Summary
Este artigo demonstra um método padronizado para a construção de esferoides tumorais tridimensionais. Uma estratégia para observação esferoide e análise de aprendizagem profunda baseada em imagens usando um sistema de imagem automatizado também é descrita.
Abstract
Nas últimas décadas, além das células cultivadas em monocamadas, esferoides tumorais tridimensionais têm sido desenvolvidos como uma ferramenta potencialmente poderosa para a avaliação de drogas antineoplásicas. No entanto, os métodos convencionais de cultura não têm a capacidade de manipular os esferoides tumorais de forma homogênea em nível tridimensional. Para abordar essa limitação, neste artigo, apresentamos um método conveniente e eficaz de construção de esferoides tumorais de tamanho médio. Adicionalmente, descrevemos um método de análise baseado em imagens usando software de análise baseado em inteligência artificial que pode escanear toda a placa e obter dados sobre esferoides tridimensionais. Vários parâmetros foram estudados. Usando um método padrão de construção esferoide tumoral e um sistema de imagem e análise de alto rendimento, a eficácia e a precisão dos testes de drogas realizados em esferoides tridimensionais podem ser dramaticamente aumentadas.
Introduction
O câncer é uma das doenças mais temidas pelo ser humano, principalmente por sua alta taxa demortalidade1. Nos últimos anos, a possibilidade de tratamento do câncer tem aumentado à medida que novas terapias têm sido introduzidas2,3,4,5. Modelos in vitro bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) são usados para estudar o câncer em laboratório. No entanto, os modelos 2D não podem avaliar imediata e precisamente todos os parâmetros importantes que indicam sensibilidade antitumoral; portanto, não conseguem representar completamente as interações in vivo nos testes de terapia medicamentosa6.
Desde 2020, o mercado global de cultura tridimensional (3D) foi muito impulsionado. De acordo com um relatório da NASDAQ OMX, o valor global do mercado de cultura de células 3D excederá US$ 2,7 bilhões até o final de 2025. Comparada aos métodos de cultivo 2D, a cultura de células 3D apresenta propriedades vantajosas, que podem ser otimizadas não só para proliferação e diferenciação, mas também para sobrevivência a longo prazo 7,8. Por esse meio, microambientes celulares in vivo podem ser simulados para obter uma caracterização tumoral mais precisa, bem como o perfil metabólico, para que as alterações genômicas e proteicas possam ser melhor compreendidas. Devido a isso, os sistemas de teste 3D devem agora ser incluídos nas principais operações de desenvolvimento de medicamentos, especialmente aqueles com foco na triagem e avaliação de novas drogas antitumorais. Crescimentos tridimensionais de linhagens celulares estabelecidas imortalizadas ou culturas de células primárias em estruturas esferoides possuem características in vivo de tumores, como hipóxia e penetração de drogas, bem como interação, resposta e resistência celular, e podem ser considerados um modelo rigoroso e representativo para a triagem in vitro de fármacos9,10,11.
No entanto, esses modelos de cultura 3D também sofrem de vários problemas que podem levar algum tempo para serem resolvidos. Os esferoides celulares podem ser formados usando esses protocolos, mas diferem em certos detalhes, como tempo de cultura ou gel de incorporação12, de modo que esses esferoides celulares construídos não podem ser bem controlados sob uma faixa de tamanho restrita. O tamanho dos esferoides pode influenciar a consistência do teste de viabilidade e da análise de imagem. Os microambientes de crescimento e os fatores de crescimento também variam, o que pode levar a diferentes morfologias devido a diferenças na diferenciação entre as células13. Existe agora uma necessidade óbvia de um método padrão, simples e custo-efetivo para a construção de todos os tipos de tumores com tamanhos controlados.
Em outra perspectiva, embora ensaios homogêneos e abordagens de imagem de alto conteúdo tenham sido desenvolvidos para avaliar morfologia, viabilidade e taxa de crescimento, a triagem em larga escala de modelos 3D permanece um desafio por várias razões relatadas na literatura, como a falta de uniformidade na posição, tamanho e morfologia dos esferoides tumorais14,15,16.
No protocolo aqui apresentado, listamos cada etapa da construção de esferoides tumorais 3D e descrevemos um método de observação e análise esferoide usando um sistema de imagem de alto rendimento e alto conteúdo que envolve foco automático, autoimagem e análise, entre outras características vantajosas. Mostramos como este método pode produzir esferoides tumorais 3D de tamanho uniforme que são adequados para imagens de alto rendimento. Esses esferoides também demonstram uma alta sensibilidade ao tratamento medicamentoso do câncer, e alterações morfológicas nos esferoides podem ser monitoradas usando imagens de alto conteúdo. Em resumo, demonstramos a robustez desta metodologia como meio de gerar construtos tumorais 3D para fins de avaliação de fármacos.
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Protocol
1. Construção esferoide
- Tratamento antiaderente da placa de cultura
- Pipetar 100 μL de reagente antiaderência em cada poço de uma placa de 48 poços com fundo de poço em forma de U e manter por 10 min. Após 10 min, aspirar o reagente de revestimento e lavar duas vezes com PBS esterilizado.
- Colocar a placa de cultura em estufa (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2) até à sua utilização.
- Preparação, coleta e contagem de células
- Utilizar o meio de cultura específico das células para cultura das células em frascos de cultura celular (Tabela Suplementar 2). Por exemplo, células NCI-H23, CT-26 são cultivadas em RPMI 1640, e células HT-29 são cultivadas em meio McCoy's 5A. Esses dois meios são suplementados com 10% de SFB inativado pelo calor e 1% de P/S, respectivamente.
- Manter todas as células em condições de cultura padrão (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2) durante a proliferação. Aqui, a linha celular NCI-H23 é usada como exemplo nas etapas a seguir.
- Lavar as células cultivadas em frasco T25 duas vezes com 1x PBS para remover o meio de cultura (é melhor escolher células na fase logarítmica e passar as células em uma confluência de 80%-90%).
- Tratar as células expandidas com 1 mL de tripsina/EDTA a 0,25% por 1-2 min em incubadora a 37 °C, 5% CO2. Confirme a forma da célula (normalmente circular neste caso) ao microscópio e, em seguida, pare o tratamento com tripsina. Para isso, aspirar a suspensão de tripsina/EDTA utilizada no frasco T25 e lavar as células com 4 mL de meio fresco.
- Transfira toda a suspensão (5 mL) para um tubo de 15 mL. Use 1 mL de meio fresco para lavar as células residuais e adicioná-lo ao tubo. Centrifugar as células a 186,48 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Retirar o sobrenadante e adicionar 10 ml de meio fresco ao pellet celular, seguido de pipetagem suave até que as células estejam em suspensão homogénea.
- Aspirar 0,1 mL de suspensão celular em um novo tubo de centrífuga, adicionar 0,9 mL de meio fresco e, em seguida, pipetar bem a suspensão.
- Extrair 10 μL da suspensão celular para contagem celular. Realize esse processo duas ou três vezes e pegue um valor médio.
- Diluir a suspensão até atingir uma densidade final de semeadura de 50.000 células/mL, de acordo com a concentração obtida do processo de contagem celular na etapa 1.2.7.
- Cultura celular e formação de esferoides
- Adicionar 200 μL da suspensão celular a cada poço de uma placa de fundo em U de 48 poços.
- Enrole a película de vedação em torno da placa e centrifugue-a a 119,35 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Retire cuidadosamente a placa da centrífuga e retire a película protetora. Em seguida, adicione 5-8 mL de água esterilizada no canal de água ao redor dos poços (para evitar evaporação) e incube a 37 °C por 5 dias. Não troque/suplemente nenhuma água do canal de água durante o período.
- Observe a agregação celular durante os 5 dias seguintes.
NOTA: Em geral, as células começam a se aglomerar como colônias dentro de 5 dias. No entanto, o processo de construção esferoide pode ser mais rápido ou mais lento com diferentes tipos celulares e densidades celulares. Devido a isso, as células devem ser observadas todos os dias usando um dos três métodos possíveis. Primeiro, as células podem ser observadas através do fundo da placa do poço. Quando as células ainda não formaram um esferoide, uma única camada de células pode ser vista na parte inferior. Quando as células formam um esferoide, uma construção 3D densa pode ser observada no fundo em U de cada poço. Outro método envolve a verificação das células sob um microscópio. Quando as células se tornam um esferoide tumoral, a construção envolve três camadas (uma camada proliferante, uma camada inativa e um núcleo necrótico, de fora para dentro do esferoide), que têm um gradiente de transparência. Finalmente, a cor do meio de cultura também pode ser usada para fins observacionais. Isso pode ser útil quando a estrutura de três camadas não pode ser claramente vista, mesmo usando um microscópio digital. Quando o meio passa de roxo-vermelho para amarelo, o processo de incorporação dos esferoides no gel pode começar. O meio não deve ser substituído durante o período de agregação celular.
- Incorporação de gel
NOTA: Os géis precisam ser armazenados a uma temperatura inferior a -20 °C. Em particular, os géis devem ser colocados longe da porta do frigorífico para evitar flutuações de temperatura. Observe que os géis estão em um estado congelado nesta fase do processo.- Retire o gel congelado da geladeira de -20 °C e coloque-o em uma caixa de gelo durante todo o tempo durante o experimento.
- Observe os esferoides celulares ao microscópio. Antes do início da incorporação do gel, o status dos esferoides deve ser novamente verificado com um microscópio digital.
- Retire cuidadosamente 150 μL do meio. A placa também deve ser colocada na caixa de gelo.
- Incorpore cada esferoide no gel adicionando o gel líquido lentamente do lado da parede do poço enquanto move a ponta da pipeta pré-resfriada ao redor e dentro do poço. Aguarde 5 min e, se o gel não se espalhar uniformemente, pipetar suavemente o gel com uma ponta de pipeta de 10 μL. Cada poço contém um esferoide tumoral, 25 μL de 3,5 mg/mL de gel e 50 μL de meio de cultura completo. Adicione 75 μL de meio aos controles também.
NOTA: Cada poço contém um esferoide. - Incubar a placa a 37 °C durante 30 minutos até que a hidrogelificação esteja totalmente concluída. Confirme o estado de gelificação ao microscópio.
- Sobrepor 125 μL do meio fresco em cada amostra.
- Cultivar os esferoides por mais 7-10 dias. Prepare grupos de esferoides com quatro a seis poços cada e escolha pelo menos três deles para análise.
NOTA: Se estiver realizando um teste de drogas, prepare dois grupos para uma amostra. Um grupo é usado para testes de viabilidade, enquanto o outro é usado para captura e análise de imagens.
2. Tratamento medicamentoso
- Dissolva a droga de acordo com as instruções do fabricante. Prepare soluções de trabalho 100x com DMSO. Prepare pelo menos cinco doses do medicamento em diluição seriada. Aqui, o medicamento terapêutico para câncer de pulmão, AMG 510, é usado como exemplo. A composição é mostrada na Tabela Suplementar 1.
- Utilizar DMSO 0,1% como controle positivo.
- Adicionar 125 μL de meio tratado com droga a cada poço e colocar a placa de volta na incubadora (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2). Nesta fase, cada poço contém um esferoide tumoral, 25 μL de 3,5 mg/mL de gel e 175 μL do meio. Os controles contêm 200 μL do meio.
3. Viabilidade esferoide
- Meça a viabilidade do esferoide usando um kit de ensaio Alamar Blue de acordo com as diretrizes do fabricante. Medir a viabilidade utilizando um fotômetro de microplacas (absorbância a 570 nm e 600 nm) após o tratamento com Alamar Blue.
- Medir a viabilidade no dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10 após a incorporação dos esferoides no gel, respectivamente, ou conforme indicado.
NOTA: Ao usar um ensaio Alamar Blue, pelo menos 16 h de tempo de reação é necessário. Portanto, adicione 20 μL de Alamar Blue nas tardes do dia 0, dia 3, dia 6 e dia 9. - Aspirar 100 μL do meio sobrenadante de cada poço para uma nova placa de ensaio e adicionar 80 μL de meio fresco a cada poço da placa de cultura. Em seguida, substitua mais 100 μL do meio tratado com a droga. Certifique-se de que não há restos de Alamar Blue no poço.
NOTA: A substituição do meio é realizada em cada ocasião em que a viabilidade é testada, e o meio tratado com medicamentos dos grupos de análise de imagem precisa ser substituído no mesmo dia.
4. Observação esferoide e análise de aprendizagem profunda através de imagens no teste de drogas
- Imagiologia
- Aspirar 100 μL do meio para fora antes da aquisição de imagens.
- Coloque o prato no palco. Obter imagens digitais dos esferoides usando um microscópio automatizado com objetiva de 10x (objetiva de 2x primeiro). O microscópio pode focar e centralizar esses esferoides automaticamente.
NOTA: A função de foco automático e o algoritmo utilizado foram previamente relatados por Yazdanfar et al.17. - Aguarde a imagem automática. São adquiridas quatro imagens para cada esferoide. Uma imagem integrada é formada e processada com o software conectado ao sistema de imagem de alto conteúdo.
- Clique no botão "Processo de correção de imagem" e escolha as imagens integradas no software.
- Escolha "U-NET model" e digite a taxa de conversão (10x imagens objetivas têm uma taxa de conversão de 3,966). Clique na parte inferior da tela abaixo, para iniciar o processamento da imagem. Em seguida, salve os dados de diâmetro, perímetro e rugosidade no software de planilha.
- Calcule o índice de perímetro excedente (EPI). O EPI é a razão entre o perímetro esferoide (P 0) e o perímetro equivalente (Pe), calculado pela Eq. 1. Medir a área do esferoide no plano focal (S) usando a Imagem J. Em seguida, calcule o perímetro equivalente do esferoide usando a Eq. 2.
EPI = (P o− P e)/Pe (Eq. 1)
(Eq. 2)
NOTA: O perímetro esferoide é gerado pelo software com algoritmos de aprendizagem profunda baseados no modelo U-NET desenvolvido. - Adicionar 100 μL de meio fresco com o fármaco e colocar a placa de volta na incubadora (37 °C em ar umidificado com 5% de CO2).
- Inibição esferoide
- Calcular a inibição do crescimento tumoral (TGI) usando a Eq. 3. O volume esferoide relativo (RTV) é o volume terminal sobre o volume original (Eq. 4). O volume esferoide (V) é calculado automaticamente pelo software usando a Eq. 5 de acordo com a saída do diâmetro esferoide.
TGI = (controle RTV −tratamento RTV)/controle RTV × 100% (Eq. 3)
RTV =V terminal/Voriginal (Eq. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (Eq. 5)
NOTA: O TGI é obtido com referência à inibição do crescimento in vivo , e os pesos do tumor são substituídos por RTV. O controle do RTV é o volume esferoide relativo do grupo controle, otratamento do RTV é o volume esferoide relativo do grupo do fármaco testado, o Vterminal é o volume do esferoide no último dia, o Voriginal é o volume do esferoide no primeiro dia de cultura e o d representa o diâmetro do esferoide.
- Calcular a inibição do crescimento tumoral (TGI) usando a Eq. 3. O volume esferoide relativo (RTV) é o volume terminal sobre o volume original (Eq. 4). O volume esferoide (V) é calculado automaticamente pelo software usando a Eq. 5 de acordo com a saída do diâmetro esferoide.
(Eq. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 1A,B mostra o processo de construção dos esferoides tumorais neste estudo. Primeiro semeamos as células em uma placa de fundo em U de 48 poços. Esta etapa é quase a mesma usada em cultura de células 2D. Mantivemos a placa em uma incubadora comum com água ao redor dos poços para que as células depositadas começassem a formar esferoides em um processo de auto-montagem. Em condições operacionais normais, a maioria dos tipos de esferoides tumorais foi completamente formada após 5 dias, quando um meio alvo foi usado (Tabela Suplementar 2). Verificamos o estado de construção esferoide em 5 dias com um microscópio digital (Figura 1D). Após o término do processo de crescimento, foi adicionado gel para envolver os esferoides individuais em cada poço, produzindo uma matriz extracelular (MEC) in vivo para cada esferoide. Em seguida, foi realizado o teste de drogas. Como utilizamos um sistema de imagem de alto conteúdo com software de análise de aprendizado profundo (Figura 1C), pudemos observar claramente o crescimento esferoide individual (Figura 1E) e obter valores para parâmetros adequados para determinar características durante a terapia medicamentosa, incluindo viabilidade, diâmetro e rugosidade.
Figura 1: Formação esferoide tumoral e exames e análises automatizados de imagem. (A) Esquema mostrando o procedimento padrão de cultura esferoide tumoral com a linha do tempo abaixo. (B) Esquema de testes de tratamento medicamentoso utilizando esferoides tumorais mostrando diferentes níveis de invasividade em matrizes 3D. (C) Imagem de um sistema baseado em aprendizado profundo para imagens e análises automatizadas mostrando detalhes a seguir: plataforma de placas; condensador com fonte de luz; estágio motorizado x, y; módulo motorizado eixo z; roda objetiva; roda filtrante; CCD; e computador com o software do sistema desenvolvido. (D) A formação de esferoides tumorais NCI-H23 a partir de células monocamadas observadas a partir da ocular de um microscópio. A barra de escala representa 500 μm. (E) Variação na invasividade e tamanho dos esferoides NCI-H23 sem tratamento medicamentoso ao longo de 10 dias. As barras de escala representam 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Neste estudo, usamos a droga antitumoral AMG510 para testar seu efeito no tratamento do câncer de pulmão de células não pequenas. O sistema de análise forneceu dados de imagem sem processamento complexo de imagens. As imagens de campo claro na Figura 2 mostram que o crescimento dos esferoides NCI-H23 pode ser inibido pelo AMG510. Isso foi indicado pela diminuição do tamanho juntamente com o aumento da concentração. Em contraste, o tamanho aumentou no grupo controle por 10 dias. Nesse período, a rugosidade do lado da borda, indicando invasividade, também mudou. Os esferoides exibiram bordas planas no dia 1, mas bordas ásperas no dia 10. No entanto, deve-se notar que comparar a rugosidade através de imagens de campo brilhante por si só é uma tarefa desafiadora. Deve-se mencionar também que o método padrão envolve esferoides de tamanho médio apropriado. Finalmente, notamos que um fundo limpo foi obtido usando este método, pois poucas células aderiram ao fundo.
Figura 2: Imagens de campo claro de esferoides celulares NCI-H23 tratados com diferentes concentrações de AMG510 capturadas automaticamente por um microscópio de alto conteúdo. As colunas representam dias diferentes, e as linhas representam diferentes concentrações de drogas. Os resultados incluem três esferoides para cada condição. Todas as imagens foram focalizadas automaticamente em aumento de 2x e, em seguida, capturadas em aumento de 10x pelo sistema de imagem de alto conteúdo usando software baseado em inteligência artificial e um controlador de microambiente associado ao microscópio. As barras de escala representam 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Os resultados de viabilidade celular, mostrados na Figura 3A, demonstraram viabilidade reduzida nas culturas de 10 dias das amostras tratadas com drogas em todos os níveis de dosagem quando comparadas ao controle. Amostras com concentrações acima de 0,01 μM exibiram uma rápida diminuição na viabilidade de células tumorais, indicando a sensibilidade da terapia AMG510 ao câncer de pulmão de células não pequenas. No 10º dia, essas amostras apresentaram níveis semelhantes de viabilidade final, com valores abaixo de 70%, como mostra a Figura 3B.
Figura 3: Viabilidade esferoide tumoral dos grupos amostrais tratados com AMG510. Os medicamentos foram adicionados no dia 1. (A) A viabilidade esferoide tumoral foi medida no dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10. (B) Viabilidade celular terminal das amostras com gradientes de concentração. As concentrações dos fármacos utilizados para o tratamento de cada esferoide tumoral foram fixadas de 0,001 μM a 5 μM. Todos os dados são apresentados como média ± EPM (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 4A revela tendência semelhante em relação à análise do diâmetro esferoide. Amostras com concentrações acima de 0,01 μM exibiram uma óbvia redução no diâmetro médio. Uniformidade no tamanho do esferoide também pôde ser observada no primeiro dia de tratamento medicamentoso, com valores em torno de 800 μm. As razões diamétricas desses esferoides (Figura 4B) indicaram contração durante o co-cultivo AMG510 de forma visivelmente mais óbvia do que o teste de viabilidade. Além disso, calculamos os valores de inibição do crescimento tumoral esferoide em termos de seus diâmetros, como mostrado na Figura 4C. O valor de TGI é um parâmetro de avaliação relativa, e os valores podem indicar diminuição do crescimento como resultado das diferenças de semeadura originais entre os esferoides; no entanto, obtivemos novamente o resultado de que concentrações acima de 0,01 μM tiveram um efeito óbvio no sucesso do tratamento com AMG510. Em um estudo anterior, experimentamos o valor de IC50, que é um índice significativo para testes de drogas; no entanto, observamos que os esferoides NCI-H23 sob tratamento AMG510 não exibiram alterações neste parâmetro.
Figura 4: Tamanho do tumor representado pelos diâmetros esferoides nos grupos de amostra controle e AMG510. (A) Os diâmetros esferoides tumorais foram medidos no dia 1, dia 4, dia 7 e dia 10. (B) A razão de crescimento esferoide foi definida como o volume terminal em relação ao volume original e calculada usando os diâmetros esferoides. (C) A razão de inibição do crescimento esferoide foi definida em relação ao volume e calculada usando os diâmetros esferoides. As concentrações de AMG510 usadas para tratar cada esferoide tumoral foram ajustadas de 0,001 μM a 5 μM. Todos os dados são apresentados como média ± EPM (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Em seguida, realizamos uma nova avaliação da invasividade dos esferoides em termos dos valores de rugosidade produzidos como saída pelo software (Figura 5A) e também do índice de excesso de perímetro baseado nos limites esferoides, produzidos pelos mesmos meios (Figura 5B). Quanto maior rugosidade, mais células estão migrando do esferoide para o gel, o que, portanto, representa maior invasividade. Os resultados dos controles foram comparados com diferentes níveis de concentração da droga. Para NCI-H23, uma linhagem celular invasiva, os valores de rugosidade esferoide e EPI aumentaram com o tempo de cultura sem qualquer tratamento medicamentoso18, e isso pôde ser comprovado pelas imagens de campo claro e aumentos de diâmetro nas amostras controle. No entanto, o crescimento foi atenuado pelo tratamento AMG510, totalmente proporcional às variações de tamanho.
Figura 5: Reconhecimento do limite tumoral nos grupos de controle não tratado e AMG510 tratado. Os medicamentos foram adicionados no dia 1. (A) A rugosidade tumoral foi medida pelo software nos dias 1, 4, 7 e 10, indicando a invasividade dos esferoides tumorais. (B) O perímetro esferoide foi localizado e desenhado pelo software utilizando algoritmos de aprendizagem profunda. As áreas esferoides no plano focal foram então medidas pela Imagem J, e um índice de excesso de perímetro foi calculado com base nesses dados. As concentrações de AMG510 usadas para tratar cada esferoide tumoral foram ajustadas de 0,001 μM a 5 μM. Todos os dados são apresentados como média ± EPM (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela suplementar 1: A composição da placa. A droga anti-tumor de pulmão AMG510 foi utilizada no experimento, e os grupos foram definidos de acordo com os gradientes da droga. Foram utilizadas duas placas: uma para o teste do kit ensaio de viabilidade e outra para a análise das imagens.
Tabela suplementar 2: Linhagens celulares que têm sido usadas na construção de tumores 3D e testes de drogas. Clique aqui para fazer o download destas Tabelas.
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Discussion
O microambiente desempenha um papel importante no crescimento tumoral. Pode afetar o fornecimento de matrizes extracelulares, gradientes de oxigênio, nutrição e interação mecânica e, assim, afetar a expressão gênica, as vias de sinal e várias funções das células tumorais19,20,21. Em muitos casos, as células 2D não produzem tais efeitos ou mesmo produzem efeitos opostos, afetando a avaliação dos tratamentos medicamentosos. No entanto, o surgimento de modelos 3D abordou esse problema. Por exemplo, nossa avaliação do efeito do AMG510 em um sistema de tratamento de câncer de pulmão foi concluída usando métodos 3D. Construímos um modelo 3D tumor-esferóide-ECM (TSE) criando esferoides tumorais embutidos em um gel para monitorar o tratamento AMG510 em uma linhagem celular invasiva relacionada ao pulmão. AMG510 é um novo inibidor que tem como alvo o mutante G12C KRAS22, e sua eficácia foi confirmada por nossa descoberta de que o câncer de pulmão de células não pequenas (CPNPC) experimentado por alguns pacientes que respondem a este mutante. A partir de nossa série de dados experimentais e análises, alguns dados muito valiosos podem ser discernidos. A sensibilidade ao AMG510 foi significativamente aumentada sob uma condição esferoide 3D, em comparação com a condição 2D, e melhorou ainda mais dentro de uma condição de hipóxia.
Os modelos construídos através do presente método oferecem diversas vantagens. Em primeiro lugar, como um modelo 3D, ele pode simular bem o tumor e a matriz extracelular. O método simples, mas eficaz, de construir esferoides tumorais 3D permite que as células sobrevivam por um período de 2 semanas. Após os 5 dias de construção do esferoide, um período de cerca de 10 dias está disponível, o que é suficiente para realizar qualquer teste de drogas. Além disso, o método de produção de cultura de células 3D é quase o mesmo que o método 2D, e seu custo é muito menor do que o da bioimpressão 3D. Em comparação com outros métodos, como o método hanging-drop, o método descrito aqui ajuda a produzir esferoides mais uniformes, e o tamanho da célula é totalmente controlado pelo tipo e densidade de células. Finalmente, este modelo tem se mostrado aplicável a vários tipos de células cancerosas, e essa flexibilidade pode ser de valor especialmente alto. No futuro, pesquisadores engajados na formação de esferoides tumorais poderão adicionar não apenas fibroblastos e células endoteliais às suas suspensões de células tumorais, mas também células imunes, como células T e células NK, para promover a migração de células estromais e potencializar os efeitos imunoterapêuticos de novas drogas23,24.
Nas últimas décadas, poucos relatos têm se concentrado em descrever as técnicas e ferramentas atualmente disponíveis para extrair dados biológicos significativos de modelos 3D25. Essas informações podem ser consideradas fundamentais para o teste de fármacos e a descoberta terapêutica utilizando modelos de cultura de células3D26. O estudo de Zanoni e colaboradores descreveu um novo software de código aberto que realiza análise automática de imagens de colônias tumorais 3D. Os autores mostraram que parâmetros morfológicos influenciaram a resposta de grandes esferoides ao tratamento medicamentoso e que o tamanho e a forma dos esferoides podem ser fontes de variabilidade27. No entanto, com esferoides tumorais cultivados em gel 3D, que mimetizam MECs in vivo, o comportamento celular é muito mais complexo, e a invasividade pode ser exibida. Embora os dados se preocupem apenas com tamanho e forma, tais limitações permanecerão. Muitos parâmetros confiáveis e diversificados podem ser obtidos usando um sistema de imagem de alto conteúdo. Tais sistemas podem não apenas determinar a viabilidade celular e a forma esferoide, mas também detectar e verificar as características dos tumores e o efeito inibidor de drogas sobre os tumores. A invasividade também pode ser determinada por esses meios. Por exemplo, um tumor invasivo pode ter um valor de rugosidade relativamente maior, enquanto um tumor não invasivo pode ter um valor de EPI mais alto. Alterações nesses valores podem indicar diferentes efeitos da droga. No futuro, esperamos combinar essas técnicas com chips microfluídicos para obter estratégias mais convenientes e eficazes.
O método padronizado aqui descrito pode atender aos requisitos da maioria dos testes de triagem e avaliação de medicamentos. No entanto, ainda existem alguns problemas que podem ocorrer durante experimentos futuros. Por exemplo, as células podem aderir às paredes internas dos poços após a centrifugação, ou o meio de cultura pode não ser adequado. Além disso, o gel utilizado no protocolo, assim como o amplamente utilizado Matrigel, pode facilmente ser gemido durante o longo processo. No entanto, a maioria desses problemas pode ser resolvida através de técnicas padrão de operação e otimização. Há outras limitações possíveis nesse método. Devido à estrutura esferoide, nutrientes, oxigênio e difusão de resíduos através do esferoide são influenciados pelo tamanho. A viabilidade das células no núcleo esferoide pode ser comprometida quando o diâmetro esferoide é superior a 1.000 μm. Por outro lado, torna-se difícil observar a invasão quando o diâmetro está abaixo de 400 μm.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a todos os membros de nossos laboratórios por suas contribuições críticas e sugestões. Esta pesquisa foi apoiada pelo Projeto Chave da Comissão de Saúde de Jiangsu (K2019030). A conceituação foi conduzida por C.W. e Z.C., a metodologia foi realizada por W.H. e M.L., a investigação foi realizada por W.H. e M.L., a curadoria dos dados foi realizada por W.H., Z.Z., S.X. e M.L., a elaboração do rascunho original foi realizada por Z.Z., J.Z., S.X., W.H., e X.L., a revisão e edição foi realizada por Z.C., a administração do projeto foi realizada por C.W. e Z.C., e a aquisição de financiamento foi conduzida por C.W. Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
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