Summary
この研究では、実験的な珪肺症マウスの肺線維症の進行に対するニコチンの相乗効果を研究するためのマウスモデルについて説明します。二重曝露マウスモデルは、ニコチンとシリカに同時に曝露した後の肺の病理学的進行をシミュレートします。説明されている方法は単純で再現性が高いです。
Abstract
喫煙とシリカへの曝露は職業労働者の間で一般的であり、シリカは非喫煙者よりも喫煙者の肺を傷つける可能性が高くなります。タバコの主要な中毒性成分であるニコチンが珪肺症の発症に果たす役割は不明です。本研究で用いたマウスモデルは、単純で制御が容易であり、ヒトの上皮間葉転換による肺線維症に対する慢性ニコチン摂取とシリカへの反復曝露の影響を効果的にシミュレートしました。さらに、このモデルは、タバコの煙に含まれる他の成分の影響を回避しながら、珪肺症に対するニコチンの影響を直接研究するのに役立ちます。
環境適応後、マウスに0.25mg/kgのニコチン溶液を首の上のゆるい皮膚に、毎朝夕方、12時間間隔で40日間皮下注射した。さらに、結晶性シリカ粉末(1〜5μm)を通常の生理食塩水に懸濁し、20mg/mLの懸濁液に希釈し、超音波水浴を用いて均一に分散させた。イソフルラン麻酔をかけたマウスは、このシリカダスト懸濁液50μLを鼻から吸入し、胸部マッサージ で 目覚めさせた。シリカ曝露は、5〜19日目に毎日投与されました。
二重ばく露マウスモデルをニコチンにばく露し、次にシリカにばく露したが、これは両方の有害因子にばく露された労働者のばく露歴と一致した。さらに、ニコチンはマウスの上皮間葉転換(EMT)を介して肺線維症を促進しました。この動物モデルは、珪肺症の発症に対する複数の要因の影響を研究するために使用できます。
Introduction
作業者のシリカ曝露は、一部の職業環境では避けられず、一度シリカに曝露すると、環境から除去した後でも劣化が進行します。さらに、これらの労働者のほとんどが喫煙しており、従来のタバコには何千もの化学物質が含まれており、主な中毒性成分はニコチン1です。電子たばこは、若い年齢層でますます人気が高まっています2。これらの電子タバコはニコチン送達システムとして機能し、ニコチンへのアクセスを増加させ、肺感受性と肺炎を増加させます3。また、タバコの煙は、ブレオマイシンに曝露されたマウスの肺線維症を加速し4、シリカに曝露されたマウスの肺毒性と線維症を増加させます5,6。ただし、ニコチンがシリカによって引き起こされる炎症性および肺線維症プロセスに影響を与える可能性があるかどうかは、まだ調査されていません。
高用量のシリカを気管に1回吸入することによって確立された珪肺症マウスモデルは、マウスにとって外傷性です。この方法では、珪肺症モデルがすぐに提供されますが、作業者が繰り返しシリカにさらされる環境の現実には一致しません。そこで、点鼻薬 で 低用量のシリカ懸濁液を繰り返し投与することで、シリカ曝露マウスモデルを確立しました。この用量は、マウスに炎症や線維症を引き起こす可能性があります。.
他のタバコ成分の影響を回避するために、このマウスモデルを首のゆるい皮膚にニコチンを皮下注射し、中毒性成分であるニコチンが珪肺症に及ぼす影響を測定しました。皮下注射を投与することで、正確な投与が可能となり、ニコチン曝露モデルの作成や用量毒性反応、中毒の観察が可能になります。ニコチン中毒モデルは、0.2-0.4 mg / kg 7,8のニコチン注射用量で、雄マウスで開発されています。このモデルでは、中毒マウスの薬物探索ニーズを満たすために、12時間間隔で2回の皮下注射を行った。このマウスのニコチン依存症モデルは、ヒトの喫煙習慣とシリカへの曝露をシミュレートするのに役立ちます。
単一因子動物モデルには疾患研究の限界があるのに対し、ここで説明する方法は、ニコチンとシリカの共曝露の2因子マウスモデルを含みます。シリカ曝露の前に、マウスは喫煙者のニコチン曝露を再現するためにニコチンに事前曝露されました。その後、喫煙歴のある個人の作業環境でシリカ曝露を模倣するために、5日目から19日目までシリカ曝露が行われました。
肺胞マクロファージは、肺の炎症や線維化の調節に重要な役割を果たすことが知られています。マクロファージはシリカを吸入してもシリカを分解できず、マクロファージの分極またはアポトーシス9 を引き起こし、腫瘍壊死因子α(TNF-α)やトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)などのサイトカインを放出します。表面マーカーCD86の存在によって識別されるM1マクロファージは、珪肺症における炎症反応の主要な扇動者であり、CD206によってマークされるM2マクロファージは、状態10の線維化期の原因である。二重ばく露マウスでは、ニコチンはシリカ損傷肺のマクロファージのM2表現型への分極を誘導し、肺線維症を促進しました。さらに、TGF-β1は線維症およびEMT11の誘導の鍵である。TGF-β1の発現増加は、EMTによる肺線維症の進行を加速させました。このモデルは、珪肺症に対するニコチンの効果を分析することに成功し、ニコチン禁煙の重要性をさらに強調しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての手順は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用に関するガイド(NRCの第8版)によって発行されたガイドラインに従って実施され、安徽科技大学の動物倫理委員会によって承認されました。
1.動物の調製
- 32匹の雄のC57/BL6マウスを8週間の実験室で12時間の明暗サイクルで飼育する。マウスが餌と水に自由にアクセスできることを確認してください。
- 2週間の環境順応後、10週齢のマウスの体重が23〜26gの場合、コンピューターによって生成された乱数を使用して、動物を分割せずにランダムにグループ化し、対照群(Con)、ニコチン基(Nic)、シリカ基(SiO 2)、およびシリカ基と結合したニコチン(Nic+ SiO2)の4つのグループのマウスを作成します。
2.ニコチン製剤
注:ニコチン密度は1.01 g / mLです。
- ニコチンを無水エタノールに溶解し、20倍に希釈して50 mg/mLのニコチンストック溶液を調製します。
- ニコチン原液を滅菌生理食塩水で1,000倍に希釈し、0.05 mg/mLの濃度で作業溶液を作ります。
注意: ニコチンは光を避けて保管してください。原液は4°Cで最大1週間保存できます。
3. シリカ調製
- 滅菌結晶性シリカを生理食塩水に懸濁して20 mg/mLのシリカ懸濁液を調製し、超音波振とう水浴中で25分間振動させます。
- マウスが点鼻薬を受ける前に、渦振動子でシリカ懸濁液を3分間振とうします。200μLのピペットで2x-3xピペッティングしてシリカ懸濁液を混合し、50μLを点鼻薬として取ります。
注:二酸化ケイ素懸 ?? 液を混合し、できるだけ早く点鼻薬 で 投与する必要があります。.
4.マウスの捕獲とニコチン曝露
- マウスの体重を量り、曝露前に毎日体重を記録します。
- 1〜40日目に、NicおよびNic + SiO 2グループのマウスに1日2 回(12時間間隔)ニコチンを皮下注射します。0.25 mg / kgのニコチン用量を使用します。たとえば、体重25gのマウスに6.25μgのニコチンが含まれていることを確認します。このマウスの場合、注入量は 6.25/0.05 = 125 μL となります。 同時に、Con群のマウスに等量の生理食塩水を注入します。
- 各グループに必要な 1 mL シリンジを準備し、それらを使用してニコチンまたは生理食塩水の注入量を吸引します。ニコチンを取り込む前に、まず0.1〜0.2 mLの空気をシリンジに引き込み、次に125μLのニコチンを吸い上げます。.シリンジを慎重に軽くたたいて、針とシリンジの前端をニコチンで満たします。.ニコチン含有シリンジを光から保護されたトレイに入れます。.
注:注射時には、0.1〜0.2 mLの空気がニコチンの後ろにあり、すべての液体がマウスに正常に投与されることを保証します。. - 右手でネズミの尻尾をつかみ、動物がリラックスしたら、左手の親指と人差し指を使って、尾から頭、耳の端まで首の後ろの皮膚を押し、適度な圧力をかけます。その後、右手を離し、左の小さな親指と薬指で尻尾と後肢をつまむと、マウスは左手で完全に動けなくなります。
メモ: マウスを適切な力でつかみます。力が足りないとネズミが噛みつきやすくなり、力が強すぎるとネズミが窒息してしまうことがあります。 - マウスの耳端付近の首の後ろの皮膚を注射器で頭から尾まで穿刺し、ニコチンを一定の割合で注射する。注射が成功したことを示す半円形の皮膚の膨らみを探します。
注意: 針が皮膚に刺さると、抵抗感があります。針が挿入されると抵抗が消えます。この時点で、針を少し引き抜いて、ゆっくりと均一に注入する必要があります。
5. in vivoでのシリカ曝露
- 5〜19日目に、二酸化ケイ素懸濁液をSiO2およびNic+SiO2グループのマウスの鼻腔に点滴します。麻酔器で2%イソフルランを投与し、3.6 mL / hの用量で各マウスに迅速に麻酔をかけます。麻酔後、マウスを片手のひらに置き、マウスの鼻腔を露出させます。50μLのシリカ懸濁液を4〜8秒以内に鼻腔に注入します。
- シリカ懸濁液ができるだけ早く肺に入るように、点眼後、マウスの心臓を人差し指で3〜5秒、毎秒3〜5回静かに押して、呼吸数を促進します。
- マウスの呼吸が徐々に均一になったら、マウスをケージに入れて3分間観察します。
- シリカ懸濁液を投与されたすべてのマウスについて、手順1〜3を繰り返します。対照群では、5〜19日目に50μLの滅菌生理食塩水を鼻腔に注入します。
6.新鮮で固定された肺組織の獲得
- 41日目に、50 mg / kgのペントバルビタールナトリウムを使用して、体重に応じて0.1 mL / 20 gの用量でマウスを腹腔内に麻酔します。.フォームテストプレートに手足を固定し、75%のアルコールを毛皮にスプレーします。
- 心臓灌流を行って新鮮な肺組織を取得し、腹部の正中線を切断して胸腔を露出させ、右心臓の頂点に小さな開口部を作ります。次に、予冷したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)20mLを左心尖部からゆっくりと均一に注入し、右心尖部にできた開口部から血液を流出させます。肺葉全体を取り出し、予冷した1.5 mL遠心チューブに入れ、タンパク質抽出を保留して保存するために-80°Cに移します。
- 他のマウスに20 mLの予冷PBSを灌流し、続いて10 mLの4%パラホルムアルデヒドを同じ場所に灌流して、肺全体を固定します。各肺を30 mLの4%PFAで保存します。
- 72時間後、固定された肺組織をパラフィンに包埋します。
- 調製した固定液に肺組織を40°Cの超音波水浴に30分間浸し、続いて75%エタノール、95%エタノール、無水エタノールでそれぞれ50分間脱水プロセスを行います。
- キシレンで2回、それぞれ50分間洗浄します。
- 55〜60°Cで2〜3時間溶融パラフィンワックスに組織を入れ、肺組織のキシレンが徐々にパラフィンワックスに置き換わるようにします。
- 肺組織を包埋フレームにパラフィンで固定し、ワックスブロックが固まるのを待ちます。ワックスブロックが固まったら、パラフィン切片化機を使用して肺を4〜5μmでスライスします。
- 肺切片を45°Cの超純水に入れます。 パラフィンが溶けたら、肺切片を接着顕微鏡スライドにロードします。
7. ヘマトキシリンとエオシン(HE)の染色
- スライドを60°Cで2時間焼き、スライドをキシレンに浸して2 x 30分間脱ワックスします。続いて、スライドを無水エタノール、95%エタノール、85%エタノール、75%エタノールにそれぞれ5分間入れます。最後に、超純水で3 x 5分間洗浄します。
- 50 μLのヘマトキシリン染色溶液をピペットガンで肺組織に滴下し、5分間染色します。次に、スライスを流水で5分間洗います。
- 50 μLの2%塩酸エタノールを切片に加え、蒸留水で30秒間すすぎます。次に、50 μLのエオシン染色溶液を肺組織に添加し、1分間染色します。
- パラフィン切片を脱水し、透明化し、密封します。
- 100〜150mLの75%エタノール、85%エタノール、95%エタノール、無水エタノール、およびキシレンを混合プラスチック染色タンクに加えます。スライドを75%、85%、95%、無水エタノールにそれぞれ5分間入れて脱水します。
- 次に、スライドをキシレンに5分間入れて透明にします。
- 最後に、20μLの中性ガムを肺切片に滴下し、スライドの上にカバーガラスを置いて密封します。
注意: 上記の手順は室温で実行されます。
8.マッソン染色
- ステップ7.1の説明に従って、パラフィン切片を脱ワックスし、水和させ、洗浄します。
- 50 μLのWeigertヘマトキシリン染色溶液で切片を7分間染色し、続いて50 μLの酸性エタノール分画溶液で10秒間染色し、流水で洗浄して核を青色に変えます。
- 切片を50 μLのMassonトリクローム溶液で4分間染色し、水で洗浄します。
- 切片を蒸留水で1分間すすぎ、次にLichun red acid magentaで7分間染色します。
- 弱酸性作動溶液(30%塩酸)で1〜2分間、リンモリブデン酸溶液で1〜2分間、弱酸性作業溶液で1〜2分間洗浄します。
- 切片をアニリンブルー染色液で2分間染色した後、弱酸性作業溶液で1分間洗浄します。
- 切片を95%エタノールで脱水した後、無水エタノールで1秒間脱水し、キシレンで1秒間透明化した後、最後にステップ7.4の説明に従って中性樹脂で密封します。
9. 免疫組織化学
- スライスを60°Cで6時間焼きます。ステップ7.1の説明に従って、パラフィン切片を脱ワックスし、水和させ、洗浄します。
- 抗原回収:スライスを沈めるのに十分なクエン酸抗原賦活化溶液を含む耐熱プラスチックスライスボックスに入れ、20〜30分間沸騰させます。
- 室温まで冷却し、切片を取り除き、脱イオン水ですすいでください。続いて、0.5% Tween-20(PBST)を含むPBSに5分×2分間浸漬します。
- 疎水性ペンでスライドの肺部分の近くにループを描き、疎水性の円を形成します。
- 50μLの3%過酸化水素溶液(3%H2O2)をスライスに滴下し、内因性ペルオキシダーゼの不活性化のために光から保護された室温で15分間インキュベートします。
- スライスをPBSTに3 x 5分間浸します。
- 50 μLの5%ウシ血清タンパク質(BSA)-PBSTをスライスに滴下し、室温で1時間ブロックします。
- ブロッキング溶液を廃棄し、希釈した一次抗体CD206(希釈倍率:1:1,500)、TGF-β1(希釈率:1:200)、ビメンチン(希釈率:1:2,000)をスライスに滴下し、4°Cで一晩インキュベートします。
注:この研究では、すべての抗体を5%BSAで希釈しました。 - 翌日、スライスを室温に戻します(40分)。手順9.6の説明に従ってスライスを洗います。
- 二次抗体を5%BSAで希釈します。西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体(希釈倍率:1:500)50 μLを滴下し、室温で1時間インキュベートします。手順9.6の説明に従ってスライスを洗います。
- 酵素標識二次抗体に対応する3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液50μLを肺組織に滴下し、黒い免疫組織化学的ウェットボックス内で5〜10分間インキュベートします。色が強い茶色になるまで顕微鏡で観察します。スライスを蒸留水ですすぎ、反応を終了します。
注:茶色の染色は陽性染色と見なされます。 - 50 μLのヘマトキシリン染色剤で30秒間染色し、流水で洗浄します。次に、スライスを75%、85%、95%、無水エタノールにそれぞれ3分間浸し、次にキシレンに2 x 10分間浸します。手順7.4の説明に従ってスライドを密封します。
10. ウェスタンブロット解析
- 冷凍庫から肺組織を取り出し、重さを量ります。次に、肺組織20mgあたりPMSFを含むRIPA溶解バッファー150μLを添加します。ハンドヘルドホモジナイザーを使用してマウスの肺を氷上で3〜5分間溶解し、肺組織を適切に溶解できるように4°Cで2時間静かに振とうし、4°Cおよび14,800 × g で15分間遠心分離し、上清を回収します。
注:RIPA溶解バッファーを使用する数分前に、100 mMのフェニルメタンスルホニルフルオニルフルオリド(PMSF)を添加します。PMSFの最終濃度は1 mMです(例えば、PMSF10 μL + RIPA990 μL)。 - BCAタンパク質濃度キットを使用して、メーカーの指示に従ってサンプルのタンパク質濃度を測定します。測定後、最小濃度のタンパク質ライセートをベースとして使用し、同じバッチのタンパク質ライセートをRIPAで最小濃度に希釈して、同じ質量と容量を実現します。
注:肺組織負荷の総量は30μgです。 - 160 μLのプロテインライセートに40 μLの5倍ローディングバッファーを加え、100°Cで10分間加熱します。
- 準備した10%ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルをウェスタンブロッティング電気泳動システムで組み立て、SDS-PAGE電気泳動バッファーを添加し、電気泳動コームを静かに引き出し、ウェルあたり20μLのタンパク質サンプルをゆっくりと均一に加えます。電源を入れ、80Vで30分間電気泳動を開始します。タンパク質が下部ゲル層に達したら、100Vに切り替え、60〜70分間電気泳動を続けます。
注:電気泳動には新しい電気泳動バッファーが必要です。 - 湿式転写によりタンパク質をPVDFメンブレンに転写します。事前にメタノールでPVDFメンブレンを活性化します(5〜30秒)。電気泳動ゲルプレートを取り出し、慎重にこじ開け、セパレーターゲルを湿式転写バッファーに入れ、電気転写サンドイッチを作り、湿式転写システムを組み立てます。電気泳動タンクに転写バッファーを充填し、400 mAで90分間移送します。
注:転写バッファーは、湿式転写中の高温の影響を避けるために、事前に冷却されています。 - PVDFメンブレンを0.5%Tween-20(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水で3 x 5分間洗浄します。TBSTで希釈した5%スキムミルクでPVDFメンブレンをブロックし、シェーカー上で室温で60分間インキュベートします。その後、TBSTで2分間洗浄します。洗浄後、一次抗体ビメンチン(1:5,000)およびGAPDH(1:10,000)を5%BSAで希釈したメンブレンを4°Cで一晩インキュベートします。
- メンブレンを室温で30分間置き、TBSTで5 x 5分間洗浄します。洗浄後、5%スキムミルクで希釈した二次抗体(1:10,000)とメンブレンを室温で60分間インキュベートします。
- メンブレンをタンパク質側を上にして置き、調製したECLワーキング溶液を滴下し、1〜2分間インキュベートし、ゲルイメージャーで結果を観察します。ゲルイメージャーのソフトウェアで測定されたグレースケール値を使用して、タンパク質発現レベルを評価します。
注:ここでは、GAPDHが内部リファレンスとして機能しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
マウスの珪肺症の進行におけるニコチンの潜在的な役割を調査するために、シリカ曝露と組み合わせたニコチンを研究するマウスモデルが確立されました。 図1 は、ニコチン注射とシリカ懸濁液の点鼻を組み合わせた二重曝露マウスモデルを使用した実験手順を示しています。各群のマウスの病理学的変化は、HE染色を用いて観察された。ニコチンとシリカの組み合わせに曝露されたマウスは、ニコチンまたはシリカのみに曝露されたマウスよりも有意に重度の肺損傷を示しました。ニコチンに曝露したマウスの肺のリンパ管付近でリンパ球が増加し、炎症性細胞塊を形成した。マッソン染色では、ニコチンとシリカの組み合わせに曝露された肺では、他のグループの肺と比較してコラーゲン線維沈着が有意に増加し、これはマッソン染色の定量化によって裏付けられました(図2)。シリカ曝露マウスでは肺胞構造が破壊され、マクロファージの数が増加しました。しかし、シリカと結合したニコチンに曝露した後、著しい炎症性細胞浸潤があり、線維芽細胞結節が現れました。さらに、蓄積されたマクロファージ、特にM2マクロファージは二重曝露群に存在する。M2マクロファージは、珪肺症の進行した線維化段階に不可欠です。
さらに、二重曝露マウスの肺、特にリンパ管近くの炎症細胞における免疫組織化学的(IHC)染色により、線維化促進因子TGF-β1の有意な増加が観察されました(図3)。マクロファージから分泌されるTGF-β1は、上皮細胞のEMTと肺線維症を促進する12。シリカのみに曝露したマウスと比較して、二重曝露マウスの肺のビメンチンレベルは有意に上昇しました。IHC染色とタンパク質定量の両方において、二重ばく露マウスの重度のEMTが示されました(図4)。これらの証拠を総合すると、慢性的なシリカ曝露はTGF-β1のアップレギュレーション後にEMTを促進し、線維芽細胞の増加と進行性線維症につながることが示唆されている。同時に、ニコチンの添加は、EMTを悪化させることによって肺線維症のプロセスを加速し、肺線維症が早期に現れることを可能にする。このモデルは、ヒトの慢性シリカ曝露の結果である肺線維症に対するニコチンの影響を調査するように設計されています。
図1:マウスのニコチンとシリカへの複合曝露の実験モデルの設計。 ニコチンを1〜40日間連続注射し、シリカを5〜19日間連続点滴します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ニコチンは、シリカに曝露されたマウスの肺における線維芽細胞腫瘤の形成を促進します。 (A)HE染色を用いて、肺の病理学的変化を可視化した。二重ばく露マウスは、重度の炎症性細胞浸潤および線維症を呈した。緑色の矢印は炎症細胞腫瘤を示します。スケールバー = 50 μm。 (B)マッソン染色を使用して、肺のコラーゲン線維を示しました。スケールバー = 50 μm。 (C)肺のコラーゲン線維の定量。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ニコチンとシリカの二重曝露マウスの肺におけるCD206陽性細胞とTGF-β1の増加。 (A)CD206のIHC染色を用いて、二重ばく露マウスにおけるマクロファージの分布と発現を観察した。CD206陽性マクロファージは、ニコチンとシリカの複合曝露後にマウスの肺で増加しました。短い矢印はCD206陽性細胞を表します。スケールバー=50μm。 (B)線維化の促進因子であるTGF-β1は、二重ばく露マウスで上昇した。長い矢印はTGF-β1陽性細胞を表す。スケールバー = 50 μm. (C,D) CD206 および TGF-β1 の AOD。AOD = IOD(積分光学密度)/面積。AODは、単位面積あたりのCD206およびTGF-β1の濃度を反映しています。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。略語:TGF-β1 =トランスフォーミング成長因子-ベータ;IHC = 免疫組織化学;AOD = 平均光学密度。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:シリカ曝露マウスにおけるEMTの悪化によるニコチンによる肺線維症の促進。 (A)IHC染色により、各群のビメンチンの発現が観察された。ビメンチンは、ニコチンとシリカに曝露されたマウスの肺で強く発現していました。スケールバー = 50 μm.(B) 各ばく露群におけるビメンチン発現のウェスタンブロット、二重ばく露マウスの肺組織におけるビメンチンの増加。(C)ビメンチンのAOD値は、二重ばく露群では他の群と比較して有意に高かった。(D)GAPDHと比較したビメンチンの相対的なタンパク質発現レベル。二重曝露群のビメンチン発現は、ニコチンまたはシリカ曝露群よりも有意に高かった。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p < 0.0001。略語:EMT =上皮間葉転換;AOD = 平均光学密度。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ニコチンと結晶性二酸化ケイ素への同時曝露の役割と潜在的なメカニズムを調査するには、二重曝露動物モデルが必要です。このモデルは、ニコチンの皮下注射とシリカの点鼻滴によってこの作業で達成されました。ニコチン注射を成功させるには、首の後ろの皮膚をつかむと痛みを伴う可能性があるため、オペレーターはマウスのつかみ方に慣れる必要があります。したがって、マウスが把持に徐々に適応できるようにすることが重要です。さらに、マウスのシリカ曝露における重要なステップは、点鼻薬です。手術の成功率とマウスの生存率を高めるためには、事前に点鼻薬の練習が不可欠です。
注射を行うときは、マウスが注射器を見たときに強い闘争を避けるために、注射器をマウスの頭上をすくい取る必要があります。ネズミの尻尾は右手でしっかりとつかみ、左手で首の後ろの耳の縁まで皮膚を丁寧に優しく押し上げ、そこの皮膚をつまみます。右手でネズミの尻尾を離した後、噛みつきを防ぐために左手の親指と薬指で尻尾と後肢を安定させます。右手に1 mLのシリンジを使用して、針を首の上の緩い皮膚に頭から尾の方向に30°の角度で挿入する必要があります。.抵抗が失われた後、針を少し引き抜き、注射をゆっくりと均一に投与する必要があります。5〜19日目に、二重ばく露群のマウスをニコチンとシリカにばく露した。午前8:00にニコチンを注射し、午後14:00に二酸化ケイ素を点鼻し、午後20:00にニコチンを再度注射することをお勧めします。2回のニコチン注射は、マウスへの繰り返しの把持の影響を避けるために、12時間間隔で投与する必要があります。.
皮下注射や点鼻薬の実施には、いくつかの技術的な課題があります。皮下注射の場合、マウスを適切な力でつかむ必要があります。.首の後ろの皮膚を強くつまむと、マウスの気道が塞がれ、すぐに窒息します。最適な強度を得るには、眼球がわずかに突き出るまで首の後ろの皮膚をつまむ必要があります。このとき、マウスは最も痛みを感じず、スムーズに呼吸します。さらに、空気を空にした1 mLのシリンジを使用してチューブからニコチン注射を引き出し、その後さらに0.1〜0.2 mLの空気を使用する必要があります。.注入する前に、泡をそっとはじき出す必要があります。注射量が少ないため、針先の先端に残ったニコチンが不十分な用量につながる可能性があります。.注射のキー部分は、針をすばやく挿入し、ニコチンをゆっくりと注入し、針を静かに取り外すことです。点鼻薬の場合、この研究では、マウスの鼻腔を深い麻酔下で完全に露出させ、その後、二酸化ケイ素懸濁液をゆっくりと均一に点滴しました。また、シリカ曝露後に胸腔をそっと押して、咳や窒息を防ぐことも重要です。
このモデルには一定の制限があります。実験に用いた1〜5μmのシリカ粒子は、環境から採取したものではなく、純粋なシリカ粒子であった。一方、実際の職場では、窯業工場や炭鉱で石炭とシリカ粉塵の混合物など、シリカ粒子だけでなく、さまざまな有害物質にさらされる可能性があります。点鼻シリカを使用して低線量を達成し、労働者の慢性曝露をシミュレートするために複数回の曝露を繰り返しました。二重曝露マウスモデルでは、ニコチンはタバコの煙への曝露に由来しませんが、注入されたニコチンは直接血流に入るため、珪肺症プロセスにおけるニコチンの役割をより焦点を絞って調査し、タバコの煙の他の成分の影響を回避することができます。
珪肺症に関する科学的研究では、通常、シリカの吸入または気管支灌流による単一因子マウスモデルを利用して、疾患の発症におけるシリカの役割を評価してきました。代替アプローチは、二酸化ケイ素の経鼻注入であり、これは単純で簡単で、反復的かつ慢性的なシリカ曝露モデルの確立を可能にする13。確立された二酸化ケイ素点鼻モデルは、マウスへのダメージを最小限に抑え、他の因子と組み合わせて、多因子曝露動物モデルを作成することができる。さらに、マウスにおけるニコチン曝露の主な方法には、飲料水中のニコチン、ニコチンの皮下注射、浸透圧ミニポンプ による ニコチン注入、およびタバコの煙曝露が含まれる14。二重曝露モデルで使用される皮下注射により、ニコチンの投与量とタイミングを正確に設定できるため、各マウスに同じ用量が投与されます。
要するに、シリカ曝露と組み合わせたニコチンの動物モデルは、現実的な慢性曝露パターンを再現し、このモデルは、珪肺症の発症における炎症および線維症に対するニコチンの影響に関するさらなる調査に利用できます。さらに、このモデルは、複数回の投与量と時間枠を持つ二重曝露動物モデルを形成するための基盤として機能します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究は、安徽省大学シナジーイノベーションプログラム(GXXT-2021-077)および安徽科技大学大学院イノベーション基金(2021CX2120)の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
