Summary
Il presente protocollo descrive un metodo efficiente per l'ottimizzazione della tecnologia di lavorazione di Tiebangchui lavorato con vino d'orzo delle Highlands basato su una superficie di risposta del design Box-Behnken combinata con il metodo dell'entropia.
Abstract
La lavorazione di etnofarmaci tossici è di grande importanza per la loro applicazione clinica sicura. Pertanto, i limiti dell'elaborazione tradizionale dovrebbero essere affrontati e il metodo di lavorazione delle etnomedicine dovrebbe essere standardizzato utilizzando moderni metodi di ricerca. In questo studio, è stata ottimizzata la tecnologia di lavorazione di una medicina tibetana comunemente usata Tiebangchui (TBC), la radice essiccata del pendolo di Aconito Busch, lavorata con vino d'orzo delle Highlands. Il contenuto di alcaloide diestere-diterpenoide (DDA) (aconitina, 3-deossiaconitina, 3-acetilaconitina) e alcaloide monoestere-diterpenoide (MDA) (benzoiliconina) sono stati utilizzati come indicatori di valutazione e il coefficiente di peso di ciascun indice di valutazione è stato determinato con il metodo dell'entropia.
Il test a fattore singolo e il design Box-Behnken sono stati utilizzati per studiare l'influenza del rapporto tra vino d'orzo delle Highlands e TBC, lo spessore della fetta di TBC e il tempo di lavorazione. Il punteggio completo è stato eseguito in base al peso oggettivo di ciascun indice determinato dal metodo dell'entropia. Le condizioni ottimali di lavorazione del TBC con vino d'orzo delle Highlands erano le seguenti: la quantità di vino d'orzo delle Highlands è cinque volte quella di TBC, un tempo di ammollo di 24 ore e uno spessore TBC di 1,5 cm. I risultati hanno mostrato che la deviazione standard relativa tra il test di verifica e il valore previsto era inferiore al 2,55% e la tecnologia di lavorazione ottimizzata del TBC lavorato con vino d'orzo delle Highlands è semplice, fattibile e stabile, e quindi può fornire un riferimento per la produzione industriale.
Introduction
Tiebangchui (TBC), la radice essiccata del pendolo di Aconito Busch, è una nota medicina tibetana ed è stata inizialmente registrata nel classico libro medico tibetano "Four Medical Tantra"1,2. Secondo gli "Standard sui farmaci del Ministero della Salute della Repubblica Popolare Cinese (Medicina Tibetana)", TBC è efficace nell'espellere il freddo, alleviare il dolore, dissipare il vento e calmare lo shock, ed è comunemente usato per trattare l'artrite reumatoide nelle cliniche 3,4,5.
TBC contiene principalmente alcaloidi, tra cui alcaloidi diestere-diterpenoidi altamente tossici (DDA) e gli alcaloidi monoestere-diterpenoidi moderatamente tossici (MDA)6,7,8. Questi componenti chimici sono principi attivi con effetti medicinali ma sono tossici. Uno dei più famosi principi attivi e tossici, l'aconitina, provoca avvelenamento quando supera 1 mg9. Pertanto, l'uso improprio o eccessivo di TBC potrebbe causare avvelenamento e persino la morte, e l'attenuazione della tossicità e la riserva di efficacia della TBC sono cruciali per la sua applicazione clinica sicura10,11.
L'elaborazione è un metodo efficace per disintossicare TBC. Secondo gli antichi libri di medicina tibetana, la lavorazione con vino d'orzo delle Highlands è un modo efficace per attenuare la tossicità e preservare l'efficacia della TBC. TBC è immerso nel vino d'orzo delle Highlands, conservato per una notte, essiccato e aggiunto ai medicinali12. Tuttavia, la tecnologia di elaborazione specifica e i potenziali fattori di influenza sono raramente riportati e il processo di elaborazione tradizionale spesso si basa sull'esperienza e manca di metodi standardizzati. Pertanto, sono necessari moderni metodi scientifici e tecnologici per ottimizzare e standardizzare il processo di elaborazione.
Il metodo di progettazione Box-Behnken viene utilizzato per studiare le interazioni tra diversi fattori e la loro influenza sul punteggio completo attraverso il fitting polinomiale quadratico. Questo design consente l'osservazione intuitiva delle condizioni ottimali ed è stato ampiamente utilizzato nel campo della farmacia13. Ad esempio, il metodo di progettazione Box-Behnken, basato sul metodo dell'entropia, ha ottimizzato con successo la tecnologia di lavorazione della frittura con aceto di Curcuma Longa Radix14. In questo studio, il disegno sperimentale della superficie di risposta Box-Behnken combinato con il metodo dell'entropia è stato utilizzato per ottimizzare la tecnologia di lavorazione del TBC lavorato con vino d'orzo delle Highlands. La tecnologia di elaborazione ottimizzata dovrebbe garantire il controllo di qualità e l'uso clinico sicuro.
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Protocol
In questo studio, la tecnologia di lavorazione del TBC lavorato con vino d'orzo delle Highlands è stata ottimizzata con un design Box-Behnken combinato con il metodo dell'entropia. Il contenuto di DDA e MDA è stato utilizzato come indicatore di valutazione e il coefficiente di peso di ciascun indice di valutazione è stato determinato con il metodo dell'entropia.
1. Preparazione sperimentale
- Preparare il vino d'orzo delle Highlands15.
- Prendi 500,00 g di riso nero d'orzo delle Highlands e aggiungi cinque volte la quantità di acqua. Cuocere il riso fino a quando l'acqua rimanente viene assorbita (~2 h). Versare, attendere che la temperatura scenda a 37 °C, aggiungere 4 g di Jiuqu (vedi Tabella dei materiali), mescolare bene, sigillare la lattina, avvolgere il contenitore con cotone idrofilo e lasciarlo stufare per 7 giorni.
- Aggiungere 300 ml di acqua il 7 ° giorno e sigillare nuovamente. L'8 ° giorno, iniziare a rimuovere il vino e sostituire con 300 ml di acqua in seguito. Sigillare e fermentare per 1 giorno, prendere il vino e aggiungere nuovamente 300 ml di acqua. Ripetere questa procedura tre volte e unire i liquori.
- Portare a ebollizione, quindi ridurre la fiamma a fuoco lento e continuare la cottura fino a quando l'acqua rimanente non viene assorbita.
- Per preparare i prodotti trasformati, pesare accuratamente il TBC in un contenitore, aggiungere vino d'orzo delle Highlands e immergere per 1 giorno. Quindi, asciugare in un forno elettrico di essiccazione a temperatura costante.
NOTA: La temperatura di essiccazione deve essere inferiore a 40 °C per evitare cambiamenti nella composizione dell'alcaloide. - Preparare la soluzione del campione di prova.
- Pesare accuratamente la polvere di prodotto trasformato TBC (2 g) in un matraccio conico, aggiungere una soluzione di ammoniaca al 40% ed eseguire l'estrazione assistita da ultrasuoni con solventi misti isopropanolo-etilacetato (1:1) (50 ml) (potenza: 200 W; frequenza: 40 kHz; temperatura: 40 °C) per 30 minuti.
NOTA: Per preparare una soluzione di ammoniaca al 40%, trasferire 40 mL di ammoniaca in un matraccio tarato da 100 mL e quindi diluire con acqua pura. - Regolare la soluzione estratta al peso originale aggiungendo una miscela di isopropanolo-acetato di etile (1:1 v/v).
- Trasferire accuratamente la soluzione estratta (25 ml) in un matraccio a fondo tondo per il recupero del solvente a pressione ridotta fino a quando non è asciutto.
- Infine, trasferire una soluzione di acido cloridrico-metanolo allo 0,05% per sciogliere il residuo della fase 1.3.3 in un matraccio tarato da 5 mL e diluire con una soluzione di cloridrato di metanolo allo 0,05%. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a membrana microporosa da 0,22 μm prima dell'iniezione nei sistemi di cromatografia liquida (HPLC) ad alte prestazioni.
NOTA: Preparare acido cloridrato di metanolo allo 0,05% aggiungendo 0,05 mL di acido cloridrico in un matraccio tarato da 100 ml, quindi diluire con metanolo.
- Pesare accuratamente la polvere di prodotto trasformato TBC (2 g) in un matraccio conico, aggiungere una soluzione di ammoniaca al 40% ed eseguire l'estrazione assistita da ultrasuoni con solventi misti isopropanolo-etilacetato (1:1) (50 ml) (potenza: 200 W; frequenza: 40 kHz; temperatura: 40 °C) per 30 minuti.
- Preparare una soluzione standard pesando accuratamente 5,18 mg di benzoiliconina, 13,13 mg di aconitina, 10,05 mg di 3-deossiaconitina e 10,09 mg di 3-acetilaconitina, quindi porre i solidi in un matraccio tarato da 5 ml singolarmente. Diluire con una soluzione di cloridrato di metanolo allo 0,05%.
2. Stato cromatografico
- Impostare le condizioni cromatografiche come mostrato nella Tabella 1 per HPLC. I dettagli degli strumenti utilizzati sono forniti nella Tabella dei Materiali.
3. Test di adattabilità del sistema
- Gamma di linearità
NOTA: In primo luogo, abbiamo usato HPLC per determinare le aree di picco di benzoilaconitina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina nel campione, quindi determinato in modo casuale l'area di picco di una concentrazione nota di soluzione standard. Successivamente, abbiamo confrontato la differenza tra due aree di picco (soluzione campione e soluzione standard) per stimare la concentrazione di benzoilaconitina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina in campioni diversi, quindi abbiamo regolato la soluzione standard in un intervallo lineare per includere la concentrazione del campione nella curva. Le concentrazioni della curva standard sono mostrate nella tabella 2.- Preparare soluzioni di riferimento di benzoiletinaconitina contenenti 1,036 mg/ml, 0,518 mg/ml, 0,2072 mg/ml, 0,1036 mg/ml e 0,0518 mg/ml.
- Preparare soluzioni di riferimento di aconitina contenenti 1,313 mg/ml, 0,5252 mg/ml, 0,2626 mg/ml, 0,1313 mg/ml e 0,05252 mg/ml.
- Preparare soluzioni di riferimento di 3-deossiaconitina contenenti 1,005 mg/ml, 0,5025 mg/ml, 0,201 mg/ml, 0,1005 mg/ml e 0,402 mg/ml.
- Preparare soluzioni di riferimento di 3-acetilaconitina contenenti 0,2018 mg/ml, 0,1009 mg/ml, 0,04036 mg/ml, 0,02018 mg/ml e 0,01009 mg/ml.
- Studiare la linearità di ciascun composto tracciando l'area di picco rispetto alla concentrazione di iniezione.
- Per eseguire il test di precisione, iniettare 10 μL di ciascuna soluzione di riferimento nel sistema HPLC sei volte al giorno e utilizzare le stesse condizioni HPLC descritte al punto 2.1 per eseguire i campioni Registrare l'area di picco di ciascun componente.
- Eseguire test di stabilità infragiornalieri iniettando 10 μL della soluzione campione preparata tramite il punto 1.3 e determinare le aree di picco dopo 0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 14 h, 12 h e 24 h16.
- Eseguire un test di riproducibilità prelevando sei campioni dello stesso lotto di TBC per preparare la soluzione campione di prova, secondo il passaggio 1.3. Iniettare 10 μL di ciascun campione nel sistema HPLC ed eseguire i campioni come descritto al punto 2.1.
- Eseguire il test di recupero per valutare l'accuratezza del metodo. Aggiungere il 100% della soluzione standard di ciascun componente indice (benzoiliconina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina) nella soluzione di prova per calcolare il tasso di recupero, rispettivamente. Ad esempio, poiché il contenuto di benzoilacestinina è di 0,1524 mg/ml nel campione TBC, pesare accuratamente 0,1524 mg di standard di benzoilacestinina e aggiungerli al campione TBC, quindi preparare la soluzione del campione di prova secondo il punto 1.3. Eseguire questi esempi con le stesse condizioni HPLC descritte nel passaggio 2.1. Calcola il tasso di recupero usando l'equazione (1):
(1)
Qui, A è la quantità di componente (benzoilaconitina, aconitina, 3-deossiaconitina o 3-acetilaconitina) da misurare nella soluzione del campione, B è la quantità di standard aggiunto (benzoiletitina, aconitina, 3-deossiaconitina o 3-acetilaconitina) e C è il valore misurato della soluzione contenente la soluzione standard e la soluzione campione (vedere Tabella 3).). Fare riferimento al passaggio 2.1 per le condizioni cromatografiche per eseguire i passaggi precedenti. Il tasso di recupero riflette il grado di perdita del componente target (benzoilaconitina, aconitina, 3-deossiaconitina o 3-acetilaconitina) durante l'analisi del campione; Maggiore è il tasso di recupero, minore è la perdita del componente di destinazione.
(1)4. Test a fattore singolo di TBC lavorato con vino d'orzo delle Highlands
NOTA: Il rapporto tra vino d'orzo delle Highlands e TBC, lo spessore della fetta di TBC e il tempo di ammollo influenzeranno la dissoluzione di componenti più tossici (aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina) in TBC durante il TBC trattato con vino d'orzo delle Highlands17. Il test a fattore singolo e il design Box-Behnken sono stati utilizzati per studiare l'influenza del rapporto tra vino d'orzo delle Highlands e TBC, lo spessore della fetta di TBC e il tempo di ammollo.
- Eseguire il test di aggiunta del vino d'orzo delle Highlands (A) impostando cinque gruppi di test, ciascuno con 30 g di TBC, in cui la quantità di vino d'orzo delle Highlands è due, tre, quattro, cinque e sei volte la quantità di TBC nella ricetta. Il tempo di ammollo è di 12 ore e le fette hanno uno spessore di 1,0 cm18.
NOTA: ogni gruppo dello stesso test di condizione deve essere elaborato in tre gruppi paralleli. - Eseguire il test del tempo di ammollo (B) impostando cinque gruppi di test, ciascuno con 30 g di TBC. I tempi di ammollo sono 12 h, 24 h, 36 h e 48 h. La quantità di vino d'orzo delle Highlands è cinque volte quella di TBC e le fette hanno uno spessore di1,0 cm 19.
NOTA: ogni gruppo dello stesso esperimento di condizione deve essere elaborato in tre gruppi paralleli. - Eseguire il test dello spessore di affettatura (C) impostando cinque gruppi di test, ciascuno con 30 g di TBC. Le fette hanno uno spessore di 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 e 2,5 cm, il tempo di ammollo è di 24 ore e la quantità di vino d'orzo delle Highlands è cinque volte quella di TBC20.
NOTA: ogni gruppo dello stesso esperimento di condizione deve essere elaborato in tre gruppi paralleli. - Pesare accuratamente i prodotti trasformati per ciascun gruppo di test per preparare la soluzione del campione di prova secondo il punto 1.3. Determinare l'area di picco di ciascun campione mediante HPLC e utilizzare la curva standard per stimare le quantità di MDA e DDA. Nella curva standard, y è l'area del picco e x è il contenuto. Il contenuto di MDA è benzoilaconitina e il contenuto di DDA è la somma di aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina.
- Utilizzare il contenuto totale delle DDA e il contenuto degli MDA come indicatori di valutazione e determinare il coefficiente di peso di ciascun indice di valutazione e il punteggio completo tramite il metodo dell'entropia (sezione 5).
ATTENZIONE: TBC è tossico e quindi devono essere prese misure protettive durante la lavorazione.
5. Metodo di entropia per calcolare il punteggio completo
NOTA: Utilizziamo i dati sperimentali del test dello spessore di tranciatura nel test a fattore singolo come esempio per illustrare in dettaglio il processo di calcolo. Utilizziamo l'area di picco dei componenti in ciascun campione nella tabella supplementare S1 e la curva standard nella tabella 2 per calcolare il contenuto di MDA e DDA (vedere la tabella supplementare S2). Nell'equazione lineare, y è l'area del picco e x è il contenuto. In questo studio, l'MDA moderatamente tossico (benzoilaconitina) è stato utilizzato come indicatore positivo e il contenuto totale di DDA (aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina) con elevata tossicità è stato utilizzato come indicatore negativo. Il contenuto di MDA è benzoilaconitina e il contenuto di DDA è la somma di aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina. Ogni campione ha due indicatori di valutazione: i = 1,2,...,n e j = 1,2,... m21.
- Utilizzare l'equazione (2) per standardizzare il contenuto degli MDA22.
(2)
Così
NOTA: Xij è il valore dell'indicatore j-esimo del campione i-esimo. Xij* è il valore standardizzato di Xij. Ad esempio, i = 3 e j = 1, X31 rappresenta il valore del primo indicatore del terzo campione ed
è il valore standardizzato del primo indicatore nel terzo campione. 
sono mostrati nella tabella supplementare S3. - Utilizzare l'equazione (3) per standardizzare il contenuto totale delle DDA23.
(3)
NOTA: Qui, i = 3, j = 2, rappresenta il secondo indicatore del terzo campione.
è il valore standardizzato del secondo indicatore nel terzo campione. 
sono riportati nella tabella supplementare S3. - Utilizzare le equazioni (4) e (5) per definire il valore di entropia (Hj) di ciascun indicatore23.
- Calcolare la probabilità della j-esima prova sotto l'i-esimo indicatore di valutazione Pij usando l'equazione (4).
(4)
Per il numero 3,
NOTA: i valori di probabilità per il primo indicatore e il secondo indicatore del terzo campione sono rispettivamente 0,2374 e 0,2812.
sono riportati nella tabella supplementare S3. - Calcola l'entropia dell'informazione Hj.
(5)
NOTA: H 1 è l'entropia del primo indicatore (MDA) e H2 è l'entropia del secondo indicatore (DDA) nel test dello spessore di taglio.
- Calcolare la probabilità della j-esima prova sotto l'i-esimo indicatore di valutazione Pij usando l'equazione (4).
- Utilizzare l'equazione (6) per calcolare i pesi dell'indicatore (Wj)23.
(6)
= 33,3%
= 66,7%
NOTA: Wjè il coefficiente di peso di ciascun indicatore. Nel test di spessore di taglio, il coefficiente di peso dell'indicatore positivo (MDA) e dell'indicatore negativo (DDA) è rispettivamente del 33,3% e del 66,7%. - Utilizzare l'equazione (7) per calcolare il punteggio complessivo degli indicatori23.
(7)
Per il numero 3,
NOTA: Si è il punteggio completo di ciascun campione. Dobbiamo ottenere il punteggio più alto come punto centrale nel design Box-Behnken. S 1, S 2, S 3, S 4 e S5 sono mostrati nella tabella supplementare S3.
(2)
è il valore standardizzato del primo indicatore nel terzo campione. 
sono mostrati nella tabella supplementare S3.
(3)
è il valore standardizzato del secondo indicatore nel terzo campione. 
sono riportati nella tabella supplementare S3.
(4)
sono riportati nella tabella supplementare S3.
(5)
(6)
= 33,3%
= 66,7%
(7)
6. Design Box-Behnken
- Attraverso il test a fattore singolo, utilizzare la condizione con il punteggio completo più alto (vedere Tabella 4, Tabella 5, Tabella 6 e Figura 2) come punto centrale della superficie di risposta. Utilizzare la quantità di vino d'orzo delle Highlands (A), il tempo di ammollo (B) e lo spessore della fetta di TBC (C) come fattori di influenza e il punteggio completo come valore di risposta24.
NOTA: in base ai dati a fattore singolo nella Tabella 4, Tabella 5 e Tabella 6, il punteggio complessivo più alto viene calcolato dalle equazioni (2), (3), (4), (5), (6) e (7) nella sezione 5 e si ottiene il punteggio migliore. La quantità di vino d'orzo delle Highlands era cinque volte quella del TBC, il tempo di ammollo era di 36 ore e lo spessore dell'affettatura era di 1,0 cm.
7. Fasi operative del software di progettazione Box-Behnken
- Aprire il software (vedere Tabella dei materiali) e selezionare Nuovo design | Progettazione box-Behnken (vedere punto 5.1; Scheda supplementare 1).
- Immettere il numero di fattori di influenza e immettere le informazioni sul livello (tre fattori di livello; vedere Tabella 7). Il progetto Box-Behnken è composto da 17 esperimenti in questo studio. Infine, fare clic su Continua (vedere il passaggio 5.2; Scheda supplementare 1).
- Impostare il punteggio completo (Y) mediante equazioni (2), (3), (4), (5), (6) e (7) nella sezione 5 come risposta. Immettere il numero di valori di risposta (l'immagine mostra un solo valore di risposta) e fare clic su Fine (vedere il passaggio 5.3; Scheda supplementare 1).
- Elaborare il TBC con vino d'orzo delle Highlands in base ai risultati del progetto e completare l'esperimento in base ai 17 scenari progettati per la superficie di risposta.
- Preparare le soluzioni di esempio seguendo il passaggio 1.3 e calcolare il contenuto totale degli MDA e DDA dal sistema HPLC.
- Calcolare il punteggio completo per ciascun gruppo in base alle equazioni (2), (3), (4), (5), (6) e (7) nel passaggio 5 e inserire i risultati del punteggio (vedere il passaggio 5.4; Scheda supplementare 1).
- Fare clic su Analizza per analizzare le informazioni sulla data e sul modello (vedere il passaggio 5.4.1; Scheda supplementare 1).
- Eseguire la validazione statistica delle equazioni polinomiali e l'analisi della superficie di risposta tracciata nei grafici del modello 3D ottenuti dal software.
- Clicca su ANOVA nel menu in alto e osserva la tabella dei risultati.
- Fare clic su Ottimizzazione per visualizzare le condizioni di processo ottimali previste (vedere il passaggio 5.4.2; Scheda supplementare 1).
8. Test di convalida
- In base ai risultati previsti dal design della superficie di risposta Box-Behnken, nel passaggio 7.3, identificare la condizione di lavorazione ottimale di TBC. Qui, è il seguente: TBC è immerso per 24 ore in cinque volte la quantità di vino d'orzo delle Highlands e lo spessore del TBC è di 1,5 cm. Prendi il livello ottimale di fattori di influenza come condizioni di elaborazione e imposta tre serie parallele di esperimenti per verificare la stabilità della tecnologia di elaborazione.
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Representative Results
In questo studio, la precisione, la stabilità, la ripetibilità e il recupero del campione di TBC hanno indicato che il metodo è fattibile. Le quattro componenti dell'indice in TBC avevano una buona relazione lineare all'interno di uno specifico intervallo di concentrazione. I cromatogrammi tipici sono mostrati nella Figura 1. I risultati dei test di precisione (Tabella 8) hanno mostrato che la deviazione standard relativa (RSD) delle aree di picco era 2,56%, 1,49% e 2,03% per benzoilaconina, aconitina e 3-deossiaconitina, rispettivamente, e 0,21% per 3-acetilaconitina, indicando che la precisione dello strumento era buona. Lo studio di stabilità eseguito per 24 ore (n = 6) ha indicato valori di deviazione standard relativa di 2,76%, 2,21%, 2,98% e 2,31% rispettivamente per benzoiliconina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina (Tabella 9), suggerendo che la soluzione del campione era stabile per 24 ore. I risultati del test di ripetibilità (Tabella 10) hanno mostrato che gli RSD delle aree di picco di benzoilaconina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-deossiaconitina erano rispettivamente del 2,80%, 2,92%, 2,92% e 2,07%, dimostrando che la ripetibilità di questo metodo era buona. I risultati dell'esperimento di recupero hanno indicato che i tassi medi di recupero di benzoilaconina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-deossiaconitina erano rispettivamente del 99,7%, 100,84%, 103,27% e 100,92%.
Il test a fattore singolo di TBC lavorato con vino d'orzo delle Highlands ha rivelato che la quantità di vino d'orzo delle Highlands era cinque volte quella del TBC, il tempo di ammollo era di 36 ore e lo spessore di affettatura era di 1,0 cm (Figura 2). Il disegno sperimentale e i risultati del modello della superficie di risposta sono mostrati nella Tabella 11. I risultati dell'ANOVA sperimentale sono riportati nella Tabella 12. I fattori sono adattati dalla regressione per ottenere un'equazione di regressione multinomiale quadratica (8). A: aggiunta di vino d'orzo delle Highlands; B: tempo di ammollo; C: spessore di taglio. I risultati hanno mostrato che il modello era ben adattato ed era in grado di prevedere la relazione tra il punteggio completo dell'aggiunta di vino d'orzo delle Highlands, il tempo di ammollo e lo spessore della fetta. L'ordine dei fattori in base alla forza degli effetti era l'aggiunta di vino d'orzo dell'altopiano > spessore della fetta di erbe medicinali > il tempo di ammollo.
(8)
Secondo l'equazione (8), il software di analisi Design-Expert 8.0.6 viene utilizzato per tracciare una curva 3D tramite il passo 7.2.1 (Figura 3). Una pendenza più ripida della superficie di risposta indica una più forte interazione orizzontale dei fattori e una pendenza più dolce è l'opposto. Il valore p (p < 0,0001) del modello nella tabella 12 mostra che il modello è significativo, con un R2 di 0,9754 e un termine disadattato non significativo (p = 0,7253), indicando che il modello è adatto e riflette meglio la relazione tra l'aggiunta di vino d'orzo delle Highlands, il tempo di ammollo, lo spessore della fetta di erbe medicinali, e punteggio complessivo.
In base al peso oggettivo di ciascun indice determinato dal metodo dell'entropia analitica, è stato eseguito un punteggio completo e la condizione di elaborazione ottimale di TBC è stata determinata come segue: TBC viene immerso per 24 ore in cinque volte la quantità di vino d'orzo delle Highlands e lo spessore del TBC è di 1,5 cm. I risultati dei test di convalida hanno mostrato che i DDA totali erano rispettivamente 0,6963, 0,6793 e 0,7023 mg / g e il contenuto di MDA in tre serie di test paralleli era 0,2096, 0,2237 e 0,2109 mg / g. Il punteggio medio complessivo è stato di 83. L'RSD tra il test di verifica e il valore previsto era inferiore all'1,8%, indicando che la tecnologia di lavorazione ottimizzata del TBC lavorato con vino d'orzo delle Highlands è semplice, fattibile e stabile, fornendo un riferimento per la produzione industriale.
Figura 1: Cromatogrammi rappresentativi dei quattro componenti caratteristici dopo aver fissato le condizioni cromatografiche menzionate al punto 2.1 (n = 1). A) Cromatogrammi tipici della soluzione di riferimento. Il picco 1 è la benzoilaconina, il picco 2 è l'aconitina, il picco 3 è la 3-deossiaconitina e il picco 4 è la 3-acetilaconitina. B) Cromatogrammi tipici della soluzione campione. Il picco 1 è la benzoilaconina, il picco 2 è l'aconitina, il picco 3 è la 3-deossiaconitina e il picco 4 è la 3-acetilaconitina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Il punteggio completo del test a fattore singolo del TBC trattato con vino d'orzo delle Highlands (n = 3). (A) Quantità di vino d'orzo delle Highlands (volte); (B) Tempo di ammollo (h); (C) Spessore della fetta (cm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Mappa della superficie di risposta 3D dell'effetto dell'interazione di vari fattori sul punteggio completo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Condizione | Parametro |
| Colonna cromatografica | Ultimate ODS-3 C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) |
| Fase mobile | Acetonitrile (A) - 0,04 mol/L soluzione di acetato di ammonio (B) pH= 8,5 ± 0,5 |
| Eluizione del gradiente | 0–10 min, 0%-70% A; 10–15 min, 70–50% A; 15–30 min, 50–40% A; 30-38 minuti, 40-15% A; 38–45 min, 15–15% A; 45–55 min, 15–70% A |
| Portata | 1 ml/min |
| Temperatura della colonna | 30 °C |
| Rilevamento della lunghezza d'onda | 235 nm |
| Volume del campione | 10 μL |
Tabella 1: Le condizioni cromatografiche stabilite in questo esperimento. Dettagli sulla colonna cromatografica, la fase mobile, l'eluizione del gradiente, la portata, la temperatura della colonna, la lunghezza d'onda di rilevamento e il volume del campione.
| Componenti dell'indice | Equazione lineare | Gamma di linearità (mg/ml) | R2 |
| Benzoylaconine | y=11.658.706,1677x +19.717,0872 | 1.036-0.0518 | 0.9995 |
| Aconitina | y=11.199.784,3030x -67.641,2429 | 1.313-0.05252 | 0.9999 |
| 3-Deossiaconitina | y=11.214.550,3140x +59.795,9119 | 1.005-0.0402 | 0.9999 |
| 3-acetilaconitina | y=9.887.511,9074x +26.713,6359 | 0.2018-0.01009 | 0.9994 |
Tabella 2: Relazione lineare dei componenti dell'indice in TBC. Le quattro componenti dell'indice in TBC avevano una buona relazione lineare in un intervallo di concentrazione specifico.
| Componenti dell'indice | Contenuto noto (mg) | Quantità aggiunta (mg) | Quantità di misura (mg) | Recuperi (%) | Recuperi medi (%) | RSD (%) |
| Benzoylaconine | 0.1558 | 0.1295 | 0.2901 | 96.4 | 99.7 | 3.14 |
| 0.1574 | 0.1295 | 0.2849 | 98.46 | |||
| 0.156 | 0.1295 | 0.2871 | 101.24 | |||
| 0.1574 | 0.1295 | 0.2923 | 104.95 | |||
| 0.1449 | 0.1295 | 0.2736 | 99.38 | |||
| 0.1566 | 0.1295 | 0.2839 | 98.3 | |||
| Aconitina | 0.3099 | 0.3283 | 0.645 | 102.07 | 100.84 | 2.02 |
| 0.3153 | 0.3283 | 0.6371 | 98.02 | |||
| 0.2928 | 0.3283 | 0.6314 | 103.14 | |||
| 0.2969 | 0.3283 | 0.6325 | 102.23 | |||
| 0.3035 | 0.3283 | 0.6343 | 100.76 | |||
| 0.3094 | 0.3283 | 0.6339 | 98.84 | |||
| 3-Deossiaconitina | 0.1789 | 0.201 | 0.3788 | 99.45 | 103.27 | 2.65 |
| 0.1793 | 0.201 | 0.3845 | 102.09 | |||
| 0.1741 | 0.201 | 0.3774 | 101.14 | |||
| 0.1635 | 0.201 | 0.3753 | 105.37 | |||
| 0.1708 | 0.201 | 0.383 | 105.57 | |||
| 0.1653 | 0.201 | 0.3783 | 105.97 | |||
| 3-acetilaconitina | 0.0169 | 0.02 | 0.0374 | 102.5 | 100.92 | 1.15 |
| 0.0168 | 0.02 | 0.037 | 101 | |||
| 0.0166 | 0.02 | 0.0366 | 100 | |||
| 0.0161 | 0.02 | 0.0365 | 102 | |||
| 0.017 | 0.02 | 0.0369 | 99.5 | |||
| 0.0171 | 0.02 | 0.0372 | 100.5 |
Tabella 3: Risultati della misurazione della velocità di recupero del campione. L'RSD del tasso di recupero di benzoiliconina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina è stato rispettivamente del 3,14%, 2,02%, 2,65% e 1,15%.
| Numero | Test di aggiunta del vino d'orzo delle Highlands (tempi) | Contenuto di MDA (mg/g) | Contenuto di DDA (mg/g) | Punteggio completo/punti |
| 1 | 2 | 0.1875 | 0.8254 | 58.98421777 |
| 2 | 3 | 0.1099 | 0.9847 | 0.056898711 |
| 3 | 4 | 0.2296 | 0.8487 | 71.12048666 |
| 4 | 5 | 0.2161 | 0.6894 | 94.6966946 |
| 5 | 6 | 0.2006 | 0.7472 | 78.22537224 |
Tabella 4: Risultati del test a fattore singolo del rapporto tra vino d'orzo delle Highlands e TBC.
| Numero | Test del tempo di ammollo (h) | Contenuto di MDA (mg/g) | Contenuto di DDA (mg/g) | Punteggio completo/punti |
| 1 | 6 | 0.236292609 | 1.047811476 | 59.67501032 |
| 2 | 12 | 0.193880685 | 1.164420534 | 23.10718817 |
| 3 | 24 | 0.229606225 | 0.848736346 | 53.86313899 |
| 4 | 36 | 0.151447388 | 0.701045217 | 79.15664943 |
| 5 | 48 | 0.193311963 | 0.767427412 | 68.88872066 |
Tabella 5: Risultati della prova a fattore singolo del tempo di ammollo.
| Numero | PROVA DI SPESSORE DI TRANCIATURA (CM) | Contenuto di MDA (mg/g) | Contenuto di DDA (mg/g) | Punteggio completo/punti |
| 1 | 0.5 | 0.1043 | 0.6190 | 66.96 |
| 2 | 1 | 0.1709 | 0.6992 | 75.05 |
| 3 | 1.5 | 0.1507 | 0.6954 | 66.23 |
| 4 | 2 | 0.1459 | 0.8347 | 20.66 |
| 5 | 2.5 | 0.1451 | 0.8298 | 21.79 |
Tabella 6: I risultati del test a fattore singolo dello spessore della fetta di TBC.
| Livello | Fattore | ||
| A (quantità di vino d'orzo delle Highlands, volte) | B (tempo di ammollo, h) | C (spessore fetta, cm) | |
| 1.0000 | 4.0000 | 24.0000 | 0.5000 |
| 2.0000 | 5.0000 | 36.0000 | 1.0000 |
| 3.0000 | 6.0000 | 48.0000 | 1.5000 |
Tabella 7: Tabella del fattore di livello superficiale della risposta del progetto Box-Behnken.
| Area di picco nei componenti dell'indice | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD (%) |
| Benzoylaconine | 1281252 | 1290912 | 1198912 | 1256056 | 1256704 | 1266738 | 2.56% |
| Aconitina | 2861208 | 2881686 | 2785022 | 2790990 | 2859024 | 2799395 | 1.50% |
| 3-Deossiaconitina | 2356317 | 2328383 | 2429059 | 2350987 | 2406114 | 2450374 | 2.04% |
| 3-acetilaconitina | 2008110 | 2021560 | 2014519 | 2015881 | 2015209 | 2012529 | 0.22% |
Tabella 8: Risultati della misurazione di precisione. L'RSD delle aree di picco di benzoiliconina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina era rispettivamente 2,56%, 1,49%, 2,03% e 0,22% (n = 6).
| Area di picco nei componenti dell'indice | 0 | 2 | 4 | 8 | 12 | 24 | RSD (%) |
| Benzoylaconine | 191657 | 189590 | 193934 | 205135 | 196159 | 195954 | 2.76 |
| Aconitina | 312259 | 310240 | 294331 | 309104 | 312199 | 305360 | 2.22 |
| 3-Deossiaconitina | 230174 | 246787 | 239760 | 249302 | 248806 | 243396 | 2.98 |
| 3-acetilaconitina | 17086 | 16953 | 16826 | 16914 | 16979 | 17896 | 2.31 |
Tabella 9: Risultati della prova di stabilità. L'RSD delle aree di picco di benzoiliconina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina era rispettivamente 2,76%, 2,21%, 2,98% e 2,31% (n = 6).
| Area di picco dei componenti dell'indice | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD (%) |
| Benzoylaconine | 191067 | 192795 | 191058 | 192907 | 179103 | 192008 | 2.79 |
| Aconitina | 308142 | 313754 | 290487 | 294740 | 301515 | 307654 | 2.92 |
| 3-Deossiaconitina | 249021 | 249456 | 243963 | 232781 | 240524 | 234661 | 2.92 |
| 3-acetilaconitina | 17465 | 17451 | 17247 | 16691 | 17608 | 17686 | 2.07 |
Tabella 10: Risultati della prova di riproducibilità. L'RSD delle aree di picco di benzoilaconina, aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina era rispettivamente 2,79%, 2,92%, 2,92% e 2,07% (n = 6).
| Numero | A (aggiunta di vino d'orzo delle Highlands, volte) | B (Tempo di ammollo, h) | C (Spessore affettatura, cm) | Contenuto di MDA (mg/g) | Contenuto di DDA (mg/g) | Punteggio completo/punti |
| 1 | 4 | 36 | 0.5 | 0.1032 | 0.6882 | 28.2 |
| 2 | 5 | 48 | 1.5 | 0.1688 | 0.6588 | 56.49 |
| 3 | 6 | 24 | 1 | 0.1236 | 0.6535 | 33.02 |
| 4 | 5 | 24 | 1.5 | 0.2201 | 0.692 | 87.23 |
| 5 | 5 | 36 | 1 | 0.2094 | 0.6199 | 70.71 |
| 6 | 5 | 24 | 0.5 | 0.1809 | 0.5689 | 48.56 |
| 7 | 4 | 24 | 1 | 0.2016 | 0.7744 | 90.74 |
| 8 | 5 | 36 | 1 | 0.2169 | 0.6889 | 85.15 |
| 9 | 5 | 36 | 1 | 0.2103 | 0.6802 | 80.5 |
| 10 | 6 | 36 | 0.5 | 0.1036 | 0.5072 | 0.36 |
| 11 | 6 | 36 | 1.5 | 0.1089 | 0.5062 | 2.86 |
| 12 | 4 | 48 | 1 | 0.1789 | 0.6789 | 64.6 |
| 13 | 6 | 48 | 1 | 0.1036 | 0.5536 | 7.55 |
| 14 | 5 | 36 | 1 | 0.2062 | 0.6084 | 67.33 |
| 15 | 4 | 36 | 1.5 | 0.1832 | 0.6954 | 69.31 |
| 16 | 5 | 48 | 0.5 | 0.1759 | 0.5569 | 44.21 |
| 17 | 5 | 36 | 1 | 0.2161 | 0.6894 | 84.82 |
Tabella 11: Progettazione e risultati della prova di progettazione della superficie di risposta.
| Fonte | Somma dei quadrati | Df | Quadrato medio | F -Valore | Valore P |
| Modello | 14403.27 | 9 | 1600.36 | 30.8 | <0,0001 |
| Un | 5463.26 | 1 | 5463.26 | 105.15 | <0,0001 |
| B | 939.61 | 1 | 939.61 | 18.08 | 0.0038 |
| C | 1117.7 | 1 | 1117.7 | 21.51 | 0.0024 |
| AB | 0.11 | 1 | 0.11 | 0.00216 | 0.9642 |
| Corrente alternata | 372.68 | 1 | 372.68 | 7.17 | 0.0316 |
| A.C | 174.11 | 1 | 174.11 | 3.35 | 0.1099 |
| A2 | 4133.52 | 1 | 4133.52 | 79.55 | <0,0001 |
| B2 | 28.63 | 1 | 28.63 | 0.55 | 0.482 |
| C2 | 1890.1 | 1 | 1890.1 | 36.38 | 0.0005 |
| Residuo | 363.71 | 7 | 51.96 | ||
| Mancanza di vestibilità | 93.28 | 3 | 31.09 | 0.46 | 0.7253 |
| Errore puro | 270.43 | 4 | 67.61 | ||
| Cor Totale | 14766.99 | 16 |
Tabella 12: ANOVA per il modello di regressione.
File supplementare 1: Una guida dettagliata del software di progettazione Box-Behnken. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S1: Area del picco del campione della prova dello spessore di affettatura mediante HPLC. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S2: Contenuto di MDA (benzoiliconina) e DDA (aconitina, 3-deossiaconitina e 3-acetilaconitina) nella prova dello spessore di affettatura. Clicca qui per scaricare questo file.
Tabella supplementare S3: Punteggio completo del test di spessore di taglio. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Come medicina tibetana comunemente usata con effetti tossici, l'effetto di attenuazione della tossicità del trattamento è estremamente importante per l'applicazione clinica della TBC25. In questo studio, la tecnologia di lavorazione del TBC lavorato con vino d'orzo delle Highlands è stata ottimizzata. Esaminando i principali principi attivi e mettendo in relazione gli effetti farmacologici della TBC, abbiamo scoperto che gli alcaloidi della TBC hanno effetti antinfiammatori e analgesici e possono essere usati per trattare l'artrite reumatoide. In questo studio, un MDA tossico moderato è stato utilizzato come indicatore positivo. Il contenuto totale delle DDA è stato utilizzato come indicatore negativo. Il metodo dell'entropia è stato utilizzato per calcolare i pesi dell'indice e ottimizzare la tecnologia di elaborazione26.
Durante l'esperimento, due punti dovrebbero essere particolarmente notati. In primo luogo, sono necessarie tre serie parallele di esperimenti per ogni condizione di un singolo fattore per migliorare l'accuratezza dei risultati successivi. In secondo luogo, nel calcolo dei punteggi complessivi, i valori standardizzati di ciascun indicatore vengono moltiplicati per il fattore di ponderazione anziché per i dati grezzi. Questa procedura garantisce l'accuratezza dei risultati del calcolo. Inoltre, il valore R2 in ANOVA dovrebbe essere il più vicino possibile a uno; altrimenti, i livelli dei fattori sono estremamente vicini, con scarso impatto sui risultati; La differenza tra i livelli dovrebbe essere moderatamente ampia.
Sebbene l'uso del punteggio completo multi-indice combinato con il metodo della superficie di risposta garantisca la previsione precisa del processo di elaborazione di TBC, presenta dei limiti. In primo luogo, quando i laboratori utilizzano l'HPLC per misurare i componenti indicati nei materiali medicinali, può verificarsi un errore umano a causa della piccola scala degli esperimenti. Risultati più convincenti possono essere ottenuti se la valutazione pilota viene effettuata in una fabbrica di lavorazione delle erbe di grandi dimensioni. In secondo luogo, il metodo di progettazione Box-Behnken non è adatto per l'ottimizzazione dell'intero processo. Dopo aver importato i dati sperimentali nel software della superficie di risposta, il termine del modello deve essere significativo (p < 0,05) e la mancanza di adattamento deve essere non significativa (p > 0,05) nei dati ANOVA. Se il risultato viene invertito, il processo non è adatto per l'ottimizzazione con questo metodo.
In conclusione, rispetto al test a fattore singolo comunemente usato, al design uniforme, al design ortogonale e al design del punto stellare, l'approccio della superficie di risposta Box-Behnken è un metodo sperimentale di progettazione di ottimizzazione che utilizza il modello di adattamento a termine lineare e quadratico multivariato27. Il modello previsto dal metodo della superficie di risposta di Behnken ha continuità e alta precisione sperimentale e prevede i punti ottimali28,29. Nel presente esperimento, il processo preferito di TBC è stato determinato da un punteggio completo basato sul test a fattore singolo e il test di convalida finale non si è discostato molto dal valore previsto, indicando che il modello selezionato è ragionevole e può fornire riferimenti per la tecnologia di lavorazione del TBC lavorato con vino d'orzo delle Highlands. La tecnologia di elaborazione ottimizzata può fornire informazioni e indicazioni per lo studio dell'effetto di attenuazione della tossicità della lavorazione di altri farmaci etnici tossici.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (n. 82130113), dalla China Postdoctoral Science Foundation (n. 2021MD703800), dalla Science Foundation for Youths of Science & Technology Department della provincia del Sichuan (n. 2022NSFSC1449) e dal programma di promozione della ricerca "Xinglin Scholars" dell'Università di Chengdu di medicina tradizionale cinese (No. BSH2021009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS000905 | |
| 3-Acetylaconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS010552 | |
| 3-Deoxyaconitine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS011258 | |
| Benzoylaconine | Chengdu Push Biotechnology Co.,Ltd | PS010300 | |
| Circulating water vacuum pump | Gongyi City Yuhua Instrument Co., Ltd | SHZ-DIII | |
| Design-Expert | State-East Corporation | 8.0.6 | |
| Electric constant temperature drying oven | Shanghai Yuejin Medical Equipment Co., Ltd | 101-3-BS | |
| Electronic analytical balance | Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd. | FA1004 | |
| High performance liquid chromatography | Shimadzu Enterprise Management (China) Co., Ltd | shimadzu 2030 | |
| Highland barley rice | Kangding City, Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture, Sichuan Province | 20221015 | |
| Millipore filter | Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd | φ13 0.22 Nylon66 | |
| Rotary evaporator | Shanghai Yarong Biochemical Instrument Factory | RE-2000A | |
| Starter of liquor-making | Angel Yeast CO., Ltd | BJ22-104 | |
| Ultra pure water systemic | Merck Millipore Ltd. | Milli-Q | |
| Ultrasonic cleansing machine | Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd | SB-8200 DTS |
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