Summary
本文介绍了一种简单、低成本的方法来记录 秀丽隐杆线虫的草坪回避行为，使用智能手机和发光二极管 （LED） 灯箱等现成的物品。我们还提供了一个 Python 脚本，将视频文件处理成更适合计数的格式。
Abstract
当暴露于有毒或致病细菌时，线虫秀 丽隐杆线 虫表现出习得的草坪回避行为，其中蠕虫逐渐离开其食物来源并宁愿留在细菌草坪之外。该测定是测试蠕虫感知外部或内部线索以正确应对有害条件的能力的简单方法。虽然检测方法简单，但计数非常耗时，尤其是对于多个样品，并且跨夜的检测持续时间对研究人员来说很不方便。可以长时间对许多板进行成像的成像系统很有用，但成本很高。在这里，我们描述了一种基于智能手机的成像方法来记录 秀丽隐杆线虫的草坪回避。该方法只需要一部智能手机和一个发光二极管（LED）灯箱作为透射光源。使用免费的延时相机应用程序，每部手机最多可以成像六个板，具有足够的清晰度和对比度来手动计数草坪外的蠕虫。生成的电影在每个小时时间点被处理成 10 秒的音频视频交错 （AVI） 文件，然后裁剪以显示每个单板，使其更适合计数。对于那些希望检查回避缺陷的人来说，这种方法是一种具有成本效益的方法，并且有可能扩展到其他 秀丽隐杆线虫 测定。
Introduction
在研究秀丽隐杆线虫的众多优点中，其简单的神经系统为研究遗传和细胞水平的变化如何影响网络功能和行为输出提供了机会。尽管神经元数量有限，秀丽隐杆线虫表现出广泛的复杂行为。其中之一是避免草坪，其中细菌线虫通过离开细菌草坪来响应有害食物来源。秀丽隐杆线虫避开致病细菌1，2，3 的草坪、产生毒素或掺有毒素的细菌草坪1，4，甚至是表达 RNAi 的细菌，其靶基因敲低对蠕虫的健康有害4，5。研究表明，蠕虫对外部线索做出反应，例如致病菌产生的代谢物1，6，或表明食物使它们生病的内部线索4，7。这些线索通过保守的信号通路处理，例如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和转化生长因子β（TGFβ）通路，并且需要肠道和神经系统之间的通信4，6，7，8。
虽然测定很简单，但学习行为会在几个小时内发展，通常是在一夜之间。虽然有些突变体无法离开，在这种情况下，仅在一个时间点回避得分就足以证明缺陷，但许多突变体最终会离开，但出来的速度较慢。对于这些，需要每隔几个小时跟踪一次蠕虫的运动，这可能很难在一夜之间完成。计数本身也需要时间，在板之间产生滞后时间，从而限制了可以同时测试的板的数量。在整个测定过程中使用成像设置同时记录许多板将非常有用，但设置成本可能令人望而却步，具体取决于研究实验室的资金情况。
为了解决这个问题，我们设计了一种非常简单的方法，使用智能手机记录回避测定。每部手机可以录制多达六个检测板的延时视频。为了提供透射光，我们使用可以在线轻松购买的发光二极管（LED）灯箱。检测板放置在高架平台上，由空心矩形隧道支撑，聚焦入射光，产生对比。我们还提供了一个 Python 脚本，可将视频转换为音频视频交错 （AVI） 文件，显示每小时 10 秒的剪辑。然后将视频裁剪到单独的板上，并保存在单独的文件中，以用于手动计数。
该方法提供了一种低成本的程序，也非常易于使用，使用大多数人都容易获得的物品。在这里，我们描述了使用成熟的草坪避免测定法针对人类病原体 铜绿假单胞 菌（PA14）的方法，其方案先前已描述过2，9。最后，我们还回顾了成像方法的注意事项和局限性，适用于那些希望将其应用于其他 秀丽隐杆线虫 行为实验的人。
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Protocol
1. 设置成像设备（图 1A-E）
- 确保具有以下最低要求的智能手机摄像头可用：
12 百万像素 （MP） 摄像头
1080p 分辨率视频
5 GB 存储空间（20 分钟视频为 3-4 GB）
来自应用商店的延时视频应用程序（提供免费应用程序） - 将LED灯箱放在将进行测定的25°C培养箱的底部架上。
- 要隐藏 LED 灯表面上的虚线图案，请铺两张纸巾以覆盖 LED 盒子的整个表面。
- 为标本制作一个升高的载物台（图1A，D）。高架舞台是由空心矩形隧道支撑的透明塑料板。隧道的功能类似于聚光镜来聚焦光线，为标本提供更好的对比度（图 1C）。确保隧道的墙壁有些暗，以尽量减少光散射。这项研究使用了牛皮纸盒。隧道的尺寸为5.5厘米x 17厘米x 4.5厘米（宽x长x高）。LED灯箱最多可容纳五个隧道。
- 在载物台上方放置另一个机架以放置电话进行录制（图1B，E）。每部手机将记录三到六个板（一到两排三个板），因此请相应地调整机架高度。这将在标本上方约15厘米处（图1B）。
- 在培养箱内放置一个电源板，以便在过夜录制期间插入手机。
2. 缓冲液和培养基的制备
- 通过将 3 g KH 2 PO 4、6 g Na 2 HPO4 和 5 g NaCl 加入 1 L 蒸馏的 H2O 中来制备 M9 缓冲液。冷却缓冲液，然后加入 1 mL 的 1 M MgSO4。
- 通过将 108.3 g KH 2 PO 4 和 35.6 g K 2 HPO 4 添加到 1 L H2O 中制备 1 M KPO4 缓冲液。通过高压灭菌灭菌。
- 通过混合 1 mL 漂白剂、0.4 mL 1 M NaOH 和 2.6 mL H2O 来制备蠕虫漂白溶液。
- 准备线虫生长培养基（NGM）琼脂平板。
- 在 3 L 烧瓶中加入 3 g NaCl、2.5 g 杆菌蛋白胨和 17 g 杆菌琼脂。加入 975 mL 蒸馏水并插入搅拌棒。
- 高压灭菌，然后冷却至55°C，并加入1mL胆固醇（5mg / mL乙醇溶液），1mL1M CaCl2，1mL1M MgSO4和25mL1M KPO4 缓冲液（pH 6.0）。搅拌均匀。倒入6厘米的盘子中。让板干燥至少 2 天。
- 通过移液约 1 mL 的 OP50 过夜培养物形成细菌草坪，用 OP50 大肠杆菌 接种 NGM 琼脂平板。在室温 （RT） 下放置，直到准备使用。
3. 高蛋白胨NGM板的制备（用于PA14）
注意：这些板应在测定前至少5天制作。
- 制作含有0.35%蛋白胨的NGM。在 250 mL 锥形瓶中混合 0.3 g NaCl、0.35 g 杆菌蛋白胨和 1.7 g 杆菌琼脂。加入 97.5 mL 蒸馏水并插入搅拌棒。
- 用铝箔盖住烧瓶口，并在121°C高压灭菌20分钟。
- 冷却至 55 °C，加入 0.1 mL 胆固醇（5 mg/mL 乙醇溶液）、0.1 mL 1 M CaCl 2、0.1 mL 1 M MgSO 4 和2.5 mL 1 M KPO4 缓冲液 （pH 6.0）。搅拌均匀。
- 将高蛋白胨NGM倒入35毫米培养皿中。
- 将盘子干燥至少 2 天。
4. 通过漂白同步蠕虫
注意：在测定前3天开始此步骤。
- 取装有妊娠成虫的平板，并通过用 M9 缓冲液洗涤平板将它们收集到 1.7 mL 微管中。
- 尽可能多地去除液体，然后加入 400 μL 漂白溶液。等待约4-5分钟，间歇性涡旋，直到成虫体破裂，释放卵。
- 加入M9缓冲液以填充微管的其余部分以稀释漂白溶液。以最大速度（12，000 至 13，000 x g）旋转 1-2 秒。除去上清液并用M9缓冲液再洗涤三次。
- 将鸡蛋转移到含有M9缓冲液的空35mm培养皿中。让卵在20°C下孵化过夜。 在没有食物的情况下，孵化的蠕虫将在L1幼虫阶段停止，使所有蠕虫的发育阶段同步。
注意：用明胶溶液（高压灭菌水中的0.05%明胶）涂覆35毫米培养皿可以防止鸡蛋粘在底部并最大限度地减少鸡蛋损失。 - 第二天，将L1阶段蠕虫转移到OP50播种的NGM板上。
- 将蠕虫在20°C孵育53-54小时，直到蠕虫达到L4幼虫阶段。
5. 细菌的制备（铜绿假单胞菌，PA14）
注意：在测定前4天开始此步骤。
- 在没有任何抗生素的Luria Bertani（LB）琼脂平板上从-80°C划线解冻的细菌，并在37°C下孵育过夜。
注意：始终使用新鲜细菌。条纹板应在4°C下储存不超过1周。 - 将单个菌落接种到3mL的King's肉汤中，并在37°C振荡培养箱中生长过夜。
- 第二天，将7μL过夜培养物接种到高蛋白胨NGM板上，并在37°C下孵育24小时。
- 将接种板移至室温，并在使用前再孵育24小时。准备好后，在接下来的24小时内使用板。
6. 准备录制
注意：在测定之前执行此操作。
- 将智能手机插入连接到电源插座的配电盘。确保禁用自动锁定设置，以防止手机在录制时返回锁定屏幕。
- 打开延时相机应用程序并将延时摄影间隔设置为 2 秒。将视频质量设置为 1080 fps 的 30p。
- 将智能手机屏幕朝上放置，以使用后置摄像头进行录制。检查屏幕以确保纸盒隧道适合视野。
7. 草坪回避测定
- 使用铂线镐将30个同步的L4级蠕虫（从L1开始53-54小时）转移到PA14板上。将蠕虫放在细菌草坪的中间。对于本研究中的每个条件，测试了两个板（即每个条件60个蠕虫）。
- 将两个板放在录音设备的升高舞台上，盖子朝下。琼脂的一侧将朝上朝向相机。
- 在智能手机屏幕上，点击板的位置，以便相机可以聚焦在检测板上。在板上贴上标签或文字会有所帮助，因为相机可以使用它来正确对焦。
注意：在板底部书写不会干扰蠕虫的成像，只要它朝向边缘。幸运的是，蠕虫即使在离开后也会留在草坪附近，因此只需要一览无余的草坪周围区域。 - 开始录制。
- 录制开始后，向舞台添加更多板。由于通过拾取转移蠕虫所需的时间，板之间可能存在明显的滞后时间。请注意之后的滞后时间，以便每个条件都可以在开始时计算。
- 从放置在舞台上的最后一组板记录20小时。在最后的延时视频中，20小时的录制将产生20分钟长的视频。
注意：在测定后直接从平板上计数蠕虫可能是值得的，至少在最初几次开始时。这可以与通过视频成像获得的值进行比较，以确保它们产生相似的数字。
8. 使用Python脚本处理视频
- 将电影文件传输到计算机进行处理。扩展名将是MOV（iPhone）或MP4文件（Android）。
- 使用 Python 代码处理视频。代码可以在 github.com/khyoon201/wormavoid 找到。
- 要运行 Python 脚本，请确保计算机上预安装了以下内容：ffmpeg，一种用于转换视频文件的工具（安装说明可以在其网站上找到，ffmpeg.org/download），以及 Python 包 os、pandas、tkinter 和 ffmpeg-python。
- 使用 extract_frame.py 脚本查找每个板的尺寸和坐标。
- 运行 extract_frame.py 脚本。将出现一个窗口以选择存储在计算机上的视频文件。运行完成后，同一目录中会出现一个同名的 jpeg 文件。
- 在 ImageJ （imagej.org） 中打开 jpeg 文件。
- 从菜单中选择 “分析>设置测量值”。确保选中 “显示标签 ”框（图2A）。关闭窗口。
- 使用“ 直线” 工具，通过在板上画一条线来测量板的直径，然后从菜单中选择 “分析>测量 ”。如果视频为 1080p，则每个板的宽度约为 480 像素。记下此信息并关闭 “结果 ”窗口。
- 使用多点工具，标记每个板左上角的 点 。这些点将成为裁剪视频的左上角（图 2B）。顺序很重要;按板启动时间的顺序标记。为所有板创建一个点后，从菜单中选择 分析>测量 。测量值（包括点的 X 和 Y 坐标）将显示在“结果”窗口中。
- 要处理多个视频，请在 ImageJ 中对其他 jpeg 文件重复此过程。所有 X 和 Y 坐标将列在同一 “结果 ”窗口中。
- 将 “结果 ”窗口保存到 csv 文件中。该文件应保存到与影片文件相同的目录中。
- 找到每个盘子的开始时间。
- 在电脑或手机上播放电影，并记下放置在相机下方的每组板的开始时间。
- 打开包含坐标的 Results.csv 文件并添加“开始”列。对于与单个板对应的每一行，在“开始”列下输入适当的开始时间（以秒为单位）（例如，如果开始时间为 0：00：08，请输入 8）。救。
注意：列名称必须为“开始”（小写，不带引号），以便下一个脚本识别以进行裁剪和修剪。
- 裁剪和修剪视频。
- 运行 crop_n_trim.py 脚本。
- 出现提示时，选择 “结果.csv ”文件。
注意：确保 结果.csv 文件和所有影片文件位于同一目录中。 - 输入板尺寸。输入前面记下的像素值。
注意：脚本现在将读取 Results.csv 文件的每一行，通过读取“标签”列中的文件名来查找正确的电影文件，并根据“X”和“Y”列中指示的坐标进行裁剪。每个板块的开始时间将由“开始”列中指示的时间确定。脚本完成运行后，将出现一个与电影同名的文件夹，后跟开始时间（例如“Movie1_8”），其中将保存与测定的每个小时时间点对应的 10 秒视频。
9. 使用 ImageJ 手动计数
- 在 ImageJ 中打开每个 AVI 文件。
- 数一数草坪外可见的蠕虫。在一个帧中重叠的蠕虫通常会在另一个帧中分开，以便可以正确计数。
- 计算每个时间点的入住率：
占用率=（蠕虫总数-草坪外蠕虫数量）/蠕虫总数
注意：在视频播放过程中，蠕虫会进出草坪，但这不会显著改变结果。尝试使用似乎是平均值的数字，或者确切的每小时时间点（视频中的 5 秒）的蠕虫数量。
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Representative Results
脚本产生的第一个视频是从测定开始1小时。0小时的视频不会被保存，因为蠕虫在草坪内开始测定，因此占用率始终为100%。
将野生型N2蠕虫与npr-1突变体进行比较，其草坪回避缺陷在文献中已得到充分证实6，10（图3A-E）。在野生类型中可以看出，蠕虫逐渐离开细菌草坪并留在室外（图3A，B）。结果绘制在图表中，以显示入住率随时间的变化（图3B）。视频中可以清楚地看到外面的蠕虫，但厚厚的细菌草坪内的蠕虫更难区分（图3D，E）。但是，由于每个盘子中正好有 30 条蠕虫，因此可以通过从总数 30 中减去计数的蠕虫来计算仍在草坪内的蠕虫数量。
虽然这种假设可能会引入计数误差，特别是如果一些蠕虫最终靠近板壁，可能很难看到，但这并不是一个重大问题。当直接从平板上进行计数与成像蠕虫的计数进行比较时，来自成像蠕虫的计数被证明是高度准确的。当每种菌株的三项试验平均在一起时，N2和npr-1菌株的准确率分别为99.5%和96.2%（图3B，C）。值得注意的是，由于其高运动性11，错过一些npr-1蠕虫的倾向略高，而野生型蠕虫倾向于停留在草坪附近。
图1：成像设备 。 （A） 成像设置的示意图。（B）设置在培养箱内的成像装置设置为25°C，用于PA14草坪回避测定。（C）有或没有隧道成像的蠕虫的比较。（D）板如何安装在隧道顶部的特写视图。（E） 调整手机的高度，以便屏幕最多可容纳六个 35 毫米板。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：使用 ImageJ 确定板坐标。 （A） 在 “分析 > 集测量值”中，必须选中 “显示标签 ”框（红色虚线框）。（B） 从视频中提取的单个帧用于绘制用于裁剪的坐标。使用多点工具创建的 点 以黄色显示。这些用作最终裁剪视频的左上角（标记为虚线白框）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：代表性图像和测定结果 。 （A）在PA14暴露几个小时后，大多数蠕虫离开草坪并留在外面。（二）草坪回避测定的代表性结果。每小时跟踪蠕虫的移动以确定占用率。20小时时间点的开放方块表示从 C的板直接计数确定的平均值。（C）为了评估通过视频进行的计数的准确性，还直接在测定结束时对蠕虫进行计数，并与通过视频成像获得的值进行比较。值表示草坪内/外的蠕虫数量。（D，E）L4蠕虫在细菌草坪外清晰可见（黑色箭头），而内部蠕虫更难看到（白色箭头）。在一个帧中重叠的蠕虫通常可以在同一电影的另一帧中区分出来（黑色轮廓箭头）。右下角的数字表示 10 秒视频剪辑总帧数（30 帧/秒）中的帧数。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
成像动物行为，而不是依靠直接观察，不仅方便，而且具有留下视觉文档的优点。这允许客观的第三人进行盲分析，甚至可以使用图像识别技术进行自动分析。尽管有这些优点，但通常提供的标准设备成本很高，因此一旦购买，就会致力于设置。
使用智能手机收集简单 秀丽隐杆线虫 行为的视频记录有几个优点。它需要对技术知识的最小熟悉程度，并且非常容易设置，使用可以轻松且廉价采购的物品。另一个优点是智能手机的便携性——它可以安装在狭小的空间里，而且由于它有自己的存储空间，所以不需要连接回计算机。这允许将设置放置在任何地方，即使空间极其有限。将录制的视频文件移动到计算机很方便 - 文件不是那么大，因为它们以压缩的 MPEG-4 格式编码。当文件传输的无线选项可用时，移动文件特别方便。
由于蠕虫是在没有任何放大倍率的情况下成像的，因此视频中捕获的蠕虫仅包含几个像素。L4蠕虫足够大，无需放大即可捕获，但小像素尺寸限制了其用于高质量图像识别和运动跟踪。使用较新型号提供的变焦镜头或安装变焦镜头适配器可能有助于获得更详细的图像，尽管我们自己还没有尝试过。然而，这也将减少视野和可以同时成像的板的数量。
为了使计数更容易，裁剪视频以显示单个板，并修剪为对应于每小时测定的10 s视频。这也很重要，因为将视频转换为 AVI 格式会显着增加文件大小，并且裁剪和修剪视频可确保文件大小更易于管理。裁剪的AVI文件也可能用于通过图像识别算法自动计数蠕虫。对于野生型菌株，我们发现在ImageJ中使用简单的阈值可以进行粗略形式的自动计数。但是，当使用体型较小的突变体时，自动计数会产生更多的错误。
已经有许多努力来对蠕虫进行成像和自动化分析。传统上，蠕虫是通过连接到解剖显微镜的相机记录的，由于其视野有限，通常只能一次对少数蠕虫进行成像。同时对更多蠕虫进行成像以进行更高通量分析的需求促使研究人员开发创造性的成像方法。一种方法是使用改进的平板扫描仪对寿命测定进行成像，例如WormScan或寿命机器12，13。高分辨率扫描仪可以对蠕虫进行成像，以便将移动的活蠕虫与未移动的死蠕虫区分开来。
为了以更高的fps速率跟踪蠕虫运动，将相机连接到镜头上，并在没有显微镜的情况下对蠕虫进行成像14，15。Churgin等人开发了WorMotel14，这是一种对聚二甲基硅氧烷（PDMS）多孔板中生长的单个蠕虫进行长期成像的方法，对选择合适的相机和镜头时要考虑的因素提供了详细的解释16。这种方法还具有成本相对适中的额外优势。
在没有显微镜的情况下捕获蠕虫不可避免地会导致图像缺乏分辨率，无法对蠕虫的运动或步态进行详细分析。为了解决这个问题，Barlow等人采用了一种策略，即使用六个相机排列成三乘二的阵列来捕获单个96孔板17。每个相机设置为仅对96孔板的四个x四个孔进行成像，从而使成像蠕虫的尺寸和分辨率更高。
由于秀丽隐杆线虫的身体清晰，因此还必须调整照明以提供与背景的对比度。我们的方法使用来自平面LED灯箱的照明，通过狭窄的隧道来聚焦光线。尺寸由成像板的大小决定;5.5 cm 的宽度适合用于回避测定的 35 mm 板。为了成像更大的区域，隧道必须更宽，但我们发现高度也需要增加才能获得相同的聚焦效果。缺点是，随着隧道的升高，可以通过板块看到更多的墙壁，从而阻碍了板块边缘的视野。另一种可以采用的策略是使用排列在圆形环中的 LED 灯串（LED 环）。来自多个方向的光散射在蠕虫的身体表面，在黑暗的背景上产生光蠕虫14，16，18。这不仅适用于较大的印版，也适用于无法容纳LED灯箱的较小空间的成像。
借助蠕虫社区开发的许多可用的成像策略，研究人员可能希望尝试一些选项，以找到适合他们需求的正确策略。这里描述的成像方法既便宜又平易近人，可以很容易地在本科课堂上使用，或者在投资长期设置之前作为临时解决方案。
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Disclosures
未声明利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢Deok Joong Lee对手稿的批判性阅读和测试Python代码。本研究由韩国国家研究基金会2017R1A5A2015369（K.-h.Y.）和2019R1C1C1008708（K.-h.Y.）赞助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dish | SPL | #10035 | |
| Bacto agar | BD | #214010 | |
| Bacto Peptone | BD | #211677 | |
| CaCl2 | DAEJUNG | 2507-1400 | |
| Cholesterol | BioBasic | CD0122 | |
| Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | JUNSEI | 84120-0350 | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| King B Broth | MB cell | MB-K0827 | |
| LED light box multi-pad | Artmate | N/A | This is a USB powered, LED light pad for tracing and drawing purposes. Artmate is a Korean brand, but searching for "LED light box for tracing" in any search engine should yield numerous options from other brands. Overall dimension is around 9" x 12" (A4 size). For example, from amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox&qid=1674183224&sprefix =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270&sr=8-5&th=1 |
| MgSO4 | DAEJUNG | 5514-4400 | |
| Plastic paper sleeve (clear) | Smead | #85753 | Any clear plastic sheet with a bit of stiffness can be used as stage. For example, from Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8 |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | JUNSEI | 84185-0350 | |
| Power strip | To accommodate 3 phones and one LED box, you need at least 4 outlets. | ||
| Smartphone | N/A | N/A | Minimum requirement: 12MP wide camera, 1080p HD video recording at 30fps |
| Sodium chloride(NaCl) | DAEJUNG | #7548-4100 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | YAKURI | #31727 |
References
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