Summary
Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la costruzione di sferoidi tumorali tridimensionali. Viene inoltre descritta una strategia per l'osservazione degli sferoidi e l'analisi di apprendimento profondo basata su immagini utilizzando un sistema di imaging automatizzato.
Abstract
Negli ultimi decenni, oltre alle cellule coltivate monostrato, gli sferoidi tumorali tridimensionali sono stati sviluppati come uno strumento potenzialmente potente per la valutazione dei farmaci antitumorali. Tuttavia, i metodi di coltura convenzionali non hanno la capacità di manipolare gli sferoidi tumorali in modo omogeneo a livello tridimensionale. Per affrontare questa limitazione, in questo articolo, presentiamo un metodo conveniente ed efficace per costruire sferoidi tumorali di medie dimensioni. Inoltre, descriviamo un metodo di analisi basato su immagini utilizzando un software di analisi basato sull'intelligenza artificiale in grado di scansionare l'intera lastra e ottenere dati sugli sferoidi tridimensionali. Sono stati studiati diversi parametri. Utilizzando un metodo standard di costruzione sferoidale tumorale e un sistema di imaging e analisi ad alto rendimento, l'efficacia e l'accuratezza dei test farmacologici eseguiti su sferoidi tridimensionali possono essere notevolmente aumentate.
Introduction
Il cancro è una delle malattie più temute dagli esseri umani, anche a causa del suo alto tasso di mortalità1. Negli ultimi anni, la possibilità di curare il cancro è aumentata con l'introduzione di nuove terapie 2,3,4,5. I modelli in vitro bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) vengono utilizzati per studiare il cancro in un ambiente di laboratorio. Tuttavia, i modelli 2D non possono valutare immediatamente e accuratamente tutti i parametri importanti che indicano la sensibilità antitumorale; pertanto, non riescono a rappresentare pienamente le interazioni in vivo nei test di terapia farmacologica6.
Dal 2020, il mercato globale della cultura tridimensionale (3D) è stato notevolmente potenziato. Secondo un rapporto del NASDAQ OMX, il valore globale del mercato delle colture cellulari 3D supererà i 2,7 miliardi di dollari entro la fine del 2025. Rispetto ai metodi di coltura 2D, la coltura cellulare 3D presenta proprietà vantaggiose, che possono essere ottimizzate non solo per la proliferazione e la differenziazione, ma anche per la sopravvivenza a lungo termine 7,8. In questo modo, i microambienti cellulari in vivo possono essere simulati per ottenere una caratterizzazione più accurata del tumore, nonché un profilo metabolico, in modo che le alterazioni genomiche e proteiche possano essere meglio comprese. A causa di ciò, i sistemi di test 3D dovrebbero ora essere inclusi nelle operazioni di sviluppo di farmaci tradizionali, in particolare quelli con particolare attenzione allo screening e alla valutazione di nuovi farmaci antitumorali. Le crescite tridimensionali di linee cellulari consolidate immortalizzate o colture cellulari primarie in strutture sferoidi possiedono caratteristiche in vivo di tumori come ipossia e penetrazione di farmaci, nonché interazione, risposta e resistenza cellulare, e possono essere considerate un modello rigoroso e rappresentativo per eseguire lo screening farmacologico in vitro 9,10,11.
Tuttavia, questi modelli di cultura 3D soffrono anche di diversi problemi che potrebbero richiedere del tempo per essere risolti. Gli sferoidi cellulari possono essere formati utilizzando questi protocolli, ma differiscono in alcuni dettagli, come il tempo di coltura o l'incorporazione di gel12, quindi questi sferoidi cellulari costruiti non possono essere ben controllati in un intervallo di dimensioni limitato. La dimensione degli sferoidi può influenzare la coerenza del test di vitalità e dell'analisi di imaging. Anche i microambienti di crescita e i fattori di crescita variano, il che può portare a morfologie diverse a causa delle differenze nella differenziazione tra le cellule13. Ora c'è un'ovvia necessità di un metodo standard, semplice ed economico per la costruzione di tutti i tipi di tumori con dimensioni controllate.
Da un'altra prospettiva, sebbene siano stati sviluppati saggi omogenei e approcci di imaging ad alto contenuto per valutare morfologia, vitalità e tasso di crescita, lo screening ad alto rendimento dei modelli 3D rimane una sfida per vari motivi riportati in letteratura, come la mancanza di uniformità nella posizione, dimensione e morfologia degli sferoidi tumorali14,15,16.
Nel protocollo qui presentato, elenchiamo ogni fase nella costruzione di sferoidi tumorali 3D e descriviamo un metodo per l'osservazione e l'analisi sferoidale utilizzando un sistema di imaging ad alto rendimento e ad alto contenuto che coinvolge auto-focus, auto-imaging e analisi, tra le altre caratteristiche vantaggiose. Mostriamo come questo metodo può produrre sferoidi tumorali 3D di dimensioni uniformi che sono adatti per l'imaging ad alto rendimento. Questi sferoidi dimostrano anche un'elevata sensibilità al trattamento farmacologico del cancro e i cambiamenti morfologici negli sferoidi possono essere monitorati utilizzando l'imaging ad alto contenuto. In sintesi, dimostriamo la robustezza di questa metodologia come mezzo per generare costrutti tumorali 3D per scopi di valutazione dei farmaci.
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Protocol
1. Costruzione sferoidale
- Trattamento antiadesione della piastra di coltura
- Pipettare 100 μL di reagente anti-adesione in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con un fondo a forma di U e conservare per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aspirare il reagente di rivestimento e lavare due volte con PBS sterilizzato.
- Mettere la piastra di coltura in un incubatore (37 °C in aria umidificata con 5% di CO2) fino all'uso.
- Preparazione, raccolta e conteggio delle cellule
- Utilizzare il terreno di coltura specifico delle cellule per la coltura delle cellule in palloni di coltura cellulare (tabella supplementare 2). Ad esempio, le cellule NCI-H23, CT-26 sono coltivate in RPMI 1640 e le cellule HT-29 sono coltivate nel mezzo 5A di McCoy. Questi due fluidi sono integrati con il 10% di FBS inattivato dal calore e l'1% di P/S, rispettivamente.
- Mantenere tutte le cellule in condizioni di coltura standard (37 °C in aria umidificata con 5% di CO2) durante la proliferazione. Qui, la linea cellulare NCI-H23 viene utilizzata come esempio nei seguenti passaggi.
- Lavare le cellule coltivate in un pallone T25 due volte con 1x PBS per rimuovere il terreno di coltura (è meglio scegliere le cellule nella fase logaritmica e far passare le cellule a una confluenza dell'80% -90%).
- Trattare le cellule espanse con 1 mL di tripsina/EDTA allo 0,25% per 1-2 minuti in un incubatore a 37 °C, 5% CO2. Confermare la forma della cellula (normalmente circolare in questo caso) al microscopio, quindi interrompere il trattamento con tripsina. Per fare ciò, aspirare la sospensione di tripsina/EDTA usata nel pallone T25 e lavare le celle con 4 ml di terreno fresco.
- Trasferire tutta la sospensione (5 ml) in un tubo da 15 ml. Utilizzare 1 ml di terreno fresco per lavare le cellule residue e aggiungerlo al tubo. Centrifugare le celle a 186,48 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 ml di terreno fresco al pellet cellulare, seguito da un delicato pipettaggio fino a quando le cellule sono in una sospensione omogenea.
- Aspirare 0,1 mL di sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga, aggiungere 0,9 mL di mezzo fresco, quindi pipettare bene la sospensione.
- Estrarre 10 μL della sospensione cellulare per il conteggio delle cellule. Esegui questo processo due o tre volte e prendi un valore medio.
- Diluire la sospensione per raggiungere una densità finale di semina di 50.000 cellule/ml, secondo la concentrazione ottenuta dal processo di conteggio delle cellule nella fase 1.2.7.
- Coltura cellulare e formazione di sferoidi
- Aggiungere 200 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra inferiore a U a 48 pozzetti.
- Avvolgere la pellicola sigillante attorno alla piastra e centrifugarla a 119,35 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Estrarre con cautela la piastra dalla centrifuga e rimuovere la pellicola protettiva. Quindi, aggiungere 5-8 ml di acqua sterilizzata nel canale d'acqua che circonda i pozzetti (per evitare l'evaporazione) e incubare a 37 ° C per 5 giorni. Non cambiare/integrare l'acqua nel canale dell'acqua durante il periodo.
- Osservare l'aggregazione cellulare durante i seguenti 5 giorni.
NOTA: In generale, le cellule iniziano ad aggregarsi come colonie entro 5 giorni. Tuttavia, il processo di costruzione sferoidale può essere più veloce o più lento con diversi tipi di cellule e densità cellulari. A causa di ciò, le cellule devono essere osservate ogni giorno utilizzando uno dei tre metodi possibili. In primo luogo, le cellule possono essere osservate attraverso il fondo della piastra del pozzo. Quando le cellule non hanno ancora formato uno sferoide, un singolo strato di cellule può essere visto sul fondo. Quando le cellule formano uno sferoide, un denso costrutto 3D può essere osservato sul fondo a U di ciascun pozzetto. Un altro metodo prevede il controllo delle cellule al microscopio. Quando le cellule diventano uno sferoide tumorale, la costruzione coinvolge tre strati (uno strato proliferante, uno strato inattivo e un nucleo necrotico, dall'esterno all'interno dello sferoide), che hanno un gradiente di trasparenza. Infine, il colore del terreno di coltura può essere utilizzato anche per scopi osservativi. Questo può essere utile quando la struttura a tre strati non può essere vista chiaramente, anche usando un microscopio digitale. Quando il mezzo passa dal rosso porpora al giallo, può iniziare il processo di incorporazione degli sferoidi nel gel. Il mezzo non deve essere sostituito durante il periodo di aggregazione cellulare.
- Incorporazione di gel
NOTA: I gel devono essere conservati a una temperatura inferiore a -20 °C. In particolare, i gel devono essere posizionati lontano dallo sportello del frigorifero per evitare fluttuazioni di temperatura. Si noti che i gel sono in uno stato congelato in questa fase del processo.- Prelevare il gel congelato dal frigorifero a -20 °C e metterlo su una ghiacciaia per tutto il tempo durante l'esperimento.
- Osservare gli sferoidi cellulari al microscopio. Prima che inizi l'incorporazione del gel, lo stato degli sferoidi deve essere nuovamente controllato con un microscopio digitale.
- Rimuovere con cautela 150 μL del mezzo. La piastra dovrebbe anche essere posizionata sulla ghiacciaia.
- Incorporare ogni sferoide nel gel aggiungendo lentamente il gel liquido dal lato della parete del pozzetto mentre si sposta la punta della pipetta pre-raffreddata intorno e all'interno del pozzetto. Attendere 5 minuti e se il gel non si diffonde uniformemente, pipettare delicatamente il gel con una punta da 10 μL. Ogni pozzetto contiene uno sferoide tumorale, 25 μL di gel da 3,5 mg/ml e 50 μL di terreno di coltura completo. Aggiungere anche 75 μL di fluido ai controlli.
NOTA: Ogni pozzetto contiene uno sferoide. - Incubare la piastra a 37 °C per 30 minuti fino al completamento dell'idrogelazione. Confermare lo stato di gelificazione al microscopio.
- Sovrapporre 125 μL di terreno fresco su ciascun campione.
- Coltiva gli sferoidi per altri 7-10 giorni. Preparare gruppi di sferoidi con quattro o sei pozzetti ciascuno e sceglierne almeno tre per l'analisi.
NOTA: se si esegue un test antidroga, preparare due gruppi per un campione. Un gruppo viene utilizzato per i test di fattibilità, mentre l'altro viene utilizzato per l'acquisizione e l'analisi delle immagini.
2. Trattamento farmacologico
- Sciogliere il farmaco secondo le istruzioni del produttore. Prepara soluzioni di lavoro 100x con DMSO. Preparare almeno cinque dosi del farmaco in diluizione seriale. Qui, il farmaco terapeutico per il cancro del polmone, AMG 510, viene utilizzato come esempio. La composizione è riportata nella tabella supplementare 1.
- Utilizzare lo 0,1% di DMSO come controllo positivo.
- Aggiungere 125 μL di mezzo trattato con farmaco a ciascun pozzetto e riposizionare la piastra nell'incubatore (37 °C in aria umidificata con 5% di CO2). In questa fase, ogni pozzetto contiene uno sferoide tumorale, 25 μL di gel da 3,5 mg / ml e 175 μL del mezzo. I controlli contengono 200 μL del mezzo.
3. Vitalità sferoidale
- Misurare la vitalità dello sferoide utilizzando un kit di analisi Alamar Blue secondo le linee guida del produttore. Misurare la vitalità utilizzando un fotometro a micropiastre (assorbanza a 570 nm e 600 nm) dopo il trattamento Alamar Blue.
- Misurare la vitalità al giorno 1, giorno 4, giorno 7 e giorno 10 dopo aver incorporato gli sferoidi nel gel, rispettivamente, o come indicato.
NOTA: Quando si utilizza un test Alamar Blue, sono necessarie almeno 16 ore di tempo di reazione. Pertanto, aggiungere 20 μL di Alamar Blue nei pomeriggi del giorno 0, del giorno 3, del giorno 6 e del giorno 9. - Aspirare 100 μL del mezzo surnatante da ciascun pozzetto ad una nuova piastra di prova e aggiungere 80 μL di terreno fresco a ciascun pozzetto della piastra di coltura. Quindi, sostituire altri 100 μL del mezzo trattato con farmaco. Assicurati che non ci siano resti di Alamar Blue nel pozzo.
NOTA: la sostituzione del terreno viene effettuata ogni volta che viene testata la vitalità e il mezzo trattato con farmaco dei gruppi di analisi di imaging deve essere sostituito lo stesso giorno.
4. Osservazione sferoidale e analisi di deep learning attraverso immagini nel test antidroga
- Imaging
- Aspirare 100 μL del mezzo prima dell'imaging.
- Posiziona il piatto sul palco. Ottieni immagini digitali degli sferoidi utilizzando un microscopio automatico con un obiettivo 10x (obiettivo 2x prima). Il microscopio può focalizzare e centralizzare automaticamente questi sferoidi.
NOTA: La funzione di messa a fuoco automatica e l'algoritmo utilizzato sono stati precedentemente riportati da Yazdanfar et al.17. - Attendere l'imaging automatico. Per ogni sferoide vengono acquisite quattro immagini. Un'immagine integrata viene formata ed elaborata con il software collegato al sistema di imaging ad alto contenuto.
- Fare clic sul pulsante "Image patch process" e scegliere le immagini integrate nel software.
- Scegli "modello U-NET" e digita il tasso di conversione (le immagini obiettivo 10x hanno un tasso di conversione di 3,966). Fare clic nella parte inferiore dello schermo sottostante, per avviare l'elaborazione delle immagini. Quindi, salvare i dati relativi al diametro, al perimetro e alla rugosità nel software del foglio di calcolo.
- Calcolare l'indice perimetrale in eccesso (EPI). L'EPI è il rapporto tra il perimetro sferoidale (P 0) e il perimetro equivalente (Pe), calcolato dall'Eq. 1. Misurare l'area dello sferoide sul piano focale (S) utilizzando l'immagine J. Quindi, calcola il perimetro equivalente dello sferoide usando Eq. 2.
EPI = (P o− P e)/Pe (Eq. 1)
(Eq. 2)
NOTA: Il perimetro sferoidale è generato dal software con algoritmi di deep learning basati sul modello U-NET sviluppato. - Aggiungere 100 μL di terreno fresco con il farmaco e riporre la piastra nell'incubatore (37 °C in aria umidificata con 5% di CO2).
- Inibizione sferoidale
- Calcolare l'inibizione della crescita tumorale (TGI) utilizzando l'Eq. 3. Il volume sferoide relativo (RTV) è il volume terminale sul volume originale (Eq. 4). Il volume sferoidale (V) viene calcolato automaticamente dal software utilizzando Eq. 5 in base all'uscita del diametro sferoide.
TGI = (controllo RTV−trattamento RTV)/controllo RTV × 100% (Eq. 3)
RTV = Vterminale/Voriginale (Eq. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (Eq. 5)
NOTA: Il TGI si ottiene con riferimento all'inibizione della crescita in vivo , e i pesi tumorali sono sostituiti con RTV. Il controllo RTV è il volume sferoide relativo del gruppo dicontrollo , iltrattamento RTV è il volume sferoide relativo del gruppo sottoposto a test farmacologici, Vterminale è il volume dello sferoide l'ultimo giorno, Voriginale è il volume dello sferoide il primo giorno di coltura e d rappresenta il diametro sferoide.
- Calcolare l'inibizione della crescita tumorale (TGI) utilizzando l'Eq. 3. Il volume sferoide relativo (RTV) è il volume terminale sul volume originale (Eq. 4). Il volume sferoidale (V) viene calcolato automaticamente dal software utilizzando Eq. 5 in base all'uscita del diametro sferoide.
(Eq. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1A,B mostra il processo utilizzato per la costruzione di sferoidi tumorali in questo studio. Per prima cosa abbiamo seminato le cellule in una piastra inferiore a U a 48 pozzetti. Questo passaggio è quasi lo stesso di quello utilizzato nella coltura cellulare 2D. Abbiamo tenuto la piastra in un incubatore comune con acqua che circonda i pozzi in modo che le cellule depositate iniziassero a formare sferoidi in un processo di auto-assemblaggio. In condizioni operative normali, la maggior parte dei tipi di sferoidi tumorali si sono completamente formati dopo 5 giorni quando è stato utilizzato un mezzo mirato (Tabella supplementare 2). Abbiamo controllato lo stato della costruzione sferoidale entro 5 giorni con un microscopio digitale (Figura 1D). Dopo che il processo di crescita è stato completato, è stato aggiunto gel per avvolgere i singoli sferoidi in ciascun pozzetto, producendo una matrice extracellulare in vivo (ECM) per ogni sferoide. Sono stati quindi effettuati test antidroga. Poiché abbiamo utilizzato un sistema di imaging ad alto contenuto con software di analisi di deep learning (Figura 1C), abbiamo potuto osservare chiaramente la crescita dei singoli sferoidi (Figura 1E) e ottenere valori per parametri adatti per determinare le caratteristiche durante la terapia farmacologica, tra cui vitalità, diametro e rugosità.
Figura 1: Formazione di sferoidi tumorali e imaging e analisi automatizzati . (A) Schema che mostra la procedura standard di coltura di sferoidi tumorali con la seguente cronologia. (B) Schema dei test di trattamento farmacologico utilizzando sferoidi tumorali che mostrano diversi livelli di invasività in matrici 3D. (C) Immagine di un sistema correlato ad algoritmi basati sull'apprendimento approfondito per l'imaging e l'analisi automatizzati che mostra i dettagli come segue: piattaforma di lastre; condensatore con sorgente luminosa; stadio x motorizzato Y; modulo motorizzato dell'asse z; ruota dell'obiettivo; ruota portafiltri; CCD; e computer con il software di sistema sviluppato. (D) La formazione di sferoidi tumorali NCI-H23 da cellule monostrato osservate dall'oculare di un microscopio. La barra della scala rappresenta 500 μm. (E) Variazione dell'invasività e delle dimensioni degli sferoidi NCI-H23 senza trattamento farmacologico nell'arco di 10 giorni. Le barre della scala rappresentano 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
In questo studio, abbiamo usato il farmaco antitumorale AMG510 per testare il suo effetto sul trattamento del carcinoma polmonare non a piccole cellule. Il sistema di analisi ha fornito dati di immagine senza complesse elaborazioni di immagini. Le immagini in campo chiaro nella Figura 2 mostrano che la crescita degli sferoidi NCI-H23 potrebbe essere inibita da AMG510. Ciò è stato indicato dalla diminuzione delle dimensioni insieme all'aumento della concentrazione. Al contrario, le dimensioni sono aumentate nel gruppo di controllo per 10 giorni. Durante questo periodo, anche la rugosità del lato del bordo, che indica invasività, è cambiata. Gli sferoidi hanno mostrato bordi piatti il giorno 1 ma bordi ruvidi il giorno 10. Tuttavia, va notato che confrontare la rugosità attraverso le sole immagini in campo chiaro è un compito impegnativo. Va anche detto che il metodo standard coinvolge sferoidi di dimensioni adeguatamente medie. Infine, notiamo che uno sfondo pulito è stato ottenuto utilizzando questo metodo, poiché poche celle hanno aderito al fondo.
Figura 2: Immagini in campo chiaro di sferoidi cellulari NCI-H23 trattati con diverse concentrazioni di AMG510 catturate automaticamente da un microscopio ad alto contenuto. Le colonne rappresentano giorni diversi e le righe rappresentano diverse concentrazioni di farmaci. I risultati includono tre sferoidi per ogni condizione. Tutte le immagini sono state messe a fuoco automaticamente con un ingrandimento di 2x e quindi catturate con un ingrandimento di 10x dal sistema di imaging ad alto contenuto utilizzando un software basato sull'intelligenza artificiale e un controller del microambiente associato al microscopio. Le barre della scala rappresentano 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
I risultati della vitalità cellulare, mostrati nella Figura 3A, hanno dimostrato una ridotta vitalità nelle colture di 10 giorni di campioni trattati con farmaco a tutti i livelli di dosaggio rispetto al controllo. I campioni con concentrazioni superiori a 0,01 μM hanno mostrato una rapida diminuzione della vitalità delle cellule tumorali, indicando la sensibilità della terapia con AMG510 al carcinoma polmonare non a piccole cellule. Il giorno 10, questi campioni hanno mostrato livelli simili di vitalità finale, con valori inferiori al 70%, come mostrato nella Figura 3B.
Figura 3: Vitalità sferoide tumorale dei gruppi campione trattati con AMG510. I farmaci sono stati aggiunti il giorno 1. (A) La vitalità sferoidale del tumore è stata misurata il giorno 1, il giorno 4, il giorno 7 e il giorno 10. (B) Vitalità cellulare terminale dei campioni con gradienti di concentrazione. Le concentrazioni di farmaco utilizzate per trattare ciascun sferoide tumorale sono state impostate da 0,001 μM a 5 μM. Tutti i dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
La figura 4A rivela una tendenza simile per quanto riguarda l'analisi del diametro sferoide. I campioni con concentrazioni superiori a 0,01 μM hanno mostrato un'evidente riduzione del diametro medio. L'uniformità nella dimensione sferoidale è stata osservata anche il primo giorno di trattamento farmacologico, con valori di circa 800 μm. I rapporti di diametro di questi sferoidi (Figura 4B) indicavano una contrazione durante la co-coltura AMG510 in modo visibilmente più evidente rispetto al test di vitalità. Inoltre, abbiamo calcolato i valori di inibizione della crescita tumorale sferoidale in termini di diametri, come mostrato in Figura 4C. Il valore TGI è un parametro di valutazione relativo, e i valori potrebbero indicare una diminuzione della crescita a causa delle differenze di semina originali tra gli sferoidi; tuttavia, abbiamo nuovamente ottenuto il risultato che concentrazioni superiori a 0,01 μM hanno avuto un effetto evidente sul successo del trattamento AMG510. In uno studio precedente, abbiamo sperimentato il valore IC50, che è un indice significativo per i test antidroga; tuttavia, abbiamo scoperto che gli sferoidi NCI-H23 sottoposti a trattamento con AMG510 non hanno mostrato cambiamenti in questo parametro.
Figura 4: Dimensione del tumore rappresentata dai diametri sferoidi nei gruppi campione di controllo e trattati con AMG510. (A) I diametri sferoidi tumorali sono stati misurati il giorno 1, il giorno 4, il giorno 7 e il giorno 10. (B) Il rapporto di crescita sferoidale è stato definito come il volume terminale relativo al volume originale e calcolato utilizzando i diametri sferoidi. (C) Il rapporto di inibizione della crescita sferoidale è stato definito rispetto al volume e calcolato utilizzando i diametri sferoidi. Le concentrazioni di AMG510 utilizzate per trattare ciascun sferoide tumorale sono state fissate da 0,001 μM a 5 μM. Tutti i dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Abbiamo quindi effettuato un'ulteriore valutazione dell'invasività degli sferoidi in termini di valori di rugosità prodotti come output dal software (Figura 5A) e anche dell'indice perimetrale in eccesso basato sui confini sferoidi, prodotto con gli stessi mezzi (Figura 5B). Maggiore rugosità significa che più cellule stanno migrando dallo sferoide al gel, che, quindi, rappresenta una maggiore invasività. I risultati dei controlli sono stati confrontati con diversi livelli di concentrazione del farmaco. Per NCI-H23, una linea cellulare invasiva, la rugosità sferoide e i valori di EPI sono entrambi aumentati con il tempo di coltura senza alcun trattamento farmacologico18, e questo potrebbe essere dimostrato dalle immagini in campo chiaro e dagli aumenti di diametro nei campioni di controllo. Tuttavia, la crescita è stata attenuata dal trattamento con AMG510, del tutto proporzionale alle variazioni di dimensioni.
Figura 5: Riconoscimento del limite tumorale nei gruppi campione di controllo non trattati e trattati con AMG510. I farmaci sono stati aggiunti il giorno 1. (A) La rugosità del tumore è stata misurata dal software il giorno 1, giorno 4, giorno 7 e giorno 10, indicando l'invasività degli sferoidi tumorali. (B) Il perimetro sferoidale è stato localizzato e disegnato dal software utilizzando algoritmi di deep learning. Le aree sferoidi sul piano focale sono state quindi misurate dall'immagine J e un indice perimetrale in eccesso è stato calcolato sulla base di questi dati. Le concentrazioni di AMG510 utilizzate per trattare ciascun sferoide tumorale sono state fissate da 0,001 μM a 5 μM. Tutti i dati sono presentati come media ± SEM (n = 3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Tabella supplementare 1: La composizione della piastra. Nell'esperimento è stato utilizzato il farmaco anti-tumore polmonare AMG510 e i gruppi sono stati impostati in base ai gradienti di farmaco. Sono state utilizzate due piastre: una per il test del kit di analisi di fattibilità e una per l'analisi di imaging.
Tabella supplementare 2: Linee cellulari che sono state utilizzate nella costruzione di tumori 3D e test antidroga. Clicca qui per scaricare queste tabelle.
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Discussion
Il microambiente svolge un ruolo importante nella crescita del tumore. Può influenzare la fornitura di matrici extracellulari, gradienti di ossigeno, nutrizione e interazione meccanica e, quindi, influenzare l'espressione genica, le vie del segnale e molte funzioni delle cellule tumorali 19,20,21. In molti casi, le cellule 2D non producono tali effetti o addirittura producono effetti opposti, influenzando così la valutazione dei trattamenti farmacologici. Tuttavia, l'emergere di modelli 3D ha risolto questo problema. Ad esempio, la nostra valutazione dell'effetto di AMG510 su un sistema di trattamento del cancro del polmone è stata completata utilizzando metodi 3D. Abbiamo costruito un modello 3D tumore-sferoide-ECM (TSE) creando sferoidi tumorali incorporati all'interno di un gel per monitorare il trattamento con AMG510 su una linea cellulare invasiva correlata al polmone. AMG510 è un nuovo inibitore che ha come bersaglio il mutante G12C KRAS22 e la sua efficacia è stata confermata dalla nostra scoperta che il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) sperimentato da alcuni pazienti che rispondono a questo mutante. Dalla nostra serie di dati sperimentali e analisi, si possono distinguere alcuni dati molto preziosi. La sensibilità ad AMG510 è stata significativamente migliorata in una condizione sferoide 3D, rispetto alla condizione 2D, e migliorata ulteriormente in una condizione di ipossia.
I modelli costruiti con il presente metodo offrono diversi vantaggi. In primo luogo, come modello 3D, può simulare bene il tumore e la matrice extracellulare. Il metodo semplice ma efficace di costruzione di sferoidi tumorali 3D consente alle cellule di sopravvivere per un periodo di 2 settimane. Dopo i 5 giorni di costruzione sferoide, è disponibile un periodo di circa 10 giorni, sufficiente per effettuare qualsiasi test antidroga. Inoltre, il metodo di produzione di colture cellulari 3D è quasi lo stesso del metodo 2D e il suo costo è di gran lunga inferiore a quello del bioprinting 3D. Rispetto ad altri metodi come il metodo della goccia sospesa, il metodo qui descritto aiuta a produrre sferoidi più uniformi e la dimensione della cella è completamente controllata dal tipo e dalla densità delle cellule. Infine, questo modello ha dimostrato di essere applicabile a vari tipi di cellule tumorali e questa flessibilità può rivelarsi di particolare valore. In futuro, i ricercatori impegnati nella formazione di sferoidi tumorali potrebbero aggiungere non solo fibroblasti e cellule endoteliali alle loro sospensioni di cellule tumorali, ma anche cellule immunitarie come cellule T e cellule NK per promuovere la migrazione delle cellule stromali e aumentare gli effetti immunoterapeutici di nuovi farmaci23,24.
Negli ultimi decenni, pochi rapporti si sono concentrati sulla descrizione delle tecniche e degli strumenti attualmente disponibili per estrarre dati biologici significativi dai modelli 3D25. Queste informazioni possono essere considerate fondamentali per i test farmacologici e la scoperta terapeutica utilizzando modelli di coltura cellulare 3D26. Lo studio di Zanoni et al. ha descritto un nuovo software open source che esegue l'analisi automatica delle immagini delle colonie tumorali 3D. Gli autori hanno dimostrato che i parametri morfologici influenzano la risposta dei grandi sferoidi al trattamento farmacologico e che le dimensioni e la forma dello sferoide potrebbero essere entrambe fonti di variabilità27. Tuttavia, con gli sferoidi tumorali coltivati in gel 3D, che imitano gli ECM in vivo, il comportamento cellulare è molto più complesso e l'invasività può essere mostrata. Sebbene i dati riguardino solo le dimensioni e la forma, tali limitazioni rimarranno. Molti parametri affidabili e diversificati possono essere ottenuti utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto. Tali sistemi possono non solo determinare la vitalità cellulare e la forma sferoide, ma possono anche rilevare e verificare le caratteristiche dei tumori e l'effetto di inibizione dei farmaci sui tumori. L'invasività può anche essere determinata con tali mezzi. Ad esempio, un tumore invasivo può avere un valore di rugosità relativamente più alto, mentre un tumore non invasivo può avere un valore EPI più elevato. I cambiamenti in tali valori possono indicare diversi effetti farmacologici. In futuro, speriamo di combinare queste tecniche con chip microfluidici per ottenere strategie più convenienti ed efficaci.
Il metodo standardizzato qui descritto può soddisfare i requisiti della maggior parte dei test di screening e valutazione dei farmaci. Tuttavia, ci sono ancora alcuni problemi che possono verificarsi durante gli esperimenti futuri. Ad esempio, le cellule possono aderire alle pareti interne dei pozzetti dopo la centrifugazione o il terreno di coltura potrebbe non essere adatto. Inoltre, il gel utilizzato nel protocollo, così come il Matrigel ampiamente utilizzato, può facilmente gelificare durante il lungo processo. Tuttavia, la maggior parte di questi problemi può essere risolta attraverso tecniche operative e di ottimizzazione standard. Ci sono altre possibili limitazioni in questo metodo. A causa della struttura sferoide, i nutrienti, l'ossigeno e la diffusione dei rifiuti attraverso lo sferoide sono influenzati dalle dimensioni. La vitalità delle cellule nel nucleo sferoidale può essere compromessa quando il diametro sferoidale è superiore a 1.000 μm. Al contrario, diventa difficile osservare l'invasione quando il diametro è inferiore a 400 μm.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo tutti i membri dei nostri laboratori per il loro contributo critico e suggerimenti. Questa ricerca è stata sostenuta dal Key Project della Jiangsu Commission of Health (K2019030). La concettualizzazione è stata condotta da C.W. e Z.C., la metodologia è stata eseguita da W.H. e M.L., l'indagine è stata eseguita da W.H. e M.L., la cura dei dati è stata eseguita da W.H., Z.Z., S.X. e M.L., la preparazione della bozza originale è stata eseguita da Z.Z., J.Z., S.X., W.H., e X.L., la revisione e l'editing sono stati eseguiti da Z.C., l'amministrazione del progetto è stata eseguita da C.W. e Z.C. e l'acquisizione dei finanziamenti è stata condotta da C.W. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
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