Summary
Questo manoscritto descrive un nuovo dispositivo di infusione diretta delle piante per lo screening dell'efficacia delle molecole contro i batteri (Candidatus Liberibacter asiaticus) o il suo insetto vettore (Diaphorina citri, Kuwayama) che, in combinazione, sono associati alla malattia degli agrumi di Huanglongbing.
Abstract
Testare la funzione dei composti terapeutici nelle piante è una componente importante della ricerca agricola. I metodi fogliari e di drenaggio del suolo sono di routine, ma presentano degli svantaggi, tra cui l'assorbimento variabile e la ripartizione ambientale delle molecole testate. L'iniezione del tronco degli alberi è ben consolidata, ma la maggior parte dei metodi per questo richiede costose attrezzature proprietarie. Per lo screening di vari trattamenti per Huanglongbing, è necessario un metodo semplice e a basso costo per fornire questi composti al tessuto vascolare di piccoli alberi di agrumi coltivati in serra infettati dal batterio limitato dal floema Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) o infestati dall'insetto vettore CLas che si nutre di floema Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
Per soddisfare questi requisiti di screening, è stato progettato un dispositivo di infusione diretta delle piante (DPI) che si collega al tronco della pianta. Il dispositivo è realizzato utilizzando un sistema di stampa 3D basato su nylon e componenti ausiliari facilmente ottenibili. L'efficacia di assorbimento del composto di questo dispositivo è stata testata nelle piante di agrumi utilizzando il marcatore fluorescente 5,6-carbossifluoresceina-diacetato. È stata regolarmente osservata una distribuzione uniforme del marcatore in tutte le piante.
Inoltre, questo dispositivo è stato utilizzato per fornire molecole antimicrobiche e insetticide per determinare i loro effetti rispettivamente su CLas e D. citri. La streptomicina antibiotica aminoglicoside è stata somministrata nelle piante di agrumi infette da CLas utilizzando il dispositivo, il che ha comportato una riduzione del titolo CLas da 2 settimane a 4 settimane dopo il trattamento. La somministrazione dell'insetticida neonicotinoide imidacloprid nelle piante di agrumi infestate da D. citri ha comportato un aumento significativo della mortalità degli psillidi dopo 7 giorni. Questi risultati suggeriscono che questo dispositivo DPI rappresenta un sistema utile per fornire molecole nelle piante per i test e facilitare scopi di ricerca e screening.
Introduction
La gestione delle piante in contesti commerciali e paesaggistici richiede spesso l'uso di composti chimici per ottimizzare la crescita e la salute delle piante. Il modo in cui queste molecole vengono consegnate dipende dal tipo di molecola, dalla funzione della molecola, dal tipo di pianta e dal sistema di gestione in atto. Le applicazioni fogliari e del suolo sono le strategie di consegna più semplici, ma le limitazioni nell'assorbimento di alcune molecole richiedono la consegna diretta. Un esempio di queste molecole sono le molecole terapeutiche che funzionano meglio quando si muovono sistemicamente all'interno della pianta ma non possono essere efficacemente fornite da semplici applicazioni topiche1. Questo è il caso di Huanglongbing (HLB), chiamato anche malattia dell'inverdimento degli agrumi. L'HLB è una malattia associata a un batterio limitato al floema, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), che non può essere coltivato al di fuori della pianta, o al suo insetto vettore, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Se le molecole terapeutiche putative sono prodotti genici, possono essere testate creando piante transgeniche che esprimono questi composti. Tuttavia, la produzione di piante transgeniche può richiedere molto tempo e risorse, è altamente dipendente dal genotipo e può essere inibita dal silenziamento genico3. Inoltre, anche se questi transgenici mostrano risultati promettenti, i vincoli normativi e di percezione pubblica riducono la probabilità della loro accettazione commerciale 4,5. L'applicazione esogena di composti, tuttavia, semplifica la sperimentazione di molecole biologiche e sintetiche perché non richiede la produzione di piante transgeniche stabili o che esprimono transitoriamente, il che riduce i tempi e le risorse per testare gli effetti di una molecola. Un metodo per la somministrazione sistemica efficace ed efficiente di composti esogeni da parte delle piante potrebbe essere utilizzato per un'ampia varietà di scopi di ricerca e screening.
Una di queste applicazioni è l'analisi del movimento sistemico delle molecole all'interno del sistema vascolare di una pianta, che può essere effettuata utilizzando marcatori tracciabili, siano essi fluorescenti, visibili o isotopi chimici unici 6,7,8,9. Un marcatore fluorescente comunemente usato è la 5,6-carbossifluoresceina-diacetato (CFDA), che è un colorante permeabile alla membrana che viene degradato dalle esterasi intracellulari in 5,6-carbossifluoresceina (CF) e, successivamente, diventa fluorescente e impermeabile alla membrana10. Il CFDA è stato ampiamente utilizzato per monitorare il trasporto del floema, le relazioni tra sink e source e il pattern vascolare nel tessuto vegetale11,12.
Oltre a questi marcatori, alcuni composti possono alterare direttamente la fisiologia della pianta per aumentare la produttività o uccidere la pianta nel caso degli erbicidi. Sia gli insetticidi che i composti antimicrobici sono un mezzo per aumentare la produttività delle piante, specialmente in presenza di HLB. Un esempio di una molecola antimicrobica che viene utilizzata per controllare CLas è la streptomicina. La streptomicina è un antibiotico aminoglicosidico originariamente isolato da Streptomyces griseus e ha dimostrato di inibire la crescita batterica attraverso l'inibizione della biosintesi proteica13. In termini di insetticidi, l'obiettivo principale per la ricerca HLB è D. citri, che trasmette CLas da albero ad albero14. A tale scopo, i neonicotinoidi, come l'imidacloprid, sono comunemente utilizzati, in quanto sono il gold standard per il controllo degli insetti nocivi15. Tutti questi diversi usi sono aspetti importanti delle attuali strategie di gestione degli impianti e lo sviluppo di nuovi prodotti dipende da saggi di screening efficienti.
Un metodo utilizzato per l'introduzione di composti nelle piante legnose è l'iniezione diretta nel tronco. Sono stati progettati una varietà di sistemi che variano nelle loro esigenze per i siti di iniezione preforati e questi sistemi utilizzano l'iniezione basata sulla pressione o il flusso passivo16. Sebbene i sistemi basati sulla pressione consentano la rapida introduzione di un determinato composto, il potenziale danno fisico causato dalla forzatura del liquido attraverso la vascolarizzazione bloccata o embolizzata deve essere considerato17. Sebbene l'applicazione fogliare o inzuppata di composti richieda meno tempo da attuare, l'iniezione diretta delle piante riduce lo spreco del composto di interesse a causa delle perdite nell'aria o nel suolo e può anche allungare il tempo in cui i composti sono in uno stato attivo riducendo l'esposizione all'ambiente esterno18. Entrambi questi aspetti sono importanti per preservare i reagenti costosi e garantire la coerenza tra le repliche nelle impostazioni di ricerca.
Questo studio descrive la progettazione, la costruzione e l'uso di un innovativo dispositivo di infusione diretta delle piante (DPI), che può essere utilizzato per valutare come i composti di interesse influenzano una pianta ospite. Una stampante 3D standard è stata utilizzata per produrre sia il dispositivo stesso che diversi componenti associati alla sua costruzione. Questo metodo di costruzione interno consente ai ricercatori di modificare il dispositivo e i componenti del dispositivo in base alle loro specifiche esigenze sperimentali e riduce la dipendenza dai dispositivi di iniezione delle piante disponibili in commercio. La configurazione del dispositivo è semplice ed efficiente e tutti i componenti ausiliari sono prontamente disponibili e poco costosi. Sebbene il sistema sia stato progettato per l'uso con una varietà di specie vegetali, gli esempi qui presentati riguardano piante di agrumi in vaso. Inoltre, questo studio dimostra che questo dispositivo è in grado di fornire in modo efficiente più tipi di composti sistemicamente alle giovani piante di agrumi senza causare letalità. I composti testati includevano CFDA, che è stato utilizzato per valutare la distribuzione del composto nella pianta, e streptomicina e imidacloprid, che sono stati utilizzati per verificare che gli effetti antimicrobici e insetticidi di questi composti sono stati osservati quando somministrati tramite DPI.
Protocol
1. Produzione di piante di agrumi per iniezione di composti sperimentali
- Propagare piccoli alberi di agrumi in vaso da talee vegetative radicate o semi. Coltivare le linee di agrumi in vaso sotto una lunghezza giorno/buio di 16 h/8 h e a 28 °C.
- Seleziona piante di agrumi della dimensione appropriata per l'esperimento. Le applicazioni descritte richiedevano che le piante fossero comprese tra 12 cm e 100 cm di altezza con diametri del tronco di 4-14 mm. Se è necessaria una nuova crescita a filo, tagliare le piante prima dell'esperimento.
2. Stampa tridimensionale del dispositivo DPI e dei componenti dello stampo
- Applicare un sottile strato di colla a base di polivinilacetato sul piano di stampa.
- Caricare il filamento di nylon nella stampante 3D e preparare la stampante secondo le istruzioni del produttore. Importare il file . STL (file supplementare 1, file supplementare 2, file supplementare 3, file supplementare 4, file supplementare 5, file supplementare 6, file supplementare 7, file supplementare 8, file supplementare 9, file supplementare 10, file supplementare 11, file supplementare 12, file supplementare 13 e file supplementare 14), impostare e avviare la stampa.
- Rimuovere il pezzo dal piano di stampa. Risciacquare la colla a base di polivinilacetato dalla base del componente stampato con acqua e rimuovere eventuali strutture di supporto.
- Spruzzare il componente DPI con due mani di vernice spray lucida trasparente.
3. Fabbricazione dello stampo ad anello plastisol
- Assemblate uno stampo abbastanza grande da contenere i pezzi del modello costruendo un involucro rettangolare usando blocchi di plastica a scatto su una base (Figura supplementare S1A).
- Mescolare il monomero siliconico RTV e il catalizzatore insieme in un rapporto 10: 1 e mescolare senza introdurre bolle per 1 minuto. Colorare aggiungendo colorante alimentare (3 gocce/25 ml di miscela di silicone) e sapone per le mani (1 mL di sapone/25 ml di miscela di silicone) (Figura supplementare S1B).
- Versare un sottile strato di silicone nella forma dello stampo che è sufficiente a coprire completamente il fondo. Tamponare per appiattire la superficie e attendere 24 ore per il fissaggio del silicone (figura supplementare S1C).
- Versare un secondo strato di silicone, come descritto sopra, che sia abbastanza profondo da coprire la stampa del nucleo del foro centrale sul motivo (visibile nella parte superiore del motivo nella figura supplementare S1D). Inserire il motivo nel silicone liquido con la stampa del nucleo del foro centrale rivolta verso il basso. Assicurarsi che nessuna bolla sia intrappolata e che i modelli siano ben separati e non si tocchino (Figura supplementare S1E).
- Fissare i modelli con un oggetto pesante e / o nastro adesivo per evitare che fluttuino fuori dal silicone mentre si imposta. Attendere 24 ore per impostare il nuovo strato versato (Figura supplementare S1F).
- Versare ulteriori strati di silicone fino a quando il livello è a filo con la parte superiore del motivo. Attendere 24 ore per la polimerizzazione (Figura supplementare S1G).
- Smontare i blocchi di plastica a scatto per rilasciare lo stampo. Rimuovere i modelli (figura supplementare S1H). Ispezionare lo stampo per verificare la presenza di strappi o deformità (Figura supplementare S1I).
4. Colata degli anelli plastisol
- Rivestire l'interno dello stampo, tutti i componenti principali e gli O-ring con olio da cucina (Figura supplementare S2A, B). Posizionare un O-ring attorno alla tacca al centro del nucleo del palo centrale e posizionare il nucleo nel foro centrale dello stampo ad anello plastisol (Figura supplementare S2C).
- Inserire il nucleo del canale di consegna nel foro sul lato dello stampo ad anello plastisol. Orientare la punta a forma di V all'estremità del nucleo del canale di mandata per allinearlo con l'O-ring sul nucleo del montante centrale (figura supplementare S2D,E).
- Riscaldare plastisol nel microonde per brevi raffiche di 10 s (Figura supplementare S2F, G). Mescolare plastisol delicatamente per evitare bolle (Figura supplementare S2H). Ripetere il riscaldamento e l'agitazione fino a quando la soluzione raggiunge una temperatura compresa tra 160 °C e 170 °C (figura supplementare S2I).
ATTENZIONE: Il surriscaldamento del plastisol può portare al rilascio di fumi tossici. Eseguire la procedura in un'area ben ventilata o in una cappa aspirante. Non riscaldare il plastisol a temperatura superiore a 170 °C. - Versare il plastisol fuso nello stampo ad anello plastisol vicino al bordo esterno dello stampo senza introdurre bolle (Figura supplementare S2J). Attendere 1 h affinché gli anelli plastisol si raffreddino (Figura supplementare S2K). Rimuovere gli anelli dallo stampo. Assicurarsi che il dispositivo DPI sia correttamente adattato prima dell'uso in saggi sperimentali (figura supplementare S2L).
5. Fissaggio del dispositivo DPI all'impianto
- Trova un sito liscio e sano sul tronco per l'attacco del dispositivo. Evitare urti o nodi, in quanto possono contribuire alla perdita del dispositivo.
- Utilizzare una punta da trapano da 2 mm di diametro per praticare un foro orizzontalmente attraverso il centro dello stelo con un angolo di 90° con la superficie del tronco (figura supplementare S3A). Far passare la punta del trapano attraverso il foro più volte per pulirlo e levigarlo per creare un foro non ostruito (Figura supplementare S3B).
- Create una fetta verticale nell'anello plastisol sul lato opposto del canale di erogazione del composto (Figura supplementare S3C). Montare l'anello attorno all'impianto e allineare il canale di mandata con il foro precedentemente praticato (figura supplementare S3D).
NOTA: L'anello deve adattarsi perfettamente al tronco per evitare perdite; I gruppi di nuclei con vari diametri possono essere utilizzati per realizzare anelli plastisol per steli di piante di diverse dimensioni. - Aggiungere il dispositivo DPI all'anello plastisol, assicurandosi che si adattino perfettamente. Allineare il beccuccio del dispositivo DPI con il canale di erogazione dell'anello plastisol e il foro praticato (figura supplementare S3E).
NOTA: può essere utile utilizzare una punta da trapano per allineare il foro e il beccuccio del dispositivo DPI. - Avvolgere ermeticamente con nastro di silicone per tenere l'apparecchio in posizione (figura supplementare S3F). Ispezionare il dispositivo completamente assemblato e collegato per garantire il corretto allineamento e orientamento sull'impianto.
6. Applicazione del composto di interesse utilizzando il dispositivo DPI
- Utilizzare una siringa o una pipetta per riempire il dispositivo DPI con la soluzione di interesse (figura supplementare S3G). Utilizzare una siringa per penetrare il nastro di silicone e l'anello plastisol sul lato opposto del dispositivo DPI per estrarre l'aria dal canale interno ed evitare l'introduzione di bolle d'aria nella vascolarizzazione della pianta (Figura supplementare S3H). Sostituire qualsiasi composto estratto nel dispositivo DPI.
- Aggiungere un'ulteriore piccola patch di nastro di silicone sopra il foro creato dalla siringa per rinforzare l'area e prevenire strappi. Ispezionare l'apparecchio per individuare perdite visibili nel punto di attacco e ispezionare il serbatoio del dispositivo per un livello di liquido stabile.
NOTA: l'acqua può essere utilizzata inizialmente per verificare la presenza di perdite per evitare sprechi della soluzione di prova. - Coprire l'estremità aperta del dispositivo DPI con pellicola sigillante di ceralacca e tirare verso il basso per formare un sigillo e ridurre l'evaporazione del composto sperimentale. Praticare un singolo foro nella pellicola di cera con la punta di una siringa per evitare lo sviluppo di un vuoto e successivamente riempire nuovamente il dispositivo (Figura supplementare S3I).
- Controllare quotidianamente l'apparecchio per garantire il corretto allineamento dei componenti (figura supplementare S3J) e rabboccare il liquido utilizzando una siringa per evitare che il serbatoio si asciughi. Ripetere questo processo fino a quando non è stata introdotta la quantità desiderata di soluzione sperimentale.
NOTA: i composti possono essere introdotti con successo da un determinato dispositivo per un massimo di 1 mese. Le durate di assorbimento della soluzione che superano questo lasso di tempo devono essere testate empiricamente prima della configurazione sperimentale.
7. Utilizzo di CFDA per osservare il movimento vascolare con piante di agrumi
- Collegare il dispositivo DPI a piante di cedro (Citrus medica L.) alte 25 cm, applicare un singolo trattamento da 2,0 ml di DMSO al 20% nel controllo H2O o CFDA al dispositivo DPI e lasciarlo assorbire per 24 ore. Per seguire questo protocollo, preparare la soluzione CFDA funzionante aggiungendo 1,6 ml di H 2 O a 400 μL di soluzione madre CFDA (la soluzione madre contiene 10 mM CFDA disciolti in 100% dimetil solfossido [DMSO]) per generare una concentrazione finale di CFDA di2mM e 20% di DMSO.
- Crea sezioni trasversali di vari tessuti della pianta e usa uno stereoscopio o un microscopio composto con un filtro fluorescente che include la lunghezza d'onda di 498 nm per visualizzare il CFDA nei tessuti vegetali. Confronta le immagini con il DMSO del 20% nei controlli H2O per tenere conto dell'autofluorescenza nel tessuto.
8. Misurazione delle variazioni del titolo CLas in campioni di foglie dopo trattamento con streptomicina
- Utilizzando piante di Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") alte 0,75 m di altezza, raccogliere il picciolo e la nervatura centrale di due foglie sintomatiche HLB da ciascuna pianta, tagliarle in piccole sezioni, raggruppare ogni tipo di tessuto e conservarle separatamente in provette resistenti agli urti da 2 ml contenenti una sfera d'acciaio di 6,35 mm di diametro.
- Macinare il campione utilizzando un omogeneizzatore programmato per due cicli da 15 s a 3,4 m/s. Estrarre l'acido nucleico totale come descritto in precedenza19.
- Eseguire la qPCR sui campioni di foglie infette da CLas utilizzando la miscela qPCR definita nella Tabella 1 e le condizioni di reazione definite nella Tabella 2. Utilizzare piante che mostrano infezioni da CLas robuste (l'infezione robusta è generalmente definita come valori di Ct basati su qPCR < 30 per il set di primer CLas 16S LasLong (LL)) per ulteriori analisi.
NOTA: Il titolo batterico viene stimato utilizzando CLas 16S Las Long (LL) e primer del DNA di deidrina degli agrumi per stimare gli equivalenti del genoma relativo, come descritto in precedenza20. - Equipaggiare le piante di agrumi che soddisfano il titolo minimo di infezione sopra descritto con dispositivi DPI e sottoporle a un trattamento una tantum di 2,0 ml di soluzione di H2O o soluzione di streptomicina alla concentrazione desiderata. Per seguire questo studio, utilizzare un singolo trattamento da 2,0 ml di streptomicina 9,5 mg / ml (19 mg in totale) sciolta in H2O.
- Raccogliere campioni di foglie a 7 giorni, 14 giorni e 28 giorni dopo il trattamento. Analizzare le foglie campionate per il titolo CLas utilizzando lo stesso protocollo descritto sopra.
- A 60 giorni dopo il trattamento, ottenere fotografie delle piante trattate con H2O o streptomicina. Utilizzare osservazioni visive dell'infezione CLas per valutare la gravità dell'infezione. Cerca il <50% delle foglie che mostrano clorosi interveinale e tappatura delle vene insieme alla crescita del rossore fogliare come segni di infezione lieve e più del 50% delle foglie con clorosi interveinale e tappatura delle vene, nonché abscissione fogliare e arresto della crescita della pianta come segni di infezioni più gravi.
9. Misurazione della mortalità di D. citri dopo trattamento con imidacloprid
- Potare piante di cedro (Citrus medica L.) alte 0,5 m ad un'altezza di 12 cm per favorire la crescita di nuove vampate.
NOTA: La velocità di crescita a filo può dipendere dalla salute della pianta e dal periodo dell'anno; Quindi, tenetene conto durante la progettazione sperimentale. - Dopo che >6 vampate, lunghe 1-2 cm, si sono sviluppate, introdurre le piante in gabbie contenenti D. citri adulto. Lasciare le piante nelle gabbie per 24 ore per consentire la deposizione delle uova.
- Condurre conteggi delle uova rappresentativi su tre germogli a filo 1-2 giorni dopo la deposizione e successivamente applicare i dispositivi DPI. Riempire questi dispositivi con 2,0 ml di un controllo dell'acqua o la concentrazione desiderata di imidacloprid (21,8% di principio attivo). Per seguire questo protocollo, utilizzare 528 μL/L, 52,8 μL/L e 5,28 μL/L di imidacloprid.
NOTA: I conteggi delle uova sono una misura distruttiva, quindi i conteggi in questa fase vengono utilizzati per stimare il numero di uova sul flusso non contato della stessa pianta e aiutano a fornire una linea di base per i successivi conteggi di emergenza delle ninfe che vengono condotti alla fine dell'esperimento. - Raccogliere il tasso di emergenza di D. citri su almeno tre dei germogli di lavaggio rimanenti. Acquisire fotografie rappresentative delle piante 7 giorni dopo l'introduzione del composto.
Representative Results
Componenti del dispositivo di infusione diretta
La versione base del dispositivo di infusione diretta è alta 8 cm e larga 3,3 cm nella parte anteriore e laterale (Figura 1A). Contiene un singolo serbatoio centrale contiguo al beccuccio e il volume totale che può essere contenuto all'interno di questi componenti è di 2,0 ml (Figura 1D). L'anello plastisol è alto 1,8 cm e ha un diametro di 2,7 cm (Figura 1C). Questo anello contiene anche due canali: uno per ospitare il beccuccio del dispositivo DPI e un altro di diametro variabile che si adatta al tronco dell'albero da trattare. Inoltre, c'è una scanalatura attorno al canale verticale per dirigere il trattamento in eccesso per circondare l'albero, che consente un ulteriore assorbimento del composto attraverso la corteccia (Figura 1F). Se assemblato correttamente, l'anello plastisol deve essere a filo contro il dispositivo DPI e il beccuccio deve allinearsi con il foro praticato nell'albero (Figura 1B e Figura 1E).
CFDA
Per studiare l'efficacia del dispositivo DPI per l'introduzione di sostanze chimiche esogene nelle piante di agrumi, 2,0 ml di 2 mM CFDA sono stati infiltrati utilizzando il dispositivo. Un segnale di fluorescenza è stato rilevato nel sistema vascolare della pianta trattata (Figura 2A) ma è stato assente negli impianti di controllo trattati con DMSO al 20% in H2O (Figura 2B). Questo segnale è stato osservato in tutti i tipi di tessuto vegetale sezionato, tra cui il mesofillo fogliare, la vascolarizzazione del picciolo, la vascolarizzazione dello stelo e la vascolarizzazione delle radici (Figura 2C). Questo segnale è stato osservato nella pianta entro 24 ore dal trattamento ed è stato distribuito in modo relativamente uniforme in tutti i tessuti.
Streptomicina
Per verificare se i composti introdotti hanno avuto un effetto terapeutico sulla malattia HLB, 2,0 ml di un composto battericida, la streptomicina, sono stati introdotti nelle piante di arancio dolce di Valencia (Citrus sinensis) CLas-positive ad una concentrazione di 9,5 mg / ml (19 mg in totale). Queste piante sono state mantenute in vasi da serra e il titolo CLas (misurato dagli equivalenti del genoma CLas per equivalenti del genoma degli agrumi) è stato monitorato nel tempo utilizzando qPCR (Figura 3A). I titoli iniziali medi di DNA CLas per le piante trattate con streptomicina e H2O erano rispettivamente 0,562 CLas genoma/genoma degli agrumi e 0,49 CLas genoma/citrus genome. Le riduzioni del titolo batterico medio sono state rilevate mediante qPCR 7-28 giorni dopo il trattamento con streptomicina rispetto ai controlli H2O nello stesso momento. Inoltre, la differenza tra i titoli batterici medi di 0 e giorno 28 era rispettivamente 0,314 e 0,117 per le piante trattate con streptomicina e le piante trattate con H2O.
Questo esperimento è stato progettato per misurare la risposta della pianta a diversi trattamenti in diversi periodi di tempo. È stato utilizzato un disegno della superficie di risposta quadratica a due fattori, con il tempo trattato come un fattore discreto quantitativo con quattro livelli (0 giorni, 7 giorni, 14 giorni e 28 giorni) e il trattamento come fattore categoriale con due livelli (H2O e streptomicina). Sono state utilizzate cinque repliche per ciascuna delle otto combinazioni di trattamento e il titolo CLas è stato misurato come variabile di risposta. I dati sono stati trasformati utilizzando il log10 basato su un'analisi del grafico Box-Cox. La riduzione del modello è stata eseguita mediante selezione in avanti utilizzando il criterio di informazione di Akaike (AICc)21, che ha comportato la rimozione sia degli effetti temporali che di interazione. Il fattore rimanente, il trattamento, è stato significativo (p = 0,0252), con le piante trattate con streptomicina che hanno mostrato un titolo CLas medio inferiore (0,349) rispetto alle piante trattate con H2O (0,496) in tutti i punti temporali combinati (Figura 3B). Questa riduzione del titolo CLas corrispondeva ad aumenti occasionali della nuova crescita sana dopo 60 giorni nelle piante trattate con streptomicina, come evidenziato dalle fotografie di alberi rappresentativi trattati con H2O (Figura 3C) rispetto a 19 mg di streptomicina (Figura 3D).
Imidacloprid
L'imidacloprid è stato introdotto in giovani piante di cedro infestate da psillide degli agrumi asiatici (ACP) utilizzando il dispositivo DPI per testare il suo potenziale come test di screening insetticida di D. citri. Un singolo trattamento da 2,0 ml di una soluzione commerciale di insetticida imidacloprid è stato testato a tre diverse concentrazioni (5,28 μL / L, 52,8 μL / L e 528 μL / L), insieme a un controllo dell'acqua. Il numero medio totale di uova per tre germogli di lavaggio prima del trattamento variava da 280,5 a 321 e non vi erano differenze significative tra le piante da utilizzare per ciascun gruppo di trattamento (Figura 4A). Le ninfe totali medie sopravvissute su tre germogli a filo 7 giorni dopo il trattamento erano rispettivamente 293,75, 268, 97,5 e 2 per il controllo dell'acqua e 5,28 μL / L, 52,8 μL / L e 528 μL / L soluzioni di imidacloprid (Figura 4B). Ciò ha rappresentato una significativa riduzione dell'emergenza della ninfa psillide ai livelli di soluzione di imidacloprid di 52,8 μL / L (p = 0,029) e 528 μL / L (p = 0,002) rispetto al controllo dell'acqua secondo un ANOVA unidirezionale seguito da un'analisi post-hoc di Tukey. Inoltre, questo aumento della mortalità delle ninfe psillidi al più alto livello di soluzione di imidacloprid era visivamente evidente dalla riduzione della produzione di melata di ninfa sulle linee trattate con imidacloprid (Figura 4D) rispetto al controllo dell'acqua (Figura 4C).
Figura 1: Il dispositivo di infusione diretta delle piante e l'anello plastisol. (A) Il dispositivo di infusione diretta delle piante intatto e (C) l'anello plastisol con le loro dimensioni. (B) Il dispositivo di infusione diretta delle piante e l'anello plastisol collegati e attaccati a un albero di agrumi. Sezioni trasversali verticali del dispositivo di infusione diretta delle piante (D), dell'anello plastisol (F) e (E) di questi due componenti collegati e attaccati a un albero di agrumi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Sezione trasversale della nervatura centrale fogliare di una pianta di agrumi di 25 cm. Immagini che mostrano 24 ore dopo il trattamento con (A) 2 mM CFDA o (B) 20% DMSO in H2O utilizzando il dispositivo di infusione diretta delle piante. (C) Sezioni trasversali di vari tessuti vegetali 24 ore dopo un trattamento CFDA di 2 mM, compreso il tronco 5 cm sopra il dispositivo di infusione diretta delle piante (in alto a sinistra), il tronco 5 cm sotto il dispositivo di infusione diretta delle piante (al centro a sinistra), la radice (in basso a sinistra), la nervatura centrale della foglia (in alto a destra), il picciolo fogliare (al centro a destra) e il mesofillo fogliare (in basso a destra). Barre della scala = 1 mm. Abbreviazioni: CFDA = 5,6-carbossifluoresceina-diacetato; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Monitoraggio del titolo CLas (misurato dagli equivalenti del genoma CLas per equivalenti del genoma degli agrumi) nel tempo utilizzando la qPCR. (A) Andamento temporale che mostra cambiamenti nel titolo del DNA CLas confrontando le cinque piante trattate con 19 mg di streptomicina con le cinque piante trattate con un controllo H2O. I punti rappresentano la media per un determinato trattamento in un determinato momento. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media. (B) Grafico a barre che mostra il titolo medio CLas delle piante trattate con H2O e streptomicina in tutti i punti temporali. Le barre di errore rappresentano l'intervallo di confidenza del 95% e gli asterischi indicano differenze significative (* = p < 0,05) tra i titoli CLas medi per le piante trattate con streptomicina e H2O secondo un ANOVA unidirezionale. (C) Immagini rappresentative di piante di agrumi 0 mesi e 2 mesi dopo il trattamento con infusione diretta di piante con streptomicina (C) H2O o (D). Le piante trattate con streptomicina mostrano una nuova crescita a filo fogliare verde chiaro dopo 2 mesi, il che è indicativo di una riduzione del titolo CLas. Abbreviazione: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Monitoraggio della mortalità delle ninfe psillidi nelle piante di cedro giovanili infestate da ACP Grafici a barre che mostrano (A) il numero stimato iniziale di uova e (B) le ninfe D. citri sopravvissute su tre lavaggi di agrumi 7 giorni dopo il trattamento con un controllo dell'acqua e varie diluizioni di imidacloprid. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media e gli asterischi denotano differenze significative (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) tra un dato livello di trattamento e il controllo dell'acqua secondo un ANOVA unidirezionale seguito da un'analisi post-hoc di Tukey. Immagini di D. citri infestati da agrumi infestati 7 giorni dopo il trattamento con (C) il controllo dell'acqua o (D) 528 μL/L imidacloprid utilizzando il dispositivo di infusione diretta delle piante. Abbreviazioni: ACP = psyllid degli agrumi asiatici; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Volume per campione (μL) | Componente | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR con BRYT Green Dye Master Mix | |||||
| 5 | Modello di DNA (20 ng/μL) | |||||
| 0.5 | 10 μM Primer F e R per CLas | Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (Attaccante); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Retromarcia) |
||||
| 0.5 | 10 μM Primer F e R per la pulizia degli agrumi | Disidratazione degli agrumi: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (Avanti); AAAACTTCACCGATCCACCAG (Retromarcia) |
||||
| 6.5 | H2O | |||||
Tabella 1: La miscela qPCR utilizzata per quantificare il titolo CLas nelle linee di agrumi trattate con streptomicina. Viene mostrata la sequenza dei primer 16S Las Long e dei primer di disidratazione degli agrumi per la quantificazione del DNA CLas e la quantificazione del DNA degli agrumi.
| Passo | Temperatura (°C) | Ore | |
| 1 | Denatura iniziale | 95 | 2 minuti |
| 2 | Denaturare | 95 | 15 secondi |
| 3 | Ricottura | 60 | 20 secondi |
| 4 | Estensione | 72 | 20 secondi |
| 5 | Vai al passaggio 2, ripeti 39x | ||
| 6 | Curva di fusione | 60 ramping a 95 a 0,2 °C/s | 3 minuti |
Tabella 2: Condizioni di reazione per la qPCR utilizzata per quantificare il titolo CLas nelle linee di agrumi trattate con streptomicina.
Figura supplementare S1: Immagini che mostrano il processo di assemblaggio dello stampo per generare l'anello plastisol. (A) Sono stati utilizzati blocchi di plastica a scatto per generare il primo strato dello stampo ad anello plastisol. (B) Soluzione uniformemente miscelata contenente la gomma siliconica RTV, il catalizzatore, il colorante alimentare e il sapone. (C) Versare uniformemente il primo strato dello stampo ad anello plastisol. (D) Immagine dei modelli ad anello plastisol con la stampa centrale del nucleo in alto. (E) Modelli ad anello Plastisol inseriti nel secondo strato non polimerizzato dello stampo. (F) Nastro adesivo e mazzuolo di gomma utilizzati per fissare i modelli mentre il secondo strato polimerizza. (G) Terzo strato dello stampo aggiunto fino a quando non è a filo con la parte superiore dei modelli. (H) Rimozione dei modelli dallo stampo. (I) Stampo ad anello plastisol completamente costruito. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Immagini che mostrano il processo di assemblaggio dell'anello plastisol associato al dispositivo di infusione diretta della pianta. (A) Componenti dell'assemblaggio dell'anello Plastisol, incluso lo stampo, il nucleo centrale con un O-ring e il nucleo del canale di consegna. (B) Rivestire le anime in olio da cucina spray antiaderente per facilitare la rimozione dell'anello plastisol dopo l'indurimento. (C) Inserimento del nucleo centrale e dell'O-ring nello stampo. (D) Inserimento del nucleo del canale di mandata perpendicolare al nucleo centrale. (E) Corretto assemblaggio dei componenti del nucleo dell'anello plastisol nella cavità dello stampo. (F) Plastisol utilizzato per la generazione dell'anello plastisol. (G) Riscaldamento del plastisol nel microonde. H) Agitare il plastisol dopo il riscaldamento. (I) Controllo della temperatura del plastisol. (J) Versare il plastisol riscaldato nel nucleo assemblato. (K) Consentire il raffreddamento del plastisol attorno al nucleo assemblato. (L) Anelli plastisol completamente assemblati attaccati al dispositivo di infusione diretta della pianta. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S3: Immagini che mostrano il processo di assemblaggio del dispositivo di infusione diretta dell'impianto. (A) Praticare un foro attraverso il centro della pianta di agrumi per creare un canale per la consegna del composto. (B) Vista frontale del foro praticato. (C) Tagliare l'anello plastisol con una lametta opposta al canale di erogazione del composto. (D) Montare saldamente l'anello plastisol attorno allo stelo nel sito del foro precedentemente praticato. (E) Montaggio del dispositivo di infusione diretta delle piante sull'anello plastisol, con il rubinetto di mandata composto sul dispositivo inserito nel canale dell'anello plastisol. (F) Uso di nastro di silicone per fissare il dispositivo di infusione diretta della pianta all'anello plastisol e tenere in posizione l'intero apparecchio. G) Riempire la camera del dispositivo di infusione diretta delle piante con il composto di interesse. (H) Uso di una siringa per aspirare l'aria dal foro praticato nell'impianto e avviare il flusso del composto. (I) Applicare una pellicola sigillante di ceralacca all'apertura nella camera del dispositivo di infusione diretta dell'impianto e praticare un foro per evitare il vuoto. J) Dispositivo di infusione diretta di una pianta interamente assemblato su una pianta di agrumi. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 1: Il nucleo centrale dell'anello plastisol. File STL per un albero di 4 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: Il nucleo centrale dell'anello plastisol. File STL per un albero di 6 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: Il nucleo centrale dell'anello plastisol. File STL per un albero di 8 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: Il nucleo centrale dell'anello plastisol. File STL per un albero di 10 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 5: Il nucleo centrale dell'anello plastisol. File STL per un albero di 12 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 6: Il nucleo centrale dell'anello plastisol. File STL per un albero di 14 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 7: Il nucleo del canale di consegna dell'anello plastisol. File STL per un albero di 4 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 8: Il nucleo del canale di consegna dell'anello plastisol. File STL per un albero di 6 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 9: Il nucleo del canale di consegna dell'anello plastisol. File STL per un albero di 8 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 10: Il nucleo del canale di consegna dell'anello plastisol. File STL per un albero di 10 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 11: Il nucleo del canale di consegna dell'anello plastisol. File STL per un albero di 12 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 12: Il nucleo del canale di consegna dell'anello plastisol. File STL per un albero di 14 mm. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 13: Il dispositivo di infusione diretta delle piante . STL. Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 14: Il modello utilizzato per creare lo stampo per l'anello plastisol. STL. Clicca qui per scaricare questo file.
Discussion
Affinché il dispositivo DPI sia considerato un metodo praticabile per la somministrazione di composti esogeni nelle piante, deve contribuire a un assorbimento di composti robusto e coerente in una varietà di tipi di tessuto. L'esperimento che utilizzava CFDA ha mostrato chiaramente sia il movimento del composto acropetale che basitale, così come sia nel sistema vascolare che nelle cellule mesofille della foglia. Inoltre, e presumibilmente perché il foro trivellato utilizzato in questo dispositivo DPI fornisce una grande quantità di superficie per l'assorbimento del composto, il CFDA era presente in quantità relativamente uguali in tutte le sezioni dello stelo, non solo in un piccolo sottoinsieme della vascolarizzazione adiacente al dispositivo, come è stato visto in precedenti studi sull'assorbimento del colorante nelle piante che utilizzano l'iniezione del tronco6. Inoltre, la somministrazione di proteine fluorescenti verdi e colorante floreale è stata testata utilizzando il dispositivo DPI ed è stata osservata una distribuzione di questi composti simile al CFDA (dati non mostrati). Questi dati suggeriscono che il dispositivo può essere utilizzato per fornire sistemicamente una varietà di composti che variano in dimensioni e struttura molecolare. Tuttavia, vale la pena notare che c'erano differenze nell'assorbimento del composto in base allo stadio di sviluppo delle foglie, con foglie in via di sviluppo più giovani che occupavano più composti rispetto alle foglie più vecchie stabilite. Ciò può essere dovuto ai cambiamenti nelle proprietà vascolari presenti nel tessuto sink rispetto al tessuto sorgente e dovrebbe essere ottimizzato per un determinato esperimento.
Il dispositivo DPI ha mostrato un assorbimento di composti sufficiente per la visualizzazione di CFDA, GFP e colorante floreale, e ha anche preso abbastanza per mostrare gli effetti antibatterici e insetticidi della streptomicina e dell'imidacloprid, rispettivamente. Entrambi questi composti hanno provocato cambiamenti nella vitalità dell'organismo bersaglio 1 settimana dopo un singolo trattamento da 2,0 ml. Questi dati suggeriscono che il dispositivo DPI potrebbe essere utilizzato in saggi di intere piante per testare la fattibilità di un'ampia varietà di composti per il controllo di parassiti microbici e insetti. Inoltre, grazie al suo contatto diretto con il sistema vascolare, questo dispositivo può anche offrire l'opportunità di testare composti che non vengono assorbiti in modo efficiente dalle radici o dalle cellule epidermiche. Di particolare interesse sarebbe l'interferenza dell'RNA (RNAi), in quanto potrebbe essere utilizzata per modulare l'espressione genica all'interno della pianta ospite, del patogeno o del vettore patogeno. Ricerche precedenti che hanno introdotto l'RNA a forcina attraverso un foro praticato nel tronco delle piante di mele e uva hanno mostrato che le molecole di RNA erano limitate al tessuto xilematico, suggerendo che queste molecole possono essere efficaci solo contro gli organismi masticatori e che si nutrono di linfa xilematica22. Dato che il dispositivo DPI utilizza un sistema di rilascio simile a foro perforato, è ovvio che l'RNA a forcina consegnato con questo dispositivo può anche essere limitato al tessuto xilematico. Tuttavia, la diminuzione osservata del titolo delle CLas limitate dal floema dopo il trattamento con streptomicina dal dispositivo DPI suggerisce fortemente che questo antibiotico era presente nel floema. Pertanto, è probabile che la distribuzione vascolare dei composti erogati utilizzando il dispositivo DPI dipenda dalle loro dimensioni e dalla loro chimica e ogni molecola debba essere valutata su base individuale.
Sebbene sul mercato siano disponibili numerosi dispositivi DPI disponibili in commercio, il dispositivo qui descritto può essere prodotto internamente ed è modificabile. In questo modo, è possibile apportare miglioramenti e cambiamenti nelle dimensioni in base alle specie vegetali e al disegno sperimentale utilizzato, e non dipende da prodotti commerciali. Inoltre, il dispositivo è collegato in modo semi-permanente alla pianta, il che significa che più trattamenti di un determinato composto possono essere eseguiti contemporaneamente senza dover ferire nuovamente la pianta con più iniezioni di composti. Su una nota cautelativa, il dispositivo può perdere se non installato correttamente. Di conseguenza, il composto viene perso nell'ambiente invece di essere consegnato alla pianta. Pertanto, è necessario prestare attenzione a ispezionare il dispositivo per eventuali segni di perdite durante l'installazione e i primi giorni successivi. Sebbene praticare un foro nell'albero sia potenzialmente dannoso, questo metodo è stato scelto per garantire un assorbimento di composti robusto e coerente. Inoltre, non sono stati osservati effetti avversi sulla salute delle piante dall'attacco del dispositivo DPI in questi esperimenti. Tuttavia, nel disegno sperimentale dovrebbero essere incluse piante extra per sostituire quelle che possono perdere vigore nel corso di un determinato esperimento. Infine, poiché questo dispositivo utilizza il flusso passivo per introdurre composti, può essere difficile prevedere il tasso di assorbimento tra diverse specie vegetali o fasi di sviluppo della stessa specie. Ciò può complicare gli esperimenti se la velocità di assorbimento dei composti è un fattore limitante. Per ottenere i migliori risultati, gli esperimenti dovrebbero essere pianificati in modo da fornire tempo sufficiente affinché la pianta assorba completamente i 2,5 ml di composto, che può richiedere fino a 1 settimana. In conclusione, questo dispositivo DPI è uno strumento efficace per la valutazione rapida dell'attività in pianta di composti antimicrobici o insetticidi contro CLas e il suo vettore, D. citri, fornendo così maggiori informazioni sull'efficacia sistemica e sull'influenza sulle prestazioni delle piante rispetto al saggio fogliare staccato precedentemente presentato23. Indubbiamente, la varietà di applicazioni per questo sistema va ben oltre gli usi specifici descritti in questo studio.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse. L'uso di nomi commerciali, di aziende o società in questa pubblicazione è per informazione e comodità del lettore. Tale uso non costituisce un'approvazione ufficiale o un'approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti o del Servizio di Ricerca Agricola di qualsiasi prodotto o servizio ad esclusione di altri che potrebbero essere adatti. Il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) proibisce la discriminazione in tutti i suoi programmi e attività sulla base di razza, colore, origine nazionale, età, disabilità e, ove applicabile, sesso, stato civile, stato familiare, stato parentale, religione, orientamento sessuale, informazioni genetiche, convinzioni politiche, rappresaglia o perché tutto o parte del reddito di un individuo deriva da qualsiasi programma di assistenza pubblica. Non tutte le basi proibite si applicano a tutti i programmi. Le persone con disabilità che necessitano di mezzi alternativi per la comunicazione delle informazioni sul programma (Braille, stampa a caratteri grandi, audiocassetta, ecc.) devono contattare il TARGET Center dell'USDA al numero (202) 720-2600 (voce e TDD). Per presentare una denuncia di discriminazione, scrivere a USDA, Direttore, Ufficio per i diritti civili, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, DC 20250-9410, o chiamare (800) 795-3272 (voce) o (202) 720-6382 (TDD). USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Mant Acon per le piante utilizzate in questo studio. Il finanziamento è stato fornito dal progetto CRIS 8062-22410-007-000-D del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e dalla sovvenzione NIFA USDA 2020-70029-33176.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
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