Summary
Questo studio descrive un modello murino per studiare l'effetto sinergico della nicotina sulla progressione della fibrosi polmonare nei topi sperimentali affetti da silicosi. Il modello murino a doppia esposizione simula la progressione patologica nel polmone dopo l'esposizione simultanea a nicotina e silice. I metodi descritti sono semplici e altamente riproducibili.
Abstract
Il fumo e l'esposizione alla silice sono comuni tra i lavoratori e la silice ha maggiori probabilità di danneggiare i polmoni dei fumatori rispetto ai non fumatori. Il ruolo della nicotina, il principale ingrediente che crea dipendenza nelle sigarette, nello sviluppo della silicosi non è chiaro. Il modello murino impiegato in questo studio era semplice e facilmente controllabile, e simulava efficacemente gli effetti dell'ingestione cronica di nicotina e dell'esposizione ripetuta alla silice sulla fibrosi polmonare attraverso la transizione epiteliale-mesenchimale negli esseri umani. Inoltre, questo modello può aiutare nello studio diretto degli effetti della nicotina sulla silicosi, evitando gli effetti di altri componenti nel fumo di sigaretta.
Dopo l'adattamento ambientale, i topi sono stati iniettati per via sottocutanea con 0,25 mg/kg di soluzione di nicotina nella pelle flaccida sopra il collo ogni mattina e sera a intervalli di 12 ore per 40 giorni. Inoltre, la polvere di silice cristallina (1-5 μm) è stata sospesa in soluzione fisiologica normale, diluita in una sospensione di 20 mg/mL e dispersa uniformemente utilizzando un bagno d'acqua ad ultrasuoni. I topi anestetizzati con isoflurano hanno inalato 50 μL di questa sospensione di polvere di silice attraverso il naso e sono stati svegliati tramite massaggio toracico. L'esposizione alla silice è stata somministrata quotidianamente nei giorni 5-19.
Il modello murino a doppia esposizione è stato esposto alla nicotina e poi alla silice, che corrisponde alla storia di esposizione dei lavoratori esposti a entrambi i fattori nocivi. Inoltre, la nicotina ha promosso la fibrosi polmonare attraverso la trasformazione epiteliale-mesenchimale (EMT) nei topi. Questo modello animale può essere utilizzato per studiare gli effetti di molteplici fattori sullo sviluppo della silicosi.
Introduction
L'esposizione alla silice nei lavoratori è inevitabile in alcuni ambienti di lavoro e, una volta esposti alla silice, il deterioramento progredisce anche dopo la rimozione dall'ambiente. Inoltre, la maggior parte di questi lavoratori fuma e le sigarette tradizionali contengono migliaia di sostanze chimiche, con il componente chiave che crea dipendenza essendo la nicotina1. Le sigarette elettroniche stanno diventando sempre più popolari nelle fasce di età più giovani2; Queste sigarette elettroniche agiscono come un sistema di somministrazione di nicotina e aumentano l'accesso alla nicotina, aumentando così la suscettibilità polmonare e la polmonite3. Il fumo di sigaretta accelera anche la fibrosi polmonare nei topi esposti alla bleomicina4 e aumenta la tossicità polmonare e la fibrosi nei topi esposti alla silice 5,6. Tuttavia, resta da indagare se la nicotina possa influenzare il processo di fibrosi infiammatoria e polmonare causato dalla silice.
Il modello murino di silicosi stabilito dall'inalazione una tantum di un'alta dose di silice nella trachea è traumatico per i topi. Sebbene questo metodo fornisca rapidamente un modello di silicosi, non corrisponde alla realtà di un ambiente in cui i lavoratori sono ripetutamente esposti alla silice. Pertanto, abbiamo stabilito un modello murino esposto alla silice somministrando ripetutamente una bassa dose di sospensioni di silice tramite una flebo nasale; Questa dose può causare infiammazione e fibrosi nei topi.
Per aggirare gli effetti di altri componenti della sigaretta, questo modello murino è stato iniettato per via sottocutanea con nicotina nella pelle flaccida del collo per determinare l'effetto del componente che crea dipendenza, la nicotina, sulla silicosi. Somministrando iniezioni sottocutanee, è possibile ottenere un dosaggio accurato, rendendo così possibile la creazione di modelli di esposizione alla nicotina e l'osservazione delle risposte dose-tossicità, nonché della dipendenza. Un modello di dipendenza da nicotina è stato sviluppato in topi maschi, con una dose iniettata di nicotina di 0,2-0,4 mg/kg 7,8. In quel modello, per soddisfare le esigenze di ricerca di droga dei topi dipendenti, sono state somministrate due iniezioni sottocutanee a intervalli di 12 ore. Questo modello murino di dipendenza da nicotina è utile per simulare le abitudini umane di fumo e l'esposizione alla silice.
I modelli animali a fattore singolo hanno limitazioni negli studi sulle malattie, mentre il metodo qui descritto coinvolge un modello murino a due fattori di co-esposizione a nicotina e silice. Prima dell'esposizione alla silice, i topi sono stati pre-esposti alla nicotina per replicare l'esposizione alla nicotina nelle persone che fumano. Successivamente, l'esposizione alla silice ha avuto luogo dal giorno 5 al giorno 19 per imitare l'esposizione alla silice in un ambiente di lavoro per individui con una storia di fumo.
I macrofagi alveolari sono noti per svolgere un ruolo significativo nella regolazione dell'infiammazione polmonare e della fibrosi. I macrofagi non possono scomporre la silice dopo l'inalazione di silice, portando alla polarizzazione dei macrofagi o all'apoptosi9 e al rilascio di citochine come il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-α) e il fattore di crescita trasformante beta (TGF-β). I macrofagi M1, che sono identificati dalla presenza del marcatore di superficie CD86, sono i principali istigatori della risposta infiammatoria nella silicosi, mentre i macrofagi M2, che sono marcati da CD206, sono responsabili della fase fibrotica della condizione10. Nei topi a doppia esposizione, la nicotina ha indotto la polarizzazione dei macrofagi verso il fenotipo M2 nei polmoni danneggiati dalla silice, promuovendo così la fibrosi polmonare. Inoltre, il TGF-β1 è fondamentale per l'induzione della fibrosi e dell'EMT11; l'aumento dell'espressione di TGF-β1 ha accelerato la progressione della fibrosi polmonare attraverso l'EMT. Questo modello ha analizzato con successo gli effetti della nicotina sulla silicosi e ha ulteriormente evidenziato l'importanza della cessazione della nicotina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sono state condotte secondo le linee guida emesse dalla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (l'ottava edizione dell'NRC) e sono state approvate dal Comitato etico per gli animali dell'Università di Scienza e Tecnologia di Anhui.
1. Preparazione dell'animale
- Ospita 32 topi maschi C57/BL6 di 8 settimane in laboratorio con un ciclo luce/buio di 12 ore. Assicurati che i topi abbiano libero accesso a cibo e acqua.
- Dopo 2 settimane di acclimatazione all'ambiente, quando i topi di 10 settimane pesano 23-26 g, utilizzare numeri casuali generati da un computer per raggruppare casualmente gli animali senza partizionamento, ottenendo quattro gruppi di topi: il gruppo di controllo (Con), il gruppo della nicotina (Nic), il gruppo della silice (SiO 2) e la nicotina combinata con il gruppo della silice (Nic + SiO2).
2. Preparazione della nicotina
NOTA: La densità della nicotina è di 1,01 g/mL.
- Sciogliere la nicotina in etanolo anidro e diluire 20 volte per preparare una soluzione madre di nicotina di 50 mg/mL.
- Diluire la soluzione madre di nicotina 1.000 volte con soluzione fisiologica normale sterile per ottenere una soluzione di lavoro a una concentrazione di 0,05 mg/mL.
NOTA: Conservare la nicotina al riparo dalla luce. La soluzione madre può essere conservata a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
3. Preparazione della silice
- Sospendere la silice cristallina sterile in soluzione salina per preparare una sospensione di silice da 20 mg/mL e farla oscillare in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 25 minuti.
- Agitare la sospensione di silice con un oscillatore a vortice per 3 minuti prima che i topi ricevano il gocciolamento nasale. Miscelare la sospensione di silice pipettando su e giù 2x-3x con una pipetta da 200 μL, quindi prelevare 50 μL per il gocciolamento nasale.
NOTA: La sospensione di biossido di silicio deve essere miscelata e somministrata tramite flebo nasale il prima possibile.
4. Cattura del topo ed esposizione alla nicotina
- Pesare i topi e registrare i pesi ogni giorno prima dell'esposizione.
- Nei giorni 1-40, iniettare per via sottocutanea la nicotina due volte al giorno (a distanza di 12 ore) nei topi dei gruppi Nic e Nic+ SiO2 . Utilizzare una dose di nicotina di 0,25 mg/kg; Ad esempio, assicurati che un topo del peso di 25 g riceva 6,25 μg di nicotina. Per questo topo, il volume di iniezione sarebbe il seguente: 6,25/0,05 = 125 μL. Contemporaneamente, iniettare nei topi del gruppo Con un volume uguale di soluzione fisiologica.
- Preparare le siringhe da 1 mL necessarie per ciascun gruppo e utilizzarle per aspirare il volume di iniezione di nicotina o soluzione fisiologica. Prima di prelevare la nicotina, aspirare prima 0,1-0,2 mL di aria nella siringa, quindi aspirare 125 μL di nicotina. Picchiettare con cautela la siringa per riempire l'ago e l'estremità anteriore della siringa con la nicotina. Collocare la siringa contenente nicotina in un vassoio al riparo dalla luce.
NOTA: Al momento dell'iniezione, 0,1-0,2 mL di aria si trovano dietro la nicotina, garantendo che tutto il liquido venga somministrato con successo al topo. - Afferra la coda del topo con la mano destra e, quando l'animale si rilassa, usa il pollice e l'indice sinistro per premere la pelle sulla parte posteriore del collo dalla coda alla testa fino al bordo dell'orecchio, applicando una pressione moderata. Dopodiché, rilascia la mano destra e usa il pollice e l'anulare sinistro per pizzicare la coda e gli arti posteriori, a quel punto il mouse sarà completamente immobilizzato dalla mano sinistra.
NOTA: Afferrare il mouse con la forza appropriata. Una forza insufficiente rende facile per i topi mordere, mentre una forza eccessiva può provocare l'asfissia dei topi. - Usando la mano destra per iniettare, perforare la pelle sulla parte posteriore del collo vicino al bordo dell'orecchio dei topi in direzione testa-coda con la siringa e iniettare nicotina a una velocità uniforme. Cerca un rigonfiamento cutaneo semicircolare che indichi che l'iniezione è andata a buon fine.
NOTA: Quando l'ago ha perforato la pelle, ci sarà una sensazione di resistenza; La resistenza scompare dopo l'inserimento dell'ago. A questo punto, l'ago deve essere leggermente ritirato per iniettare lentamente e in modo uniforme.
5. Esposizione alla silice in vivo
- Nei giorni 5-19, instillare la sospensione di biossido di silicio nella cavità nasale dei topi nei gruppi SiO 2 e Nic+ SiO2. Anestetizzare rapidamente ogni topo con isoflurano al 2% in una macchina per anestesia alla dose di 3,6 ml/h. Dopo l'anestesia, posizionare il topo sul palmo di una mano ed esporre la cavità nasale del topo. Instillare 50 μL di sospensione di silice nella cavità nasale entro 4-8 s.
- Per consentire alla sospensione di silice di entrare nei polmoni il prima possibile, dopo l'instillazione, premere delicatamente il cuore del topo con il dito indice per 3-5 secondi, 3x-5x al secondo, per favorire la sua frequenza respiratoria.
- Dopo che la respirazione del topo diventa gradualmente uniforme, metti il topo in una gabbia per osservare per 3 minuti.
- Per tutti i topi che ricevono la sospensione di silice, ripetere i passaggi 1-3. Nel gruppo di controllo, instillare 50 μL di soluzione fisiologica sterile nella cavità nasale nei giorni 5-19.
6. Acquisizione di tessuti polmonari freschi e fissati
- Il giorno 41, utilizzare 50 mg/kg di pentobarbital di sodio per anestetizzare i topi per via intraperitoneale alla dose di 0,1 ml/20 g in base al loro peso corporeo. Fissare gli arti su una piastra di prova in schiuma e spruzzare la pelliccia con alcol al 75%.
- Eseguire la perfusione cardiaca per ottenere tessuto polmonare fresco, tagliare la linea mediana dell'addome per esporre la cavità toracica e praticare una piccola apertura all'apice del cuore destro. Quindi, iniettare 20 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preraffreddata lentamente e uniformemente dall'apice del cuore sinistro, facendo defluire il sangue dall'apertura creata all'apice del cuore destro. Estrarre l'intero lobo polmonare, metterlo in una provetta da centrifuga da 1,5 mL preraffreddata e trasferirlo a -80 °C per la conservazione in attesa dell'estrazione delle proteine.
- Perfondere altri topi con 20 mL di PBS pre-raffreddato seguiti da 10 mL di paraformaldeide al 4% nella stessa posizione per fissare i polmoni interi; conservare ogni polmone in 30 mL di PFA al 4%.
- Dopo 72 ore, incorporare i tessuti polmonari fissati in paraffina.
- Immergere il tessuto polmonare nel fissativo preparato in un bagno d'acqua ad ultrasuoni a 40 °C per 30 minuti, seguito da un processo di disidratazione in etanolo al 75%, etanolo al 95% ed etanolo anidro per 50 minuti ciascuno.
- Lavare 2 volte con xilene per 50 minuti ciascuna.
- Porre il tessuto in cera di paraffina fusa a 55-60 °C per 2-3 ore in modo che lo xilene nel tessuto polmonare venga gradualmente sostituito dalla cera di paraffina.
- Fissare il tessuto polmonare nel telaio di inclusione con paraffina e attendere che il blocco di cera si indurisca. Dopo che il blocco di cera si è indurito, utilizzare la macchina per il sezionamento della paraffina per affettare il polmone a 4-5 μm.
- Immergere le sezioni polmonari in acqua ultrapura a 45 °C. Una volta che la paraffina si è sciolta, caricare la sezione polmonare su un vetrino da microscopio aderente.
7. Colorazione con ematossilina ed eosina (HE)
- Cuocere i vetrini a 60 °C per 2 ore e metterli in xilene a decerare per 2 x 30 minuti. Successivamente, posizionare i vetrini in etanolo anidro, etanolo al 95%, etanolo all'85% ed etanolo al 75% per 5 minuti ciascuno. Infine, lavali per 3 x 5 minuti con acqua ultrapura.
- Far cadere 50 μL di soluzione colorante con ematossilina sul tessuto polmonare con una pistola a pipetta e colorare per 5 minuti; Quindi, lavate le fette con acqua corrente per 5 minuti.
- Aggiungere 50 μL di acido cloridrico al 2% in etanolo sulla sezione e risciacquare con acqua distillata per 30 secondi. Quindi, aggiungere 50 μL di soluzione colorante con eosina sul tessuto polmonare da colorare per 1 minuto.
- Disidratare, rendere trasparenti e sigillare le sezioni di paraffina.
- Aggiungere 100-150 ml di etanolo al 75%, etanolo all'85%, etanolo al 95%, etanolo anidro e xilene in un serbatoio di tintura di plastica combinato. Mettere i vetrini in etanolo anidro al 75%, 85%, 95% ed etanolo anidro per 5 minuti ciascuno per disidratare.
- Quindi, posizionare i vetrini in xilene per 5 minuti per renderli trasparenti.
- Infine, far cadere 20 μL di gomma neutra sulla sezione polmonare e posizionare un vetrino coprioggetto sul vetrino per sigillarlo.
NOTA: I passaggi precedenti vengono eseguiti a temperatura ambiente.
8. Colorazione di Masson
- Decerare, idratare e lavare le sezioni di paraffina come descritto al punto 7.1.
- Colorare le sezioni con 50 μL di soluzione di colorazione con ematossilina Weigert configurata per 7 minuti, quindi con 50 μL di soluzione acida di frazionamento dell'etanolo per 10 secondi e lavare con acqua corrente per far diventare blu i nuclei.
- Colorare le sezioni con 50 μL di soluzione tricromica Masson per 4 minuti e lavare con acqua.
- Sciacquare le sezioni con acqua distillata per 1 minuto, quindi colorare con Lichun rosso acido magenta per 7 minuti.
- Lavare le sezioni con una soluzione di lavoro acida debole (acido cloridrico al 30%) per 1-2 minuti, una soluzione di acido fosfomolibdico per 1-2 minuti e una soluzione di lavoro acida debole per 1-2 minuti.
- Colorare le sezioni con una soluzione colorante blu anilina per 2 minuti, quindi lavare con una soluzione di lavoro acida debole per 1 minuto.
- Disidratare le sezioni con etanolo al 95% seguito da etanolo anidro per 1 s, trasparente con xilene per 1 s e infine sigillare con resina neutra come descritto al punto 7.4.
9. Immunoistochimica
- Infornare le fette a 60 °C per 6 ore. Decerare, idratare e lavare le sezioni di paraffina come descritto al punto 7.1.
- Recupero dell'antigene: mettere le fette in una scatola di plastica resistente al calore contenente una soluzione di recupero dell'antigene citrato sufficiente per immergere le fette e far bollire per 20-30 minuti.
- Raffreddare a temperatura ambiente, rimuovere le sezioni e risciacquare con acqua deionizzata. Successivamente, immergere per 2 x 5 minuti in PBS contenente lo 0,5% di Tween-20 (PBST).
- Disegna un anello vicino alla sezione polmonare sul vetrino con una penna idrofobica per formare un cerchio idrofobico.
- Aggiungere 50 μL di soluzione di perossido di idrogeno al 3% (3%H 2 O2 ) goccia a goccia sulle fette e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce per l'inattivazione della perossidasi endogena.
- Immergere le fette nel PBST per 3 x 5 min.
- Aggiungere 50 μL di proteine sieriche bovine al 5% (BSA)-PBST goccia a goccia sulle fette e bloccare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Scartare la soluzione bloccante, aggiungere 50 μL degli anticorpi primari diluiti CD206 (diluizione: 1:1.500), TGF-β1 (diluizione: 1:200) e vimentina (diluizione: 1:2.000) goccia a goccia sulle fette e incubare per una notte a 4 °C.
NOTA: In questo lavoro, tutti gli anticorpi sono stati diluiti in BSA al 5%. - Il giorno dopo, rimettere le fette a temperatura ambiente (40 min). Lavare le fette come descritto al punto 9.6.
- Diluire l'anticorpo secondario in BSA al 5%. Aggiungere 50 μL di anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano (diluizione: 1:500) goccia a goccia e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare le fette come descritto al punto 9.6.
- Versare 50 μL di soluzione di 3,3'-diaminobenzidina (DAB) corrispondente all'anticorpo secondario marcato con enzima sul tessuto polmonare e incubare per 5-10 minuti in una scatola umida immunoistochimica nera. Osservare al microscopio fino a quando il colore non si sviluppa in un marrone intenso. Sciacquare le fette con acqua distillata per terminare la reazione.
NOTA: La colorazione marrone è considerata una colorazione positiva. - Colorare con 50 μL di colorante di ematossilina per 30 secondi e lavare con acqua corrente. Quindi, immergere le fette al 75%, 85%, 95% ed etanolo anidro per 3 minuti ciascuna e poi nello xilene per 2 x 10 minuti. Sigillare i vetrini come descritto al punto 7.4.
10. Analisi Western blot
- Estrarre il tessuto polmonare dal congelatore e pesarlo. Successivamente, aggiungere 150 μL di tampone di lisi RIPA contenente PMSF per 20 mg di tessuto polmonare. Lisare i polmoni di topo su ghiaccio per 3-5 minuti utilizzando un omogeneizzatore portatile, agitare delicatamente per 2 ore a 4 °C per consentire un'adeguata lisi del tessuto polmonare, centrifugare a 4 °C e 14.800 × g per 15 minuti e raccogliere il surnatante.
NOTA: Aggiungere 100 mM di fenilmetansolfonilfluoruro (PMSF) alcuni minuti prima di utilizzare il tampone di lisi RIPA. La concentrazione finale di PMSF è di 1 mM (ad esempio, 10 μL di PMSF + 990 μL di RIPA). - Utilizzare un kit di concentrazione proteica BCA per determinare la concentrazione proteica del campione seguendo le istruzioni del produttore. Dopo la determinazione, utilizzando la più piccola concentrazione di lisato proteico come base, diluire lo stesso lotto di lisato proteico con RIPA alla concentrazione più piccola per ottenere la stessa massa e volume.
NOTA: La quantità totale di carico di tessuto polmonare è di 30 μg. - Aggiungere 40 μL di tampone di caricamento 5x a 160 μL di lisato proteico e riscaldarlo a 100 °C per 10 min.
- Assemblare il gel preparato per elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecilsolfato al 10% (SDS-PAGE) nel sistema di elettroforesi western blotting, aggiungere il tampone per elettroforesi SDS-PAGE, estrarre delicatamente il pettine per elettroforesi e aggiungere 20 μL di campione proteico per pozzetto lentamente e uniformemente. Accendere l'alimentazione e avviare l'elettroforesi a 80 V per 30 min. Dopo che le proteine hanno raggiunto lo strato inferiore del gel, passare a 100 V e continuare l'elettroforesi per 60-70 minuti.
NOTA: L'elettroforesi necessita di un nuovo tampone per elettroforesi. - Trasferire le proteine su una membrana in PVDF mediante trasferimento a umido. Attivare preventivamente (5-30 s) la membrana in PVDF con metanolo. Estrarre la piastra in gel per elettroforesi, aprirla con cautela, posizionare il gel separatore nel tampone di trasferimento a umido, preparare il sandwich di trasferimento elettrico e assemblare il sistema di trasferimento a umido. Riempire il serbatoio di elettroforesi con il tampone di trasferimento e trasferire a 400 mA per 90 min.
NOTA: Il tampone di trasferimento viene raffreddato in anticipo per evitare gli effetti delle alte temperature durante il trasferimento a umido. - Lavare la membrana in PVDF con soluzione salina tamponata Tris con Tween-20 allo 0,5% (TBST) per 3 x 5 minuti. Bloccare la membrana in PVDF con latte scremato al 5% diluito in TBST e incubare su agitatore a temperatura ambiente per 60 min; quindi, lavare con TBST per 2 min. Dopo il lavaggio, incubare la membrana per una notte a 4 °C con l'anticorpo primario vimentina (1:5.000) e GAPDH (1:10.000) diluiti in BSA al 5%.
- Posizionare la membrana a temperatura ambiente per 30 minuti e lavare con TBST per 5 x 5 minuti. Dopo il lavaggio, incubare la membrana con l'anticorpo secondario (1:10.000) diluito in latte scremato al 5% per 60 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare la membrana, con il lato proteico rivolto verso l'alto, far cadere la soluzione di lavoro ECL preparata, incubare per 1-2 minuti e osservare i risultati con un gel imager. Utilizzare i valori della scala di grigi misurati dal software nell'imager su gel per valutare i livelli di espressione proteica.
NOTA: In questo caso, GAPDH è servito come riferimento interno.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
È stato stabilito un modello murino per studiare la nicotina combinata con l'esposizione alla silice per studiare il potenziale ruolo della nicotina nella progressione della silicosi nei topi. La Figura 1 illustra la procedura sperimentale per l'utilizzo di un modello murino a doppia esposizione, che ha abbinato un'iniezione di nicotina con l'instillazione nasale di una sospensione di silice. I cambiamenti patologici dei topi in ciascun gruppo sono stati osservati utilizzando la colorazione HE. I topi esposti alla nicotina combinata con la silice hanno avuto un danno polmonare significativamente più grave rispetto a quelli esposti alla nicotina o alla sola silice. I linfociti sono aumentati vicino ai vasi linfatici nei polmoni dei topi esposti alla nicotina, formando gruppi di cellule infiammatorie. La colorazione di Masson ha rivelato un aumento significativo della deposizione di fibre di collagene nei polmoni esposti alla nicotina combinata con silice rispetto ai polmoni degli altri gruppi, e questo è stato supportato dalla quantificazione della colorazione di Masson (Figura 2). La struttura alveolare è stata distrutta nei topi esposti alla silice e il numero di macrofagi è aumentato. Tuttavia, dopo l'esposizione alla nicotina combinata con la silice, c'è stata una significativa infiltrazione di cellule infiammatorie e sono apparsi noduli di fibroblasti. Inoltre, i macrofagi accumulati, in particolare i macrofagi M2, presenti nel gruppo a doppia esposizione. I macrofagi M2 sono essenziali per lo stadio fibrotico avanzato della silicosi.
Inoltre, un aumento significativo del fattore pro-fibrotico TGF-β1 è stato osservato mediante colorazione immunoistochimica (IHC) nei polmoni di topi a doppia esposizione, in particolare nelle cellule infiammatorie vicino ai vasi linfatici (Figura 3). Il TGF-β1 secreto dai macrofagi promuove l'EMT delle cellule epiteliali e la fibrosi polmonare12. Rispetto ai topi esposti alla sola silice, i livelli di vimentina erano significativamente elevati nei polmoni dei topi a doppia esposizione. Sia la colorazione IHC che la quantificazione delle proteine hanno indicato una grave EMT nei topi a doppia esposizione (Figura 4). L'evidenza combinata suggerisce che l'esposizione cronica alla silice promuove l'EMT dopo la sovraregolazione del TGF-β1, portando ad un aumento dei fibroblasti e alla fibrosi progressiva. Allo stesso tempo, l'aggiunta di nicotina accelera il processo di fibrosi polmonare aggravando l'EMT, consentendo alla fibrosi polmonare di comparire prima. Questo modello è progettato per esplorare l'impatto della nicotina sulla fibrosi polmonare, che è una conseguenza dell'esposizione cronica alla silice negli esseri umani.
Figura 1: Disegno di un modello sperimentale di esposizione combinata a nicotina e silice nei topi. Iniezione continua di nicotina per 1-40 giorni e instillazione nasale continua di silice per 5-19 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La nicotina promuove la formazione di masse fibroblastiche nei polmoni dei topi esposti alla silice. (A) La colorazione HE è stata utilizzata per visualizzare i cambiamenti patologici nei polmoni. I topi a doppia esposizione presentavano una grave infiltrazione di cellule infiammatorie e fibrosi. Le frecce verdi indicano le masse cellulari infiammatorie. Barra della scala = 50 μm. (B) La colorazione di Masson è stata utilizzata per mostrare le fibre di collagene nei polmoni. Barra della scala = 50 μm. (C) Quantificazione delle fibre di collagene nei polmoni. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Aumento delle cellule CD206-positive e del TGF-β1 nei polmoni di topi con doppia esposizione alla nicotina e alla silice. (A) La colorazione IHC di CD206 è stata utilizzata per osservare la distribuzione e l'espressione dei macrofagi nei topi a doppia esposizione. I macrofagi CD206-positivi sono aumentati nei polmoni dei topi dopo l'esposizione combinata a nicotina e silice. Le frecce corte rappresentano le cellule CD206-positive. Barra della scala = 50 μm. (B) TGF-β1, un promotore della fibrosi, è risultato elevato nei topi a doppia esposizione. Le frecce lunghe rappresentano le cellule TGF-β1-positive. Barra della scala = 50 μm. (C,D) AOD di CD206 e TGF-β1. AOD = IOD (densità ottica integrata)/area. L'AOD riflette la concentrazione di CD206 e TGF-β1 per unità di superficie. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abbreviazioni: TGF-β1 = fattore di crescita trasformante-beta; IHC = immunoistochimica; AOD = densità ottica media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Promozione della fibrosi polmonare da parte della nicotina nei topi esposti alla silice attraverso l'aggravamento dell'EMT. (A) L'espressione della vimentina in ciascun gruppo è stata osservata mediante colorazione IHC. La vimentina è stata fortemente espressa nei polmoni dei topi esposti a nicotina e silice. Barra della scala = 50 μm.(B) Western blot dell'espressione della vimentina in ciascun gruppo di esposizione, con un aumento della vimentina nei tessuti polmonari dei topi a doppia esposizione. (C) Il valore AOD della vimentina era significativamente più elevato nel gruppo a doppia esposizione rispetto agli altri gruppi. (D) Il livello relativo di espressione proteica della vimentina rispetto a GAPDH. L'espressione di vimentina nel gruppo a doppia esposizione era significativamente più alta rispetto ai gruppi esposti alla nicotina o alla silice. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abbreviazioni: EMT = transizione epiteliale-mesenchimale; AOD = densità ottica media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Un modello animale a doppia esposizione è necessario per studiare il ruolo e i potenziali meccanismi dell'esposizione concomitante alla nicotina e al biossido di silicio cristallino. Questo modello è stato realizzato in questo lavoro attraverso l'iniezione sottocutanea di nicotina e il gocciolamento nasale di silice. Per garantire il successo dell'iniezione di nicotina, l'operatore deve acquisire familiarità con la presa dei topi, poiché afferrare la pelle nella parte posteriore del collo potrebbe essere doloroso per loro. Pertanto, è importante consentire ai topi di adattarsi gradualmente alla presa. Inoltre, un passaggio critico nell'esposizione alla silice nei topi è il gocciolamento nasale. Per aumentare il successo della procedura e il tasso di sopravvivenza dei topi, è essenziale praticare preventivamente la flebo nasale.
Quando si esegue l'iniezione, la siringa deve essere sfiorata sulla testa del topo per evitare una forte lotta quando il topo vede la siringa. La coda del topo dovrebbe essere afferrata saldamente con la mano destra, mentre la mano sinistra dovrebbe essere usata per spingere la pelle fino al margine dell'orecchio nella parte posteriore del collo con attenzione e delicatezza e per pizzicare la pelle lì. Dopo aver rilasciato la coda del topo con la mano destra, la coda e gli arti posteriori devono essere stabilizzati usando il pollice e l'anulare sinistro per evitare di mordere. Utilizzando una siringa da 1 mL nella mano destra, l'ago deve essere inserito nella pelle flaccida sopra il collo con un angolo di 30° in direzione testa-coda. L'ago deve essere ritirato leggermente dopo aver perso la resistenza e l'iniezione deve essere somministrata lentamente e in modo uniforme. Nei giorni 5-19, i topi del gruppo a doppia esposizione sono stati esposti a nicotina e silice. Si raccomanda di iniettare la nicotina alle 08:00, seguita dal gocciolamento nasale di biossido di silicio alle 14:00 e da un'altra iniezione di nicotina alle 20:00. Le due iniezioni di nicotina devono essere somministrate a distanza di 12 ore l'una dall'altra per evitare gli effetti di ripetute prese sui topi.
L'esecuzione di iniezioni sottocutanee e gocciolamento nasale presenta diverse sfide tecniche. Per le iniezioni sottocutanee, i topi devono essere afferrati con forza appropriata. Se la pelle nella parte posteriore del collo viene pizzicata troppo strettamente, le vie aeree del topo saranno bloccate, portando rapidamente al soffocamento. Per una forza ottimale, la pelle nella parte posteriore del collo deve essere pizzicata fino a quando i bulbi oculari non sporgono leggermente. In questo momento, il topo sente il dolore più basso e respira senza intoppi. Inoltre, una siringa da 1 mL svuotata d'aria deve essere utilizzata per aspirare l'iniezione di nicotina dal tubo, seguita da altri 0,1-0,2 mL di aria. Prima dell'iniezione, le bolle devono essere espulse delicatamente. A causa del piccolo volume dell'iniezione, la nicotina rimasta sulla punta dell'estremità dell'ago può portare a una dose insufficiente. Le parti chiave dell'iniezione sono l'inserimento rapido dell'ago, l'iniezione lenta della nicotina e la rimozione delicata dell'ago. Per il gocciolamento nasale, in questo studio, la cavità nasale dei topi è stata completamente esposta in anestesia profonda, seguita dall'instillazione lenta e uniforme di una sospensione di biossido di silicio. È anche importante premere delicatamente la cavità toracica dopo l'esposizione alla silice per evitare tosse o soffocamento.
Questo modello presenta alcune limitazioni. Le particelle di silice da 1-5 μm utilizzate negli esperimenti non sono state raccolte dall'ambiente ed erano particelle di silice pura. Al contrario, in ambienti di lavoro reali, i lavoratori possono essere esposti a una varietà di materiali pericolosi, non solo particelle di silice, come una miscela di carbone e polvere di silice in una fabbrica di ceramica o in una miniera di carbone. Abbiamo utilizzato silice per instillazione nasale per ottenere basse dosi ed esposizioni multiple ripetute per simulare l'esposizione cronica dei lavoratori. Nel modello murino a doppia esposizione, sebbene la nicotina non provenga dall'esposizione al fumo di sigaretta, la nicotina iniettata entra direttamente nel flusso sanguigno, consentendo un'esplorazione più mirata del ruolo della nicotina nel processo di silicosi e l'evitare gli effetti di altri componenti del fumo di sigaretta.
La ricerca scientifica sulla silicosi ha tipicamente utilizzato modelli murini a fattore singolo, attraverso l'inalazione o la perfusione bronchiale di silice, per valutare il ruolo della silice nello sviluppo della malattia. Un approccio alternativo è l'instillazione nasale di biossido di silicio, che è semplice e facile e consente di stabilire modelli di esposizione ripetuta e cronica alla silice13. Il modello di gocciolamento nasale al biossido di silicio ben consolidato provoca danni minimi ai topi e potrebbe essere combinato con altri fattori per creare un modello animale esposto a più fattori. Inoltre, i principali metodi di esposizione alla nicotina nei topi includono la nicotina nell'acqua potabile, l'iniezione sottocutanea di nicotina, l'infusione di nicotina tramite minipompe osmotiche e l'esposizione al fumo di tabacco14. L'iniezione sottocutanea utilizzata nel modello a doppia esposizione consente di impostare con precisione il dosaggio e la tempistica della nicotina, assicurando che a ciascun topo venga somministrata la stessa dose.
In breve, il modello animale della nicotina in combinazione con l'esposizione alla silice replica un modello di esposizione cronica realistico e questo modello può essere utilizzato per ulteriori indagini sugli impatti della nicotina sull'infiammazione e sulla fibrosi nello sviluppo della silicosi. Inoltre, questo modello funge da base per la formazione di un modello animale a doppia esposizione con dosi e intervalli di tempo multipli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal programma di innovazione della sinergia universitaria della provincia di Anhui (GXXT-2021-077) e dal Fondo per l'innovazione dei laureati dell'Università di scienza e tecnologia dell'Anhui (2021CX2120).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin neutral fixative | Nanchang Yulu Experimental Equipment Co. | ||
| alcohol disinfectant | Xintai Kanyuan Disinfection Products Co. | ||
| BSA, Fraction V | Beyotime Biotechnology | ST023-200g | |
| CD206 Monoclonal antibody | Proteintech | 60143-1-IG | |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | biosharp life science | BL619A | |
| dimethyl benzene | West Asia Chemical Technology (Shandong) Co | ||
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime Biotechnology | P0009 | |
| GAPDH Polyclonal antibody | Proteintech | 10494-1-AP | |
| Hematoxylin and Eosin (H&E) | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| HRP substrate | Millipore Corporation | P90720 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) Substrate | Vector Laboratories | SK-4103-100 | |
| Masson's Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | |
| Methanol | Macklin | ||
| Nicotine | Sigma | N-3876 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Biosharp | BL601A | |
| Physiological saline | The First People's Hospital of Huainan City | ||
| PMSF | Beyotime Biotechnological | ST505 | |
| Positive fluorescence microscope | OlympusCorporation | BX53+DP74 | |
| Prestained Color Protein Molecular Weight Marker, or Prestained Color Protein Ladder | Beyotime Biotechnology | P0071 | |
| PVDF membranes | Millipore | 3010040001 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotechnology | P0013B | |
| SDS-PAGE gel preparation kit | Beyotime Biotechnology | P0012A | |
| Silicon dioxide | Sigma | #BCBV6865 | |
| TGF-β | Bioss | bs-0086R | |
| Vimentin Polyclonal antibody | Proteintech | 10366-1-AP | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | |
| 0.5 mL Tube | Biosharp | BS-05-M | |
| Oscillatory thermostatic metal bath | Abson | ||
| Paraffin Embedding Machine | Precision (Changzhou) Medical Equipment Co. | PBM-A | |
| Paraffin Slicer | Jinhua Kratai Instruments Co. | ||
| Pipettes | Eppendorf | ||
| Polarized light microscope | Olympus | BX51 | |
| Precision Balance | Acculab | ALC-110.4 | |
| RODI IOT intelligent multifunctional water purification system | RSJ | RODI-220BN | |
| Scilogex SK-D1807-E 3D Shaker | Scilogex | ||
| Small animal anesthesia machine | Anhui Yaokun Biotech Co., Ltd. | ZL-04A | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1011 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1212 | |
| Universal Pipette Tips | KIRGEN | KG1313 | |
| Vortex Mixers | VWR | ||
| Name of Material/ Equipment | |||
| Adobe Illustrator | |||
| ImageJ | |||
| Photoshop | |||
| Prism7.0 |
References
- Wonnacott, S.
- Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794 (2019).
- Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604 (2021).
- Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
- Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
- Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
- Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
- Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517 (2013).
- Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364 (2020).
- Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066 (2022).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
- Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
- Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
- Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).
