Summary
כאן אנו מציגים בפירוט התאמה של טכניקת לכידת קונפורמציית הכרומוזומים (3C) עם דגש על מעורבות ולמידה לתואר ראשון.
Abstract
לכידת קונפורמציה של כרומוזומים (3C) היא כלי רב עוצמה שהוליד משפחה של טכניקות דומות (למשל, Hi-C, 4C ו-5C, המכונות כאן טכניקות 3C) המספקות מידע מפורט על הארגון התלת-ממדי של כרומטין. טכניקות 3C שימשו במגוון רחב של מחקרים, החל מניטור השינויים בארגון הכרומטין בתאים סרטניים ועד לזיהוי מגעים משפרים שנעשו עם מקדמי גנים. בעוד שרבים מהמחקרים המשתמשים בטכניקות אלה שואלים שאלות גדולות ברחבי הגנום עם סוגי דגימות מורכבים (כלומר, אנליזה של תא יחיד), מה שהולך לאיבוד לעתים קרובות הוא שטכניקות 3C מבוססות על שיטות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות הישימות למגוון רחב של מחקרים. על ידי התייחסות לשאלות ממוקדות היטב של ארגון הכרומטין, ניתן להשתמש בטכניקה חדשנית זו כדי לשפר את חוויית המחקר וההוראה לתואר ראשון. מאמר זה מציג פרוטוקול 3C ומספק התאמות ונקודות דגש ליישום במוסדות לתואר ראשון בעיקר בהתנסויות מחקר והוראה לתואר ראשון.
Introduction
הגנום של אורגניזם מכיל לא רק את כל הגנים הדרושים לתפקוד, אלא גם את כל ההוראות כיצד ומתי להשתמש בהם. זה הופך את ויסות הגישה לגנום לאחד התפקידים החשובים ביותר של התא. ישנם מנגנונים רבים לשליטה בתפקוד הגנים; עם זאת, ברמת הבסיס שלו, בקרת גנים מסתכמת ביכולתם של גורמי שעתוק רגולטוריים (טרנס-פקטורים) להיקשר לרצפי הדנ"א הספציפיים שלהם (רצפי CIS-Regulatory ). זו אינה יכולת מולדת; במקום זאת, הוא נשלט על ידי הארגון/המבנה של הגנום בגרעין, אשר שולט על זמינות/חשיפה של רצפי CIS-regulatory לגורמים טרנס-פקטוריים 1,2,3. אם הגורמים הטרנס-פקטוריים אינם יכולים למצוא את הרצפים הרגולטוריים שלהם, אז הטרנס-פקטורים אינם יכולים לבצע את משימות הרגולציה שלהם. עובדה זו הפכה את הבנת האופן שבו גנומים מאורגנים בגרעין למקור חשוב לחקירה.
מקובל שבמהלך שלב הביניים, כרומוזומים אאוקריוטים בגרעין תופסים תחום משלהם המעוגן ללמינה הגרעינית ולמטריצה הגרעינית (איור 1), מה שהופך את הכרומוזום לדומה יותר לפרוסת פיצה, ולא לאטריות על צלחת ספגטי. הכרומוזומים מעובים חלקית על ידי אינטראקציות חלבון-דנ"א (כרומטין) המסובבות ולולאות חלקים של הכרומוזום. באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, פלואורסצנטיות DNA תלת-ממדית בהכלאה באתרו (FISH), וטכניקות תיוג DNA (כלומר, מתילציה פלואורסצנטית ומלאכותית של DNA), נמצאו תחומים לא פעילים של כרומטין דחוסים בצפיפות לאורך הפריפריה הגרעינית 4,5,6, בעוד חלקים של כרומטין פעיל ופחות מעובה נמצאים בחלק הפנימי של הגרעין 7,8,9, 10. ניסויים אלה מספקים זווית ראייה רחבה של דינמיקת הכרומוזומים, אך עושים מעט כדי ללכוד את השינויים המתרחשים באופן מקומי סביב מנועי הגן שנצפו במחקרי DNase11,12 ונוקלאוזומים13,14,15.
המפתח לשחרור דינמיקת כרומטין ברזולוציה גבוהה יותר היה ניסוח טכניקת מיפוי הכרומוזומים התלת-ממדית, 3C. טכניקת 3C עצמה כוללת ארבעה שלבים עיקריים: קישור צולב של כרומטין, עיכול כרומטין על-ידי אנזימי הגבלה, קשירת כרומטין וטיהור דנ"א (איור 2). לאחר מכן ניתן לאפיין את מקטעי הדנ"א המלאכותיים החדשים שנוצרו בתהליך זה כדי לחשוף את הקשר הפיזיקלי ההדוק בין פיסות דנ"א מרוחקות ליניארית16. טכניקת 3C הפכה לבסיס ליצירת טכניקות ספין-אוף מרובות המשתמשות בשלבים הראשונים של 3C כדי לשאול שאלות רחבות יותר ברחבי הגנום (למשל, Hi-C, 4C, ChIP-C). משפחה זו של טכניקות 3C זיהתה כי כרומוזומים מאורגנים במספר יחידות בדידות הנקראות תחומים הקשורים טופולוגית (TADs). TADs מקודדים בגנום ומוגדרים על ידי לולאות כרומטין שמשני צדיהן גבולות לא לולאתיים 16,17,18,19. גבולות TAD נשמרים על ידי שני גורמים שמורים אבולוציונית הנמצאים בכל מקום, כולל גורם קשירת CCCT (CTCF) ולכידות, המונעים מלולאות בתוך TADs נפרדים מאינטראקציה16,20. הלולאות מתווכות על ידי אינטראקציה של טרנס-פקטורים עם הרצפים הרגולטוריים שלהם, כמו גם CTCF ולכידות21.
למרות שמחקרים רבים המשתמשים בטכנולוגיות 3C שואלים שאלות רחבות היקף בגנום ומשתמשים בטכניקות איסוף דגימות מסובכות, ניסוח טכניקת 3C מבוסס על טכניקות בסיסיות של ביולוגיה מולקולרית. זה הופך את 3C למסקרן לפריסה הן במעבדות מחקר לתואר ראשון והן במעבדות הוראה. ניתן להשתמש בטכניקת 3C עבור שאלות ממוקדות קטנות יותר והיא גמישה מטבעה להרחבה או למטה (גנים בודדים22, כרומוזומים16 ו / או גנומים18) בהתאם למיקוד ולכיוון של השאלות שנשאלו. טכניקה זו יושמה גם על מגוון רחב של מערכות מודל 7,16,19,23 והוכחה להיות תכליתי בשימוש בו. זה עושה 3C טכניקה מצוינת עבור סטודנטים לתואר ראשון כי התלמידים יכולים לצבור ניסיון בטכניקות ביולוגיה מולקולרית משותפת תוך גם צובר ניסיון רב ערך לענות על שאלות מכוונות.
מוצג כאן פרוטוקול מותאם להכנת ספריית 3C המבוסס על פרוטוקולים 24,25,26,27 שפורסמו בעבר. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לכ- 1 × 107 תאים, אם כי הוא יצר ספריות 3C עם מעט כמו 1 × 105 תאים. פרוטוקול זה הוכח כרב-תכליתי ושימש ליצירת ספריות 3C מעוברים של דגי זברה, קווי תאים של דגי זברה ותולעת עגולה (Caenorhabditis elegans) של מבוגרים צעירים (YA). הפרוטוקול צריך להתאים גם לשורות תאים של יונקים, ועם הסתגלות נוספת, שמרים.
מטרת התאמות אלה היא להפוך את 3C לנגיש יותר עבור סטודנטים לתואר ראשון. הקפיד להשתמש בטכניקות דומות לאלה שניתן להשיג במעבדת הוראה לתואר ראשון. טכניקת 3C מספקת הזדמנויות למידה רבות לסטודנטים לתואר ראשון ללמוד טכניקות ביולוגיה מולקולרית בסיסיות שיועילו להתפתחותם על הספסל, בכיתה ובמאמציהם לאחר סיום הלימודים.
Protocol
1. עיצוב פריימר
הערה: כלי העיצוב של פריימרים 3C זמינים באינטרנט28. לחילופין, ניתן לעצב פריימרים מותאמים אישית על ידי התלמידים (ראו בהמשך).
- זיהוי מיקומי פריימר
- פתח את דפדפן הגנום של UCSC (http://genome.ucsc.edu/), בחר את אורגניזם המחקר וחפש באזור הגנום שיש להעריך באמצעות 3C.
- בחלון הבא, הפעל את מסלול האנזימים בכרטיסייה מיפוי ורצף מתחת לדפדפן על ידי לחיצה על Restr Enzymes.
- הזן את אנזימי ההגבלה שבהם יש להשתמש והגדר את מצב התצוגה לארוז. לחץ על שלח.
- בווריאציה ובחזרות, ודא ש- RepeatMasker מוגדר לצפיפות.
- באמצעות אתרי ההגבלה כמדריכים, זהה אתרים מעניינים שאינם בתוך האזורים החוזרים במסכה (פסים שחורים). סמן 300 זוגות בסיסים (bp) המאגפים הן את רצף המעלה והן את הרצף במורד הזרם המקיף את אתר ההגבלה על ידי לחיצה על המיקום (הרצועה העליונה) וגרירה לאורך הרצוי (~ 600 bp).
- שחרר את העכבר ותופיע תיבה מוקפצת. שימו לב למיקום הגנומי, לחצו על התקרבות ותנו לדפדפן להתאים את עצמו לבחירה.
- רחף עם העכבר מעל הכרטיסיה תצוגה ברצועת הכלים העליונה של הדפדפן ובתפריט הנפתח, בחר DNA.
- השאר את אפשרות ברירת המחדל, שים לב לייעוד של רצפים מסיכה (יש אפשרות להפוך אותם N). לחץ על קבל DNA.
- לאחר מכן הרצף המסומן יוצג בחלון. העתק והדבק רצף זה לתוך Primer3 (https://primer3.ut.ee/).
- באמצעות הגדרות ברירת המחדל של Primer3, צור פריימרים על ידי לחיצה על בחירת פריימרים.
- בתוצאות, שימו לב למיקום אנזים ההגבלה, ובחרו פריימרים שיוצרים מוצר PCR של 200-500 bp עם אתר ההגבלה הממוקם באמצע.
- לאחר שלבים אלה, בדיקת עיצוב פריימרים 1 קילו-בסיס (kb), 2 kb, 5 kb, 10 kb ו-20 kb מהאתר(ים) המעניינים.
- כדי לעצב את הפריימרים של בקרת הקלט, חזור על שלבים אלה עבור אתר 1-2 kB מהאתר המעניין שאין בו אתר הגבלה, כלומר הוא לעולם לא נחתך.
- אימות פריימר פונקציונלי
- כדי לאמת את פונקציונליות הפריימר, הגדר תגובות PCR באמצעות ריכוזי פריימר מטוהרים ו- DNA גנומי מטוהר. בין אם באמצעים כמותיים או כמותיים למחצה, לקבוע אם פריימרים ליצור את המוצר הצפוי.
- עצבו מחדש פריימרים שנכשלים באימות.
2. יום 1
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול (להקפיא ב -20 ° C) לאחר קישור צולב כרומטין ולאחר איסוף גרעינים. הצעדים לוקחים, בממוצע, 5-6 שעות עם סטודנטים לתואר ראשון.
- אוסף גרעיני C. elegans למבוגרים צעירים (מעובד מ-Han et al.29)
- קרוסלינקינג כרומטין
- אספו 5,000 תולעי YA ב-30 מ"ל של M9 בינוני בצינור חרוטי של 50 מ"ל, והסתובבו ב-400 × גרם במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- שטפו את גלולת התולעת פי 3 יותר עם M9 כדי להסיר חיידקים.
- מוציאים את הסופרנטנט, משעים מחדש את גלולת התולעת ב-47.3 מ"ל של M9 המכיל 2.7 מ"ל של 37% פורמלדהיד (2% סופי), ודגרים עם תסיסה (נדנוד או אגוז) למשך 30 דקות ב-RT.
אזהרה: יש לטפל בפורמלדהיד בזהירות, ולעבוד תחת מכסה אדים עם ציוד מגן אישי מתאים (מעיל PPE-lab, כפפות מתאימות והגנה על העיניים). פורמלדהיד הוא חומר מגרה שמשפיע על העיניים, האף, הגרון והריאות. - סובבו את התולעים ב 400 × גרם במשך 2 דקות ב RT.
- הסר את supernatant, ו resuspend את גלולת התולעת ב 50 מ"ל של 1 M גליצין. סובבו את התולעים ב 400 × גרם במשך 2 דקות ב RT.
- אוסף גרעינים
- יש להשהות מחדש את כדורית התולעת ב-6 מ"ל של מאגר NP מקורר (50 mM HEPES ב-pH 7.5, 40 mM NaCl, 90 mM KCl, 2 mM EDTA, 0.5mM EGTA, 0.1% Tween 20, 0.2 mM DTT, 0.5 mM זרע, 0.25 mM זרע, 1x מעכב פרוטאז מלא).
- מעבירים את מתלה התולעת ל-Dounce רופף בנפח 7 מ"ל על קרח. מקפיצים את הדגימה פי 15, ומחזיקים קרח למשך 5 דקות.
- מעבירים את מתלה התולעת ל-Dounce צמוד של 7 מ"ל על קרח. הקפיצו את הדגימה פי 20, והחזיקו קרח למשך 5 דקות.
- מעבירים את מתלה התולעת לצינור חרוטי נקי של 15 מ"ל, ומוסיפים חיץ NP ל-10 מ"ל בסך הכל (כ-4 מ"ל).
- מערבול את מתלה התולעת על הגדרה גבוהה במשך 30 שניות. לדגור את הדגימה על קרח במשך 5 דקות.
- חזור על השלב הקודם.
- סובב את תרחיף התולעת ב 100 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חרוטי טרי בנפח 15 מ"ל.
- בדוק את הדגימה עבור פסולת תולעת. דמיינו 10 μL של הדגימה עם מיקרוסקופ אור. אם קיימת פסולת תולעת, סובבו את הדגימה בטמפרטורה של 2,000 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C, השהו מחדש את הגלולה במאגר NP טרי של 10 מ"ל, וסובבו את הדגימה שוב ב-100 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C. השליכו את הכדורית, בדקו אם יש שאריות תולעים וחזרו על הפעולה עד שהדגימה נקייה משאריות תולעים.
הערה: לחלופין, ניתן להסיר את פסולת התולעת גם על ידי מאמץ הדגימה דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר (6x) ואחריה מסננת תאים של 20 מיקרומטר (6x). - אם הדגימה נקייה מפסולת תולעים, קח 5 μL מהדגימה, הוסף 5 μL של פירונין ירוק מתיל (הגרעינים יהיו כחולים), וספור את הגרעינים עם המוציטומטר.
- סובבו את הדגימה בטמפרטורה של 2,000 × למשך 5 דקות ב-4°C
- הסר את supernatant, להניח את הדגימות על קרח, ולהמשיך; לחלופין, הקפיאו את הגרעינים בהצמדה, ואחסנו בטמפרטורה של -80°C.
- קרוסלינקינג כרומטין
- עיכול כרומטין
- להשהות מחדש את הגרעינים ב 450 μL של מים נקיים. מעבירים את הגרעינים לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בנפח 1.5 מ"ל.
- לדגימה הצולבת, הוסף 60 μL של מאגר אנזים הגבלה 10x DpnII, וערבב היטב.
הערה: ניתן להשתמש באנזימי הגבלה אחרים שעדיין חותכים DNA מוצלב. - הוסף 15 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) כדי לחלחל את הגרעינים, ודגר עם תסיסה (נדנוד או אגוז) ב 37 ° C במשך 1 שעה.
אזהרה: SDS הוא חומר מגרה והוא רעיל אם הוא נבלע או נספג דרך העור. יש לטפל בזהירות ולהשתמש בציוד הגנה אישי מתאים (מעיל מעבדה, כפפות מתאימות והגנה על העיניים). - להרוות את SDS על ידי הוספת 75 μL של 20% Triton X-100 ולדגור עם תסיסה ב 37 ° C במשך 1 שעה.
- קח 10 μL מהדגימה כבקרה לא מעוכלת. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- הוסף 400 U של DpnII, ודגור ב 37 ° C במשך הלילה עם תסיסה.
3. יום 2
הערה: בממוצע, לוקח לסטודנטים לתואר ראשון 5 שעות להשלים שלבים אלה.
- עיכול כרומטין
- הוסף 200 U נוספים של DpnII, ודגר על הדגימות במשך 4 שעות ב 37 ° C עם תסיסה כדי להבטיח את העיכול המלא של הדגימה מוצלבת.
- קח aliquot 10 μL מן הדגימות כמו בקרת העיכול.
- נטרל בחום את אנזים ההגבלה על ידי דגירה של הדגימה למשך 20 דקות בטמפרטורה של 65°C (או בהתאם להוראות היצרן). המשך לשלב 2.1.3.
- אם לא ניתן להשבית את האנזים על ידי חום, יש להוסיף 80 μL של 10% SDS, ולדגור על הדגימה במשך 30 דקות בטמפרטורה של 65°C. לאחר מכן, הוסיפו 375 μL של 20% Triton X-100, וערבבו על ידי ערבול. לדגור את הדגימה במשך 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס, ולהמשיך לשלב 2.2.
- קשירת כרומטין
- מעבירים את הדגימה לצינור חרוטי נקי של 50 מ"ל, מתאימים את נפח הדגימה ל-5.7 מ"ל עם H2O ברמה מולקולרית, ומערבבים על ידי ערבול.
- הוסף 700 μL של 10x T4 Ligase buffer, וערבב על ידי ערבול.
- הוסף 60 U של T4 DNA Ligase, וערבב על ידי ערבול.
- לדגור לילה ב 16 °C (75 °F).
4. יום 3
הערה: בממוצע, לוקח לסטודנטים לתואר ראשון 15-30 דקות להשלים שלבים אלה. לאחר הדגירה הלילית ניתן להקפיא את הדגימות.
- עיכול חלבונים וקישור הפוך
- הוסף 30 μL של proteinase K (10 מ"ג / מ"ל) לדגימה 3C, ודגור ב 65 ° C לילה עם תסיסה. יש להוסיף 5 μL של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל) לבקרת העיכול והלא מעוכל, ולדגור ב-65°C למשך הלילה עם תסיסה.
5. יום 4
הערה: בממוצע, לוקח לסטודנטים לתואר ראשון 4-5 שעות להשלים שלבים אלה.
- טיהור ספריית 3C
- הוסף 30 μL של RNase A (10 מ"ג / מ"ל) לדגימה 3C, ומערבל כדי לערבב. לדגור את הדגימה במשך 45 דקות ב 37 ° C.
- מוסיפים 7 מ"ל פנול-כלורופורם לדגימה, ומערבבים על ידי ניעור.
אזהרה: פנול-כלורופורם מגרה את העור ואת העיניים ועלול לגרום לכוויות אם לא מטפלים במגע. יש להשתמש בפנול-כלורופורם במכסה אדים עם הגנה מתאימה לעיניים וכפפות (ניטריל). - צנטריפוגה את הדגימה במשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב RT. לאסוף את הפאזה המימית, ולהעביר צינור חרוטי נקי 50 מ"ל. מוסיפים כמויות שוות של כלורופורם, ומערבבים את הדגימה על ידי ניעור.
- צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב RT. לאסוף את הפאזה המימית, ולהעביר צינור חרוטי נקי 50 מ"ל. הוסף 7.5 מ"ל של H2O ברמה מולקולרית, 35 מ"ל של 100% אתנול, ו (אופציונלי) 7 מיקרוליטר של גליקוגן (1 מ"ג / מ"ל). מערבבים על ידי ניעור, ודגרים ב -80 מעלות צלזיוס עד הדגימה מוקפאת.
הערה: ייתכן שיחלפו שעה או יותר עד שהדגימה תקפא. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.- בזמן שדגימת 3C קופאת, טהרו את דגימות הבקרה. לדגימות הבקרה, כוונן את עוצמת הקול ל- 500 μL באמצעות מים ברמה מולקולרית, והוסף 2 μL של תערובת RNase A (10 מ"ג / מ"ל) על ידי הזזת הצינור.
- סובב בקצרה כדי לאסוף את הדגימה בתחתית הצינור. לדגור את הדגימות במשך 45 דקות ב 37 ° C.
- לדגימות הבקרה, להוסיף 1 מ"ל של פנול-כלורופורם, ולערבב על ידי ניעור הצינורות. צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב RT. לאסוף את השלב המימי של הפקדים, ומניחים בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי 1.5 מ"ל.
- מוסיפים כמויות שוות של כלורופורם, ומערבבים את הדגימה על ידי ניעור. צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב RT. לאסוף את השלב המימי של הפקדים, ומניחים בצינור מיקרוצנטריפוגה נקי 1.5 מ"ל.
- הוסף 1 מ"ל של 100% אתנול ו 2 מיקרוליטר של גליקוגן (1 מ"ג / מ"ל). מערבבים על ידי ניעור ודגרים בטמפרטורה של -80°C למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה את הדגימה במשך 15 דקות ב 3,270 × גרם ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולהוסיף 750 μL של אתנול 70% מקורר.
- צנטריפוגה את הדגימה במשך 10 דקות ב 3,270 × גרם ב 4 ° C. מוציאים את הסופרנטנט, ומייבשים את הדגימות באוויר. השהה מחדש את הגלולה ב 50 μL של כיתה מולקולרית H2O. להקפיא, או להמשיך לשלב 6.
- צנטריפוגה את הדגימה במשך 60 דקות ב 3,270 × גרם ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולהוסיף 10 מ"ל של אתנול 70% מקורר. לשבש ולפרק את גלולת הדנ"א על ידי ניעור הדגימה כדי לערבב.
- צנטריפוגה הדגימה במשך 30 דקות ב 3,270 × גרם ב 4 ° C. הסר את supernatant, ולאפשר את הדגימה להתייבש חלקית באוויר ב RT. להשהות מחדש את הגלולה ב 150 μL של 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) על ידי pipeting למעלה ולמטה. זוהי "ספריית 3C".
הערה: הקפא את הדגימה או המשך לניתוח.
6. יום 5
הערה: בממוצע, לוקח לסטודנטים לתואר ראשון 1-2 שעות להשלים שלבים אלה.
- קביעת איכות הדגימה באמצעות העקומה הסטנדרטית של פריימר הבקרה
- לכמת את ריכוז הדנ"א עבור דגימת 3C, כמו גם את כל הבקרות, ולהתאים את הדגימות ל 30 מיקרוגרם / μL (אם הריכוזים מאפשרים זאת). באופן סדרתי הדגימות המדוללות פעמיים ארבע פעמים, והתוצאה היא חמישה דילולים לכל דגימה (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x).
הערה: אם לא ניתן לבצע כימות בקלות, דלל סדרתית את הדגימות כפי שצוין לעיל והמשך. - הגדר תגובות PCR עבור 3C, בקרה גנומית ובקרה מעוכלת עבור כל דגימה מדוללת עם פריימרים בקרה: 1 μL של DNA, 10 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של 10 mM פריימר בקרה (מעורב קדימה ואחורה), 1 μL של Taq פולימראז, ו 36 μL של מים.
- בהתאם להוראות עבור התוכנה הספציפית למכונת ה- PCR, הגדר את תוכנית PCR העקומה הסטנדרטית באמצעות תנאי רכיבה כדלקמן: 30 שניות ב- 98 ° C; 30 מחזורים של 5 שניות ב 98 ° C, 5 s ב 60 °C, ו 10 s ב 72 °C (72 °F); 1 דקות ב 72 ° C; החזקה של 4°C.
- באמצעות התוכנה, ליצור את העקומות הסטנדרטיות עבור הדגימות. לאחר שהתוכנה יוצרת את העקומה, שים לב ליעילות PCR ולערך R2 .
- לכמת את ריכוז הדנ"א עבור דגימת 3C, כמו גם את כל הבקרות, ולהתאים את הדגימות ל 30 מיקרוגרם / μL (אם הריכוזים מאפשרים זאת). באופן סדרתי הדגימות המדוללות פעמיים ארבע פעמים, והתוצאה היא חמישה דילולים לכל דגימה (1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x).
- קביעת ריכוז ה- DNA
- כדי לקבוע את ריכוז הדנ"א של דגימות 3C, השוו את הדגימות לדגימת DNA גנומית בריכוז ידוע. דללו את הדגימות ל-30 ננוגרם/מיקרוליטר, ודללו סדרתית את הבקרה הגנומית מ-10 ננוגרם/מיקרוליטר ל-0.01 ננוגרם/מיקרוליטר בצעדים כפולים ליצירת עקומה סטנדרטית.
הערה: אם לא ניתן לבצע כימות בקלות, דלל את הדגימה ביחס 1:10 והמשך. - הגדר את תגובות ה- PCR עבור 3C, בקרה גנומית ובקרה מעוכלת עבור כל דגימה מדוללת עם פריימרים של הבקרה: 1 μL של DNA, 10 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של 10 mM פריימר בקרה (מעורב קדימה ואחורה), 1 μL של Taq פולימראז, ו 36 μL של מים.
- בהתאם להוראות עבור התוכנה הספציפית למכונת PCR, הגדר את תוכנית PCR העקומה הסטנדרטית באמצעות תנאי הרכיבה כדלקמן: 30 שניות ב- 98 ° C; 30 מחזורים של 5 שניות ב 98 ° C, 5 s ב 60 °C, ו 10 s ב 72 °C (72 °F); 1 דקות ב 72 ° C; החזקה של 4°C.
- באמצעות התוכנה, ליצור את העקומות הסטנדרטיות עבור הדגימות, שרטוט דגימות 3C על העקומה. השוו את מיקום שפע דגימות 3C לעקומה הסטנדרטית שנוצרה על ידי תגובות הדנ"א הגנומי בריכוז ידוע, והתאימו את דגימות 3C ל-30 ננוגרם/מיקרוליטר.
- כדי לקבוע את ריכוז הדנ"א של דגימות 3C, השוו את הדגימות לדגימת DNA גנומית בריכוז ידוע. דללו את הדגימות ל-30 ננוגרם/מיקרוליטר, ודללו סדרתית את הבקרה הגנומית מ-10 ננוגרם/מיקרוליטר ל-0.01 ננוגרם/מיקרוליטר בצעדים כפולים ליצירת עקומה סטנדרטית.
- קביעת נוכחות או היעדר אינטראקציה כרומטין
- הגדר תגובות qPCR עם 30 ng של דגימת 3C, דגימת בקרה גנומית ודגימת בקרה מעוכלת: 1 μL של DNA, 10 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של פריימר 10 mM (מעורב קדימה ואחורה), 1 μL של Taq פולימראז, ו 36 μL של מים.
הערה: יש להגדיר את התגובות באמצעות פריימר הבקרה, פריימרים לבדיקה עבור loci גנומי בודד, ושילובים רצויים של פריימרים לבדיקה (אתר "a" קדימה ואתר "b" הפוך) המשמשים לקביעת אינטראקציית הכרומטין (איור 3). - בהתאם להוראות התוכנה של מכונת ה- PCR, הגדר את תוכנית ה- PCR כדלקמן: 30 שניות ב- 98 °C; 40 מחזורים של 5 שניות ב 98 ° C, 5 s ב 60 °C, ו 10 s ב 72 °C (72 °F); 1 דקות ב 72 ° C; החזקה של 4°C.
- לאחר הפעלת ה- PCR, בדוק את חלקת ההגברה. ודא שתגובות ה-PCR מציגות הגברה אקספוננציאלית, המכפילה את עצמה בכל מחזור.
הערה: תגובות שאינן מציגות הגברה מעריכית אינן ניתנות לניתוח נוסף. - בהתאם להוראות התוכנה של מכונת ה- PCR, הגדר את סף ניסוי ה- qPCR.
- יצא את ערכי Ct עבור כל הדגימות.
- קבע את יעילות העיכול באמצעות פריימר הבדיקה (TP) ופריימר הבקרה (CP) ערכי Ct מדגימות הבקרה הלא מעוכלת (UC) והבקרה המעוכלת (DC) באמצעות משוואה (1).
אחוז מעוכל = 100 -
(1) - ערכים אלה צריכים להיות בטווח של 80%-90% עיכול. רשום את הערכים האלה (איור 4A).
- קבע את אינטראקציית הכרומטין היחסית באמצעות שילוב פריימר הבדיקה (TPC) ופריימר הבקרה (CP) ערכי Ct מדגימות הבקרה הלא מעוכלת (UC) ומדגימות 3C (3C) באמצעות משוואה (2).
אינטראקציה כרומטין = 100 -
(2) - התווה את הערכים של כל דגימה בתרשים עמודות לכל שילוב פריימר בדיקה.
- השווה את האות של דגימות 3C לדגימות הבקרה כדי לקבוע אם לדגימת 3C יש העשרה של אינטראקציה כרומטין מסוימת על דגימות הביקורת. דגימות 3C שמראות העשרה על פני הבקרה יכולות להיחשב חיוביות מותנות ודורשות אימות באמצעות ריצוף Sanger (איור 4B).
הערה: בעת ניתוח נתוני הגרף, חשוב לזכור כי אם לא נעשה שימוש ב"תבנית בקרה" (ראה דיון), לא ניתן להשוות את השפע בין תגובות (כלומר, מקבוצת פריימרים אחת לאחרת).
- הגדר תגובות qPCR עם 30 ng של דגימת 3C, דגימת בקרה גנומית ודגימת בקרה מעוכלת: 1 μL של DNA, 10 μL של 5x מאגר תגובה, 1 μL של 10 mM dNTPs, 1 μL של פריימר 10 mM (מעורב קדימה ואחורה), 1 μL של Taq פולימראז, ו 36 μL של מים.
- זיהוי מוצרי 3C
- הפעל את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 1.5%.
- דמיינו את הג'ל לגודל הנכון של מוצרי ה-PCR באמצעות קופסת אור UV או מערכת תיעוד ג'ל.
הערה: ספריות 3C בנויות היטב יכילו מגוון רחב של מקטעי דנ"א, ולמרות אימות קודם של הפריימרים לספציפיות, לתגובות PCR מספריות 3C יש פוטנציאל להכיל פסים רבים (איור 5A). זה לא מונע את הניתוח של ספריות 3C. - הבלו את רצועות המוצרים המתאימות לגודל הקטע הצפוי, ובצעו מיצוי ג'ל של מוצרי PCR בהתאם להוראות ערכה מסחרית או פרוטוקול תוצרת בית המפורט להלן.
זהירות: אור UV הוא מסרטן ידוע, ויש לנקוט בזהירות רבה כדי להגביל את זמן החשיפה לאור UV. יש ללבוש מגן עיניים עמיד בפני UV, מגן דגימה, כפפות ומעיל מעבדה.- כדי לבנות מחסנית טיהור תוצרת בית, לדקור חור בתחתית של צינור 0.5 מ"ל עם מחט.
- ארוז כמות קטנה של כותנה מכדור צמר גפן לתוך החלק התחתון של צינור 0.5 מ"ל, מילוי לא יותר ממחצית הצינור.
- מקם את הצינור 0.5 מ"ל לתוך צינור 1.5 מ"ל; ודא שהצינור הקטן יותר מונח על שפת הצינור הגדול יותר, ולא בתוך הצינור.
- בזהירות לחתוך קטע ג'ל לחתיכות קטנות יותר, ומניחים אותו בצינור 0.5 מ"ל של המחסנית.
- הכניסו את המכלול למקפיא בטמפרטורה של 20°C למשך 5 דקות. סובב את ההרכבה במשך 3 דקות ב- 13,000 × גרם ב- RT.
- שמור את הצינור 1.5 מ"ל עם ה- DNA שחולץ בחיץ, והפטר את הצינור 0.5 מ"ל המכיל את פסולת האגרוז.
- ניתן לשלוח דנ"א מטוהר לריצוף סנגר באמצעות פריימרים קדימה ואחורה עבור מקטע 3C.
- זיהוי מגעי כרומטין באמצעות Blat
- עם השלמת הריצוף, יש לקבוע אם הדגימות עומדות בתקני בקרת האיכות כפי שמצוין בדו"ח הריצוף.
- עבור רצפים העוברים את ה- QC, פתח קבצי .seq ו- .ab1 (מעקב) בתוכנית עריכת רצף כגון Another Plasmid Editor (ApE), בדוק את קובץ ה- .ab1 לאיתור פסגות קריאות בסיסיות ברורות, וערוך את הפסגות שנקראו בטעות בקובץ .seq.
- באמצעות קובץ ה- .seq הערוך, חפש את אתר DpnII. בהתאם לתוצאת הרצף, זה צריך להיות באמצע הדרך לתוך הרצף המדווח.
- כדי לקבוע אם הרצף הוא רצף המטרה הצפוי, סמן את אתר DpnII ועוד 30-50 bp של הרצף במעלה הזרם המתאים לפריימר הקדמי של האתרים הגנומיים שנבדקו עבור 3C. בצע חיפוש של רצף זה כנגד מין היעד. ודא שהאתרים הגנומיים תואמים לאלה של הפריימר.
- חזור על השלב לעיל עבור רצף הפריימר ההפוך, וודא שהמוקד הגנומי שהוחזר תואם לזה של הפריימר ההפוך.
(1)
(2)Representative Results
הליך זה יפיק דגימת 3C ניסיונית אחת ושתי דגימות ביקורת (לא מעוכלות ומעוכלות). באמצעות שלוש דגימות אלה, qPCR בוצע. מתוצאות אלה חושבה יעילות העיכול (משוואה 1) ונרשמה (טבלה 1). מחישובים אלה נקבע כי לדגימת 3C הייתה יעילות עיכול של כ-88% (ממוצע של טבלה 1) בשבעת האתרים הגנומיים שנבדקו.
לאחר מכן, הדגימות נבדקו לנוכחות של מגעי כרומטין ארוכי טווח בין האתרים הגנומיים השונים באמצעות שילובים של פריימרים ספציפיים ללוקי (טבלה 2) ו-qPCR. באמצעות תוצאות אלה חושבו כמויות המכפלה ביחס לערכת פריימר בקרה (משוואה 2) וגרפים להשוואה (איור 4). נתונים אלה הצביעו על כך ש-8 מתוך 10 התגובות היו חיוביות מותנות לאינטראקציות ארוכות טווח.
תגובות ה-PCR הופעלו אז על ג'ל אגרוז. מוצר ה-PCR הצפוי עבור שמונת החיוביים המותנים ותגובה שלילית אחת טוהר בג'ל ונשלח לריצוף סנגר. התוצאות עבור תגובות חיוביות מייצגות (חץ כחול, תיבה כחולה) ושליליות (חץ אדום, תיבה אדומה) מוצגות (איור 5).
איור 1: מבנה הכרומוזומים בגרעין. ארגון כרומוזומים היפותטי בתוך הגרעין. (א) מעטפת גרעינית, קווים שחורים; (ב) למינה גרעינית, כתומה; (C) הטרוכרומטין, קווים דחוסים; (D) אוכרומטין, לולאות רופפות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סכמה של פרוטוקול 3C. חלקים מרוחקים של כרומוזומים ליניאריים (כחול, צהוב וורוד) מתקרבים זה לזה בתוך הגרעין באמצעות לולאות רגולטוריות. (A) מבני הלולאה מתווכים על ידי גורמי שעתוק (עיגול אפור וכוכב שחור); אינטראקציות אלה נשמרות באמצעות הצלבה כימית. (B) הלולאות נשברות באמצעות עיכול אנזימטי (קווים שחורים). (C) חתיכות כרומטין מרוחקות קשורות זו לזו דרך הקצוות הדביקים שנוצרו על-ידי העיכול. (D) דנ"א מטוהר מחלבון. (E) הרצף בתוך המקטעים מזוהה וממופה חזרה לגנום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סכימת פריימר 3C. פריימרים 3C מתוכננים סביב אתרי הגבלה במרחקים משתנים מהמיקום הגנומי המעניין. החצים הוורודים מייצגים את ערכות הפריימר הניסיוניות המקיפות אתר DpnII. ניתן לערבב ולהתאים את הפריימרים הניסיוניים כדי להעריך את לולאת הכרומטין באזור. הפריימרים הכתומים מייצגים בקרה שלילית ללא אתר DpnII. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נתוני qPCR מייצגים עבור ניסוי 3C. שפע יחסי של ערכות פריימר מבחן 3C. (A) גרף בקרה המציג את השפע היחסי של המוצר בדגימת הבקרה הלא מעוכלת (כחול), בקרה מעוכלת (אפור) ודגימת 3C (כתום). (ב) ניסוי 3ג; השפע היחסי של המוצר משילובים של פריימרים לבדיקה בקבוצת הבקרה הלא מעוכלת (כחול), בקרה מעוכלת (אפור) ודגימת 3C (כתום). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הדמיה של מוצרי 3C qPCR. למעלה, ג'ל עם מוצרי נקודת הקצה qPCR עם הדגימות שצוינו. למטה, מייצג קבצי מעקב רצף Sanger עבור התגובות שצוינו. הדגימה הכתומה היא דוגמה לתוצאה חיובית כוזבת (ראו איור 4, r38/34), והמדגם הכחול הוא דוגמה לתוצאה חיובית אמיתית עם אתר DpnII המצוין מעל העקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| אתר | % עיכול |
| ₪100 | 86.98 |
| ₪3 | 88.44 |
| ₪100 | 89.64 |
| ₪83 | 87.55 |
| ₪83 | 87.85 |
| ₪33 | 86.97 |
| ₪103 | 89.45 |
טבלה 1: יעילות עיכול מחושבת.
| שם | רצף | אתרים גנומיים | ||
| r3 FWD | ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC | chrX:11361475 | ||
| r3 RVS | TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC | chrX:11361561 | ||
| R38 FWD | TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC | chrX:5859700 | ||
| R38 RVS | AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG | chrX:5859775 | ||
| R34 FWD | ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG | chrX:5429702 | ||
| R34 RVS | AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC | chrX:5429777 | ||
| R33 FWD | AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC | chrX:6296704 | ||
| R33 RVS | TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG | chrX:6296807 | ||
| r14 FWD | AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG | chrX:8036367 | ||
| R14 RVS | ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCTCTC | chrX:8036427 | ||
| R47 FWD | ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC | chrX:9464939 | ||
| R47 RVS | AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC | chrX:9465064 | ||
| r8 FWD | GAGAATGTTGTGTGTAACTGAAAACTTG | chrX:11094257 | ||
| r8 RVS | TTACGAAATTTGGTTTTTTGGACC | chrX:11094362 | ||
| פריימר בקרה FWD | CAATCGTCTCGCTCACTTGTC | chrX:7608049 | ||
| בקרת פריימר RVS | GATGTGAGCAACAAGGCACC | chrX:7608166 | ||
טבלה 2: פריימרים לניסוי 3C מייצג.
Discussion
3C היא טכניקה רבת עוצמה המושרשת בטכניקות מולקולריות בסיסיות. זהו הבסיס הזה של כלים בסיסיים שהופך את 3C לטכניקה מסקרנת כל כך לשימוש עם סטודנטים לתואר ראשון. עם כל כך הרבה מחקרים עדכניים המתבוננים בדינמיקה של כרומטין בקנה מידה רחב כל כך, שימוש בתוצאות אלה כדי לתכנן ניסוי ממוקד צר על גן יחיד או אזור גנומי יש פוטנציאל ליצור ניסוי ייחודי ומשפיע במחקר לתואר ראשון. לעתים קרובות, ניסויים כאלה נחשבים מתקדמים מדי עבור סטודנטים לתואר ראשון, אבל עם תכנון זהיר, הם ניתנים להשגה בקלות. חשוב לציין כי הבדיקות שנועדו לחקור את קשרי הכרומטין שנלכדו על ידי ספריית 3C יכולות להשתנות מ- PCR כמותי למחצה לריצוף גנום שלם. למעשה, נתונים מנייר 3C הראשון16 נוצרו מ- qPCR. ניתן להשתמש במגוון רחב זה של בדיקות מכיוון שכל טכנולוגיות ה-3C מייצרות את אותו מוצר – ספרייה של מקטעי דנ"א המייצגים קשרים תלת-ממדיים בגרעין.
מוצג כאן התאמה של פרוטוקול גמיש יותר ומתאים יותר שמתאים יותר לחוקרים לתואר ראשון. תקופות ההשהיה המפורטות לעיל מרמזות על עיכובים של לילה; עם זאת, הפסקות אלה יכולות להימשך על פני סופי שבוע, ובמקרה של התאים והגרעינים, במשך שבועות. השיקול החשוב ביותר הוא מתי העבודה תתבצע. לעתים קרובות בפרוטוקולים, ישנם שלבים תלויי זמן כאשר השהיה אינה אופציה. מלבד כמה נקודות (יום 1 ויום 2), ישנם מקומות רבים לעצור ולהקפיא את הדגימה. אלה קריטיים כאשר עובדים עם סטודנטים לתואר ראשון, שבו לוחות הזמנים והתזמונים של עבודת המעבדה צריכים להיות גמישים. בנוסף להנדסת תחנות אלה לתוך הפרוטוקול, סטודנטים לתואר ראשון מעודדים לעבוד בזוגות או אפילו בקבוצות קטנות של שלושה או ארבעה. קבוצות עובדות היטב עבור פרוטוקול זה, מכיוון שהתלמידים יכולים לתמוך זה בזה וליצור מערכת חברים כך שכולם עובדים בבטחה. עבודת מעבדה היא גם מהנה יותר עם אחרים המעורבים. עם קבוצות, התלמידים יכולים גם לעבוד על מגוון רחב של שאלות המתמקדות בארגון הכרומטין תוך ביצוע אותו פרוטוקול. לכן, גם בזמן שהתלמידים עובדים על פרויקטים נפרדים, הפרוטוקול מקשר בין מאמציהם, ובגלל זה, הם יכולים לתמוך זה בזה.
התאמות אחרות נועדו לעקוף את העובדה שכלים וציוד מיוחדים מסוימים אינם נמצאים בהכרח בכל המוסדות לתואר ראשון. פריטי ציוד אלה כוללים אך אינם מוגבלים לתרמוסייקלרים qPCR, מערכות תיעוד ג'ל וספקטרומטרים של ננו נפח. ואכן, חלקים אלה של ציוד הם נוחים אבל הם לא דרישה. כאן, השיטה הקלאסית של 3C מתוארת גם בחלק עיצוב פריימר; זה כרוך בזיהוי מוקד עניין גנומי, ומתוך כך, הערכת מוקדים גנומיים אחרים עבור נקודות מגע כרומטין רחוקות יותר. טכניקה זו פועלת היטב גם אם נעשה שימוש במערך נתונים שפורסם, כגון מערך נתונים המשתמש ב- Hi-C, שבו מזוהים אתרים חיוביים (מתחברים) ושליליים ידועים (שאינם מתחברים). תכנון ניסויים באמצעות מערכי נתונים אלה שפורסמו הוא התאמה נהדרת נוספת עבור מעבדות הוראה, שכן הסיכוי לזיהוי מוצלח של קשרי כרומטין הוא בדרך כלל גדול יותר. בנוסף, ניתן לדון במאמר המחקר בכיתה ולשמש כאסמכתא.
פרוטוקול זה משתמש בגישת qPCR שונה כדי להמחיש את היווצרות המוצר 3C. בקרות חיוניות להצלחת טכניקת 3C. כל ניסוי משתמש הן בפקדי דגימה והן בבקרות פריימר כדי לקבוע את השלמת הליך 3C. בקרות הדגימה כוללות בקרה לא מעוכלת (DNA גנומי) ובקרה מעוכלת. הבקרה הלא מעוכלת קובעת את האות הבסיסי עבור ערכות הפריימר ומשמשת עם בקרת העיכול הצולבת כדי לקבוע את יעילות העיכול צפוי שתהיה ירידה במוצר עבור כל פריימר המופנה דרך אתר הגבלה. השוואת ערך זה לבקרה הלא מעוכלת מספקת אינדיקציה לכמה טוב הדגימה עוכלה.
הפריימרים ל-PCR כוללים פריימר בקרה ופריימרים לבדיקה. פריימר הבקרה הוא ערכת פריימר הקרובה לאזור הגנומי הנבדק ואינה מכילה אתר הגבלה. זה מספק את הבסיס לקביעת השפע של מוצרי PCR פריימר בדיקה. פריימרים לבדיקה הם פריימרים קדימה ואחורה שמאגפים אתר הגבלה עבור מוקד עניין גנומי מסוים (איור 3). תגובות באמצעות ערכות פריימר אלה מושוות כדי לקבוע את יעילות העיכול, כמו שפע המוצר צריך לרדת אם אתר ההגבלה נחתך. בקביעת ארגון הכרומטין, פריימר בדיקה אחד מלוקוס אחד מזווג עם פריימר בדיקה אחר ממוקד גנומי אחר כדי לקבוע אם שני מוקדים אלה קרובים זה לזה במרחב תלת-ממדי. במקרה כזה, הציפייה היא שמוצר PCR יימצא רק באמצעות דגימת 3C כתבנית.
חשוב לציין שגם לפריימרים מתוקפים יש נטייה להיכשל (איור 4: סט פריימר r14). בנוסף, תוצרי PCR מזוהים לעיתים קרובות בתגובות בקרה ובתגובות בהן לא צפוי קשר כרומטין (כגון הבקרה המעוכלת, שכן היא אינה קשורה). מופעים אלה רצפים ונכשלים ב-Sanger QC או חוזרים ללא רצף מוגדר (איור 5). בנוסף, ניסויי 3C מסורתיים יוצרים "תבנית בקרה", דגימת דנ"א לא מוצלבת, מעוכלת וקשורה, המייצגת את כל המקטעים הקשורים האפשריים שניתן לייצר עם כמות נתונה של דנ"א. "תבנית הבקרה" ממלאת תפקיד חשוב בהשוואת העוצמות של אותות qPCR בין שני אתרים גנומיים כדי לקבוע אם האות מייצג אינטראקציה אמיתית או רק אסוציאציה אקראית. יצירת "תבנית בקרה" יכולה להיות בעייתית, מכיוון שחלק גדול מהכרומטין הנבדק חייב להילכד בצורה של כרומוזום מלאכותי ולעבד יחד עם דגימות 3C. אבטחת מבנה כזה עשויה להיות בלתי ישימה, ויצירתו יכולה להיות מחוץ לתחום של פרויקט סמסטריאלי. בשל קשיים אלה, אנו ממליצים להשתמש בפריימר בקרה. פריימר הבקרה אינו מחליף את כל הפונקציונליות של "תבנית הבקרה", אך עדיין מספק את ההזדמנות לנתח את הנתונים כדי לקבל החלטות "נוכחות" או "היעדרות".
בעת ביצוע qPCR, שימוש בכמויות שוות של המדגם חשוב. יש לקבוע זאת, גם אם משתמשים בננו-ספקטרופוטומטר כגון ננו-טיפה, על ידי יצירת עקומה סטנדרטית מדנ"א גנומי בריכוז ידוע והתאמת דגימות 3C לקו זה. יש לרשום כמויות אלה ולהשתמש בהן בבדיקות PCR עוקבות. איכות תגובת ה-PCR חשובה גם היא. כאשר ה-PCR פועל ב-qPCR, שפע המוצר נמדד באמצעות פלואורסצנטיות ונרשם. הקלטה זו נגישה בחלקת ההגברה. לאחר סיום התוכנית, חשוב לבדוק את תרשים ההגברה ולוודא שלתגובות (למעט פקדי ה- No Template) יש שלושה שלבים: קו בסיס, שלב מעריכי ושלב מישור/רוויה. חשוב לבדוק שלתגובות יש פאזה אקספוננציאלית, בפרט לקביעת הסף (ראו בהמשך). בנוסף, עבור דגימות בדילול סדרתי, צריך להיות שינוי בערכי Ct בהתאם לדילול המדגם (הריכוז הגבוה ביותר יהיה בעל ערכי ה- Ct הנמוכים ביותר, ואילו הריכוז הנמוך ביותר יהיה בעל ערכי ה- Ct הגבוהים ביותר). דגימות שאינן משקפות שינוי זה בתרשים ההגברה דורשות דילול חדש או מצביעות על בעיה גדולה יותר בהיווצרות דגימת 3C. לבסוף, תוך יצירת העקומה הסטנדרטית, תוכנת ה- PCR תחשב את יעילות ה- PCR ואת ערך R2 . יעילות ה- PCR צריכה להיות גדולה מ- 90%, וערך R2 צריך להיות גדול מ- 0.99. אם אחד מהתנאים הללו אינו מתקיים, סביר להניח שמשהו לא בסדר במדגם או בפריימרים של PCR.
לאחר qPCR, אחוז העיכול ואת הנוכחות של אינטראקציות 3C ניתן לחשב באמצעות qPCR Ct עבור כל תגובה. כדי לקבוע זאת, ראשית, יש לקבוע את הסף לתגובת PCR. זה נעשה בדרך כלל באמצעות התוכנה שמגיעה עם מכונת qPCR. קביעת הסף תגדיר את ריכוז מוצר ה-PCR שישמש להשוואת ערכי ה-Ct המדגם. הסף צריך לחצות את עקומות ההגברה של תגובות ה-PCR בשלב המעריכי של ההגברה. ניתן להשוות רק תגובות PCR עם הגברה מעריכית (במקרה זה, פריימר הבקרה ותגובות פריימר הבדיקה), מכיוון שזו הדרך היחידה להבטיח שהתגובות מגבירות DNA באותו קצב וניתן להשוות אותן נאמנה. כאשר מנתחים את הגרפים של 3C, תגובות חיוביות מותנות מזוהות כתגובות עם יותר תוצר על פני דגימות הביקורת, הבקרה הגנומית ובקרת העיכול (איור 4B). עם זאת, דגימות אלה חייבות להיות מאומתות עוד יותר באמצעות ריצוף Sanger לאחר טיהור הג'ל של מוצר ה- PCR.
לאחר ריצוף Sanger, ניתן לנתח דגימות שעוברות את ה- QC באמצעות Blat. מטרת ניתוח זה היא לקבוע אם לדגימה יש את הרצף של שני המוקדים הגנומיים של המטרה הצמודים לאתר ההגבלה (DpnII במקרה של פרוטוקול זה). אם שני הרצפים מזוהים, אז קטע 3C יכול להיחשב מאומת. אם התוצאות של Blat אינן מחזירות את הרצף הצפוי, הדבר עשוי להצביע על כך שפריימר אחד או שניהם אינם אופטימליים, וכתוצאה מכך תוצאת qPCR חיובית שגויה. קבצי המעקב עבור הדגימות החיוביות הכוזבות יהיו בעלי שיאי בסיס לא מוגדרים, ודוחות Seq יכילו בעיקר קריאות בסיס "n".
אימות Sanger הוא חיוני, מכיוון שתוצאות חיוביות שגויות מהיווצרות מוצר PCR מלאכותי אפשריות. ניתן לזהות את התוצאות החיוביות הכוזבות האלה כאשר לתוצרי הריצוף אין את רצף המטרה הצפוי או אתר DpnII האופייני למקטע 3C תקין (איור 5). ריצוף מקטעי ה-PCR מספק גם נקודת נתונים נוספת לניסוי ומסביר לתלמידים כי טכניקת ה-3C מזהה מוקדים גנומיים מרוחקים המתאחדים במרחב תלת-ממדי בתוך הגרעינים.
טכניקת 3C מספקת שפע של טכניקות מולקולריות בסיסיות לסטודנטים לתואר ראשון בהליך גמיש ופשוט. טכניקת 3C זו היא גם נקודת השקה לטכניקות 3C אחרות המשלבות ריצוף מהדור הבא (NGS). ניסויים מסוג זה יכולים לחשוף סטודנטים לתואר ראשון להיבטים חשובים של ביואינפורמטיקה והם מושרשים בעקרונות הבסיסיים המתוארים כאן. ניסיון ומעורבות לתואר ראשון הם המפתח להצלחתם ולהתפתחותם כמדענים צעירים. על ידי מתן הזדמנויות אלה, סטודנטים לתואר ראשון יכולים לחזק את הבנתם של עקרונות בסיסיים תוך בניית הביטחון שלהם להתמודד עם טכניקות חדשניות ושאלות.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי פרס הפיתוח המוסדי של רוד איילנד (IDeA) רשת מצוינות במחקר ביו-רפואי מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מענק מספר P20GM103430 ומרכז בריאנט לבריאות ומדעי ההתנהגות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37% Formaldehyde | Millapore-Sigma | F8775 | |
| 100% Ethanol | Millapore-Sigma | E7023 | |
| CaCl2 | MP Biomedical | 215350280 | |
| chloroform | Millapore-Sigma | C0549 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millapore-Sigma | COEDTAF-RO | mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| Dithiothreitol (DTT) | Millapore-Sigma | D0632 | 1 M stock diluted to 500 µM in Sucrose buffer and GB buffer fresh |
| DpnII | NEB | R0543M | |
| Glycerol | Millapore-Sigma | G9012 | |
| glycine | Millapore-Sigma | G8898 | |
| glycogen | Millapore-Sigma | 10901393001 | |
| HEPES | Millapore-Sigma | H3375 | |
| KCl | Millapore-Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Millapore-Sigma | P5655 | |
| methyl green pyronin | Millapore-Sigma | HT70116 | |
| MgAc2 | Thermoscientific | 1222530 | |
| Na2HPO4 | Millapore-Sigma | S5136 | |
| NaCl | Millapore-Sigma | S9888 | |
| phenol-chloroform | Millapore-Sigma | P3803 | |
| Pronase | Millapore-Sigma | 11459643001 | |
| Proteinase K | IBI Scientific | IB05406 | |
| qPCR Ready mix (Phire Taq etc) | Millapore-Sigma | KCQS07 | |
| RNase A | Millapore-Sigma | R6148 | |
| Sodium Acetate | Millapore-Sigma | S2889 | |
| sodium dodecyl sulfate (SDS) | Millapore-Sigma | L3771 | |
| Sucrose | Millapore-Sigma | S0389 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1804 | |
| Tris-HCl | Millapore-Sigma | 108319 | |
| Triton X-100 | Millapore-Sigma | T9284 | |
| Trypsin-EDTA | Millapore-Sigma | T4049 |
References
- McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C.
- Nalabothula, N., et al. The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation. BMC Genomics. 15, 92 (2014).
- John, S., et al. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).
- Fawcett, D. W. On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates. The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).
- Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina. Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).
- Finlan, L. E., et al. Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells. PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).
- Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).
- Chambeyron, S., Bickmore, W. A. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).
- Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).
- Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH. The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).
- Li, B., Carey, M., Workman, J. L.
- Chen, A., Chen, D., Chen, Y. Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals. Gene. 667, 83-94 (2018).
- Hughes, A. L., Rando, O. J. Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo. Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).
- Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging. Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).
- Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern. Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N.
- van Berkum, N. L., Dekker, J. Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology. Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).
- Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus. American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).
- Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. University of California, Berkeley. , PhD thesis (2012).
- Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell. 98 (3), 387-396 (1999).
- Cuadrado, A., et al. Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells. Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).
- Sarro, R., et al. Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development. Development. 145 (7), (2018).
- Tolhuis, B., et al. Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture. PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).
- Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
- Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish. Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).
- Dekker, J. The three "C" s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).
- Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).
- Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies. Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).
- Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression. BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).
