Summary
Denna artikel visar en standardiserad metod för att konstruera tredimensionella tumörsfäroider. En strategi för sfäroidobservation och bildbaserad djupinlärningsanalys med hjälp av ett automatiserat bildsystem beskrivs också.
Abstract
Under de senaste decennierna har tredimensionella tumörsfäroider förutom monolagerodlade celler utvecklats som ett potentiellt kraftfullt verktyg för utvärdering av cancerläkemedel. De konventionella odlingsmetoderna saknar emellertid förmågan att manipulera tumörsfäroiderna på ett homogent sätt på tredimensionell nivå. För att ta itu med denna begränsning presenterar vi i detta dokument en bekväm och effektiv metod för att konstruera medelstora tumörsfäroider. Dessutom beskriver vi en metod för bildbaserad analys med hjälp av artificiell intelligensbaserad analysprogramvara som kan skanna hela plattan och få data om tredimensionella sfäroider. Flera parametrar studerades. Genom att använda en standardmetod för tumörsfäroidkonstruktion och ett bild- och analyssystem med hög genomströmning kan effektiviteten och noggrannheten hos läkemedelstester som utförs på tredimensionella sfäroider ökas dramatiskt.
Introduction
Cancer är en av de sjukdomar som människor fruktar mest, inte minst på grund av dess höga dödlighet1. Under de senaste åren har möjligheten att behandla cancer ökat eftersom nya terapier har introducerats 2,3,4,5. Tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) in vitro-modeller används för att studera cancer i laboratoriemiljö. 2D-modeller kan emellertid inte omedelbart och exakt bedöma alla viktiga parametrar som indikerar antitumörkänslighet; Därför misslyckas de med att fullt ut representera in vivo-interaktioner vid läkemedelsbehandlingstestning6.
Sedan 2020 har den globala tredimensionella (3D) kulturmarknaden ökat kraftigt. Enligt en rapport från NASDAQ OMX kommer det globala värdet av 3D-cellodlingsmarknaden att överstiga 2,7 miljarder USD i slutet av 2025. Jämfört med 2D-odlingsmetoder uppvisar 3D-cellodling fördelaktiga egenskaper, som kan optimeras inte bara för spridning och differentiering utan också för långsiktig överlevnad 7,8. På så sätt kan cellulära mikromiljöer in vivo simuleras för att erhålla mer exakt tumörkarakterisering, såväl som metabolisk profilering, så att genomiska och proteinförändringar kan förstås bättre. På grund av detta bör 3D-testsystem nu inkluderas i den vanliga läkemedelsutvecklingsverksamheten, särskilt de med fokus på screening och utvärdering av nya antitumörläkemedel. Tredimensionella tillväxter av odödliggjorda etablerade cellinjer eller primära cellkulturer i sfäroidstrukturer har in vivo-egenskaper hos tumörer såsom hypoxi och läkemedelspenetration, såväl som cellinteraktion, respons och resistens, och kan betraktas som en strikt och representativ modell för att utföra in vitro-läkemedelsscreening 9,10,11.
Men dessa 3D-kulturmodeller lider också av flera problem som kan ta lite tid att lösa. Cellsfäroider kan bildas med hjälp av dessa protokoll, men de skiljer sig åt i vissa detaljer, såsom odlingstid eller inbäddning av geler12, så dessa konstruerade cellsfäroider kan inte kontrolleras väl under ett begränsat storleksintervall. Storleken på sfäroiderna kan påverka konsistensen av viabilitetstestet och avbildningsanalysen. Tillväxtmikromiljöerna och tillväxtfaktorerna varierar också, vilket kan leda till olika morfologier på grund av skillnader i differentieringen mellan celler13. Det finns nu ett uppenbart behov av en standardiserad, enkel och kostnadseffektiv metod för att konstruera alla typer av tumörer med kontrollerade storlekar.
Ur ett annat perspektiv, även om homogena analyser och avbildningsmetoder med högt innehåll har utvecklats för att utvärdera morfologi, livskraft och tillväxthastighet, är screening med hög genomströmning av 3D-modeller fortfarande en utmaning av olika skäl som rapporterats i litteraturen, såsom bristen på enhetlighet i positionen, storleken och morfologin hos tumörsfäroider14,15,16.
I protokollet som presenteras här listar vi varje steg i konstruktionen av 3D-tumörsfäroider och beskriver en metod för sfäroidobservation och analys med hjälp av ett bildsystem med hög genomströmning och högt innehåll som involverar autofokus, autoavbildning och analys, bland andra fördelaktiga egenskaper. Vi visar hur denna metod kan producera 3D-tumörsfäroider av enhetlig storlek som är lämpliga för avbildning med hög genomströmning. Dessa sfäroider visar också en hög känslighet för cancerläkemedelsbehandling, och morfologiska förändringar i sfäroiderna kan övervakas med hjälp av höginnehållsavbildning. Sammanfattningsvis demonstrerar vi robustheten i denna metod som ett sätt att generera 3D-tumörkonstruktioner för läkemedelsutvärdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Sfäroid konstruktion
- Anti-vidhäftningsbehandling av odlingsplattan
- Pipettera 100 μL antiadhesionsreagens i varje brunn på en 48-brunnsplatta med U-formad brunnsbotten och förvara i 10 minuter. Efter 10 minuter, aspirera beläggningsreagenset och tvätta två gånger med steriliserad PBS.
- Lägg odlingsplattan i en inkubator (37 °C i fuktad luft med 5 %CO2) tills den används.
- Cellberedning, insamling och räkning
- Använd det odlingsmedium som är specifikt för cellerna för att odla cellerna i cellodlingskolvar (kompletterande tabell 2). Till exempel odlas NCI-H23, CT-26-celler i RPMI 1640 och HT-29-celler odlas i McCoys 5A-medium. Dessa två medier kompletteras med 10% värmeinaktiverad FBS respektive 1% P/S.
- Håll alla celler i standardodlingsförhållanden (37 °C i fuktad luft med 5%CO2) under proliferation. Här används NCI-H23-cellinjen som ett exempel i följande steg.
- Tvätta celler odlade i en T25-kolv två gånger med 1x PBS för att avlägsna odlingsmediet (det är bättre att välja celler i den logaritmiska fasen och passera cellerna vid ett sammanflöde av 80% -90%).
- Behandla de expanderade cellerna med 1 ml 0,25% trypsin / EDTA i 1-2 min i en inkubator vid 37 ° C, 5% CO2. Bekräfta cellformen (normalt cirkulär i detta fall) under mikroskopet och stoppa sedan trypsinbehandlingen. För att göra detta, aspirera den använda trypsin / EDTA-suspensionen i T25-kolven och tvätta cellerna med 4 ml färskt medium.
- Överför hela suspensionen (5 ml) till ett 15 ml rör. Använd 1 ml färskt medium för att tvätta kvarvarande celler och tillsätt det till röret. Centrifugera cellerna vid 186,48 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 10 ml färskt medium till cellpelleten, följt av försiktig pipettering tills cellerna är i en homogen suspension.
- Aspirera 0,1 ml cellsuspension i ett nytt centrifugrör, tillsätt 0,9 ml färskt medium och pipettera sedan suspensionen väl.
- Extrahera 10 μL av cellsuspensionen för cellräkning. Utför denna process två eller tre gånger och ta ett medelvärde.
- Späd suspensionen så att den slutliga sådddensiteten på 50 000 celler/ml uppnås enligt den koncentration som erhålls från cellräkningsprocessen i steg 1.2.7.
- Cellodling och sfäroidbildning
- Tillsätt 200 μL av cellsuspensionen till varje brunn på en U-bottenplatta med 48 brunnar.
- Linda tätningsfilmen runt plattan och centrifugera den vid 119,35 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt ut plattan ur centrifugen och dra av skyddsfilmen. Tillsätt sedan 5-8 ml steriliserat vatten i vattenkanalen som omger brunnarna (för att förhindra avdunstning) och inkubera vid 37 °C i 5 dagar. Byt/komplettera inte vatten till vattenkanalen under perioden.
- Observera cellaggregeringen under de följande 5 dagarna.
OBS: I allmänhet börjar cellerna klumpa sig som kolonier inom 5 dagar. Processen med sfäroidkonstruktion kan dock vara snabbare eller långsammare med olika celltyper och celldensiteter. På grund av detta måste cellerna observeras varje dag med en av tre möjliga metoder. Först kan cellerna observeras genom botten av brunnplattan. När cellerna ännu inte har bildat en sfäroid kan ett enda lager av celler ses längst ner. När cellerna bildar en sfäroid kan en tät 3D-konstruktion observeras vid U-botten av varje brunn. En annan metod innebär att man kontrollerar cellerna under ett mikroskop. När cellerna blir en tumörsfäroid innefattar konstruktionen tre lager (ett prolifererande skikt, ett inaktivt skikt och en nekrotisk kärna, från utsidan till insidan av sfäroiden), som har en genomskinlighetsgradient. Slutligen kan färgen på odlingsmediet också användas för observationsändamål. Detta kan vara till hjälp när treskiktsstrukturen inte kan ses tydligt, även med hjälp av ett digitalt mikroskop. När mediet blir från lila-rött till gult kan processen att bädda in sfäroiderna i gelén börja. Mediet bör inte bytas ut under cellaggregeringsperioden.
- Gel inbäddning
OBS: Gelerna måste förvaras vid en temperatur under -20 ° C. I synnerhet bör geler placeras långt ifrån kylskåpsdörren för att undvika temperaturfluktuationer. Observera att gelerna är i fruset tillstånd i detta skede av processen.- Ta den frysta gelén från -20 ° C kylskåp och placera den på en islåda under hela tiden under experimentet.
- Observera cellsfäroiderna under mikroskopet. Innan gelinbäddningen börjar, bör sfäroidernas status återigen kontrolleras med ett digitalt mikroskop.
- Ta försiktigt bort 150 μl av mediet. Plattan ska också placeras på isboxen.
- Bädda in varje sfäroid i gelén genom att tillsätta den flytande gelén långsamt från brunnens väggsida medan du flyttar den förkylda pipettspetsen runt och inuti brunnen. Vänta i 5 minuter och om gelen inte sprider sig jämnt, pipettera försiktigt gelen med en 10 μL pipettspets. Varje brunn innehåller en tumörsfäroid, 25 μL 3,5 mg/ml gel och 50 μL komplett odlingsmedium. Tillsätt 75 μL medium till kontrollerna också.
OBS: Varje brunn innehåller en sfäroid. - Inkubera plattan vid 37 °C i 30 minuter tills hydrogeleringen är helt avslutad. Bekräfta geleringsstatusen under mikroskopet.
- Överlägg 125 μl av det färska mediet på varje prov.
- Odla sfäroiderna i ytterligare 7-10 dagar. Förbered grupper av sfäroider med fyra till sex brunnar vardera och välj minst tre av dem för analys.
OBS: Om du utför ett drogtest, förbered två grupper för ett prov. En grupp används för viabilitetstestning, medan den andra används för bildtagning och analys.
2. Läkemedelsbehandling
- Lös upp läkemedlet enligt tillverkarens instruktioner. Förbered 100x arbetslösningar med DMSO. Förbered minst fem doser av läkemedlet i serieutspädning. Här används det lungcancerterapeutiska läkemedlet, AMG 510, som exempel. Sammansättningen visas i kompletterande tabell 1.
- Använd 0,1% DMSO som en positiv kontroll.
- Tillsätt 125 μL läkemedelsbehandlat medium till varje brunn och sätt tillbaka plattan i inkubatorn (37 °C i fuktad luft med 5 %CO2). I detta skede innehåller varje brunn en tumörsfäroid, 25 μL 3,5 mg / ml gel och 175 μL av mediet. Kontrollerna innehåller 200 μL av mediet.
3. Sfäroid livskraft
- Mät sfäroidens livskraft med hjälp av ett Alamar Blue-analyskit enligt tillverkarens riktlinjer. Mät livskraften med hjälp av en mikroplattfotometer (absorbans vid 570 nm och 600 nm) efter att Alamar Blue-behandlingen har utförts.
- Mät viabiliteten dag 1, dag 4, dag 7 och dag 10 efter inbäddning av sfäroiderna i gelén, eller enligt anvisningar.
OBS: När du använder en Alamar Blue-analys krävs minst 16 timmars reaktionstid. Tillsätt därför 20 μL Alamar Blue på eftermiddagarna dag 0, dag 3, dag 6 och dag 9. - Aspirera 100 μl av supernatantmediet från varje brunn till en ny provplatta och tillsätt 80 μl färskt medium till varje brunn på odlingsplattan. Byt sedan ut ytterligare 100 μL av det läkemedelsbehandlade mediet. Se till att det inte finns några rester av Alamar Blue i brunnen.
OBS: Mediumersättning utförs vid varje tillfälle som viabiliteten testas, och det läkemedelsbehandlade mediet i bildanalysgrupperna måste bytas ut samma dag.
4. Sfäroidobservation och djupinlärningsanalys genom bilder i drogtestet
- Imaging
- Aspirera 100 μL av mediet ut före avbildning.
- Placera plattan på scenen. Hämta digitala bilder av sfäroiderna med hjälp av ett automatiserat mikroskop med ett 10x mål (2x mål först). Mikroskopet kan fokusera och centralisera dessa sfäroider automatiskt.
OBS: Autofokusfunktionen och algoritmen som används har tidigare rapporterats av Yazdanfar et al.17. - Vänta på den automatiska bildbehandlingen. Fyra bilder förvärvas för varje sfäroid. En integrerad bild bildas och bearbetas med programvaran som är ansluten till bildsystemet med högt innehåll.
- Klicka på knappen "Bildkorrigeringsprocess" och välj de integrerade bilderna i programvaran.
- Välj "U-NET-modell" och skriv in konverteringsfrekvensen (10x målbilder har en konverteringsfrekvens på 3,966). Klicka längst ner på skärmen nedan för att starta bildbehandlingen. Spara sedan data om diameter, omkrets och grovhet i kalkylprogrammet.
- Beräkna överskott av perimeterindex (EPI). EPI är förhållandet mellan sfäroidomkretsen (P 0) och ekvivalent omkrets (Pe), beräknat med Eq. 1. Mät sfäroidens yta vid fokalplanet (S) med bild J. Beräkna sedan sfäroidens ekvivalenta omkrets med Eq. 2.
EPI = (P o− P e)/Pe (Ekv. 1)
(Ekv. 2)
Den sfäroida perimetern genereras av programvaran med djupinlärningsalgoritmer baserade på den utvecklade U-NET-modellen. - Tillsätt 100 μL färskt medium med läkemedlet och sätt tillbaka plattan i inkubatorn (37 °C i fuktad luft med 5 %CO2).
- Sfäroid hämning
- Beräkna tumörtillväxthämningen (TGI) med hjälp av Eq. 3. Den relativa sfäroidvolymen (RTV) är terminalvolymen över den ursprungliga volymen (Eq. 4). Sfäroidvolymen (V) beräknas automatiskt av programvaran med hjälp av Eq. 5 enligt sfäroiddiameterutgången.
TGI = (RTV-styrning−RTV-behandling)/RTV-styrning × 100 % (Ekv. 3)
RTV =V-terminal/Voriginal (Ekv. 4)
V = 4/3π(d/2)3 (Ekv. 5)
OBS: TGI erhålls med hänvisning till tillväxthämning in vivo och tumörvikterna ersätts med RTV. RTV-kontroll är kontrollgruppens relativa sfäroidvolym, RTV-behandling är den relativa sfäroidvolymen för den testade läkemedelsgruppen, V-terminalen är sfäroidens volym den sista dagen,V-originalet är sfäroidens volym den första odlingsdagen och d representerar sfäroiddiametern.
- Beräkna tumörtillväxthämningen (TGI) med hjälp av Eq. 3. Den relativa sfäroidvolymen (RTV) är terminalvolymen över den ursprungliga volymen (Eq. 4). Sfäroidvolymen (V) beräknas automatiskt av programvaran med hjälp av Eq. 5 enligt sfäroiddiameterutgången.
(Ekv. 2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1A,B visar processen som används för att konstruera tumörsfäroider i denna studie. Vi sådde först cellerna i en 48-brunns U-bottenplatta. Detta steg är nästan detsamma som det som används i 2D-cellodling. Vi förvarade plattan i en gemensam inkubator med vatten som omgav brunnarna så att de deponerade cellerna började bilda sfäroider i en självmonteringsprocess. Under normala driftsförhållanden bildades de flesta typer av tumörsfäroider fullständigt efter 5 dagar när ett målmedium användes (kompletterande tabell 2). Vi kontrollerade statusen för sfäroidkonstruktion inom 5 dagar med ett digitalt mikroskop (figur 1D). Efter att tillväxtprocessen var klar tillsattes gel för att linda in de enskilda sfäroiderna i varje brunn, vilket gav en in vivo-liknande extracellulär matris (ECM) för varje sfäroid. Drogtester genomfördes sedan. Eftersom vi använde ett bildsystem med högt innehåll med djupinlärningsanalysprogramvara (figur 1C) kunde vi tydligt observera individuell sfäroidtillväxt (figur 1E) och få värden för lämpliga parametrar för att bestämma egenskaper under läkemedelsbehandling, inklusive livskraft, diameter och grovhet.
Figur 1: Tumörsfäroidbildning och automatiserad avbildning och analys . (A) Schematiskt som visar standardproceduren för odling av tumörsfäroider med tidslinjen nedan. (B) Schematisk bild av läkemedelsbehandlingstestning med tumörsfäroider som visar olika nivåer av invasivitet i 3D-matriser. (C) Bild av ett djupinlärningsbaserat algoritmrelaterat system för automatiserad avbildning och analys som visar detaljer enligt följande: plattplattform; kondensor med ljuskälla; motoriserat x, y-steg; motoriserad z-axelmodul; objektivt hjul; filterhjul; CCD; och dator med den utvecklade systemprogramvaran. (D) Bildandet av NCI-H23 tumörsfäroider från monolagerceller observerade från okularet i ett mikroskop. Skalstapeln representerar 500 μm. (E) Variation i invasivitet och storlek hos NCI-H23-sfäroider utan läkemedelsbehandling under 10 dagar. Skalstrecken representerar 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I denna studie använde vi antitumörläkemedlet AMG510 för att testa dess effekt vid behandling av icke-småcellig lungcancer. Analyssystemet tillhandahöll bilddata utan komplex bildbehandling. Ljusfältsbilderna i figur 2 visar att tillväxten av NCI-H23-sfäroider kan hämmas av AMG510. Detta indikerades av den minskade storleken tillsammans med ökad koncentration. Däremot ökade storleken i kontrollgruppen i 10 dagar. Under denna period förändrades också grovheten på kantsidan, vilket indikerar invasivitet. Sfäroiderna uppvisade plana kanter på dag 1 men grova kanter på dag 10. Det bör dock noteras att det är en utmanande uppgift att jämföra grovhet genom ljusfältsbilder ensam. Det bör också nämnas att standardmetoden innefattar sfäroider av lämplig medelstorlek. Slutligen noterar vi att en ren bakgrund uppnåddes med denna metod, eftersom få celler fästes vid botten.
Figur 2: Brightfield-bilder av NCI-H23-cellsfäroider behandlade med olika koncentrationer av AMG510 som automatiskt fångas av ett höginnehållsmikroskop. Kolumnerna representerar olika dagar och raderna representerar olika läkemedelskoncentrationer. Resultaten inkluderar tre sfäroider för varje tillstånd. Alla bilder fokuserades automatiskt vid 2x förstoring och togs sedan vid 10x förstoring av bildsystemet med högt innehåll med hjälp av artificiell intelligensbaserad programvara och en mikroskopassocierad mikromiljökontroll. Skalstrecken representerar 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Resultaten av cellviabiliteten, som visas i figur 3A, visade minskad viabilitet i 10-dagarsodlingarna av läkemedelsbehandlade prover vid alla dosnivåer jämfört med kontrollen. Prover med koncentrationer över 0,01 μM uppvisade en snabb minskning av tumörcellens viabilitet, vilket indikerar känsligheten hos AMG510-terapi för icke-småcellig lungcancer. På dag 10 uppvisade dessa prover liknande nivåer av slutlig viabilitet, med värden under 70%, som visas i figur 3B.
Figur 3: Tumörsfäroidviabilitet hos AMG510-behandlade provgrupper. Droger tillsattes på dag 1. (A) Tumörsfäroidens viabilitet mättes dag 1, dag 4, dag 7 och dag 10. b) Provernas viabilitet i terminala celler med koncentrationsgradienter. Läkemedelskoncentrationerna som användes för att behandla varje tumörsfäroid sattes från 0,001 μM till 5 μM. Alla data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4A visar en liknande trend med avseende på analysen av sfäroiddiametern. Prover med koncentrationer över 0,01 μM uppvisade en tydlig minskning av medeldiametern. Enhetlighet i sfäroidstorleken kunde också ses på den första dagen av läkemedelsbehandling, med värden på cirka 800 μm. Diameterförhållandena för dessa sfäroider (figur 4B) indikerade sammandragning under AMG510-samkulturen på ett synligt mer uppenbart sätt än viabilitetstestet. Dessutom beräknade vi hämningsvärdena för sfäroidtumörtillväxt med avseende på deras diametrar, som visas i figur 4C. TGI-värdet är en relativ utvärderingsparameter, och värdena kan indikera minskad tillväxt som ett resultat av ursprungliga såddskillnader mellan sfäroiderna; Vi fick dock återigen resultatet att koncentrationer över 0,01 μM hade en uppenbar effekt på AMG510-behandlingens framgång. I en tidigare studie experimenterade vi med IC50-värdet, vilket är ett signifikant index för drogtestning; Vi fann dock att NCI-H23-sfäroider under AMG510-behandling inte uppvisade några förändringar i denna parameter.
Figur 4: Tumörstorlek representerad av sfäroiddiametrar i kontroll- och AMG510-behandlade provgrupper. (A) Tumörsfäroiddiametrar mättes dag 1, dag 4, dag 7 och dag 10. (B) Tillväxtförhållandet för sfäroider definierades som terminalvolymen i förhållande till den ursprungliga volymen och beräknades med användning av sfäroiddiametrarna. (C) Tillväxthämningsförhållandet för sfäroider definierades i förhållande till volymen och beräknades med hjälp av sfäroiddiametrarna. AMG510-koncentrationerna som användes för att behandla varje tumörsfäroid sattes från 0,001 μM till 5 μM. Alla data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Vi genomförde sedan en ytterligare utvärdering av sfäroidernas invasivitet när det gäller grovhetsvärdena som produceras som utgång av programvaran (figur 5A) och även överskottsperimeterindexet baserat på sfäroidgränserna, producerade på samma sätt (figur 5B). Högre grovhet innebär att fler celler migrerar från sfäroiden till gelén, vilket således representerar högre invasivitet. Resultaten av kontrollerna jämfördes med olika läkemedelskoncentrationsnivåer. För NCI-H23, en invasiv cellinje, ökade sfäroidens grovhet och EPI-värdena båda med odlingstiden utan någon läkemedelsbehandling18, och detta kunde bevisas av ljusfältbilderna och diameterökningarna i kontrollproverna. Tillväxten dämpades dock av AMG510-behandling, helt i proportion till variationer i storlek.
Figur 5: Tumörgränsigenkänning i de obehandlade kontroll- och AMG510-behandlade provgrupperna. Droger tillsattes på dag 1. (A) Tumörens grovhet mättes av programvaran dag 1, dag 4, dag 7 och dag 10, vilket indikerar invasiviteten hos tumörsfäroiderna. (B) Den sfäroida omkretsen lokaliserades och ritades av programvaran med hjälp av djupinlärningsalgoritmer. Sfäroidområdena vid fokalplanet mättes sedan med bild J, och ett överskott av omkretsindex beräknades baserat på dessa data. AMG510-koncentrationerna som användes för att behandla varje tumörsfäroid sattes från 0,001 μM till 5 μM. Alla data presenteras som medelvärde ± SEM (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande tabell 1: Plattans sammansättning. Anti-lungtumörläkemedlet AMG510 användes i experimentet, och grupper sattes enligt läkemedelsgradienter. Två plattor användes: en för viabilitetstestet och en för bildanalysen.
Kompletterande tabell 2: Cellinjer som har använts i 3D-tumörkonstruktion och läkemedelstestning. Klicka här för att ladda ner dessa tabeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikromiljön spelar en viktig roll i tumörtillväxt. Det kan påverka tillhandahållandet av extracellulära matriser, syregradienter, näring och mekanisk interaktion och därmed påverka genuttryck, signalvägar och många funktioner hos tumörceller 19,20,21. I många fall producerar 2D-celler inte sådana effekter eller till och med motsatta effekter, vilket påverkar utvärderingen av läkemedelsbehandlingar. Framväxten av 3D-modeller har dock tagit itu med detta problem. Till exempel slutfördes vår utvärdering av effekten av AMG510 på ett lungcancerbehandlingssystem med hjälp av 3D-metoder. Vi konstruerade en 3D-tumörsfäroid-ECM-modell (TSE) genom att skapa tumörsfäroider inbäddade i en gel för att övervaka AMG510-behandling på en lungrelaterad invasiv cellinje. AMG510 är en ny hämmare som riktar sig mot G12C-mutant KRAS22, och dess effektivitet bekräftades av vårt fynd att den icke-småcelliga lungcancer (NSCLC) som upplevs av vissa patienter som svarar på denna mutant. Från vår serie av experimentella data och analyser kan några mycket värdefulla data urskiljas. Känsligheten för AMG510 förbättrades signifikant under ett 3D-sfäroidtillstånd, jämfört med 2D-tillståndet, och förbättrades ytterligare inom ett hypoxitillstånd.
De modeller som konstruerats med den nuvarande metoden erbjuder flera fördelar. För det första, som en 3D-modell, kan den simulera tumören och den extracellulära matrisbrunnen. Den enkla men effektiva metoden att konstruera 3D-tumörsfäroider gör att cellerna kan överleva under en 2-veckorsperiod. Efter de 5 dagarna av sfäroidkonstruktion finns en period på cirka 10 dagar tillgänglig, vilket är tillräckligt för att utföra eventuella drogtester. Dessutom är metoden för 3D-cellodlingsproduktion nästan densamma som 2D-metoden, och kostnaden är mycket lägre än för 3D-bioprinting. Jämfört med andra metoder, såsom hängningsmetoden, hjälper metoden som beskrivs här att producera mer enhetliga sfäroider, och cellstorleken styrs helt av cellernas typ och densitet. Slutligen har denna modell visat sig vara tillämplig på olika typer av cancerceller, och denna flexibilitet kan visa sig vara av särskilt högt värde. I framtiden kan forskare som arbetar med bildandet av tumörsfäroider lägga till inte bara fibroblaster och endotelceller till sina tumörcellsuspensioner utan också immunceller som T-celler och NK-celler för att främja stromal cellmigration och öka de immunterapeutiska effekterna av nya läkemedel23,24.
Under de senaste decennierna har få rapporter fokuserat på att beskriva de tekniker och verktyg som för närvarande finns tillgängliga för att extrahera betydande biologiska data från 3D-modeller25. Denna information kan anses vara grundläggande för läkemedelstestning och terapeutisk upptäckt med hjälp av 3D-cellodlingsmodeller26. Studien av Zanoni et al. beskrev ny programvara med öppen källkod som utför automatisk bildanalys av 3D-tumörkolonier. Författarna visade att morfologiska parametrar påverkade svaret hos stora sfäroider på läkemedelsbehandling och att sfäroidstorlek och form båda kunde vara källor till variabilitet27. Men med tumörsfäroider odlade i 3D-gel, som efterliknar ECM in vivo, är cellbeteendet mycket mer komplext och invasivitet kan uppvisas. Även om data endast handlar om storlek och form, kommer sådana begränsningar att kvarstå. Många tillförlitliga och diversifierade parametrar kan erhållas med hjälp av ett bildsystem med högt innehåll. Sådana system kan inte bara bestämma cellviabiliteten och sfäroidformen utan kan också detektera och verifiera tumörernas egenskaper och läkemedlets hämningseffekt på tumörer. Invasivitet kan också bestämmas med sådana medel. Till exempel kan en invasiv tumör ha ett relativt högre grovhetsvärde, medan en icke-invasiv tumör kan ha ett högre EPI-värde. Förändringar i sådana värden kan indikera olika läkemedelseffekter. I framtiden hoppas vi kunna kombinera dessa tekniker med mikrofluidiska chips för att få mer praktiska och effektiva strategier.
Den standardiserade metoden som beskrivs här kan uppfylla kraven för de flesta drogscreening- och utvärderingstester. Det finns dock fortfarande några problem som kan uppstå under framtida experiment. Till exempel kan celler fästa vid brunnarnas inre väggar efter centrifugering, eller odlingsmediet kanske inte är lämpligt. Dessutom kan gelén som används i protokollet, liksom den allmänt använda Matrigel, lätt gelera under den långa processen. De flesta av dessa problem kan dock lösas genom standarddrift och optimeringstekniker. Det finns andra möjliga begränsningar i denna metod. På grund av sfäroidstrukturen påverkas näringsämnen, syre och avfallsdiffusion genom sfäroiden av storleken. Livskraften hos cellerna i sfäroidkärnan kan äventyras när sfäroiddiametern är över 1 000 μm. Omvänt blir det svårt att observera invasionen när diametern är under 400 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar alla medlemmar i våra laboratorier för deras kritiska input och förslag. Denna forskning stöddes av nyckelprojektet för Jiangsu Commission of Health (K2019030). Konceptualisering utfördes av C.W. och Z.C., metoden utfördes av W.H. och M.L., undersökningen utfördes av W.H. och M.L., datakureringen utfördes av W.H., Z.Z., S.X. och M.L., det ursprungliga utkastet till förberedelse utfördes av Z.Z., J.Z., S.X., W.H., och X.L., granskningen och redigeringen utfördes av Z.C., projektadministrationen utfördes av C.W. och Z.C. och finansieringsförvärvet genomfördes av C.W. Alla författare har läst och godkänt den publicerade versionen av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5-10 μL Pipette tips | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Boil proof microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μL Pipette tips | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Centrifuge Tube | Nest | 601052 | |
| 200 μL Pipette tips | AXYGEN | T-200-Y | |
| 3D gel | Avatarget | MA02 | |
| 48-well U bottom Plate | Avatarget | P02-48UWP | |
| 50 mL Centrifuge Tube | Nest | 602052 | |
| Alamar Blue | Thermo | DAL1100 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL | #07010 | |
| Certified FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Deionized water | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft office | ||
| Graphpad prism sofware | GraphPad software | ||
| High Content Imager and SMART system | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium-A Supplement (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin/streptomycin Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Trypsin, 0.25% (1X) | Hyclone | SH30042.01 |
References
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer biology and therapy. Nature Reviews Cancer. 22 (5), 259-279 (2022).
- Abrantes, R., Duarte, H. O., Gomes, C., Walchili, S., Reis, C. A. CAR-Ts: New perspectives in cancer therapy. FEBS Letter. 596 (4), 403-416 (2022).
- Shokooohi, A., et al. Effect of targeted therapy and immunotherapy on advanced nonsmall-cell lung cancer outcomes in the real world. Cancer Medicine. 11 (1), 86-93 (2022).
- Chen, K., Zhang, Y., Qian, L., Wang, P. Emerging strategies to target RAS signaling in human cancer therapy. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 116 (2021).
- Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Qin, Y., Hu, X., Fan, W., Yan, J. A stretchable scaffold with electrochemical sensing for 3D culture, mechanical loading, and real-time monitoring of cells. Advanced Science. 8 (13), 2003738 (2021).
- Wartenberg, M., et al. Regulation of the multidrug resistance transporter P-glycoprotein in multicellular tumor spheroids by hypoxia-inducible factor (HIF-1) ad reactive oxygen species. FASEB Journal. 17 (3), 503-505 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F.
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: How 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Brüningk, S. C., Rivens, I., Box, C., Oelfke, U., Ter Haar, G. 3D tumour spheroids for the prediction of the effects of radiation and hyperthermia treatments. Scientific Reports. 10, 1653 (2020).
- Graves, E. E., Maity, A., Thu Le, Q. The tumor microenvironment in non-small-cell lung cancer. Seminars in Radiation Oncology. 20 (3), 156-163 (2010).
- Kunz-Schughart, L. A., Frreyer, J. P., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: The multicellular spheroid model. Journal of Biomolecular Screening. 9 (4), 273-285 (2004).
- Carragher, N., et al. Concerns, challenges and promises of high-content analysis of 3D cellular models. Nature Review Drug Discovery. 17 (8), 606 (2018).
- Huang, Y., et al. Longitudinal morphological and physiological monitoring of three-dimensional tumor spheroids using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (144), e59020 (2019).
- Yazdanfar, S., et al. Simple and robust image-baed autofocusing for digital microscopy. Optics Express. 16 (12), 8670-8677 (2008).
- Chen, Z., et al. Automated evaluation of tumor spheroid behavior in 3D culture using deep learning-based recognition. Biomaterials. 22 (272), 120770 (2021).
- Boucherit, N., Gorvel, L., Olive, D. 3D tumor models and their use for the testing of immunotherapies. Frontiers in Immunology. 11, 603640 (2020).
- Anastasiou, D., et al. Microenvironment factors shaping the cancer metabolism landscape. British Journal of Cancer. 116 (3), 277-286 (2017).
- Zhou, H., et al. Functions and clinical significance of mechanical tumor microenvironment: Cancer cell sensing, mechanobiology and metastasis. Cancer Communications. 43 (5), 374-400 (2022).
- Zhu, G. G., et al. Targeting KRAS cancers: From druggable therapy to druggable resistance. Molecular Cancer. 21 (1), 159 (2022).
- Ando, Y., Mariano, C., Shen, K. Engineered in vitro tumor models for cell-based immunotherapy. Acta Biomaterialia. 132, 345-359 (2021).
- Timmins, N. E., Dietmair, S., Nielsen, L. K. Hanging-drop multicellular spheroids as a model of tumor angiogenesis. Angiogenesis. 7 (2), 97-103 (2004).
- Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: An overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
- Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today. Technologies. 23, 27-36 (2017).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
