Summary
このプロトコルは野生型マウスの皮質をそのまま残している間2光子の顕微鏡検査との単一ニューロンの活動をイメージ投射すること、および部分皮質の突然変異体のマウスの広視野顕微鏡検査が付いている全体のSCをイメージ投射することを含む目がさめているマウスの優秀なcolliculus (SC)のカルシウム応答を、イメージ投射するためのプロシージャを詳述する。
Abstract
すべての脊椎動物で進化的に保存された中脳構造である上結腸(SC)は、大脳皮質が出現する前の最も洗練された視覚中枢です。~30種類の網膜神経節細胞(RGC)から直接入力を受け、それぞれが特定の視覚的特徴をコード化しています。SCが単に網膜の特徴を継承するのか、それとも追加の潜在的に de novo プロセシングがSCで起こるのかは、とらえどころのないままです。SCにおける視覚情報の神経コーディングを明らかにするために、ここでは、覚醒マウスの2つの相補的な方法で視覚応答を光学的に記録するための詳細なプロトコルを提供します。1つは、2光子顕微鏡を用いて、重なり合う皮質を切除することなく、1細胞の分解能でカルシウム活性を画像化する方法であり、もう1つは、広視野顕微鏡を用いて、皮質がほとんど発達していない変異マウスのSC全体を画像化する方法です。このプロトコルでは、動物調製、ウイルス注入、ヘッドプレート移植、プラグ移植、データ収集、データ解析など、これら2つの方法を詳しく説明します。代表的な結果は、2光子カルシウムイメージングが1細胞分解能で視覚的に誘発された神経応答を明らかにし、広視野カルシウムイメージングがSC全体の神経活動を明らかにすることを示しています。この2つの方法を組み合わせることで、異なるスケールでのSCの神経コードを明らかにすることができ、そのような組み合わせは他の脳領域にも適用できます。
Introduction
上結腸(SC)は、すべての脊椎動物において重要な視覚中枢です。哺乳類では、網膜および視覚野1から直接入力を受ける。光記録は皮質2,3,4,5に広く適用されているが、SCでの応用は光アクセスの悪さによって妨げられている6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 、18,19。このプロトコルの目的はSCの神経活動の光学記録のための2つの相補的な方法についての細部を提供することである。
SCは皮質と横洞の下に位置し、結腸ニューロンへの光アクセスを制限します。この制限を克服する1つのアプローチは、重なり合う皮質を吸引し、前外側SC 7,9,10,13,14,19を露出させることです。しかし、SCは皮質入力を受け取るため、このような操作はSCニューロンが視覚刺激にどのように反応するかに影響を与える可能性があります。この制限を克服するために、皮質をそのまま残しながら、シリコンプラグで後内側SCの表層を画像化する代替プロトコルをここで詳しく説明します8,11。具体的には、単一細胞の分解能を達成するために、2光子顕微鏡を適用して、野生型マウスの後内側SCにおけるカルシウム応答を画像化しました。さらに、広い範囲をカバーするために、広視野顕微鏡を適用して、後皮質が発達していない変異マウスのSC全体を画像化しました20。
このプロトコルで説明されている2つの方法は、互いに補完的です。皮質を切除しない2光子カルシウムイメージングは、皮質入力が無傷の単一細胞分解能で神経活動を記録するのに適しています。広視野カルシウムイメージングは、空間分解能を犠牲にしながら、SC全体の神経活動を記録するのに適しています。
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Protocol
すべての実験手順は、動物福祉ガイドラインに従って実施され、北京の中国脳研究所のIACUCによって承認されました。
注:このプロトコルのタイムラインは次のとおりです:1)吸盤を作ります。2)ウイルスを注入する。3)ヘッドプレートを埋め込みます。4)3週間後、プラグを埋め込みます。5)トレッドミルで~3日間の回復と慣れの後、2光子/広視野イメージングを実行します。
1.吸盤の準備(図1A)
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS、1x)をアクリル皿に一滴垂らし、21Gの平らな針で触れて毛細管現象で先端を満たします。
- 針の先端を半透明のシリコン接着剤で覆い、約~10分間セットします。
- シリコーン接着剤をはさみで直径~2mmの円盤に切ります。
2.プラグの準備(図1B)
- 厚さ0.75mmのプラスチックシムストックを用意し、中央に1cm×1cmの正方形を切り取ります。アクリルブロックを2枚用意します。シムストックとアクリルブロックをアルコールで洗浄し、レンズペーパーで拭きます。
- シムストックを1つのアクリルブロックに置き、シリコーン接着剤を中央に堆積させて開口部の~90%を埋め(気泡を避け)、別のアクリルブロックと~1kgの力を加え、20分待ちます。
- 手術用顕微鏡で、三角形が印刷された紙の上で、メスでシリコーン接着剤を高さ1mm、幅1.5mmの三角柱に切ります。
- プラスチック製の粘着テープで三角柱のほこりを取り除き、直径5mm、厚さ0.15mmのガラスカバーガラスの上に置きます。
- 三角柱の入ったカバーガラスをコロナ処理器の下に置き、コロナ処理器の電源を入れ、稲妻が現れるまでカバーガラスに近づけます。それらが互いに取り付けられるまで、数分間その位置に保持します。
注:このステップは、他のコロナ治療薬では異なる場合があります。 - プラグをペトリ皿に入れ、70°Cのインキュベーターに一晩入れます。
3.動物の調製とウイルスコンストラクトの注入
- C57BL/6J(野生型)およびEmx1-Cre:Pals1flox/wt (部分皮質)20 匹の雌雄マウスを6週齢(イメージング時は9週)で用いる。
- 外科的処置に使用されるすべての材料と器具を滅菌します。
- マウスを5%イソフルランで麻酔し、手術中はイソフルランを1%〜2%、流量1L / minに維持します。つま先挟み反射の欠如による麻酔のレベルを確認します。
- イヤーバー付きの脳定位固定装置フレームにマウスをヘッド固定します。手術中は、マウスの目に眼科用軟膏を塗って乾燥を防ぎ、サーモスタット加熱パッドで体温を37°Cに保ちます。
- 毛皮を剃り、ヨードフォアと75%エタノールで皮膚表面を殺菌します。リドカイン(5 mg / kg、皮下注射[SQ])、チリジン(2 mg / kg、SQ)、およびメロキシカム(2 mg / kg、SQ)を注射します。.
注:滅菌、鎮痛、および局所麻酔の外科的処置は、施設によって異なる場合があります。 - 手術用ハサミでSCの上の皮膚を取り除き、頭蓋骨を露出させます。綿棒で頭蓋骨をきれいにします。
- 頭蓋骨の表面が平らになるまで脳定位固定装置フレームを調整します。硬膜が露出するまで、ラムダの横0.5mm、前方0.42mmの穴を開けます。
- GCaMP6m(rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m;1x 10 13 GC/mLを1x PBSに溶解)を発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)をラムダから1 mmおよび1.6 mmの深さに、面取りしたガラスマイクロピペット(先端を25°に面取りし、直径40〜50μm)で注入します。
- 各深度で、100 nL を 50 nL/分の速度で注入し、各注入後に 5 分間待ちます。注入後、インジェクターをゆっくりと引き出します。
4.ヘッドプレートの埋め込み
- 頭蓋骨の上の筋肉と組織をきれいにし、ブレードで頭蓋骨を引っ掻きます。出血が起こった場合は、ジェルフォームで止めて血液をきれいにします。ヘッドプレート(図1C)を自己硬化性の歯科用接着樹脂セメントで頭蓋骨に取り付けます。具体的には、3/4スプーン1杯のポリマー、3滴のモノマー、1滴の触媒をセラミックボウルに入れて氷上で混合します。混合物をヘッドプレートと頭蓋骨に塗布します。それらを一緒に取り付け、接着剤が固まるまで5分間待ちます。
- 感染症予防のために抗生物質(セフチオフルナトリウム、5mg/kg、SQ)を注射する。マウスを脳定位固定装置フレームから取り外し、回復のために加熱パッドの上に置きます。麻酔から回復した後、ホームケージに戻します。疼痛管理のために、イブプロフェン含有飲料水(0.5 mL / 50 mL)を手術後3日間マウスに与えます。
5.プラグの埋め込み(図2)
- ウイルス注射の3週間後にプラグを埋め込みます。ステップ3.2〜3.5で説明するように、マウスを脳定位固定装置フレームに麻酔して固定します。生理食塩水に浸したジェルフォームを準備して、出血の可能性を止めます。
- 3 mm x 2 mmの楕円形に、ラムダの中央0.5 mmを中心とするマイクロドリルで穴を開けます。楕円の境界をひびが入るまで薄くします。楕円形の記録ウィンドウの前で頭蓋骨を薄くして、カバーガラスをSCに近づけます。
- 細い鉗子を使用して骨皮弁を取り除きます。横洞の後方の硬膜に切り込みを入れ、硬膜を取り除きます。必要に応じて、乾燥を防ぐために、3 mLのシリンジで人工脳脊髄液(ACSF)を脳に追加します。頭蓋骨と記録ウィンドウをジェルフォームと綿棒で乾かします。
- 記録ウィンドウにシリコン接着剤を一滴垂らします。吸盤を使用して、プラグを負圧で保持します。電動マイクロマニピュレーターを使用して吸盤を動かし、カバーガラスが頭蓋骨に触れるまでプラグをシリコン接着剤に下げます。次に、プラグを前方~1mm動かして横洞を押しのけ、SCを露出させます。このステップは、シリコーン接着剤が粘着性になる前に1〜2分で行う必要があります。
- ヘッドプレートを清掃し、プラグの境界付近にブチルシアノアクリレートと樹脂セメントを塗布してヘッドプレートに固定します。
注意: ステップ4.2で説明されているように、術後ケアを提供します。
6. 2光子イメージング(図3)
- ヘッドプレートを使用して回転するトレッドミルに動物を頭固定します。トレッドミルを2光子顕微鏡の下に置き、高さを適切な位置に調整します。対物レンズとヘッドプレートの間に黒いアルミコーンを置き、モニターからの光の汚染を防ぎ、視覚刺激を与えます。マウスを~15分間慣れさせます。
- 倍率16倍、開口数(NA)0.8、作動距離(WD)3mmの対物レンズを使用して、顕微鏡で2光子イメージングを実行します。2台のガルバノスキャナーで制御されるモードロック技術を備えたTi:sapphireレーザーを使用して、GCaMP6mを920nmで励起します。サンプル面のレーザー出力を20〜80mWの間で調整します。
- 600 μm x 600 μmの視野を4.8 Hzで2.4 μ m/ピクセルの空間分解能でスキャンし、最大350 μ mの深さで神経活動を画像化します。
注意: サンプリングレートと空間分解能はガルバノスキャナー用であり、レゾナントスキャナー用に調整する必要があります。 - 発光した蛍光をダイクロイックミラーで捕集し、バンドパスフィルターを通過させた後、光電子増倍管(PMT)で検出します。
- ロータリーエンコーダーを使用して、トレッドミルでのマウスの移動を記録します。50mmレンズのカメラを使用して、瞳孔のサイズと位置を記録します。これらの記録と画像取得を、刺激コンピュータから送信された記録トリガーによって視覚刺激に同期させます。
7. 2光子イメージングによるカルシウム応答の解析
- SIMA21 または NoRMCorre22 を使用してイメージング中の脳の動きを補正します。
- セルの自動選択ツール (ImageJ) を使用して関心領域 (ROI) を手動で描画し、MATLAB で楕円に当てはめます。ニューロピルのコンタミネーションを除去した後の各ROIの蛍光痕を抽出します。
F true と F rawは、それぞれ ROI の補正された蛍光振幅と生の蛍光振幅であり、Fneuropilは周囲のニューロピルの蛍光振幅であり、r は焦点が合っていないニューロピル汚染係数 (このセットアップでは 0.7) です。rは、前述のように、Ftrue = 0である血管上の信号を測定することによって推定されます23,24。 - 各フレーム 25 を中心とする15 秒のウィンドウから 8 番目のパーセンタイル値を差し引くことにより、遅いベースライン変動を除去します。
- ニューロンの視覚応答を、刺激期間中のROIにおける蛍光振幅の相対的な変化として定義します。
F ピークは視覚刺激中の蛍光トレースのピーク 振幅であり、Fベースラインは刺激前の 0.5 秒の期間の平均振幅です。
8. 広視野イメージングとデータ解析(図4)
- タンデムレンズ4 (図4A)を備えた広視野マクロスコープを構築します。タンデムレンズマクロスコープは、2つのカメラレンズ(50mmと105mm)をアダプター で 接続したもので、倍率は~2倍です。
- 手順3.2〜3.5の説明に従って、部分皮質変異マウスを調製します。GCaMP6mを発現させたAAVを100 nL、SC両側中央200 μmの深さに注入する。
- ~3週間後、直径5mmのカバーガラスをSCに埋め込み、SCを中心に4mm x 3mmの楕円形開頭術を行い、周囲の骨を薄くします。次に、カバーガラスをSCに直接押し付け、レジンセメントで固定します。
- GCaMP6mを励起フィルタ付き青色発光ダイオード(LED)で励起(469nm±35nm)します。10Hzの発光フィルター(525nm±39nm)を通過した後、相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラを使用して画像を取得します。カメラは5.36mm x 2.85mmの領域をカバーし、2.63μm/ピクセルの空間分解能を備えています。
- 正規化されたボックス フィルターを使用して取得した各画像を畳み込み、元のサイズの 1/4 にダウンサンプリングします。イメージ内の各ピクセルについて、手順 7.4 の説明に従って応答を定義します。
注意: ステップ4.2で説明されているように、術後ケアを提供します。
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Representative Results
図1A、B は、吸盤とプラグの作り方をそれぞれ示しています。 図2 は、プラグを正常に埋め込む方法を示しています。プラグを埋め込んだ後、 図2Dに示すように、後内側SCが露出します。 図3 は、2光子顕微鏡を用いて画像化した野生型マウスの例から得られたSCニューロンのカルシウム応答を示しています。顕微鏡で簡単にキャプチャできる三角柱を使用して、イメージング部位を見つけることができます(図3B)。視覚反応は、単一細胞の解像度で示されています(図3C 、D、 およびビデオ1)。 図4 は、広視野顕微鏡を用いて画像化した部分皮質変異マウスの例から得られたSCニューロンのカルシウム応答を示しています。取得した画像は、まず元のサイズの4分の1にダウンサンプリングされました(図4B)。視覚的に誘発されたカルシウム反応は、SCの両側に示されています(図4C および ビデオ2)。 図5 は、注射部位とイメージング部位のSCにおけるGCaMP6mの発現を示しています。注射部位のニューロンが少なくなります。
図1:準備。 (A)吸盤を作るための3つのステップ(ステップ1.1〜1.3)。針の中のPBSは示されていません。(B)プラグを作るための3つのステップ(ステップ2.1-2.3)。(C)野生型マウス用の直径8mmのヘッドプレート2種類。部分皮質変異マウス用の直径7mmの2種類のヘッドプレート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:プラグの埋め込み(ステップ5.2-5.5)。 (A)骨が薄くなっている。周囲は樹脂セメント。(B)骨と硬膜を切除し、下結腸と小脳を露出させます。(C)プラグを下げ、横洞を前方に押し出して後内側SCを露出させます。緑色の破線の円はカバーガラスを示します。青い破線の三角形はプラグをマークします。赤い破線の円は吸盤を示します。(D)プラグはブチルシアノアクリレートと樹脂セメントで固定されています。画像は露出オーバーで、内側後SCがはっきりと見えます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:2光子カルシウムイメージング 。 (A)プラグを埋め込んだ後のマウスの脳解剖学的構造の模式図。暗い破線はSCの輪郭を示しています。黄色い三角形は三角柱を示しています。緑色はGCaMP式を示します。(B)スキャン前のシリコン三角柱を顕微鏡で撮影した写真。(C)野生型マウスの例の2光子顕微鏡で測定したSCニューロンからのGCamMPの蛍光の画像。(D)画像全体の蛍光の標準偏差投影( ビデオ1を参照)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:広視野カルシウムイメージング 。 (A)広視野イメージングセットアップの写真。(B)例の生画像とダウンサンプリング画像。黄色の破線はSCの輪郭を示す(C)部分皮質マウスの例の広視野顕微鏡で測定したSCニューロンのカルシウム応答の単一フレームと標準偏差投影( ビデオ2参照)。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:注射部位から異なる距離にあるマウス脳の冠状切片。 一番下の行は、一番上の行でマークされたボックスの高倍率を示しています。黄色の破線の長方形は、右側の領域よりも少ないニューロンを含む注入部位を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:2光子顕微鏡によるビデオ3の視覚刺激に対するSCニューロンのカルシウム応答の生のモーション補正ビデオ。画像は4.8Hzで取得され、20Hzで表示されました。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:広視野顕微鏡によるビデオ3の視覚刺激に対するSCニューロンのカルシウム応答の生およびモーション補正ビデオ。 画像は10Hzで取得され、20Hzで表示されました。 この ビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ 3: 12 の異なる方向 (50°/s) にドリフトする黒いフルスクリーン バー (幅 5°)。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルの重要なステップ
最も重要なステップは、ステップ5.2と5.3の開頭手術です。まず、ラムダの後0.5mmの骨は太く、内部に血管があるため、穴あけプロセス中に出血する可能性があります。出血を止めるために適切なジェルフォームを準備する必要があります。.第二に、横洞のすぐ上の骨を取り除くと、血管性動脈硬化症の可能性が高くなります。トラブルシューティングの1つの方法は、楕円形の内側の骨を薄くし、少しずつ取り除くことです。また、リフティングする前に骨を浸しておくことで、硬膜が骨から剥がれやすくなり、出血を防ぐのも効果的です。
もう一つの重要なステップは、ステップ5.4のプラグの注入で、プロセス全体が1〜2分続くはずです。トラブルシューティングのために、まずマイクロマニピュレーターでプラグをACSFの適切な位置に移動し、プラグの最終位置を設定します。次に、シリコン接着剤を追加し、プラグを適切な速度で最終位置に移動します。
意味
このプロトコルには2つのメリットがあります。まず、野生型マウスでは、前外側皮質を露出させるために重なり合う皮質を吸引していたが、野生型マウスでは、後内側皮質を無傷の単一細胞分解能でイメージングするための詳細を提供する。第二に、広視野カルシウムイメージング技術を用いて、部分皮質変異マウスのSC全体をイメージングする方法を詳述する。これら2つのアプローチは、異なるスケールで行動する動物の他の脳領域を画像化するために適用できます。
重なり合う皮質を吸引せずに後内側SCを画像化する2つの代替方法が報告されている15,16。Schröderらは、円形の4mm開頭術を行い、両端にワッシャーとガラスカバーガラスを備えたステンレス鋼チューブを塗布して、SC16を露出させました。開頭手術が大きく、硬い素材は、私たちが使用したものと比較して、移植中に出血を引き起こす可能性が高くなります。さらに、ステンレス鋼は生体適合性がないため、慢性画像検査では感染症を引き起こす可能性が高くなります。同様に、Savierらで使用されたガラス製のカバーガラスも、より硬く、生体適合性がなく、出血や感染症を引き起こす可能性が高かった15。これら2つの方法とのもう一つの違いは、ウイルス注入部位がイメージングウィンドウの外側にあるため、イメージング品質が注入部位の潜在的な損傷の影響を受けにくいことです(図5)。
プロトコルの制限
このプロトコルはSCの表面的な層のイメージ投射カルシウム応答のための細部を、例えばプリズム26を使用してイメージ投射のより深い層に、カバーされない提供する。2光子カルシウムイメージング法は、後内側SCの神経活動を記録するために使用され、前外側SCはカバーしません7,13。広視野顕微鏡によるSCカルシウムイメージング全体を、変異部分皮質マウスに適用した。ワイドタイプマウスのSC全体をイメージングするには、重なり合う皮質を吸引する必要があります。ウイルス注射を行わずにSC全体を画像化する別の方法は、内因性イメージング技術です。ただし、信号対雑音比は低くなります6,8。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(32271060)の支援を受けています。Y.-t.L.は、研究をデザインし、実験を行い、データを解析し、原稿を書きました。Z.L.とR.W.が実験を行った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
References
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