Summary
В этом исследовании описывается мышиная модель для изучения синергетического влияния никотина на прогрессирование легочного фиброза у экспериментальных мышей с силикозом. Мышиная модель с двойным воздействием моделирует патологическое прогрессирование в легких после одновременного воздействия никотина и диоксида кремния. Описанные методы просты и легко воспроизводимы.
Abstract
Курение и воздействие диоксида кремния распространены среди профессиональных работников, и диоксид кремния с большей вероятностью повреждает легкие курильщиков, чем некурящих. Роль никотина, основного ингредиента сигарет, вызывающего привыкание, в развитии силикоза неясна. Мышиная модель, использованная в этом исследовании, была простой и легко контролируемой, и она эффективно имитировала влияние хронического приема никотина и повторного воздействия диоксида кремния на фиброз легких через эпителиально-мезенхимальный переход у людей. Кроме того, эта модель может помочь в непосредственном изучении влияния никотина на силикоз, избегая при этом влияния других компонентов сигаретного дыма.
После адаптации к окружающей среде мышам подкожно вводили 0,25 мг/кг раствора никотина в дряблую кожу над шеей каждое утро и вечер с интервалом в 12 часов в течение 40 дней. Кроме того, кристаллический порошок кремнезема (1-5 мкм) суспендировали в физиологическом растворе, разбавляли до суспензии 20 мг/мл и равномерно диспергировали с помощью ультразвуковой водяной бани. Мыши, обезболинные изофлураном, вдыхали 50 мкл этой суспензии кремнеземной пыли через нос и просыпались с помощью массажа грудной клетки. Воздействие диоксида кремния вводилось ежедневно с 5-го по 19-й день.
Мышиная модель с двойным воздействием подвергалась воздействию никотина, а затем диоксида кремния, что соответствует истории воздействия рабочих, которые подвергались воздействию обоих вредных факторов. Кроме того, никотин способствовал фиброзу легких через эпителиально-мезенхимальную трансформацию (ЭМП) у мышей. Эта животная модель может быть использована для изучения влияния нескольких факторов на развитие силикоза.
Introduction
Воздействие диоксида кремния на рабочих неизбежно в некоторых профессиональных условиях, и после воздействия кремнезема ухудшение ухудшается даже после удаления из окружающей среды. Кроме того, большинство этих работников курят, а традиционные сигареты содержат тысячи химических веществ, ключевым компонентом, вызывающим привыкание, являетсяникотин-1. Электронные сигареты становятся все более популярными в младших возрастных группах2; Эти электронные сигареты действуют как система доставки никотина и увеличивают доступ к никотину, тем самым повышая восприимчивость легких и пневмонию3. Сигаретный дым также ускоряет фиброз легких у мышей, подвергшихся воздействию блеомицина4, и увеличивает легочную токсичность и фиброз у мышей, подвергшихся воздействию диоксида кремния 5,6. Тем не менее, может ли никотин влиять на воспалительный и легочный фиброзный процесс, вызванный диоксидом кремния, еще предстоит исследовать.
Модель силикоза у мышей, созданная путем однократного вдыхания высокой дозы диоксида кремния в трахею, травматична для мышей. Несмотря на то, что этот метод позволяет быстро получить модель силикоза, он не соответствует реальности среды, в которой рабочие постоянно подвергаются воздействию кремнезема. Таким образом, мы создали мышиную модель, подвергшуюся воздействию кремнезема, многократно вводя низкую дозу кремнеземной суспензии через назальную капельницу; Эта доза может вызвать воспаление и фиброз у мышей.
Чтобы обойти воздействие других компонентов сигареты, этой модели мыши подкожно вводили никотин в дряблую кожу шеи для определения влияния вызывающего привыкание компонента, никотина, на силикоз. Путем введения подкожных инъекций можно добиться точной дозировки, что позволяет создавать модели воздействия никотина и наблюдать за реакцией дозо-токсичности, а также привыканием. Разработана модель никотиновой зависимости у самцов мышей с инъекционной дозой никотина 0,2-0,4 мг/кг 7,8. В этой модели, чтобы удовлетворить потребности зависимых мышей в поиске наркотиков, были введены две подкожные инъекции с интервалом в 12 часов. Эта модель никотиновой зависимости у мышей полезна для моделирования привычек курения и воздействия диоксида кремния.
Однофакторные модели на животных имеют ограничения в изучении заболеваний, в то время как метод, описанный здесь, включает в себя двухфакторную мышиную модель совместного воздействия никотина и диоксида кремния. До воздействия диоксида кремния мыши подвергались предварительному воздействию никотина, чтобы воспроизвести воздействие никотина на курящих людей. Впоследствии воздействие диоксида кремния проводилось с 5-го по 19-й день, чтобы имитировать воздействие диоксида кремния в рабочей среде для лиц с историей курения.
Известно, что альвеолярные макрофаги играют важную роль в регуляции воспаления и фиброза легких. Макрофаги не могут расщеплять кремнезем при вдыхании кремнезема, что приводит к поляризации макрофагов или апоптозу9 и высвобождению цитокинов, таких как фактор некроза опухоли-альфа (TNF-α) и трансформирующий фактор роста бета (TGF-β). Макрофаги М1, которые идентифицируются по наличию поверхностного маркера CD86, являются первичными инициаторами воспалительной реакции при силикозе, в то время как макрофаги М2, которые маркируются CD206, ответственны за фиброзную фазу состояния10. У мышей с двойным воздействием никотин индуцировал поляризацию макрофагов в сторону фенотипа М2 в легких, поврежденных диоксидом кремния, тем самым способствуя легочному фиброзу. Кроме того, TGF-β1 является ключом к индукции фиброза и EMT11; повышенная экспрессия TGF-β1 ускоряла прогрессирование фиброза легких при ЭМП. Эта модель успешно проанализировала влияние никотина на силикоз и еще раз подчеркнула важность отказа от никотина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были проведены в соответствии с рекомендациями, выпущенными Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (8-е издание NRC) и одобрены Комитетом по этике животных Аньхойского университета науки и технологий.
1. Подготовка животных
- Содержать 32 самца мышей C57/BL6 в возрасте 8 недель в лаборатории с 12-часовым циклом свет/темнота. Обеспечьте мышам свободный доступ к пище и воде.
- После 2 недель акклиматизации к окружающей среде, когда 10-недельные мыши весят 23-26 г, используйте случайные числа, сгенерированные компьютером, чтобы случайным образом сгруппировать животных без разделения, в результате чего получатся четыре группы мышей: контрольная группа (Con), никотиновая группа (Nic), группа кремния (SiO 2) и никотин в сочетании с группой кремния (Nic + SiO2).
2. Подготовка никотина
ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность никотина составляет 1,01 г/мл.
- Растворите никотин в безводном этаноле и разбавьте в 20 раз, чтобы получить исходный раствор никотина 50 мг/мл.
- Разбавьте исходный раствор никотина в 1000 раз стерильным физиологическим раствором, чтобы получить рабочий раствор в концентрации 0,05 мг/мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните никотин вдали от света. Исходный раствор можно хранить при температуре 4 °C до 1 недели.
3. Приготовление диоксида кремния
- Суспендируйте стерильный кристаллический диоксид кремния в физиологическом растворе, чтобы получить суспензию кремнезема 20 мг/мл, и осцилляйте ее на ультразвуковой водяной бане в течение 25 минут.
- Встряхните кремнеземную суспензию с помощью вихревого осциллятора в течение 3 мин, прежде чем мыши получат капельницу из носа. Перемешайте кремнеземную суспензию, пипетируя пипеткой 2-3 раза вверх и вниз пипеткой объемом 200 мкл, а затем возьмите 50 мкл для капельницы из носа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензию диоксида кремния следует как можно скорее смешать и ввести через назальную капельницу.
4. Отлов мышей и воздействие никотина
- Взвешивайте мышей и записывайте их ежедневно перед воздействием.
- С 1 по 40 день подкожно вводите никотин два раза в день (с интервалом в 12 часов) мышам в группах Nic и Nic+ SiO2 . Используйте дозу никотина 0,25 мг/кг; Например, убедитесь, что мышь весом 25 г получает 6,25 мкг никотина. Для этой мыши объем инъекции будет следующим: 6,25/0,05 = 125 мкл. Одновременно мышам из группы Con ввести равный объем физиологического раствора.
- Подготовьте необходимые шприцы объемом 1 мл для каждой группы и используйте их для аспирации объема инъекции никотина или физиологического раствора. Перед тем, как принять никотин, сначала наберите в шприц 0,1-0,2 мл воздуха, а затем наберите 125 мкл никотина. Осторожно постучите по шприцу, чтобы наполнить иглу и передний конец шприца никотином. Поместите никотиносодержащий шприц в лоток, защищенный от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инъекции 0,1-0,2 мл воздуха находится позади никотина, гарантируя, что вся жидкость будет успешно введена мыши. - Возьмитесь правой рукой за хвост мыши, а когда животное расслабится, большим и указательным пальцами левой руки надавите на кожу на задней части шеи от хвоста до головы до края уха, применяя умеренное давление. После этого отпустите правую руку, а левым мизинцем и безымянным пальцем зажмите хвост и задние конечности, после чего мышь будет полностью обездвижена левой рукой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмитесь за мышь с соответствующей силой. Недостаточная сила позволяет мышам легко кусаться, в то время как чрезмерная сила может привести к удушью мышей. - Используя правую руку для инъекции, проколите шприцем кожу на задней части шеи возле края уха мышей в направлении головы к хвосту и введите никотин с равномерной скоростью. Обратите внимание на полукруглую выпуклость кожи, которая указывает на успешную инъекцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда игла вонзится в кожу, возникнет чувство сопротивления; Сопротивление исчезает после того, как игла была введена. В этот момент иглу нужно слегка отстранить, чтобы вводить медленно и равномерно.
5. Воздействие диоксида кремния in vivo
- На 5-19-е сутки закапывают суспензию диоксида кремния в носовую полость мышей групп SiO2 и Nic+SiO2. Быстро обезболить каждую мышь 2% изофлураном в наркозном аппарате в дозе 3,6 мл/ч. После анестезии положите мышь на ладонь одной руки, и обнажите носовую полость мыши. Закапывают 50 мкл кремнеземной суспензии в полость носа в течение 4-8 с.
- Чтобы суспензия кремнезема как можно скорее попала в легкие, после закапывания осторожно прижмите сердце мыши указательным пальцем в течение 3-5 с, 3-5 раз в секунду, чтобы повысить частоту дыхания.
- После того, как дыхание мыши постепенно станет равномерным, поместите мышь в клетку для наблюдения в течение 3 минут.
- Для всех мышей, получающих кремнеземную суспензию, повторите шаги 1-3. В контрольной группе закапывают в полость носа 50 мкл стерильного физиологического раствора на 5-19 день.
6. Получение свежих и фиксированных легочных тканей
- На 41-й день использовать 50 мг/кг пентобарбитала натрия для внутрибрюшинной анестезии мышей в дозе 0,1 мл/20 г в зависимости от массы их тела. Зафиксируйте конечности на поролоновой тестовой пластине, и опрыскайте мех 75% спиртом.
- Выполните сердечную перфузию, чтобы получить свежую легочную ткань, разрежьте среднюю линию живота, чтобы обнажить грудную полость, и сделайте небольшое отверстие на верхушке правого сердца. Затем медленно и равномерно введите 20 мл предварительно охлажденного фосфатно-солевого буфера (PBS) из верхушки левого сердца, заставляя кровь вытекать из отверстия, созданного на верхушке правого сердца. Выньте всю долю легкого, поместите ее в предварительно охлажденную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и переложите до −80 °C для хранения до экстракции белка.
- Перфузии другим мышам 20 мл предварительно охлажденного PBS, а затем 10 мл 4% параформальдегида в том же месте, чтобы зафиксировать целые легкие; сохранить каждое легкое в 30 мл 4% PFA.
- Через 72 ч закрепить ткани легких в парафин.
- Погрузить легочную ткань в приготовленный фиксатор на ультразвуковой водяной бане при 40 °С на 30 мин с последующим процессом обезвоживания в 75% этаноле, 95% этаноле и безводном этаноле по 50 мин.
- Промыть 2 раза ксилолом по 50 мин.
- Поместите ткань в расплавленный парафин при температуре 55-60 °С на 2-3 ч так, чтобы ксилол в легочной ткани постепенно замещался парафином.
- Зафиксируйте легочную ткань в рамке для закладки парафином, и подождите, пока восковой блок затвердеет. После того, как восковой блок затвердеет, используйте парафиновую секционную машину, чтобы разрезать легкое на 4-5 мкм.
- Поместите срезы легких в сверхчистую воду с температурой 45 °C. После того, как парафин расплавится, загрузите срез легкого на предметное стекло микроскопа.
7. Окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ)
- Выпекайте предметные стекла при температуре 60 °C в течение 2 часов и поместите их в ксилол для депарафинизации на 2 x 30 минут. Затем поместите предметные стекла в безводный этанол, 95% этанол, 85% этанол и 75% этанол на 5 минут каждый. Наконец, промойте их в течение 3 x 5 минут сверхчистой водой.
- Капнуть 50 мкл раствора для окрашивания гематоксилина на легочную ткань с помощью пистолета-пипетки и окрашивать в течение 5 мин; Затем промойте ломтики проточной водой в течение 5 минут.
- Добавьте 50 мкл 2% соляной кислоты в этаноле на срез и промойте дистиллированной водой в течение 30 с. Затем добавьте 50 мкл раствора для окрашивания эозина в легочную ткань для окрашивания в течение 1 минуты.
- Обезвоживайте, прозрачьте и герметизируйте парафиновые срезы.
- Добавьте 100-150 мл 75% этанола, 85% этанола, 95% этанола, безводного этанола и ксилола в комбинированный пластиковый краситель. Поместите предметные стекла в 75%, 85%, 95% и безводный этанол на 5 минут каждый, чтобы обезвоживать.
- Затем поместите предметные стекла в ксилол на 5 минут, чтобы они стали прозрачными.
- Наконец, капните 20 мкл нейтральной жевательной резинки на легочную часть и наложите на предметное стекло покровное стекло, чтобы запечатать его.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные действия выполняются при комнатной температуре.
8. Окрашивание по Массону
- Удалите парафин, увлажните и промойте парафиновые срезы, как описано в шаге 7.1.
- Окрасьте срезы 50 мкл сконфигурированного раствора для окрашивания гематоксилина Вейгерта в течение 7 мин, затем 50 мкл кислого раствора этанола для фракционирования в течение 10 с и промойте проточной водой, чтобы ядра приобрели синий цвет.
- Прокрасьте срезы 50 мкл раствора трихрома Массона в течение 4 минут и промойте водой.
- Промойте срезы дистиллированной водой в течение 1 минуты, а затем покрасьте красной кислотой Lichun пурпурного цвета в течение 7 минут.
- Промыть срезы слабокислотным рабочим раствором (30% соляная кислота) в течение 1-2 мин, раствором фосфомолибдиновой кислоты в течение 1-2 мин и слабым кислотным рабочим раствором в течение 1-2 мин.
- Окрасьте срезы в растворе анилинового синего красящего в течение 2 мин, а затем промыть слабым кислотным рабочим раствором в течение 1 мин.
- Обезвоживают срезы 95%-ным этанолом, затем безводным этанолом в течение 1 с, прозрачят ксилолом в течение 1 с и, наконец, запечатывают нейтральной смолой, как описано в шаге 7.4.
9. Иммуногистохимия
- Выпекайте ломтики при температуре 60 °C в течение 6 часов. Удалите парафин, увлажните и промойте парафиновые срезы, как описано в шаге 7.1.
- Извлечение антигена: поместите ломтики в термостойкую пластиковую коробку для нарезки, содержащую достаточное количество раствора для извлечения цитратного антигена, чтобы погрузить ломтики, и кипятите в течение 20-30 минут.
- Остудите до комнатной температуры, удалите срезы и промойте деионизированной водой. Затем замочите на 2 x 5 мин в PBS, содержащем 0,5% Tween-20 (PBST).
- Нарисуйте петлю возле участка легких на предметном стекле гидрофобной ручкой, чтобы образовался гидрофобный круг.
- Добавить по каплям 50 мкл 3% раствора перекиси водорода (3%H2O2) и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре, защищенной от света, для инактивации эндогенной пероксидазы.
- Замочите ломтики в PBST на 3 x 5 минут.
- Добавьте 50 мкл 5% бычьего сывороточного белка (BSA)-PBST по каплям к ломтикам и заблокируйте на 1 ч при комнатной температуре.
- Выбросьте блокирующий раствор, добавьте по каплям 50 мкл разбавленных первичных антител CD206 (разведение: 1:1,500), TGF-β1 (разведение: 1:200) и виментина (разведение: 1:2,000) по каплям к ломтикам и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе все антитела были разведены в 5% БСА. - На следующий день верните ломтики до комнатной температуры (40 мин). Вымойте ломтики, как описано в шаге 9.6.
- Разведите вторичное антитело в 5% БСА. Добавьте по каплям 50 мкл вторичного антитела, меченного пероксидазой хрена (разведение: 1:500), и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре. Вымойте ломтики, как описано в шаге 9.6.
- Капните 50 мкл раствора 3,3'-диаминобензидина (DAB), соответствующего меченному ферментом вторичному антителу, на легочную ткань и инкубируйте в течение 5-10 мин в черной иммуногистохимической влажной коробке. Наблюдайте под микроскопом до тех пор, пока цвет не станет ярко-коричневым. Промойте ломтики дистиллированной водой, чтобы прекратить реакцию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коричневое окрашивание считается положительным окрашиванием. - Окрасить 50 мкл гематоксилиновой краски в течение 30 с и промыть проточной водой. Затем замочите ломтики в 75%, 85%, 95% и безводном этаноле на 3 минуты каждый, а затем в ксилоле на 2 x 10 минут. Запечатайте предметные стекла, как описано в шаге 7.4.
10. Вестерн-блоттинг-анализ
- Достаньте легочную ткань из морозильной камеры и взвесьте ее. Далее добавляют 150 мкл лизисного буфера RIPA, содержащего PMSF, на 20 мг легочной ткани. Лизируйте легкие мыши на льду в течение 3-5 минут с помощью ручного гомогенизатора, осторожно встряхивайте в течение 2 ч при 4 °C, чтобы обеспечить достаточный лизис легочной ткани, центрифугируйте при 4 °C и 14 800 × г в течение 15 минут и соберите надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 100 мМ фенилметансульфонилфторида (PMSF) за несколько минут до использования буфера для лизиса RIPA. Конечная концентрация PMSF составляет 1 мМ (например, 10 мкл PMSF + 990 мкл RIPA). - Используйте набор для концентрации белка BCA, чтобы определить концентрацию белка в образце, следуя инструкциям производителя. После определения, используя наименьшую концентрацию лизата белка в качестве основы, разбавляют ту же партию лизата белка RIPA до наименьшей концентрации для достижения той же массы и объема.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая нагрузка легочной ткани составляет 30 мкг. - Добавьте 40 мкл 5-кратного загрузочного буфера к 160 мкл лизата белка и нагревайте его при 100 °C в течение 10 минут.
- Соберите приготовленный 10%-ный гель для электрофореза с полиакриламидным гелем на основе додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) в системе электрофореза вестерн-блоттинг, добавьте буфер для электрофореза SDS-PAGE, осторожно вытащите гребень для электрофореза и медленно и равномерно добавьте 20 мкл образца белка на лунку. Включите питание и начните электрофорез при напряжении 80 В на 30 мин. После того, как белки достигнут нижнего слоя геля, переключают на 100 В и продолжают электрофорез в течение 60-70 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для электрофореза необходим свежий буфер для электрофореза. - Перенос белков на мембрану из ПВДФ методом мокрого переноса. Заранее активируйте мембрану ПВДФ метанолом (5-30 с). Выньте пластину с гелем для электрофореза, осторожно подденьте ее, поместите разделительный гель во влажный буфер переноса, сделайте сэндвич с электрическим переносом и соберите систему влажного переноса. Наполните резервуар для электрофореза буфером для переноса и перенесите при 400 мА в течение 90 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для переноса охлаждается заранее, чтобы избежать воздействия высоких температур во время влажного переноса. - Промыть мембрану ПВДФ трис-буферным физиологическим раствором с 0,5% Tween-20 (TBST) в течение 3 x 5 мин. Заблокируйте мембрану из ПВДФ 5%-ным обезжиренным молоком, разбавленным в TBST, и инкубируйте на шейкере при комнатной температуре в течение 60 мин; затем промыть TBST в течение 2 минут. После промывки инкубируйте мембрану в течение ночи при 4 °C с первичными антителами виментином (1:5 000) и GAPDH (1:10 000), разбавленными 5% БСА.
- Поместите мембрану при комнатной температуре на 30 минут и промойте TBST в течение 5 x 5 минут. После промывки инкубируют мембрану со вторичным антителом (1:10 000), разведенным в 5% обезжиренном молоке, в течение 60 мин при комнатной температуре.
- Поместите мембрану белковой стороной вверх, капните приготовленный рабочий раствор ЭХЛ, инкубируйте в течение 1-2 мин и наблюдайте за результатами с помощью гелевого тепловизора. Используйте значения оттенков серого, измеренные программным обеспечением в гелевом имидж-сканере, для оценки уровней экспрессии белка.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае GAPDH служил внутренней ссылкой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Была создана мышиная модель для изучения никотина в сочетании с воздействием диоксида кремния для изучения потенциальной роли никотина в прогрессировании силикоза у мышей. На рисунке 1 показана экспериментальная процедура использования мышиной модели с двойным воздействием, в которой инъекция никотина сочеталась с назальной инстилляцией кремнеземной суспензии. Патологоанатомические изменения мышей в каждой группе наблюдали с помощью ОН-окрашивания. У мышей, подвергшихся воздействию никотина в сочетании с диоксидом кремния, наблюдалось значительно более серьезное повреждение легких, чем у тех, кто подвергался воздействию только никотина или диоксида кремния. Лимфоциты увеличивались вблизи лимфатических сосудов в легких мышей, подвергавшихся воздействию никотина, образуя воспалительные кластеры клеток. Окрашивание по Массону выявило значительное увеличение отложения коллагеновых волокон в легких, подвергшихся воздействию никотина в сочетании с диоксидом кремния, по сравнению с легкими в других группах, и это было подтверждено количественной окраской по Массону (рис. 2). Альвеолярная структура была разрушена у мышей, подвергшихся воздействию диоксида кремния, и количество макрофагов увеличилось. Однако после воздействия никотина в сочетании с диоксидом кремния наблюдалась значительная воспалительная клеточная инфильтрация, и появлялись узелки фибробластов. Кроме того, накопленные макрофаги, особенно макрофаги М2, присутствуют в группе двойного воздействия. Макрофаги М2 необходимы для прогрессирующей фиброзной стадии силикоза.
Кроме того, значительное увеличение профибротического фактора TGF-β1 наблюдалось при иммуногистохимическом (ИГХ) окрашивании в легких мышей с двойным воздействием, особенно в воспалительных клетках вблизи лимфатических сосудов (рис. 3). TGF-β1, секретируемый макрофагами, способствует ЭМП эпителиальных клеток и легочному фиброзу12. По сравнению с мышами, подвергавшимися воздействию только диоксида кремния, уровни виментина были значительно повышены в легких мышей с двойным воздействием. Как окрашивание ВПХ, так и количественное определение белка указывали на тяжелую ЭМП у мышей с двойным воздействием (рис. 4). Совокупные данные свидетельствуют о том, что хроническое воздействие диоксида кремния способствует развитию ЭМП после повышения регуляции TGF-β1, что приводит к увеличению фибробластов и прогрессированию фиброза. В то же время добавление никотина ускоряет процесс фиброза легких, усугубляя ЭМП, позволяя фиброзу легких появиться раньше. Эта модель предназначена для изучения влияния никотина на легочный фиброз, который является следствием хронического воздействия диоксида кремния на человека.
Рисунок 1: Разработка экспериментальной модели сочетанного воздействия никотина и кремния на мышей. Непрерывное введение никотина в течение 1-40 дней и непрерывное назальное закапывание диоксида кремния в течение 5-19 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Никотин способствует образованию фибробластических масс в легких мышей, подвергшихся воздействию диоксида кремния. (А) Для визуализации патологических изменений в легких использовали окрашивание HE. У мышей с двойным воздействием наблюдалась тяжелая воспалительная клеточная инфильтрация и фиброз. Зелеными стрелками обозначены воспалительные клеточные образования. Масштабная линейка = 50 мкм. (B) Окрашивание по Массону было использовано для выявления коллагеновых волокон в легких. Масштабная линейка = 50 мкм. (C) Количественное определение коллагеновых волокон в легких. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Увеличение CD206-положительных клеток и TGF-β1 в легких мышей, подвергшихся двойному воздействию никотина и кремнезема. (A) Окрашивание CD206 методом ВПХ использовалось для наблюдения за распределением и экспрессией макрофагов у мышей с двойным воздействием. Количество CD206-положительных макрофагов увеличилось в легких мышей после комбинированного воздействия никотина и диоксида кремния. Короткими стрелками обозначены CD206-положительные клетки. Масштабная линейка = 50 мкм. (B) TGF-β1, промотор фиброза, был повышен у мышей с двойным воздействием. Длинные стрелки обозначают TGF-β1-положительные клетки. Масштабная линейка = 50 мкм. (C,D) AOD CD206 и TGF-β1. AOD = IOD (интегрированная оптическая плотность)/площадь. AOD отражает концентрацию CD206 и TGF-β1 на единицу площади. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Сокращения: TGF-β1 = трансформирующий фактор роста-бета; ИГХ = иммуногистохимия; AOD = средняя оптическая плотность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Стимулирование фиброза легких никотином у мышей, подвергшихся воздействию диоксида кремния, при обострении ЭМП. (А) Экспрессия виментина в каждой группе наблюдалась при окрашивании ВПХ. Виментин был сильно экспрессирован в легких мышей, подвергшихся воздействию никотина и диоксида кремния. Масштабная линейка = 50 мкм.(B) Вестерн-блот экспрессии виментина в каждой группе экспозиции с увеличением виментина в легочных тканях мышей с двойным воздействием. (C) Значение AOD виментина было значительно выше в группе с двойным воздействием по сравнению с другими группами. (D) Относительный уровень экспрессии белка виментина по сравнению с GAPDH. Экспрессия виментина в группе двойного воздействия была значительно выше, чем в группах, подвергавшихся воздействию никотина или диоксида кремния. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Сокращения: EMT = эпителиально-мезенхимальный переход; AOD = средняя оптическая плотность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для изучения роли и потенциальных механизмов одновременного воздействия никотина и кристаллического диоксида кремния необходима модель животного с двойным воздействием. Эта модель была достигнута в данной работе путем подкожного введения никотина и назального капельного введения диоксида кремния. Чтобы обеспечить успешную инъекцию никотина, оператор должен научиться хватать мышей, так как захват кожи в задней части шеи может быть болезненным для них. Поэтому важно позволить мышам постепенно адаптироваться к хватанию. Кроме того, критическим этапом воздействия диоксида кремния на мышей является капельница из носа. Чтобы повысить успешность процедуры и выживаемость мышей, необходимо заранее практиковать капельницу из носа.
При выполнении инъекции шприц следует провести по голове мыши, чтобы избежать сильной борьбы, когда мышь увидит шприц. Правой рукой следует крепко схватить мышь за хвост, а левой рукой осторожно и осторожно протолкнуть кожу к краю уха на задней части шеи и ущипнуть кожу там. Отпустив хвост мыши правой рукой, хвост и задние конечности следует стабилизировать с помощью большого и безымянного пальцев левой руки, чтобы предотвратить укусы. Используя шприц объемом 1 мл в правой руке, иглу следует ввести в дряблую кожу над шеей под углом 30° в направлении головы к хвосту. Игла должна быть немного отведена после того, как сопротивление будет потеряно, а инъекция должна вводиться медленно и равномерно. На 5-19 день мыши в группе двойного воздействия подвергались воздействию никотина и диоксида кремния. Рекомендуется ввести никотин в 08:00 утра, затем закапать диоксид кремния через нос в 14:00 и еще одну инъекцию никотина в 20:00 вечера. Две инъекции никотина должны быть сделаны с интервалом в 12 часов, чтобы избежать последствий повторного хватания мышей.
Выполнение подкожных инъекций и капельниц из носа сопряжено с рядом технических проблем. Для подкожных инъекций мышей следует захватывать с соответствующей силой. Если кожа на задней части шеи зажата слишком сильно, дыхательные пути мыши будут заблокированы, что быстро приведет к удушью. Для оптимальной прочности кожу в задней части шеи следует зажимать до тех пор, пока глазные яблоки не выступят незначительно. В это время мышь чувствует наименьшую боль и дышит ровно. Кроме того, следует использовать шприц объемом 1 мл, очищенный от воздуха, чтобы набрать инъекцию никотина из трубки, а затем еще 0,1-0,2 мл воздуха. Перед инъекцией пузырьки следует аккуратно стряхнуть. Из-за небольшого объема инъекции никотин, оставшийся на кончике конца иглы, может привести к недостаточной дозе. Ключевыми частями инъекции являются быстрое введение иглы, медленное введение никотина и осторожное извлечение иглы. Для назального капельного введения в этом исследовании носовая полость мышей была полностью обнажена под глубоким наркозом с последующим медленным и равномерным введением суспензии диоксида кремния. Также важно осторожно надавливать на грудную полость после воздействия диоксида кремния, чтобы избежать кашля или удушья.
Данная модель имеет определенные ограничения. Частицы кремнезема размером 1-5 мкм, использованные в экспериментах, не были собраны из окружающей среды и представляли собой чистые частицы кремнезема. Напротив, в реальных профессиональных условиях рабочие могут подвергаться воздействию различных опасных материалов, а не только частиц кремнезема, таких как смесь угля и кварцевой пыли на керамическом заводе или в угольной шахте. Мы использовали назальный инстилляционный диоксид кремния для достижения низких доз и многократное воздействие для имитации хронического облучения рабочих. В модели мышей с двойным воздействием, несмотря на то, что никотин не образуется при воздействии сигаретного дыма, инъекционный никотин попадает непосредственно в кровоток, что позволяет более целенаправленно исследовать роль никотина в процессе силикоза и избежать воздействия других компонентов сигаретного дыма.
В научных исследованиях силикоза, как правило, использовались однофакторные мышиные модели, либо путем ингаляции, либо через бронхиальную перфузию кремнезема, для оценки роли кремнезема в развитии заболевания. Альтернативным подходом является назальное закапывание диоксида кремния, которое является простым и легким и позволяет установить модели многократного и хронического воздействия диоксида кремния13. Хорошо зарекомендовавшая себя модель назального капельного введения диоксида кремния наносит минимальный ущерб мышам и может быть объединена с другими факторами для создания многофакторной модели животных. Кроме того, основными методами воздействия никотина на мышей являются никотин в питьевой воде, подкожная инъекция никотина, инфузия никотина с помощью осмотического мини-насоса и воздействие табачного дыма14. Подкожная инъекция, используемая в модели двойного воздействия, позволяет точно установить дозировку и время введения никотина, гарантируя, что каждой мыши будет введена одинаковая доза.
Короче говоря, животная модель никотина в сочетании с воздействием диоксида кремния воспроизводит реалистичную картину хронического воздействия, и эта модель может быть использована для дальнейших исследований влияния никотина на воспаление и фиброз при развитии силикоза. Кроме того, эта модель служит основой для формирования модели животных с двойным воздействием с несколькими дозами и временными рамками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Инновационной программой университетской синергии провинции Аньхой (GXXT-2021-077) и Инновационным фондом выпускников Аньхойского университета науки и технологий (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
