Summary
Dit manuscript presenteert een reeks zeer reproduceerbare gedragstests om een muismodel met het Angelman-syndroom te valideren.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een reeks gedragstests die beschikbaar zijn om angelmansyndroom (AS) -achtige fenotypen te karakteriseren in een gevestigd muizenmodel van AS. We gebruiken het rotarod-leerparadigma, gedetailleerde loopanalyse en nestbouwtest om motorische beperkingen bij dieren te detecteren en te karakteriseren. We testen de emotionaliteit van dieren in het open veld en verhoogde plus doolhoftests, evenals het effect in de staartsuspensietest. Wanneer AS-muizen worden getest in de open veldtest, moeten de resultaten met zorg worden geïnterpreteerd, omdat motorische disfuncties het gedrag van muizen in het doolhof beïnvloeden en de activiteitsscores veranderen.
De reproduceerbaarheid en effectiviteit van de gepresenteerde gedragstests is al gevalideerd in verschillende onafhankelijke Uba3a-muislijnen met verschillende knock-outvarianten, waardoor deze reeks tests een uitstekend validatie-instrument is in AS-onderzoek. Modellen met de relevante constructie en gezichtsvaliditeit zullen verder onderzoek rechtvaardigen om de pathofysiologie van de ziekte op te helderen en de ontwikkeling van causale behandelingen toe te staan.
Introduction
Angelman syndroom (AS) is een zeldzame neurologische ontwikkelingsziekte. De meest voorkomende genetische oorsprong van AS is een grote deletie van het 15q11-q13-gebied van het maternale chromosoom, dat wordt aangetroffen bij bijna 74% van de patiënten1. Deletie van dit gebied veroorzaakt het verlies van UBE3A, het belangrijkste oorzakelijke gen van AS dat codeert voor een E3-ubiquitineligase. Het vaderlijke allel van het UBE3A-gen in neuronen wordt tot zwijgen gebracht in een proces dat bekend staat als imprinting. Als gevolg hiervan staat vaderlijke inprenting van het gen alleen maternale expressie in het centrale zenuwstelsel (CZS)2 toe. Daarom leidt UBE3A-gendeletie van het maternale chromosoom tot de ontwikkeling van AS-symptomen. Bij mensen manifesteert AS zich rond de leeftijd van 6 maanden, met ontwikkelingsachterstand die aanhoudt in alle ontwikkelingsstadia en resulteert in ernstige slopende symptomen bij getroffen personen 3,4. De kernsymptomen van de aandoening zijn het tekort aan fijne en grove motoriek, waaronder schokkerige ataxische gang, ernstige spraakstoornissen en intellectuele achterstand. Ongeveer 80% van de AS-patiënten lijdt ook aan slaapstoornissen en epilepsie. Tot op heden zijn de enige beschikbare behandelingen symptomatische geneesmiddelen, die epileptische aanvallen verminderen en de slaapkwaliteit verbeteren1. Daarom zal de ontwikkeling van robuuste diermodellen met reproduceerbare gedragsfenotypen naast verfijnde fenotyperingsanalyse essentieel zijn om de pathofysiologische mechanismen van de aandoening op te helderen en effectieve medicijnen en behandelingen te ontdekken.
De complexiteit van de menselijke aandoening die het CZS beïnvloedt, vereist dat modelorganismen een vergelijkbaar genoom, fysiologie en gedrag bezitten. Muizen zijn populair als modelorganisme vanwege hun korte voortplantingscyclus, kleine omvang en relatief gemak van DNA-modificatie. In 1984 stelde Paul Willner drie basisvalidatiecriteria voor ziektemodellen voor: de construct, het gezicht en de voorspellende validiteit, die worden gebruikt om de waarde van het modelte bepalen 5. Simpel gezegd, constructvaliditeit weerspiegelt de biologische mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van de stoornis, gezichtsvaliditeit vat de symptomen samen en voorspellende validiteit beschrijft de modelrespons op therapeutische geneesmiddelen.
Om aan de bovenstaande principes te voldoen, hebben we de meest voorkomende genetische etiologie gekozen, een grote deletie van de maternale 15q11.2-13q-locus inclusief het UBE3A-gen, om AS-modelmuizen te creëren. We gebruikten de CRISPR/Cas9-techniek om een 76.225 bp lang gebied te verwijderen dat het hele UBE3A-gen beslaat, dat zowel de coderende als niet-coderende elementen van het gen omvat, bij muizen met een C57BL/6N-achtergrond6. Vervolgens hebben we de dieren gefokt om UBE3A+/− heterozygote muizen te verkrijgen. Voor gezichtsvalidatie van het model gebruikten we dieren van kruisingen van UBE3A+/− vrouwtjes en wild-type mannetjes om UBE3A+/- nakomelingen te krijgen (stam genaamd C57BL/6NCrl-UBE3A
De hier gepresenteerde gedragstests behoren tot de gebruikelijke fenotyperingsinstrumenten in genetisch onderzoek, dankzij hun hoge voorspellende waarde en voldoende constructvaliditeit 8,9,10. We gebruikten deze tests om een muismodel van AS te valideren door kernsymptomen van de menselijke ziekte op een reproduceerbare, leeftijdsonafhankelijke manier samen te vatten. De emotionaliteit van het dier werd geëvalueerd in de verhoogde plus doolhof en open veld tests. Beide tests zijn gebaseerd op het benaderingsvermijdingsconflict, waarbij dieren een nieuwe omgeving verkennen op zoek naar voedsel, onderdak of paringsmogelijkheden en tegelijkertijd anxiogene compartimenten vermijden11. Daarnaast wordt de open veld test gebruikt om de locomotorische activiteit van een muis te testen8. De staartsuspensietest wordt veel gebruikt in depressieonderzoek om te screenen op nieuwe antidepressiva of depressieve fenotypen in knock-outmodellen van muizen12. Deze test evalueert de wanhoop die dieren in de loop van de tijd ontwikkelen in een onontkoombare situatie. Motorisch leren en gedetailleerde loopkarakteristieken werden respectievelijk bepaald op de rotarod en in DigiGait. Het uithoudingsvermogen van dieren op de versnellende staaf kenmerkt zijn evenwichts- en bewegingscoördinatievaardigheden, terwijl gedetailleerde analyse van de stappatronen van een muis een gevoelige evaluatie is van neuromusculaire stoornissen die verband houden met vele neurogeneratieve bewegingsstoornissen13,14,15. De nestjesversnipperringstest maakt deel uit van de standaardmethodologie voor het detecteren van impulsief gedrag bij knaagdieren, en omdat het gebruik maakt van natuurlijk knaagdierbouwgedrag, geeft het het welzijn van het dier aan16,17.
De grootte van de experimentele groepen was het resultaat van een compromis om te voldoen aan de eisen van de 3R-regel en efficiënt gebruik van kolonie-fokprestaties. Om statistische kracht te verkrijgen, hadden de groepen echter niet minder dan 10 individuen, vanwege de oprichting van een voldoende aantal broedparen. Helaas resulteerden fokprestaties niet altijd in voldoende dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dieren en experimenten die in dit onderzoek zijn gebruikt, hebben een ethische beoordeling ondergaan en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU. De studie werd goedgekeurd door de Tsjechische Centrale Commissie voor Dierenwelzijn. Muizen werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien en op een constante temperatuur van 22 ± 2 °C gehouden met een licht/donkercyclus van 12 uur. De muizen werden voorzien van muizenchow en water ad libitum. De muizen werden gehuisvest in groepen van drie tot zes dieren per kooi. Voorafgaand aan de test werd geen andere behandeling dan weging uitgevoerd. Zie de Tabel met materialen voor details over alle materialen en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Algemene overwegingen voorafgaand aan en tijdens het testen
OPMERKING: Omwille van de duidelijkheid en begrijpelijkheid worden algemene opmerkingen gepresenteerd vóór de beschrijving van de afzonderlijke tests. Dit geldt voor elke test, met de voor de hand liggende uitzondering van de nestjesvernietigingstest, die wordt uitgevoerd in een huisvestingsruimte en waarvoor geen experimentele apparatuur nodig is.
- Dieren ten minste 14 dagen voorafgaand aan het testen in de onderzoeksfaciliteit onderbrengen om eventuele stress als gevolg van transport en veranderingen in de omgeving te minimaliseren.
- Registreer diergewichten voordat u gaat testen, omdat gewicht een veel voorkomende verstorende factor is in gedragsonderzoek.
- Laat de dieren na het vervoer uit hun huiskamer ten minste 1 uur in de proefruimte acclimatiseren om de transportstress tot een minimum te beperken wanneer een dergelijk vervoer plaatsvindt (d.w.z. elke hieronder beschreven test, behalve het versnipperen van nestjes, dat in de huisvestingsruimte wordt uitgevoerd).
- Label elk dier op de staart met een niet-toxische marker op waterbasis om snelle identificatie tijdens het experiment mogelijk te maken.
- Verwijder alle urine en uitwerpselen die door de dieren in het experimentele apparaat zijn afgezet tijdens het testen na elke proef.
- Veeg alle experimentele apparaten met 75% alcohol voor en na elk getest dier schoon. De reiniging verwijdert olfactorische sporen die tijdens het testen zijn afgezet en helpt stabiele experimentele omstandigheden te behouden.
- Vervoer de dieren met zoveel mogelijk zorg van hun thuiskooi naar het experimentele apparaat, bij voorkeur in een kleine ondoorzichtige container, en laat ze vervolgens vrij los, tenzij andere manipulaties nodig zijn.
- Plaats elk dier na het testen in een tijdelijke kooi om te voorkomen dat ze de niet-geteste dieren in de thuiskooi beïnvloeden.
- Test mannetjes en vrouwtjes op opeenvolgende dagen. Wissel de volgorde van verschillende genotypen af tijdens het testen om onvoorspelbare omgevingsfactoren tussen de experimentele groepen te compenseren.
- Plaats de dieren terug in hun thuiskooi nadat alle dieren zijn getest en breng ze terug naar de huiskamer.
- In het geval van herhaalde dierproeven, ten minste 1 dag tussen elke test aanhouden.
2. Gedragstesten
- Verhoogd plus doolhof (EPM)
OPMERKING: Beide geslachten van C57BL/6NCrl en UBE3AmGenedel/+ muizenstammen werden voor deze studie getest op de leeftijd van 9-12 weken. Het gewicht van de dieren varieerde van 22 tot 36 g voor mannetjes en 18 tot 28 g voor vrouwtjes op het moment van testen.- Plaats het plusvormige doolhof op het testplatform net onder de camera. Gebruik de potentiometer op de muur om de lichtintensiteit in het midden in te stellen op 70 lux met behulp van een luxometer, waarbij de sensor tijdens de aanpassing in het midden van het doolhof wordt geplaatst.
- Open de software door te dubbelklikken op het pictogram Viewer-software en laad de configuratie voor EPM-testen door op het pictogram linksboven op het tabblad Configuratie te klikken. Laad de EPM-plug-in vanuit het menu Bestand . Vul de diergegevens in met behulp van het toetsenbord van de computer - dier-ID, genotype, geslacht en de experimentinformatie (datum, lichtintensiteit) - in de overeenkomstige velden van het tabblad Experiment . Controleer of de positie van de zone, open armen en gesloten armen correct zijn geconfigureerd. Zorg er met behulp van een visuele besturing en computermuis voor dat de virtueel afgelijnde zones overeenkomen met de overeenkomstige EPM-zones in het videovoorbeeld.
- De EPM is een test die wordt gebruikt om de algemene angst van een dier te evalueren, die is gebaseerd op benadering-vermijdconflict . Knaagdieren hebben van nature de neiging om goed verlichte onbeschermde gebieden (open armen) te vermijden, ten gunste van veiligere (gesloten armen). Omdat deze volledig geautomatiseerde test is gebaseerd op een videotrackingsysteem, laat de software automatisch de tijd berekenen die in elke zone wordt doorgebracht, evenals het aantal ingangen.
- Neem tijdens het testen de dieren op video op via een industriële, infraroodlichtgevoelige camera. Laat de software de positie van het dier in realtime detecteren tijdens de opname. Laat de software vervolgens automatisch de sporen van het dier evalueren om alle parameters te berekenen die het gedrag van het dier in het doolhof beschrijven. Gebruik de tijd doorgebracht in de anxiogene open armen en het percentage open armen bezoeken om het niveau van angstachtig gedrag bij dieren te evalueren.
OPMERKING: Het op maat gemaakte doolhof is gemaakt van infrarood lichtdoorlatend materiaal en wordt geplaatst op een lichtgevende diode (LED) infrarood lichtbronplatform. - Plaats de muiscursor op het pijlpictogram linksboven op het tabblad Acquisitie . Verwijder een dier met de hand uit de kooi en plaats het voorzichtig in het midden van de EPM. Start het protocol door met de linkermuis op de computermuis te klikken en verlaat de experimentele ruimte onmiddellijk.
- Zodra het opnameprotocol is voltooid na 5 minuten gratis doolhofverkenning, slaat u de opgenomen gegevens op door op OK te klikken in het venster dat verschijnt na beëindiging van het protocol, het bestand de juiste naam te geven en op Opslaan te klikken. Exporteer de resultaten naar een .csv bestand voor elk getest dier voor offline analyse door op het pictogram in het linker verticale deelvenster van het tabblad Gegevensanalyse te klikken.
- Haal het dier met de hand uit het doolhof en plaats het in de tijdelijke kooi. Ga verder met het testen van alle dieren op dezelfde manier. Kopieer de resultaten voor alle geteste dieren naar een Kladblok-bestand voor offline analyse door te klikken op het pictogram Resultaten kopiëren op het tabblad Resultaten van de Elevated Plus-doolhofplug-in .
OPMERKING: De software en hardware kunnen verschillen en de relevante handleidingen moeten worden gevolgd. Bovendien kan de experimentele opstelling, zoals verlichting of computerplaatsing, variëren afhankelijk van de constructie van de dierenfaciliteit.
- Open veld (OF) test
OPMERKING: De open veldtest beoordeelt de algehele beweging van een dier, die wordt veroorzaakt door verkennend gedrag in een nieuwe omgeving. Bovendien wordt het vaak gebruikt als een screeningsinstrument om algemene angst te detecteren in een onbeschermde, goed verlichte ruimte. Dit is een volledig geautomatiseerde test die gebruik maakt van een videotrackingsysteem, dat ook in de vorige test werd gebruikt.- Plaats de vier OF-testboxen op het testplatform net onder de camera. Gebruik de potentiometer aan de muur om de lichtintensiteit in het midden van elke OF-test in te stellen op 200 lux met behulp van een luxometer, waarbij de sensor tijdens het afstellen in het midden van elke doos wordt geplaatst.
- Open de software door te dubbelklikken op het viewer-softwarepictogram en laad de configuratie voor OF-testen door op het pictogram linksboven op het tabblad Configuratie te klikken. Vul de diergegevens in met behulp van het toetsenbord van de computer - dier-ID, genotype, geslacht en experimentinformatie (datum, lichtintensiteit) - in de overeenkomstige velden van het tabblad Experiment. Controleer of de positie van de zone (midden en periferie) overeenkomt met de OF-testboxen en pas deze indien nodig aan. Zorg er met behulp van een visuele besturing en computermuis voor dat de virtueel omlijnde midden- en randzones overeenkomen met de overeenkomstige OF-testzones in het videovoorbeeld.
- Neem tijdens het testen de dieren vast op video via een industriële, infraroodlichtgevoelige camera. Laat de software de positie van het dier in realtime detecteren tijdens de opname en automatisch de sporen van het dier evalueren om alle parameters te berekenen die het gedrag van het dier in de OF-testbox beschrijven. De gelopen afstand, gemiddelde snelheid en rusttijd zijn parameters die worden gebruikt om dierlijke activiteit in een nieuwe omgeving te evalueren, terwijl het aantal centrumingangen en de duur in het centrum angstachtig gedrag bij dieren beschrijven.
OPMERKING: Het op maat gemaakte doolhof is gemaakt van infrarood lichtdoorlatend materiaal en wordt geplaatst op een LED-infrarood lichtbronplatform. - Plaats de muiscursor op het pijlpictogram linksboven op het tabblad Acquisitie . Haal vier dieren met de hand uit de kooi en plaats ze voorzichtig in de hoek van elke OF-testdoos. Start het protocol door met de linkermuis op een computermuis te klikken en verlaat onmiddellijk de experimentele ruimte.
- Wanneer het protocol na 10 minuten gratis doolhofverkenning is voltooid, slaat u de gegevens op door op OK te klikken in het venster dat verschijnt na het beëindigen van het protocol, het bestand de juiste naam te geven en op Opslaan te klikken. Exporteer de resultaten naar een .csv bestand voor elk getest dier voor offline analyse door op het pictogram in het linker verticale deelvenster van het tabblad Gegevensanalyse te klikken.
- Haal de dieren met de hand uit het doolhof en zet ze in de tijdelijke kooi. Ga verder met het testen van alle dieren op dezelfde manier. Analyseer de geëxporteerde gegevens.
OPMERKING: De software en hardware kunnen verschillen en de relevante handleidingen moeten worden gevolgd. Bovendien kan de experimentele opstelling, zoals verlichting, aantal doolhoven of computerplaatsing, variëren, afhankelijk van de constructie van de dierenfaciliteit.
- Staartveringstest (TST)
OPMERKING: Drie muizen worden tegelijkertijd getest met het geautomatiseerde staartophangingsapparaat.- Houd de lichtintensiteit van de ruimte op 100-120 lux.
- Verbind het TST-systeem met de computer via een USB-kabel. Plaats de USB-dongle in de computer en start de software door te dubbelklikken op het BIO-TST-softwarepictogram . Pas op het tabblad Instellingen onder Globaal de aankoopduur aan naar 360 s. Selecteer op het tabblad Experiment de optie Nieuwe lijst met onderwerpen en maak een nieuw experimentbestand en een nieuwe lijst met geteste onderwerpen door de instructies in het geopende tabblad te volgen.
- Start de uitvoering door te klikken op Uitvoeren starten | doorgaan op het tabblad Acquisitie . Bereid de dieren voor op de test door enkelzijdig plakband, zoals de transpore medische tape, rond 3/4 van de staart van het dier te wikkelen, beginnend vanaf de basis.
- Haal de ophanghaak door de tape en hang het dier erop. Begin met het verzamelen van gegevens voor elk dier afzonderlijk onmiddellijk nadat u het aan de haak hebt gehangen door op het startpictogram onder de gevisualiseerde positie voor elk dier te klikken en observeer dieren continu tijdens de test.
- Na voltooiing van de acquisitie voor de eerste set dieren, klikt u op De volgende run starten, verwijdert u de dieren van de haak, maakt u de plakband van hun staart los, knipt u de tape voorzichtig met een schaar langs de staart en plaatst u de dieren in de tijdelijke kooi.
- Reinig het apparaat met 75% alcohol en papieren zakdoekjes en ga verder met de rest van de dieren zoals hierboven beschreven. Selecteer op het tabblad Analyse de laatste 4 minuten van de acquisitie voor analyse, selecteer vervolgens alle geldige uitvoeringen in de analyseperiode, klik op Geselecteerde onderwerpen analyseren, kies de gewenste gegevensindeling en klik op Geselecteerde gegevens exporteren om de verzamelde gegevens te exporteren voor verdere analyse.
OPMERKING: De test duurt 6 min. Tijdens de eerste 2 minuten zullen de dieren krachtig worstelen, maar naarmate de wanhoopsreactie tijdens de resterende 4 minuten overheerst, wordt de immobiliteitstijd tijdens deze periode genomen voor de analyse. De software en hardware kunnen verschillen en de relevante handleidingen moeten worden gevolgd. Bovendien kan de apparatuur zelf variëren (bijv. aantal testposities).
- Loopanalyse
- Schakel de loopband in en stel de bandsnelheid handmatig in op 20 cm/s op het uitrustingspaneel door op het + of - symbool naast de snelheidsindicator te klikken. Schakel het lampje van het apparaat in door de knop met de klok mee te draaien. Start de DigiGait Imager-software door te dubbelklikken op het softwarepictogram en stel de sluitertijd in op 100 voor albino-muizen of 130 voor zwarte / donkere muizen in het veld voor sluitertijd.
- Verwijder het eerste dier met de hand uit de thuiskooi en plaats het voorzichtig op de loopbandband. Sluit de deur naar het dierencompartiment. Inspecteer visueel om ervoor te zorgen dat de staart van het dier niet vastzit tussen de deur en het frame.
- Laat de muis de loopbandband verkennen voordat u opneemt. Zorg ervoor dat het dier in staat is om de test uit te voeren door de loopband gedurende ~ 3 s op een langzame loopsnelheid te zetten en vervolgens te stoppen, waarbij het dier continu wordt geobserveerd.
- Start de riem door op de Start-knop op het uitrustingspaneel te drukken en neem ongeveer 10 s op. Zorg ervoor dat een duidelijke en vloeiende voortbeweging van ten minste 10-15 stappen waarneembaar is. Stop de riem door op de stopknop op het uitrustingspaneel te drukken en breng de muis met de hand terug naar de tijdelijke kooi.
- Screen de opname op een reeks afbeeldingen met vloeiende stappen door op AFSPELEN te klikken en de opname te bekijken met de visuele besturing in de modus BEWERKEN . Kies 10-15 vloeiende bewegingen door hun begin- en eindframenummers handmatig in de relevante velden te schrijven (Van frame# voor het eerste frame en Aan voor het laatste frame). Vul de informatie van het dier in - dier-ID, geboortedatum, geslacht, gewicht, riemsnelheid en riemhoek - en geef commentaar wanneer dat nodig is in de relevante velden. Sla het bestand op voor verdere analyse door op Opslaan te klikken.
- Maak de riem schoon met water en ga op dezelfde manier verder met de rest van de dieren. Kies CAMERA om door te gaan met het opnemen van de volgende wandeling met het dier. Wanneer opnames voor alle dieren zijn verkregen, gaat u verder met de analyse.
OPMERKING: Dieren die niet in staat zijn om met een ingestelde snelheid van de riem te lopen, zijn uitgesloten van testen. Op basis van onze ervaring zien we dat oudere dieren (ouder dan 50 weken) meer moeite hebben met lopen op de loopband, met een variabele frequentie tussen 2% en 50% afhankelijk van het genotype. Dierlijk afval wordt verzameld in trays aan de voor- of achterkant van de loopband. De trays worden na elk onderzoek geleegd en gewassen met warm zeepsop. De riem wordt afgeveegd met een vochtige doek. - Voer loopanalyses uit op basis van een volledig geautomatiseerde analyse van video-opnames van dierlijke voetafdrukken. Pas de gegevens aan in DigiGait Analysis software.
OPMERKING: Loopanalyse biedt niet alleen een maat voor motorische coördinatie, maar ook een gedetailleerde kinematische beschrijving op basis van de analyse van dynamisch loopsignaal, die de temporele geschiedenis van pootplaatsing door sequentiële stappen vertegenwoordigt. De volgende parameters worden automatisch door de software gemeten: zwenkduur, percentage van de pasduur bij het zwaaien, remduur, percentage van de pasduur bij het remmen, voortstuwingsduur, percentage van de pas in voortstuwing, standduur, percentage van de pas in houding, pasduur, rempercentage van de stand, voortstuwingspercentage van de standfase, zwenk/standverhouding, paslengte, pasfrequentie, poothoek, poothoekvariabiliteit, voethoekvariabiliteit, standbreedte, staphoek, paslengtevariabiliteit, pasbreedtevariabiliteit, staphoekvariabiliteit, variatiecoëfficiënt van paslengte, variatiecoëfficiënt van standbreedte, variatiecoëfficiënt van staphoek, variatiecoëfficiënt van zwaaiduur, pootgebied bij piekstand, pootgebiedvariabiliteit bij piekstand, duur van de gedeelde houding van de achterpoten, percentage van de gedeelde houding, verhouding van de duur van de linker- en rechterachterstand, loopsymmetrie, maximale snelheid van verandering van pootgebied in contact met de loopbandgordel tijdens de remfase, maximale snelheid van verandering van pootgebied in contact met de loopbandgordel tijdens de voortstuwingsfase, tau-voortstuwing, pootoverlapafstand, Plaatsing van de poot, ataxiecoëfficiënt, afstand van de middellijn, asafstand en pootweerstand. De software maakt een kleine correctie van stapspoorruis mogelijk, die voorafgaand aan statistische analyse moet worden voltooid. De software en hardware kunnen verschillen en de relevante handleidingen moeten worden gevolgd.
- Rotarod
OPMERKING: De rotarod-test wordt gebruikt om de motorische functies-balans en motorcoördinatie van knaagdieren te beoordelen. De test vereist dat een muis op een roterende staaf met een vaste diameter (5 cm) loopt, waarbij de rotatie gedurende een bepaalde periode (5 minuten) versnelt totdat het dier niet langer kan blijven.- Schakel de rotarod-apparatuur in door op de aan/uit-schakelaar op de apparatuur te drukken en start de software door te dubbelklikken op het staafsoftwarepictogram. Initialiseer een nieuw bestand op het tabblad Bestand en sla het op onder de juiste naam. Vul in het venster Instellen de experimentgegevens in, zoals de datum, de naam van de gebruiker en eventuele opmerkingen. Stel het snelheidsprofiel in op 300 s, het begintoerental op 4 tpm en het eindtoerental op 40 tpm.
- Maak een schema voor de geteste dieren in het dierenveld en wijs elk dier toe aan zijn positie op de staaf. De posities worden niet expliciet in de software aangegeven, maar komen overeen met de lijstregel; De eerste lijn zou bijvoorbeeld de eerste positie van de staaf aangeven, de vijfde lijn zou de vijfde positie van de staaf aangeven, enzovoort. Vergeet niet om tegenwicht te bieden aan elke staafpositie tussen de experimentele groepen.
OPMERKING: Vijf dieren kunnen tegelijkertijd worden getest. - Sluit het deelvenster Instellingen door op Sluiten te klikken en open het meetpaneel door op Meten te klikken. Start de eerste rotatie van de hengel bij 4 rpm door op Start/Stop te klikken en plaats de eerste vijf dieren op hun toegewezen posities. Wanneer alle dieren op de hengel staan, start u het testprotocol door op Startprofiel te klikken en de hengel zal geleidelijk versnellen tot 40 tpm gedurende 5 minuten. Als een dier van de hengel valt, breng het dan terug naar de hengel voordat het protocol begint.
OPMERKING: Dieren blijven meestal niet lang genoeg op de staaf om alle muizen er tijdens de eerste poging tegelijk op te plaatsen. Het is belangrijk om geduldig te zijn bij het plaatsen van dieren op de hengel met de constante rotatiesnelheid aan het begin. Het doel van de test is niet om het uithoudingsvermogen van het dier op de staaf met een vaste rotatiesnelheid te bepalen, maar om de snelheid te bepalen waarmee het dier niet op de staaf kan blijven. De snelheid van de staaf is evenredig met de latentie om erop te blijven; Het wordt dus gebruikt om de balans van het dier uit te drukken. - Verplaats de dieren naar de tijdelijke kooi nadat ze allemaal van de hengel zijn gevallen of na 5 minuten zijn verstreken. Verwijder eventuele dierlijke resten en maak de staaf en het bakje schoon met alcohol.
- Klik op Dieren -> om op dezelfde manier door te gaan met de volgende groep dieren. Nadat u alle dieren hebt getest, sluit u het venster Meten door op Sluiten te klikken en op Weergeven te klikken om de verzamelde gegevens weer te geven. Exporteer de verkregen gegevens in .csv bestandsindeling voor verdere analyse door op CSV exporteren te klikken.
- Test elk dier op de staaf drie keer met intertriale intervallen van 15 minuten. Gebruik de gemiddelde waarde van de latentie om over de drie onderzoeken te vallen voor verdere statistische analyse. Evalueer het motorisch leren van het dier door de test gedurende 5 opeenvolgende dagen te herhalen.
OPMERKING: De software en hardware kunnen verschillen en de relevante handleidingen moeten worden gevolgd. Bovendien kan de apparatuur zelf variëren, bijvoorbeeld in aantal testposities, algehele constructie en staafmaat.
- Nestje versnipperen-nestbouw
- Scheid de dieren in enkele polycarbonaat muizenkooien met standaarduitrusting (strooisel, voedselgaas en watervoorziening) gedurende 1 week. Neem ongeveer 12 g katoenen nestje met een tang, registreer het gewicht handmatig met behulp van een weegschaal en plaats het willekeurig in een kooi, maar aan de andere kant van de watertoevoer. Breng de kooien met de dieren terug naar de huisvestingsruimte.
- Weeg elk nestje de komende 4 dagen elke dag op hetzelfde tijdstip handmatig met behulp van een weegschaal. Noteer de gewichten op papier of in een vooraf gemaakte spreadsheet. Zorg ervoor dat elk nestje droog is wanneer het wordt gewogen; Zo niet, droog dan op een verwarmingskussen en breng alle nestjes tegelijkertijd terug naar hun toegewezen kooien op de plaats waar de muis zijn nest heeft gemaakt. Als het nestje in verschillende delen is gescheurd, weeg dan de grootste.
- Voor gegevensanalyse drukt u de afname van het nestgewicht op elke dag uit ten opzichte van het oorspronkelijke gewicht en presenteert u dit als een percentage van het gebruikte materiaal.
OPMERKING: Het terugbrengen van mannetjes naar een gemeenschappelijke kooi kan leiden tot verhoogde agressie en ongewenste verwondingen bij de dieren. Daarom moet de nestjesvernietigingstest tegen het einde van het testregime worden gepland om te voorkomen dat het dierenwelzijn in gevaar komt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verhoogd plus doolhof en open veld testen
De EPM- en OF-tests gebruiken de natuurlijke neiging van knaagdieren om nieuwe omgevingen te verkennen18,19. De verkenning wordt beheerst door een benadering-vermijdingsconflict, waarbij knaagdieren kiezen tussen het verkennen van een nieuwe omgeving en het vermijden van mogelijk gevaar. Dieren verkennen onbekende plaatsen op zoek naar beschutting, sociaal contact of foerageren. Nieuwe plaatsen kunnen echter risicofactoren met zich meebrengen, zoals roofdieren of concurrenten. Zowel de OF-test als de EPM bestaan uit veilige en risicovolle compartimenten - respectievelijk de periferie en het midden in de OF-test en gesloten en open armen in de EPM. Knaagdieren geven van nature de voorkeur aan donkere, afgesloten compartimenten in vergelijking met open, verhoogde en fel verlichte gebieden. Dus, verminderde exploratie van de risicovolle / anxiogene delen, uitgedrukt als een afname van het aantal bezoeken en de duur van het bezoek, of als verhoogde latentie tot het eerste bezoek, karakteriseren dierangstachtig gedrag 8,11. Rusttijd, gemiddelde snelheid en totale afgelegde afstand leveren aanvullende informatie over de spontane activiteit van de dieren. Geen van de parameters met betrekking tot angstachtig gedrag werd veranderd in UBE3AmGenedel/+ mutanten in de OF-test of de EPM (figuur 1D-G). UBE3AmGenedel/+ dieren waren echter significant hypoactief, zoals blijkt uit een kortere afgelegde afstand, lagere gemiddelde snelheid en langere rusttijd in de OF-test (figuur 1A-C).
Figuur 1: Spontane activiteit en angstreactie op een nieuwe omgeving in de EPM- en OF-test. (A-E) Verkenning van het open veld. De UBE3AmGenedel/+ dieren liepen een kortere afstand (A) met een lagere gemiddelde snelheid (B) en langere rusttijd (C). Het aantal bezoeken en de duur in het centrum verschilden niet tussen de dieren (D,E). Een tweerichtings-ANOVA onthulde een significant hoofdgenotype-effect zonder significante interactie tussen genotype en geslacht (genotype-effect: p < 0,01; genotype/geslachtsinteractie : p > 0,7). Het percentage bezoeken aan open en gesloten armen was niet afhankelijk van genotype (F), noch verschilde de tijd doorgebracht in de anxiogene open armen tussen experimentele groepen (G). Een tweerichtings-ANOVA onthulde geen significante hoofdeffecten of genotype/geslachtsinteractie (genotype-effect : p > 0,9; genotype/sekse-interactie: p > 0,9). De gegevens die in de boxplot worden weergegeven, tonen de mediaanwaarde, het interkwartielbereik en het waardenbereik. Significante post-hoc testresultaten worden aangegeven als *. Gegevens voor controledieren (vrouwelijke n = 10, mannelijke n = 11) worden in rood weergegeven en mutanten (vrouwelijke n = 9, mannelijke n = 10) in blauw. Deze figuur is overgenomen uit Syding et al.6. Afkortingen: EPM = verhoogd plus doolhof; VAN = open veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Staartveringstest
De TST meet dierlijke wanhoop ontwikkeld in een onontkoombare situatie. Wanneer ze aan de staart hangen, worden knaagdieren snel immobiel na een eerste periode van krachtige activiteit. De duur van de immobiliteit geeft de omvang van de "wanhoop" aan. Talrijke laboratoria hebben aangetoond dat een breed scala aan klinisch actieve antidepressiva de immobiliteitsduur 9,20,21 verkort. Deze ongecompliceerde test is algemeen gebruikt voor screening op potentiële antidepressiva, en het kan ook worden gebruikt om het fenotype van verschillende dierstammen te karakteriseren, evenals transgene murines, in studies die de neurobiologische basis van depressieve toestanden onderzoeken 9,21. UBE3AmGenedel/+ dieren waren significant langer onbeweeglijk dan hun controle-nestgenoten, wat wijst op hun depressie-achtige gedrag (figuur 2).
Figuur 2: Immobiliteitstijd in de staartveringstest. UBE3AmGenedel/+ dieren vertoonden een langere immobiliteit tijdens de staartophanging. Een tweerichtings-ANOVA vertoonde significante hoofdeffecten, maar geen significantie in genotype/geslachtsinteractie (genotype-effect: p < 0,001; geslachtseffect: p < 0,001; genotype/ sekse-interactie: p > 0,5). De gegevens die in de boxplot worden weergegeven, tonen de mediaanwaarde, het interkwartielbereik en het waardenbereik. Significante post-hoc testresultaten worden aangegeven als *. Gegevens voor controledieren (vrouwelijke n = 10, mannelijke n = 14) worden in rood weergegeven en mutanten (vrouwelijke n = 10, mannelijke n = 11) in blauw. Deze figuur is overgenomen uit Syding et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Rotarod en loopanalyse
De geschiedenis van rotarod-testen in modellen van neuromotorische tekorten gaat terug tot het midden van de 20eeeuw 22. De rotarod wordt gebruikt om de balans en bewegingscoördinatie van dieren te beoordelen, omdat hun beperkingen zich manifesteren in een aanzienlijk kortere latentie om van de roterende staaf14 te vallen. Herhaalde tests op de rotarod worden gebruikt om het motorisch leervermogen van dieren te bestuderen. De snelle ontwikkeling van moderne apparatuur en digitale technologieën hebben een geautomatiseerde, nauwkeurige en onbevooroordeelde evaluatie van locomotorische fenotypen van knaagdieren mogelijk gemaakt op basis van de gedetailleerde beschrijvingen van hun gang23. Geautomatiseerde loopanalyse verving voetafdrukanalyse en is ook gevoeliger voor neuromusculaire tekorten14,24,25. Veranderingen van spatio-temporele kenmerken van de dierlijke gang zijn specifiek voor de gemodelleerde nosologische eenheid26,27,28. UBE3AmGenedel/+ mutanten hadden een robuuste afwisseling van loopindices (figuur 3A-G), verder bevestigd door een verminderde latentie om van de rotarod te vallen (figuur 3H).
Figuur 3: Gedetailleerde loopanalyse en motorisch leren op de rotarod. (A-G) De loopindices van UBE3AmGenedel/+ dieren werden gewijzigd. UBE3AmGenedel/+ dieren hadden een langere swing (A) en houding (B) wat resulteerde in een langere pasduur en lengte (C,D). Hun achterpoten voortstuwingsduur (E) en vertraging (F) waren ook verhoogd. De analyse onthulde ook een groter pootoppervlak bij de piekstand (G). Noch de metrische parameters noch het gewicht van de dieren verschilden (gegevens niet getoond), wat aangeeft dat de waargenomen verschillen niet te wijten waren aan verschillen in diergrootte. Een tweerichtings-ANOVA met herhaalde metingen toonde een significant hoofdeffect van genotype zonder significante genotype/geslachtsinteractie (genotype-effect : p < 0,001; genotype/geslachtsinteractie: p > 0,2). (H) De resultaten van de rotarod-prestaties laten een kortere latentie zien om te vallen in UBE3AmGenedel/+ dieren. Een tweerichtings-ANOVA met herhaalde metingen toonde significante hoofdeffecten zonder een significante interactie (genotype-effect: p < 0,001; geslachtseffect : p < 0,01; genotype/geslachtsinteractie: p > 0,1). Loopparameters die in de boxplot worden weergegeven, tonen de mediaanwaarde, het interkwartielbereik en het waardenbereik. Significante post-hoc testresultaten worden aangegeven als *. Gegevens over de latentie om te vallen worden gepresenteerd in een lijnplot als gemiddelde ± SEM. Gegevens voor controledieren (vrouwelijke n = 10, mannelijke n = 14) worden gepresenteerd in rood en mutanten (vrouwelijke n = 10, mannelijke n = 11) in blauw. Deze figuur is overgenomen uit Syding et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Nestlet-shredding - nestbouw
De nestlet shredding test wordt voornamelijk gebruikt om stereotiep dwangmatig gedrag bij muizen te detecteren29,30. Muizen vertonen echter een natuurlijke neiging om geleverd materiaal te scheuren om hun nest te bouwen. Het onvermogen om een katoenen nestje te versnipperen wordt dus gebruikt als een indicator van hun welzijn beïnvloed door neurologische ontwikkelingsstoornissen16,31. De UBE3AmGenedel/+ dieren gebruikten significant minder materiaal om hun nesten te bouwen, en dit verschil was bijzonder prominent tussen transgene vrouwtjes en hun controle tegenhangers (figuur 4A).
Figuur 4: Gebruik van nestmateriaal voor nestbouw. UBE3AmGenedel/+ dieren versnipperden minder katoenen materiaal dan hun controle nestgenoten. De gegevens werden omgezet in uitgelijnde rangen om te voldoen aan de normaliteitsvoorwaarde. Een variantieanalyse met herhaalde metingen toonde een significant genotype-effect zonder een significantie van genotype/geslachtsinteractie (genotype-effect: p < 0,05; genotype/geslachtsinteractie : p > 0,4). De gegevens in de lijngrafiek tonen het gemiddelde ± SEM. Significante post-hoc testresultaten worden aangegeven als *. Gegevens voor controledieren (vrouwelijke n = 10, mannelijke n = 14) worden in rood weergegeven en mutanten (vrouwelijke n = 10, mannelijke n = 11) in blauw. Deze figuur is overgenomen uit Syding et al.6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Testtijdschaal
Elke groep (controle en experimenteel) wordt op dezelfde dagen aan dezelfde tests onderworpen. Een pauze van 1 dag tussen de tests wordt gebruikt om mogelijke overdrachtseffecten te minimaliseren. Indien mogelijk worden vrouwtjes en mannetjes op opeenvolgende dagen getest; anders worden vrouwtjes getest nadat mannetjes zijn getest (figuur 5)6.
Figuur 5: Testtijdschaal. UBE3AmGenedel/+ dieren en hun controles werden getest in twee cohorten. De testtijdschaal voor het eerste cohort wordt weergegeven in het bovenste paneel en voor het tweede cohort in het onderste paneel. De dagen waarop mannetjes zijn getest worden in het blauw aangegeven, terwijl de dagen waarop vrouwtjes zijn getest in het groen zijn aangegeven. Dagen waarop beide geslachten zijn getest, worden in geel aangegeven. In het weekend werd er niet getest. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De cijfers zijn aangepast van Syding et al.6 in overeenstemming met het MDPI-licentiebeleid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AS-modellen gemaakt in verschillende muizenstammen worden vaak gevalideerd met tests van de emotionele toestand van dieren, motorische functies en cognitieve vaardigheden om vergelijking met menselijke symptomen te vergemakkelijken31,32. Een motorisch tekort in AS-modellen is de meest consistente bevinding in laboratoria, gevolgd door een onveranderde emotionaliteitstoestand van mutanten en problemen met het bouwen van nesten31,32,33. Daarentegen is cognitieve stoornissen mild of afwezig 7,31,33. Discrepantie in het cognitieve fenotype lijkt af te hangen van de leeftijd van de geteste dieren, zoals aangetoond door Huang et al.7. Daarom werd voor dit artikel gekozen voor een reeks tests op basis van hun reproduceerbaarheid, evenals leeftijds- en soortonafhankelijkheid, aangezien vergelijkbare resultaten worden waargenomen in zowel muis- als rat-AS-modellen 6,31,32.
Kritisch moet men in gedachten houden dat het herhaaldelijk testen van dieren in verschillende experimentele opstellingen hun zorgvuldige volgorde vereist, te beginnen met de tests die het meest gevoelig zijn voor eerdere manipulatie, en tegelijkertijd met een minimaal effect op de volgende tests, zoals de EPM- en OF-tests34. Bijkomende zorgen hebben betrekking op de nestjesvernietigingstest, waarbij dieren eengezinswoningen zijn, waarvan bekend is dat het een stressvolle toestand is35. Vervolgens leidt het poolen van mannetjes in een gemeenschappelijke kooi vaak tot verhoogde agressie als gevolg van hiërarchie-oprichting. De nestjesvernietigingstest moet dus het testschema afsluiten. Het is ook een goede gewoonte om mannetjes voor vrouwen te testen om te voorkomen dat mannelijk gedrag wordt beïnvloed door achterblijvende vrouwelijke reuksporen. Het afwisselen van dieren die tot verschillende experimentele groepen behoren tijdens het testen is cruciaal in gedragsonderzoek om de effecten van onvoorspelbare factoren op het gedrag van dieren in evenwicht te brengen. Het is bekend dat het hanteren van dieren vóór het testen in de EPM hun waargenomen stressrespons beïnvloedt. Daarom moet de hoeveelheid hantering voor alle dieren consistent zijn36. Het is ook erg belangrijk om de huisvestingsomstandigheden (enkele versus groep), verlichting tijdens het testen, het testtijdstip en voorafgaand aan de testervaring voor elk dier te handhaven, omdat al deze factoren de reactie van een muis in de EPM- en OF-test beïnvloeden en de resultaten kunnen vertekenen37.
Ondanks de gepresenteerde tests die behoren tot gevestigde screeningsinstrumenten bij de ontwikkeling van geneesmiddelen en genetisch gemodificeerde muizenfenotypering die reproduceerbare resultaten opleveren in laboratoria, kunnen sommige tests nog steeds worden onderworpen aan kleine wijzigingen. Aangezien motorische stoornissen het belangrijkste kenmerk zijn van het fenotype van een AS-diermodel, kan de rotarod-test worden beperkt tot 1 dag testen in plaats van 5 opeenvolgende dagen. Bovendien kunnen parameters die de kwaliteit van een gebouwd nest beschrijven, worden opgenomen in de nestlet-versnipperingstest38.
Een duidelijke beperking van de gepresenteerde resultaten is de dubbelzinnigheid van hun interpretatie. Met name het motorische tekort van AS-dieren kan veranderingen in op voortbeweging gebaseerde taken verklaren, zoals de OF-test en EPM. Analoog kan een langere immobiliteitstijd in de TST een gevolg zijn van de grotere fysieke vermoeidheid die AS-dieren ontwikkelen tijdens deze veeleisende test, in tegenstelling tot depressief gedrag. Ook kan bij de nestjesversnipperingstest een verminderd katoengebruik te wijten zijn aan het neuromusculaire fenotype in plaats van het verlies van het nestbouwinstinct. De interpretatie van paslengteveranderingen is dubbelzinnig, omdat verkorting wordt waargenomen in sommige muismodellen van de ziekte van Parkinson, terwijl verlenging wordt waargenomen bij ouder wordende muizen39,40. Wij zijn echter van mening dat een toename van de totale paslengte een gevolg is van een langere swingduur. De swingduur neemt toe met pijn en wordt verlengd in artritismodellen, wat impliceert dat een langere swingduur bij muizen mogelijk een goede positionering van de ledematen mogelijk kan maken voordat het gewicht41,42 wordt gedragen. Voortstuwingsduur verwijst naar de tijdsduur die een dier nodig heeft om voorwaartse beweging te initiëren en te behouden. Een korte duur bij gezonde dieren kan dus wijzen op meer kracht en betere controle. Deze bevindingen karakteriseren niet alleen dit AS-muizenmodel, maar wijzen ook op loopstoornissen. Er is echter nader onderzoek nodig om de fysiologische basis van een dergelijke stoornis op te helderen, zoals het bepalen van spierkracht en het onderzoeken van neuromusculaire verbindingen / transmissie.
Ondanks het interpretatieve dilemma biedt de gepresenteerde reeks gedragstests reproduceerbare resultaten die consistent zijn in laboratoria en kan het dienen als een elegant validatie-instrument voor nieuwe muizenmodellen van het Angelman-syndroom en nieuwe therapeutische benaderingen 6,31,32,43,44,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door de Tsjechische Academie van Wetenschappen RVO 68378050, LM2018126 Tsjechisch Centrum voor Fenogenomics van MEYS CR, OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_013/0001789 (Upgrade of the Czech Centre for Phenogenomics: developing towards translation research by MEYS and ESIF), OP RDE CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015861 (CCP Infrastructure Upgrade II by MEYS and ESIF), en OP RDI CZ.1.05/2.1.00/19.0395 (hogere kwaliteit en capaciteit voor transgene modellen door MEYS en EFRO). Daarnaast ontving deze studie financiering van de NGO "Association of Gene Therapy (ASGENT)", Tsjechië (https://asgent.org/) en LM2023036 Tsjechisch Centrum voor Fenogenomics van het Ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cages, individually ventilated | Techniplast | ||
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., 2 Central Street Level Unit 110 Framingham, MA 01701, USA |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Detailed analysis of mouse gait, hardware and software provided. |
| FDA Nestlet squares | Datesand Ltd., 7 Horsfield Way, Bredbury, Stockport SK6, UK | Material was bought from Velaz vendor via direct email request. Velaz do not provide any catalogue no. | Cotton nestlets for nest building test. Nestlet discription: 2-3 g each, with diameter around 5 x 5 x 0.5cm. |
| Mouse chow | Altramion | ||
| Rotarod | TSE Systems GmbH, Barbara-McClintock-Str.4 12489 Berlin, Germany |
Equipment was tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Rotarod for 5 mice, hardware and software provided. Drum dimensions: Diameter: 30 mm, width per lane: 50 mm, falling distance 147 mm. |
| Tail Suspension Test | Bioseb, In Vivo Research Instruments, 13845 Vitrolles FRANCE |
Reference: BIO-TST5 | Fully automated equipment for immobility time evaluation of 3 mice hanged by tail, hardware and software provided |
| Transpore medical tape | Medical M, Ltd. | P-AIRO1291 | The tape used to attach an animal to the hook by its tail. |
| Viewer - Video Tracking System | Biobserve GmbH, Wilhelmstr. 23 A 53111 Bonn, Germany |
Equipment with software were tendered, no catalogue number was provided, nor could be find on company's web site | Software with custom made hardware: maze, IR base, IR sensitive cameras. Custom-made OF dimensions: 42 x 42 cm area, 49 cm high wall, central zone area: 39 cm2. A custom-made EPM was elevated 50 cm above the floor, with an open arm 79 cm long, 9 cm wide, and closed arm 77 cm long, 7.6 cm wide. |
References
- Kalsner, L., Chamberlain, S. J. Prader-Willi, Angelman, and 15q11-q13 duplication syndromes. Pediatric Clinics of North America. 62 (3), 587-606 (2015).
- Yamasaki, K., et al. Neurons but not glial cells show reciprocal imprinting of sense and antisense transcripts of Ube3a. Human Molecular Genetics. 12 (8), 837-847 (2003).
- Clayton-Smith, J., Laan, L. Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. Journal of Medical Genetics. 40 (2), 87-95 (2003).
- Jolleff, N., Ryan, M. M.
- Willner, P. The validity of animal models of depression. Psychopharmacology. 83 (1), 1-16 (1984).
- Syding, L. A., et al. Generation and characterization of a novel Angelman syndrome mouse model with a full deletion of the Ube3a gene. Cells. 11 (18), 2815 (2022).
- Huang, H. -S., et al. Behavioral deficits in an Angelman syndrome model: effects of genetic background and age. Behavioural Brain Research. 243, 79-90 (2013).
- Choleris, E., Thomas, A. W., Kavaliers, M., Prato, F. S. A detailed ethological analysis of the mouse open field test: effects of diazepam, chlordiazepoxide and an extremely low frequency pulsed magnetic field. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 25 (3), 235-260 (2001).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Walf, A. A., Frye, C. A. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
- Carola, V., D'Olimpio, F., Brunamonti, E., Mangia, F., Renzi, P. Evaluation of the elevated plus-maze and open-field tests for the assessment of anxiety-related behaviour in inbred mice. Behavioural Brain Research. 134 (1-2), 49-57 (2002).
- Yan, H. -C., Cao, X., Das, M., Zhu, X. -H., Gao, T. -M.
- Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behavioural Brain Research. 311, 340-353 (2016).
- Knippenberg, S., Thau, N., Dengler, R., Petri, S. Significance of behavioural tests in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Behavioural Brain Research. 213 (1), 82-87 (2010).
- Farr, T. D., Liu, L., Colwell, K. L., Whishaw, I. Q., Metz, G. A. Bilateral alteration in stepping pattern after unilateral motor cortex injury: a new test strategy for analysis of skilled limb movements in neurological mouse models. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 104-113 (2006).
- Jirkof, P. Burrowing and nest building behavior as indicators of well-being in mice. Journal of Neuroscience Methods. 234, 139-146 (2014).
- Wulaer, B., et al. Repetitive and compulsive-like behaviors lead to cognitive dysfunction in Disc1Δ2-3/Δ2-3 mice. Genes, Brain, and Behavior. 17 (8), 12478 (2018).
- Glickman, S. E., Hartz, K. E. Exploratory behavior in several species of rodents. Journal of Comparative and Physiological Psychology. 58, 101-104 (1964).
- La-Vu, M., Tobias, B. C., Schuette, P. J., Adhikari, A. To approach or avoid: an introductory overview of the study of anxiety using rodent assays. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 145 (2020).
- Karolewicz, B., Paul, I. A. Group housing of mice increases immobility and antidepressant sensitivity in the forced swim and tail suspension tests. European Journal of Pharmacology. 415 (2-3), 197-201 (2001).
- Liu, X., Gershenfeld, H. K. Genetic differences in the tail-suspension test and its relationship to imipramine response among 11 inbred strains of mice. Biological Psychiatry. 49 (7), 575-581 (2001).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. Journal of the American Pharmaceutical Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Dorman, C. W., Krug, H. E., Frizelle, S. P., Funkenbusch, S., Mahowald, M. L. A comparison of DigiGait and TreadScan imaging systems: assessment of pain using gait analysis in murine monoarthritis. Journal of Pain Research. 7, 25-35 (2013).
- Stroobants, S., Gantois, I., Pooters, T., D'Hooge, R. Increased gait variability in mice with small cerebellar cortex lesions and normal rotarod performance. Behavioural Brain Research. 241, 32-37 (2013).
- Vandeputte, C., et al. Automated quantitative gait analysis in animal models of movement disorders. BMC Neuroscience. 11, 92 (2010).
- Amende, I., et al. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 2, 20 (2005).
- Hampton, T. G., et al.
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
- Li, X., Morrow, D., Witkin, J. M. Decreases in nestlet shredding of mice by serotonin uptake inhibitors: comparison with marble burying. Life Sciences. 78 (17), 1933-1939 (2006).
- Murphy, M., et al. Chronic adolescent Δ9-tetrahydrocannabinol treatment of male mice leads to long-term cognitive and behavioral dysfunction, which are prevented by concurrent cannabidiol treatment. Cannabis and Cannabinoid Research. 2 (1), 235-246 (2017).
- Sonzogni, M., et al. A behavioral test battery for mouse models of Angelman syndrome: A powerful tool for testing drugs and novel Ube3a mutants. Molecular Autism. 9, 47 (2018).
- Dodge, A., et al. Generation of a novel rat model of Angelman syndrome with a complete Ube3a gene deletion. Autism Research. 13 (3), 397-409 (2020).
- Born, H. A., et al. Strain-dependence of the Angelman syndrome phenotypes in Ube3a maternal deficiency mice. Scientific Reports. 7 (1), 8451 (2017).
- File, S. E., Mabbutt, P. S., Hitchcott, P. K. Characterisation of the phenomenon of "one-trial tolerance" to the anxiolytic effect of chlordiazepoxide in the elevated plus-maze. Psychopharmacology. 102 (1), 98-101 (1990).
- Liu, N., et al. Single housing-induced effects on cognitive impairment and depression-like behavior in male and female mice involve neuroplasticity-related signaling. The European Journal of Neuroscience. 52 (1), 2694-2704 (2020).
- Ueno, H., et al. Effects of repetitive gentle handling of male C57BL/6NCrl mice on comparative behavioural test results. Science Reports. 10 (1), 3509 (2020).
- Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defence and the elevated plus-maze. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 21 (6), 801-810 (1997).
- Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behavioural Brain Research. 139 (1-2), 139-155 (2003).
- Fernagut, P. O., Diguet, E., Labattu, B., Tison, F. A simple method to measure stride length as an index of nigrostriatal dysfunction in mice. Journal of Neuroscience Methods. 113 (2), 123-130 (2002).
- Wooley, C. M., Xing, S., Burgess, R. W., Cox, G. A., Seburn, K. L. Age, experience and genetic background influence treadmill walking in mice. Physiology & Behavior. 96 (2), 350-361 (2009).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284 (2017).
- Tanas, J. K., et al. Multidimensional analysis of behavior predicts genotype with high accuracy in a mouse model of Angelman syndrome. Translational Psychiatry. 12 (1), 426 (2022).
- Silva-Santos, S., et al. Ube3a reinstatement identifies distinct developmental windows in a murine Angelman syndrome model. The Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 2069-2076 (2015).
- Milazzo, C., et al. Antisense oligonucleotide treatment rescues UBE3A expression and multiple phenotypes of an Angelman syndrome mouse model. JCI Insight. 6 (15), e145991 (2021).
