Summary
Этот протокол фокусируется на использовании проточной цитометрии и счетных шариков для количественного определения бактериальных спор, меченных бромидом этидия. Метод также эффективен для анализа ковалентного сцепления белков на поверхности интактных спор.
Abstract
Споры Bacillus subtilis уже были предложены для различных биотехнологических и иммунологических применений; Однако возрастает потребность в разработке методологий, улучшающих обнаружение антигенов, иммобилизованных на поверхности спор, и их количественного определения. Анализ на основе проточной цитометрии ранее был предложен в качестве быстрого, надежного и специфического подхода к обнаружению меченых клеток B. subtilis. В данной работе мы предлагаем использовать проточную цитометрию для оценки эффективности отображения флуоресцентного антитела (ФА) на поверхности споры и количественной оценки количества спор с помощью счетных шариков.
Для этого мы использовали бромид этидия в качестве ДНК-маркера и антитело, меченное аллофикоцианином (APC), которое было связано со спорами, в качестве поверхностного маркера. Количественное определение спор проводили с помощью счетных шариков, так как этот метод демонстрирует высокую точность в обнаружении клеток. Меченые споры были проанализированы с помощью проточного цитометра, который подтвердил связь. В результате было продемонстрировано, что мечение ДНК повышает точность количественной оценки методом проточной цитометрии для обнаружения проросших спор. Было замечено, что бромид этидия не способен маркировать спящие споры; Тем не менее, этот метод обеспечивает более точное определение количества спор с флуоресцентным белком, связанным с их поверхностью, что помогает в развитии исследований, которые сосредоточены на использовании спор в качестве биотехнологической платформы в различных приложениях.
Introduction
Bacillus subtilis представляет собой палочковидную грамположительную бактерию, способную производить спокойные споры, когда условия окружающей среды не позволяют клеткам расти1. Споры являются чрезвычайно стабильными клеточными формами, и споры нескольких видов, включая B. subtilis, широко используются в качестве пробиотиков для использования человеком и животными2. Благодаря своей устойчивости и свойствам безопасности споры B. subtilis, которые демонстрируют гетерологичные белки, были предложены в качестве адъюванта слизистой оболочки, системы доставки вакцины и платформы иммобилизации ферментов 3,4.
Для получения спор из B. subtilis необходимо подвергнуть его депривации питательных веществ с помощью специальной питательной среды. После получения и очистки этих спор необходимо количественно оценить их для повышения эффективности теста 5,6. Таким образом, для анализа концентрации полученных спор применяются определенные методы. Можно использовать пластинчатый счет и камеру Петрова-Хауссера, также известную как счетная камера. Последний изначально был разработан для определения концентрации клеток крови; Однако возможно его использование в области микробиологии для подсчета спор 7,8. Несмотря на то, что это стандартный метод, используемый для подсчета клеток, чтение является трудоемким, так как этот метод полностью ручной, и его точность зависит от опыта оператора.
Анализ на основе проточной цитометрии (ФК) ранее был предложен в качестве быстрого, надежного и специфического подхода к обнаружению меченых клеток Bacillus spp. Использование гранул для подсчета клеток методом проточной цитометрии гарантирует воспроизводимость при подсчете клеток при рутинных исследованиях (абсолютное количество CD4 и CD8 Т-лимфоцитов) и при разработке исследований с участием частиц, которые могут быть обнаружены и подсчитаны с помощью проточной цитометрии9. Годжафри и Альшариф предложили использовать счетные шарики для количественной оценки немеченых спор10. Описано использование проточной цитометрии для мониторинга спороношения у Bacillus spp. путем мечения споровой ДНК 10,11,12,13. В другом исследовании FC использовали FC для оценки количества флуоресцентно меченных белков на поверхности споры15.
Это исследование было направлено на использование коммерческих счетных шариков для обеспечения стандарта воспроизводимости в отношении подсчета событий с помощью проточной цитометрии. В данной работе мы предлагаем использовать счетные шарики для подсчета клеток в ФК для уточнения нумерации спор и оценки эффективности связывания флуоресцентно меченных антител на поверхности спор.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Подробные сведения обо всех материалах, инструментах и программном обеспечении, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .
1. Настройка проточной цитометрии
- Юстировка оптических параметров проточного цитометра, сопряженного с компьютером
- Войдите в программное обеспечение Cytometer.
- В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр | Запустите и подождите несколько минут | Режим очистки | Сидячие жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки воздуха и препятствия были удалены в процессе инициации цитометра, до взятия образца.
- Контроль качества
- С помощью реагента контроля качества отрегулируйте напряжение фотоэлектронных умножителей и оцените их чувствительность.
- Приготовьте реактив для контроля качества в полистирольной тубе.
- Для определения исходного уровня приготовьте гранулы суспензии, добавив 0,5 мл разбавителя (10 мМ отфильтрованного PBS, pH 7) и 3 капли гранул в маркированную пробирку.
- Смешайте флакон с бусинами путем плавного переворачивания.
- В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр | CST для подключения к интерфейсу CST. Подождите несколько минут и наблюдайте за сообщением цитометра об отключении.
- Присоедините полистирольную трубку, содержащую реагент для контроля качества, к зонду проточного цитометра.
- С помощью реагента контроля качества отрегулируйте напряжение фотоэлектронных умножителей и оцените их чувствительность.
- Проверка конфигурации цитометра
- В окне "Сводка по системе " убедитесь, что конфигурация цитометра подходит для эксперимента.
- Выберите соответствующий идентификатор партии установочных бусин, чтобы убедиться, что выбранный идентификатор партии установочных бусин соответствует текущей партии исследовательских бусин CS&T.
- Проверка производительности
- Выберите опцию «Проверить производительность » и нажмите «Выполнить».
- По завершении проверки производительности отобразятся результаты производительности. Просмотрите отчет о производительности цитометра. Нажмите кнопку «Готово », чтобы завершить проверку производительности, или извлеките пробирку из цитометра и просмотрите результаты в окне «Сводка системы ».
- Обратите внимание на окончательный результат анализа морфометрической и флуоресцентной чувствительности, который появится в | сводка системы| результат работы цитометра| со статусом: ПРОЙДЕНО
2. Подготовка спор
- После спороношения споры 3 раза промывают сверхчистой ледяной водой центрифугированием при 17 949 × г в течение 10 мин.
- Гранулы, полученные в результате последнего центрифугирования, повторно суспендировать 10 мл сверхчистой воды.
- Автоклавировать споры в течение 45 мин при 121 ºC для инактивации вегетативных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие тесты, проведенные нашей группой, сравнивающие различные методы инактивации, показали, что условия, упомянутые на этапе 2.3, показали высокую эффективность, не показывая образования колоний в методе анализа гальванического покрытия на среде агара LB.
3. Количественное определение автоклавных спор с помощью проточной цитометрии
- Берут 50 мкл автоклавных спор и инкубируют их в защищенном от света бромиде этидия (EtBr, 10 мг/мл, разведенный в воде) при коэффициенте разбавления 0,05% v/v в течение 30 мин (рис. 1A).
- Промывают споры 3 раза 1x фосфатно-солевым буфером (PBS) центрифугированием при 17 949 × g в течение 10 мин и ресуспендируют в 1x PBS.
- Добавьте 10 мкл гранул, следуя рекомендациям производителя по разведению.
- Проанализируйте образец с помощью проточного цитометра, как описано в шаге 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно подчеркнуть, что гранулы должны быть пипетированы как можно более однородно, так как в расчетах наблюдались несоответствия, когда этот этап не был выполнен должным образом.
4. Анализ с помощью проточной цитометрии
- Войдите в программное обеспечение Cytometer.
- В рабочей области программного обеспечения выберите Цитометр | Режим очистки | Сидячие жидкости.
- Настройтесь на рабочую область, чтобы определить анализ в проточной цитометрии.
- Определите вентили для анализа (рис. 2).
- Определите стратегию стробирования на основе морфометрических и флуоресцентных характеристик частиц на основе отрицательного контроля (немаркированные споры).
- Чтобы определить морфометрию клеток, выберите Точечная диаграмма для анализа параметров FSC-A по оси x и SSC-A по оси y.
- Чтобы определить флуоресценцию, выберите FL3 Точечные графики по оси y, используя FL5 по оси x, и создайте вентили в четырех квадрантах.
- Определите вентили для анализа (рис. 2).
- Используйте полистирольную трубку размером 12 x 75 мм с пробкой, содержащую немаркированные образцы, предварительно помеченные одноцветным EtBr, одноцветным APC и многоцветным EtBr+ APC.
- Очень осторожно перемешайте пробирку, содержащую отрицательный контроль, и присоедините ее к зонду проточного цитометра.
- Нажмите « Приобрести».
- Установите мощность лазеров, перейдя в раздел Цитометр | Параметры | FSC (375) и SSC (275).
- Установите пороговое значение (500) Цитометр | Порог.
- Чтобы удалить автофлуоресценцию, проанализируйте образец без красителей, содержащий только споры.
- Отрегулируйте напряжения для детекторов фильтров: FL3 (603) и FL5 (538), чтобы различать отрицательные и положительные популяции по отношению к выбранной флуоресценции в контрольных элементах. Цитометр | Параметры.
- Цитометр | Компенсация | Установите смещение настройки FL5/FL3 на 1.0.
- После морфометрии и флуоресцентного анализа настройте устройство для получения 30 000 событий | Эксперимент | Макет эксперимента | Приобретение |30 000 событий....
- После настройки параметров в проточном цитометре получают данные для образцов, которые маркированы и содержат гранулы.
- Рассчитайте концентрацию спор, как описано в инструкциях производителя, используя уравнение (1).
(1)
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании метод количественного определения валика был сравнен с анализом счетной камеры Петрова-Хауссера. Кроме того, мечение автоклавных спор сравнивалось с мечением неавтоклавных спор.
(1)5. Оценка индекса связывания белков на поверхности споры методом проточной цитометрии
- Собирают центрифугированием 50 мкл спор (103/мкл) 17,949 × г в течение 10 мин, а затем ресуспендируют с 25 мкл 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЭДК) (300 мМ)).
- Выдерживать 15 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 25 мкл N-гидроксисульфосукцинимида (NHS) (50 мМ) к споровой суспензии и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Промойте споры 3 раза 1 PBS центрифугированием, как описано в шаге 5.1.
- Добавьте флуоресцентный белок и оставьте образцы на ночь при температуре 15 °C.
Примечание: Флуоресцентный белок, использованный в этой работе, представлял собой меченое APC античеловеческое антитело IL-10. Это антитело было использовано в качестве модели для исследования, хотя применение других флуоресцентных молекул возможно, поскольку EDC/NHS способствуют ковалентному лигированию между группами -COOH и -NH2 , присутствующими в белках на поверхности спор. - Промойте споры в соответствии с шагом 5.3.
- Добавьте 10 мг/мл бромида этидия, разбавленного в соотношении 1:50, затем оставьте на 1 ч на льду в защищенном от света месте (рисунок 1B).
- Промойте споры в соответствии с шагом 5.3.
- Повторите шаг 4.
- Чтобы определить флуоресценцию, измените параметры FL3 по оси X и FL5 по оси Y точечной диаграммы.
- Проанализируйте образец с помощью проточного цитометра с синим лазером (488 нм) на FL3 (фильтр 670 LP) и красным лазером (633 нм) на FL5 (фильтр 660/20), как описано в шаге 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Те же образцы были проанализированы на иммунофлуоресценцию на предметных стеклах под микроскопом, при увеличении 1000 x и с использованием следующих фильтров: FITC 480/30 нм (зеленый) и TRITC 540/25 нм (красный).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В образцах автоклавных спор (АС) с помощью счетных шариков и метода Петрова-Хауссера было обнаружено 2 × 103 споры/мкл и 1 ×10 3 споры/мкл соответственно (рис. 2).
Рисунок 1: Общая схема количественного определения спор. (A) Споры, помеченные EtBr, и (B) споры с двойной меткой. Аббревиатуры: EDC = 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид; NHS = N-гидроксисульфосукцинимид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфометрический и качественный анализ спор и счетных шариков Bacillus subtilis с помощью проточной цитометрии. Количественное определение спор B. subtillis с помощью счетных шариков (неразбавленный образец). Сокращения: FSC-A = площадь прямого пика рассеяния; SSC-A = площадь бокового пика рассеяния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Окрашивание образцами автоклавных спор (AS) бромидом этидия (EtBr) показало более высокую среднюю интенсивность флуоресценции (MFI), чем окрашивание неавтоклавных спор (NAS), что указывает на большее окрашивание генетического материала в первом состоянии. Кроме того, в популяции АС, меченной EtBr, наблюдался больший MFI, чем в популяции NAS (рис. 3, пик красным цветом и пик черным). Контрольный образец, не помеченный EtBr, не показал значимой флуоресценции (рис. 3, пунктирный пик).
Рисунок 3: Гистограмма меченных бромидом этидия, автоклавированных и неавтоклавных спор Bacillus subtillis . Пик в маркировке red-NAS EtBr; пик в черной маркировке AS EtBr; пунктирный контроль пиков без маркировки EtBr. Сокращения: EtBr = бромид этидия; NAS = неавтоклавные споры; AS = автоклавные споры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
В этих экспериментах MFI на поверхностном соединении AS с меченым APC античеловеческим антителом IL-10 показал большую эффективность связывания по сравнению с NAS (рис. 4). По этой причине эксперименты с двойной меткой были проведены с АС. При анализе проточной цитометрии были идентифицированы четыре популяции спор: EtBr+/FA+; EtBr+/FA-; EtBr-/FA+; EtBr-/FA-. Наличие спор, проницаемых для молекулярного маркера EtBr, указывает на возможное присутствие проросших спор в общей популяции. Это можно было наблюдать после анализа образца с помощью флуоресцентной микроскопии (с помощью которой можно было наблюдать маркировку EtBr/Fluorescent Anti-mouse table 8 и оба флуорофора по отдельности, рис. 5). Использование метода окрашивания Виртца-Конклина позволило визуализировать наличие спор с проницаемостью для сафранина (окрашены в розовый цвет, дополнительный рисунок S1). В этом же анализе наблюдались споры, окрашенные только малахитовым зеленым цветом, что указывает на непроницаемость, как сообщается в литературе для спящих спор13. Анализ спор с помощью фазово-контрастной микроскопии показал большее количество спящих спор в образце AS по сравнению с NAS (дополнительный рисунок S2)14.
Рисунок 4: Средняя интенсивность флуоресценции меченых APC антител к IL-10 в автоклавных и неавтоклавных спорах. Сокращения: FA = флуоресцентное антитело; APC = аллофикоцианин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Иммунофлуоресцентная визуализация спор, меченных EtBr и флуоресцентным антимышиным средством. (A) Споры с генетическим материалом, помеченным EtBr (красный). (B) Споры с поверхностью, помеченной флуоресцентным антимышиным средством (зеленый). (C) Споры с двойной меткой, с EtBr и флуоресцентным антимышиным веществом (оранжевый). Масштабная линейка = 10 мкм. Сокращения: EtBr = бромид этидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Проведенный здесь анализ методом проточной цитометрии показал более высокий процент связывания ЖК со спящими спорами (EtBr-/FA+) по сравнению с проросшими спорами (EtBr+/FA+). На графике, представленном на рисунке 6А, Б, можно наблюдать увеличение процента связанных спор и MFI по мере увеличения концентрации FA. Кроме того, популяции этих спор, которые не связывались с флуоресцентным белком (EtBr+/FA- и EtBr-/FA-), демонстрировали постепенное снижение с увеличением концентрации ФА (Дополнительная таблица S1).
Рисунок 6: Анализ процентного соотношения флуоресценции и средней интенсивности флуоресценции популяций EtBr-/FA+ и EtBr+/FA-. (A) Ось X представляет различные концентрации ФА, черная ось Y представляет обнаруженные MFI, а красная ось Y представляет процент спор, меченных ФА, из популяции EtBr-/FA+. (B) Ось X представляет различные концентрации FA, черная ось Y представляет обнаруженные MFI, а красная ось Y представляет процентное соотношение меченых EtBr спор и FA в популяции EtBr+/FA+. Сокращения: MFI = средняя интенсивность флуоресценции; EtBr = бромид этидия; FA = флуоресцентные антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Микроскопическое изображение автоклавных спор B. subtilis , окрашенных по методу Виртца-Конклина. Споры, окрашенные в розовый цвет, представляют собой пророщенные споры (проницаемые для сафранина). Зеленым цветом выделены спящие споры (непроницаемые для сафранина). Масштабная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Сравнение изображений фазово-контрастной микроскопии автоклавных и неавтоклавных спор B. subtilis . (А,Б) Изображения спор B. subtilis до и после обработки автоклавом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица S1: Значения процентного содержания спор, помеченных или не помеченных флуоресцентными антителами и бромидом этидия, в различных концентрациях ЖК, наблюдаемых при проточной цитометрии. Сокращения: EtBr = бромид этидия; FA = флуоресцентные антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Традиционные методы, такие как пластинчатый подсчет колоний, не только отнимают много времени, но и требуют жизнеспособных клеток и не позволяют количественно определить инактивированные споры5. Камера Петрова-Хауссера является альтернативной методикой, но для ее выполнения требуется опытный микроскопист. Проточная цитометрия зарекомендовала себя как полезная альтернатива для этой цели.
Genovese et al.12 описали использование проточной цитометрии для количественного определения жизнеспособных клеток и спор Bacillus sp. с использованием двух маркеров нуклеиновых кислот и высокой контрольной способности расхода (объем/минуту) используемого оборудования, что дает возможность определять численное количество, которое необходимо настроить. Не все цитометрическое оборудование имеет строгий контроль за расходом (объем/минуты), а некоторые регулируются только в минимальном, среднем и максимальном вариантах. В этих случаях счетные шарики могут быть использованы для обеспечения точности подсчета клеток и воспроизводимости по сравнению с другим оборудованием для проточной цитометрии. С помощью этого метода в данном исследовании удалось рассчитать количество спор (проросших и спящих) на миллилитр в образцах.
Популяция спор была переписана и проанализирована в соответствии с параметрами, описанными в патенте10 Годфри и Альшарифа. Авторы описывают использование данной методики для анализа стадий прорастания Bacillus spp. без описания состояния споры и с использованием дорогостоящих коммерческих ДНК-маркеров 11,12,13. В описанной здесь работе с помощью АС удалось идентифицировать две популяции спор (спящие и проросшие) с помощью EtBr, который является широко используемым и легкодоступным маркером. Идентификация спорового состояния стала возможной благодаря проницаемости проросших спор к EtBr. Важно подчеркнуть, что популяция спор, не помеченных EtBr, может представлять артефакты аналогичного размера в одном и том же образце. Это ограничение можно смягчить, промыв и отфильтровав используемые буферы.
Анализ проточной цитометрии образцов АС, меченных EtBr, в сочетании с ФА, описанными здесь, также позволил квалифицировать и количественно определить флуоресцентное сопряжение белков (FPC). Анализ флуоресцентно меченных и связанных образцов следует проводить немедленно, чтобы избежать потери флуоресцентного излучения. Кроме того, удалось сделать вывод о том, влияет ли процедура конъюгации на морфологию и концентрацию споровой популяции, что дало общее представление о процессе, которое не получается при использовании метода дот-блоттинга. Isticato et al.15 также проанализировали FPC на поверхности спор и продемонстрировали его жизнеспособность, подтвердив ее с помощью иммунофлуоресценции и проточной цитометрии, в зависимости от типа белка, который используется для связывания. При этом было отмечено, что использование AS11 предпочтительнее для связывания, поскольку процесс автоклавирования важен для инактивации протеаз, которые могут разрушать связываемый белок. Важно отметить, что описанные здесь методы были выполнены только с использованием штамма B. subtilis KO7, а применение на других штаммах еще предстоит испытать.
В литературе отсутствуют сообщения, сравнивающие способность спор к связыванию в зависимости от их стадии. В представленных здесь экспериментах наблюдался более высокий процент спящих спор в сочетании с ФА (EtBr-/FA+)16. Напротив, проросшие споры (EtBr+/FA+), несмотря на их более низкий процент, показали более высокий MFI, чем то, что наблюдалось у спящих спор. Необходимо провести дальнейшие исследования, чтобы оценить это поведение для более высоких концентраций FA (точки насыщения) у других Bacillus spp.
Для будущих применений представленный здесь метод может быть использован в исследованиях по использованию спор B. subtilis в качестве вакцинного адъюванта, оценивая связь целевого антигена, первоначально меченного флуоресценцией. После определения насыщающей концентрации обнаруженное значение может быть применено к целевому антигену для использования в иммунизации.
Таким образом, в данной работе представлен практичный и чувствительный метод перебора проросших и спящих спор и анализа флуоресцентного сопряжения белков спор Bacillus subtilis с помощью проточной цитометрии. Использование счетных шариков в качестве параметра для количественного определения, в дополнение к мечению спорами EtBr, позволяет проводить точный подсчет проросших спор и процентное определение соединения флуоресцентных белков. Этот метод должен помочь в развитии исследований, которые сосредоточены на использовании спор в качестве адъюванта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование было частично профинансировано Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) - Финансовый кодекс 001; Governo do Estado do Amazonas с ресурсами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Авторы благодарят Программу технологического развития в области инструментов для здоровья PDTIS-FIOCRUZ за использование ее возможностей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M.
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , John Wiley and Sons, Chichester, UK. (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O'Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. Godfrey, A., Alsharif, R. , US20040023319A1 https://patentimages.storage.googleapis.com/fa/3c/dc/9e08d9ecd1b315/US20040023319A1.pdf (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A.
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
