såforskjeller mellom sfæroidene; Imidlertid oppnådde vi igjen resultatet at konsentrasjoner over 0,01 μM hadde en åpenbar effekt på suksessen til AMG510-behandlingen. I en tidligere studie eksperimenterte vi med IC50-verdien, som er en signifikant indeks for narkotikatesting; Vi fant imidlertid at NCI-H23 sfæroider under AMG510-behandling ikke viste noen endringer i denne parameteren.
Figur 4: Tumorstørrelse representert ved sfæroiddiametre i kontroll- og AMG510-behandlede prøvegrupper. (A) Tumor sfæroiddiametre ble målt på dag 1, dag 4, dag 7 og dag 10. (B) Det sfæroide vekstforholdet ble definert som terminalvolumet i forhold til det opprinnelige volumet og beregnet ved hjelp av sfæroiddiametre. (C) Det sfæroide veksthemmingsforholdet ble definert i forhold til volumet og beregnet ved hjelp av sfæroiddiametre. AMG510-konsentrasjonene som ble brukt til å behandle hver tumorsfæroid ble satt fra 0,001 μM til 5 μM. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vi utførte deretter en ytterligere evaluering av invasiviteten til sfæroidene når det gjelder ruhetsverdiene som produseres som utgang av programvaren (figur 5A) og også overflødig omkretsindeks basert på sfæroidgrensene, produsert på samme måte (figur 5B). Høyere ruhet betyr at flere celler migrerer fra sfæroiden til gelen, som dermed representerer høyere invasivitet. Resultatene av kontrollene ble sammenlignet med ulike legemiddelkonsentrasjonsnivåer. For NCI-H23, en invasiv cellelinje, økte både sfæroidruhet og EPI-verdier med dyrkningstid uten medikamentell behandling18, og dette kunne bevises ved lysfeltbildene og diameterøkningene i kontrollprøvene. Veksten ble imidlertid dempet av AMG510-behandling, helt i forhold til variasjoner i størrelse.
Figur 5: Tumorgrensegjenkjenning i de ubehandlede kontroll- og AMG510-behandlede prøvegruppene. Narkotika ble lagt til på dag 1. (A) Tumorruhet ble målt av programvaren på dag 1, dag 4, dag 7 og dag 10, noe som indikerer invasiviteten til tumorsfæroidene. (B) Den sfæroide omkretsen ble lokalisert og tegnet av programvaren ved hjelp av dyplæringsalgoritmer. De sfæroide områdene i fokalplanet ble deretter målt ved bilde J, og en overflødig perimeterindeks ble beregnet basert på disse dataene. AMG510-konsentrasjonene som ble brukt til å behandle hver tumorsfæroid ble satt fra 0,001 μM til 5 μM. Alle data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Sammensetningen av platen. Anti-lungetumormedikamentet AMG510 ble brukt i forsøket, og gruppene ble satt etter medikamentgradienter. To plater ble brukt: en for levedyktighetsanalysesetttesten og en for bildeanalysen.
Supplerende tabell 2: Cellelinjer som har blitt brukt i 3D-tumorkonstruksjon og narkotikatesting. Klikk her for å laste ned disse tabellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikromiljøet spiller en viktig rolle i tumorvekst. Det kan påvirke tilførselen av ekstracellulære matriser, oksygengradienter, ernæring og mekanisk interaksjon og dermed påvirke genuttrykk, signalveier og mange funksjoner i tumorceller 19,20,21. I mange tilfeller produserer 2D-celler ikke slike effekter eller til og med produserer motsatte effekter, og påvirker dermed evalueringen av medikamentelle behandlinger. Fremveksten av 3D-modeller har imidlertid løst dette problemet. For eksempel ble vår evaluering av effekten av AMG510 på et lungekreftbehandlingssystem fullført ved hjelp av 3D-metoder. Vi konstruerte en 3D-tumor-spheroid-ECM (TSE) -modell ved å lage tumorsfæroider innebygd i en gel for å overvåke AMG510-behandling på en lungerelatert invasiv cellelinje. AMG510 er en ny hemmer som retter seg mot G12C-mutant KRAS22, og dens effektivitet ble bekreftet av vårt funn at ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) opplevd av noen pasienter som reagerer på denne mutanten. Fra vår serie av eksperimentelle data og analyser kan noen svært verdifulle data skjelnes. Følsomheten for AMG510 ble betydelig forbedret under en 3D sfæroidtilstand, sammenlignet med 2D-tilstanden, og forbedret ytterligere innenfor en hypoksitilstand.
Modellene konstruert gjennom dagens metode gir flere fordeler. For det første, som en 3D-modell, kan den simulere svulsten og den ekstracellulære matrisen godt. Den enkle, men effektive metoden for å konstruere 3D-tumor sfæroider gjør at cellene kan overleve i en 2 ukers periode. Etter de 5 dagene med sfæroidkonstruksjon er en periode på rundt 10 dager tilgjengelig, noe som er tilstrekkelig til å utføre narkotikatesting. I tillegg er metoden for 3D-cellekulturproduksjon nesten den samme som 2D-metoden, og kostnaden er langt lavere enn for 3D-bioprinting. Sammenlignet med andre metoder som hengende dråpe-metoden, bidrar metoden beskrevet her til å produsere mer ensartede sfæroider, og cellestørrelsen styres fullt ut av cellens type og tetthet. Endelig har denne modellen vist seg å være anvendelig for ulike typer kreftceller, og denne fleksibiliteten kan vise seg å være av spesielt høy verdi. I fremtiden kan forskere engasjert i dannelsen av tumor sfæroider legge ikke bare fibroblaster og endotelceller til deres tumorcellesuspensjoner, men også immunceller som T-celler og NK-celler for å fremme stromalcellemigrasjon og øke immunterapeutiske effekter av nye stoffer23,24.
De siste tiårene har få rapporter fokusert på å beskrive teknikker og verktøy som er tilgjengelige for å trekke ut signifikante biologiske data fra 3D-modeller25. Denne informasjonen kan betraktes som grunnleggende for narkotikatesting og terapeutisk oppdagelse ved hjelp av 3D-cellekulturmodeller26. Studien av Zanoni et al. beskrev ny åpen kildekode-programvare som utfører automatisk bildeanalyse av 3D-tumorkolonier. Forfatterne viste at morfologiparametere påvirket responsen til store sfæroider på medikamentell behandling, og at sfæroid størrelse og form begge kunne være kilder til variabilitet27. Imidlertid, med tumorsfæroider dyrket i 3D-gel, som etterligner ECM in vivo, er celleadferd mye mer kompleks, og invasivitet kan utvises. Mens dataene bare er opptatt av størrelse og form, vil slike begrensninger forbli. Mange pålitelige og diversifiserte parametere kan oppnås ved hjelp av et bildebehandlingssystem med høyt innhold. Slike systemer kan ikke bare bestemme cellens levedyktighet og sfæroidform, men kan også oppdage og verifisere egenskapene til svulster og inhiberingseffekten av legemidler på svulster. Invasivitet kan også bestemmes på denne måten. For eksempel kan en invasiv tumor ha en relativt høyere ruhetsverdi, mens en ikke-invasiv tumor kan ha en høyere EPI-verdi. Endringer i slike verdier kan indikere ulike legemiddeleffekter. I fremtiden håper vi å kombinere disse teknikkene med mikrofluidiske chips for å oppnå mer praktiske og effektive strategier.
Den standardiserte metoden beskrevet her kan oppfylle kravene til de fleste narkotika screening og evalueringstester. Det er imidlertid fortsatt noen problemer som kan oppstå under fremtidige eksperimenter. For eksempel kan celler feste seg til brønnens indre vegger etter sentrifugering, eller kulturmediet kan ikke være egnet. I tillegg kan gelen som brukes i protokollen, så vel som den mye brukte Matrigel, lett gelere under den lange prosessen. Imidlertid kan de fleste av disse problemene løses gjennom standard drift og optimaliseringsteknikker. Det er andre mulige begrensninger i denne metoden. På grunn av sfæroidstrukturen påvirkes næringsstoffer, oksygen og avfallsdiffusjon gjennom sfæroiden av størrelsen. Levedyktigheten til cellene i sfæroidkjernen kan bli kompromittert når sfæroiddiameteren er over 1000 μm. Omvendt blir det vanskelig å observere invasjonen når diameteren er under 400 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker alle medlemmer av våre laboratorier for deres kritiske innspill og forslag. Denne forskningen ble støttet av Key Project of Jiangsu Commission of Health (K2019030). Konseptualisering ble utført av CW og Z.C., metodikken ble utført av W.H. og M.L., undersøkelsen ble utført av W.H. og M.L., datakurateringen ble utført av W.H., Z.Z., S.X. og M.L., det opprinnelige utkastet ble utført av Z.Z., J.Z., S.X., W.H., og X.L., gjennomgangen og redigeringen ble utført av Z.C., prosjektadministrasjonen ble utført av C.W. og Z.C., og finansieringsanskaffelsen ble utført av C.W. Alle forfatterne har lest og samtykket til den publiserte versjonen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
