Summary
I denne artikkelen beskrives en protokoll for manuell tyramidsignalforsterkning (TSA) multiplex immunfluorescens (mIF) kombinert med bildeanalyse og romlig analyse. Denne protokollen kan brukes med formalinfaste parafin-innebygde (FFPE) seksjoner for farging av to til seks antigener per lysbilde, avhengig av lysbildeskanneren som er tilgjengelig i laboratoriet.
Abstract
Tumormikromiljøet (TME) består av en mengde forskjellige celletyper, for eksempel cytotoksiske immunceller og immunmodulerende celler. Avhengig av sammensetningen og interaksjonene mellom kreftceller og peritumorale celler, kan TME påvirke kreftprogresjonen. Karakteriseringen av svulster og deres komplekse mikromiljø kan forbedre forståelsen av kreftsykdommer og kan hjelpe forskere og klinikere til å oppdage nye biomarkører.
Vi har nylig utviklet flere multiplex immunfluorescens (mIF) paneler basert på tyramid signalforsterkning (TSA) for karakterisering av TME i kolorektal kreft, hode og nakke plateepitelkarsinom, melanom og lungekreft. Når farging og skanning av de tilsvarende panelene er fullført, analyseres prøvene på en bildeanalyseprogramvare. Den romlige posisjonen og fargingen av hver celle eksporteres deretter fra denne kvantifiseringsprogramvaren til R. Vi utviklet R-skript som lar oss ikke bare analysere tettheten av hver celletype i flere tumorrom (f.eks. sentrum av svulsten, marginen til svulsten og stroma), men også å utføre avstandsbaserte analyser mellom forskjellige celletyper.
Denne spesielle arbeidsflyten gir en romlig dimensjon til den klassiske tetthetsanalysen som allerede rutinemessig utføres for flere markører. mIF-analyse kan tillate forskere å få en bedre forståelse av det komplekse samspillet mellom kreftceller og TME og å oppdage nye prediktive biomarkører for respons på behandlinger, for eksempel immunkontrollpunkthemmere og målrettede terapier.
Introduction
Med utviklingen av målrettede terapier og immunkontrollpunkthemmere har det blitt av største betydning å bedre karakterisere samspillet mellom kreftceller og deres tumormikromiljø, og dette er for tiden et viktig felt for translasjonsforskning. TME består av en mengde forskjellige celletyper, med en balanse mellom immuncytotoksiske celler rettet mot kreftcellene og immunmodulerende celler som kan favorisere tumorvekst og invasivitet 1,2,3,4. Karakteriseringen av dette komplekse miljøet kan forbedre forståelsen av kreftsykdommer og kan hjelpe forskere og klinikere til å oppdage nye prediktive og prognostiske biomarkører for bedre å velge pasienter for fremtidig behandling 5,6. For eksempel utviklet Galon og hans team Immunoscore, som er en reproduserbar scoringsmetode som kan brukes som en prediktiv biomarkør. Immunoscore beregnes ved hjelp av tettheten av CD3+ og CD8+ T-celler i invasiv margin og i sentrum av tumor 7,8.
I løpet av de siste tiårene har kommersielle løsninger for mIF blitt utviklet, men disse er ofte dyre og designet for spesifikke paneler av antigener. For å overvinne behovet for spesifikke paneler av antigener i akademisk og translasjonsforskning, utviklet vi en kostnadseffektiv metode for å utføre mIF på FFPE-tumorseksjoner, slik at farging av to til seks antigener tilsatt cellekjernene motfarging på menneske- og museprøver.
Når hele vevsseksjonene er farget og skannet med en fluorescensglideskanner, kan prøvene analyseres av flere bildeanalyseprogrammer som støtter store pyramidale datasett. Til slutt kan rådataene brukes i et miljø for statistisk databehandling og grafikk som R-programvaren (v.4.0.2) for å utføre tetthets- og rombaserte analyser.
En protokoll optimalisert for farging med fem markører, samt triks og tips for å optimalisere nye paneler, presenteres i dette manuskriptet. Videre forklares detaljerte trinn i bildeanalysen og R-funksjonene som brukes til statistisk og romlig analyse.
Protocol
Alle prøvene som ble brukt i denne protokollen kom fra en studie godkjent av de lokale etiske komiteene og autorisert av den kompetente myndigheten. Alle deltakerne i studien ga skriftlig informert samtykke. Studien er registrert hos ClinicalTrials.gov (NCT03608046).
1. Multiplex immunfluorescens
- FFPE-seksjonering
- Fest vevet i 4% paraformaldehyd, og legg det faste vevet i parafin.
- Klipp 5 μm seksjoner, og legg dem på limmikroskoplysbilder.
- Tørk lysbildene over natten ved romtemperatur (RT).
- Deparaffinisering og endogene peroksidaser hemming
- Devoks vevet ved å senke lysbildene i toluen (3x i 5 minutter hver) og metanol (3x i 5 minutter hver) under en avtrekkshette.
- Hemme de endogene peroksidasene ved å senke lysbildene i 3% hydrogenperoksid fortynnet i metanol i 20 minutter under en avtrekkshette.
- Skyll lysbildene i destillert (d) H2O (1x i 3 min).
- Multiplex immunfluorescensfarging
- Senk lysbildene i en 300 ml fargekrukke inneholdende 10 mM citrat (pH 6) eller EDTA (pH 9) buffer komplementert med 0,1% TritonX-100.
MERK: Bufferen som brukes (pH 6 eller pH 9) avhenger av antigenet som er farget (se tabell 1). - Sett fargeglasset med lokket lukket i en mikrobølgeovn i 3-5 minutter med maksimal effekt (f.eks. 900 W) til bufferen begynner å koke.
NOTAT: Den optimale tiden for koking avhenger av mikrobølgeovnen og volumet av bufferen. Justeringer kan være nødvendig for å finne den perfekte timingen. For noen skjøre antigener eller skjøre og mindre adherente prøver (f.eks. Organoider og sfæroider), kan mikrobølgekoking være for hard. I dette tilfellet kan en trykkoker brukes i stedet. - Hold bufferen ved nær kokende temperatur ved å sette den lukkede fargekrukken i mikrobølgeovnen på lav effekt (f.eks. 90 W) i 15 minutter.
- Utfør det siste trinnet med oppvarming ved å sette mikrobølgeovnen på maksimal effekt i 90 s.
- Fjern krukken fra mikrobølgeovnen, og la bufferen avkjøles i 15 min ved RT.
- Skyll lysbildene 3x i 5 min hver i dH2O og 1x i 5 min i tris-bufret saltvann inneholdende 0,1% Tween 20 (TBS-T).
- Fjern TBS-T ved å blotte lysbildene på et papirhåndkle
- Plasser lysbildene (flate) på et fargekammerbrett eller lysbildeboks i mikroskop (se Materialfortegnelse).
- Omkrans vevet med en hydrofob penn.
- Blokker de uspesifikke bindingsstedene ved å dekke vevet med 5% bovint serumalbumin (BSA) oppløst i TBS-T i 30 minutter.
- Fjern blokkeringsbufferen ved å blotte lysbildene på et papirhåndkle.
MERK: Ikke skyll lysbildene etter blokkeringstrinnet. - Inkuber vevet i 60 minutter med det primære antistoffet (se tabell 1) fortynnet i 1% BSA TBS-T ved å dekke vevet med rundt 300 μL av løsningen.
- Skyll lysbildene 3x i 3 min hver med TBS-T.
- Inkuber vevet i 40 minutter med poly-HRP sekundært antistoff (se tabell 1) ved å dekke vevet med ca. 300 μL av oppløsningen.
- Skyll lysbildene 3x i 3 min med TBS-T.
- Inkuber vevet i 10 minutter med fluorokrom-tyramidreagens (se tabell 1) fortynnet 200 ganger i boratbuffer (0,1 M borat, pH 7,8, 3 M NaCl) ekstemporant supplert med 0,003% H 2 O2ved å dekke vevet med rundt 300 μL av løsningen.
- Skyll lysbildene 3x i 3 min med TBS-T.
- Gjenta trinn 1.3.1-1.3.16 til all TSA-farging er utført.
- Inkuber vevet over natten ved 4 °C med det siste primære antistoffet (se tabell 1) fortynnet i 1 % BSA TBS-T.
MERK: Siden inkubasjonen er over natten, er det viktig å dekke fargekammerbrettet eller mikroskopets lysbildeboks og legge dH2O på et papirhåndkle i bunnen av esken (under lysbildene) for å sikre at vevet ikke tørker under inkubasjonen. - Skyll vevet 3x i 5 min hver med TBS-T.
- Inkuber vevet i 120 minutter med det sekundære antistoffet (direkte koblet med fluorokrom) fortynnet 200 ganger i 1% BSA TBS-T.
- Skyll vevet 3x i 5 min hver med TBS-T.
- Flekk kjernene ved å inkubere vevet i 5 minutter i bisbenzimid (20 mM) fortynnet 1000 ganger i 10% BSA TBS-T.
MERK: Bisbenzimid kan erstattes av DAPI, men sistnevnte er giftigere og må håndteres forsiktig under en avtrekkshette. - Skyll vevet 3x i 3 min hver i dH2O.
- Monter lysbildene ved å bruke et fluorescensmonteringsmedium og borosilikatdekselbriller.
- Senk lysbildene i en 300 ml fargekrukke inneholdende 10 mM citrat (pH 6) eller EDTA (pH 9) buffer komplementert med 0,1% TritonX-100.
2. Skyv skanning
- Digitaliser lysbildene ved å skanne dem på en fluorescens lysbildeskanner ved 20x forstørrelse (lysbildeskannerdetaljer er gitt i materialfortegnelsen).
MERK: En representativ skanning av en optimal multiplex er vist i figur 1.
3. Bildeanalyse
- Importer skanningene til et bildeanalyseprogram (File > Open Image).
- Gå til kategorien Klassifiserere , og velg DenseNet AI V2-plugin .
- Tren DenseNet AI V2-plugin for å gjenkjenne kjerner ved å omgi rundt rundt 500 kjerner i ett bilde.
- Tren AI på flere andre lysbilder fra samme batch og forskjellige batcher med mIF-farging ved å omgi flere kjerner (50) på flere lysbilder (rundt 10).
MERK: Detaljerte instruksjoner om hvordan du bruker AI-plugin finner du i programvarehåndboken. Bruk av AI for kjernedeteksjon er valgfritt. Andre metoder for å oppdage kjerner er tilgjengelige, avhengig av bildeanalyseprogramvaren som brukes. - Lagre den opplærte AI (Classifier Actions > Save).
- Gå til kategorien Merknader , og opprett en merknad for hvert område av interesse (ROI), for eksempel midten av svulsten og margen til svulsten, ved hjelp av verktøyet for pennmerknader.
- Fjern om nødvendig områdene med bretter og områdene som vises uskarpe, med verktøyet for utelukkelsesmerknad.
MERK: Hematoksylin-eosinfarging av en seksjon ved siden av den som brukes til mIF kan utføres før mIF-fargingen for å sikre at tumorceller er tilstede i prøven og for å hjelpe anatomopatologer til å bestemme avkastningen. - Gå til kategorien Analyse, og velg HighPlex FL-algoritmen (Innstillingshandlinger > Last inn > HighPlex FL).
- Velg kategorien Fargestoffvalg , og velg fargestoffet av interesse.
- I kategorien Nuclear Detection går du til Nuclear Segmentation Type, og velger AI custom.
- I Nuclear Segmentation Classifier, velg AI lagret i trinn 3.5.
- I kategorien Membran- og cytoplasmadeteksjon valgte du maksimal cytoplasmaradius (i denne studien ble 1,5 brukt) og antall membranfarger.
- For hvert fargestoff, velg kjernen positiv terskel, cytoplasma positiv terskel og membran positiv terskel.
MERK: Terskelen er forskjellig for hver farging og bør justeres for hver gruppe lysbilder og hvert antigen farget. Bruk av verktøyet Visningsinnstillinger (Vis > visningsinnstillinger) kan hjelpe deg med å velge en tilstrekkelig terskel ved å bruke intensitetsverdien på slutten av intensitetstoppen (til høyre). - For hvert fargestoff velger du kjerne-, membran- og cytoplasmaprosentandelen av fullstendighetsverdier.
MERK: Denne parameteren er viktig for å unngå falsk positiv deteksjon når to celler med forskjellig farging er nær hverandre (figur 2). - Lagre algoritmen (Innstillinger, Handlinger, > Lagre).
- Analyser avkastningen (analyser > merknadslag).
- Gå til kategorien Resultater , og velg alle dataene i Objektdata (ctrl + A).
- Eksporter dataene i .csv format (Høyreklikk > Eksporter > objektdata . Csv).
MERK: Denne tabellen inneholder posisjonen (Xmin, Xmax; Ymin, Ymax) og positiviteten til hver markør for hver analysert celle.
4. Bioinformatikk ved hjelp av R
MERK: Et R-skript som gir mer informasjon om følgende trinn, er tilgjengelig på GitHub (benidovskaya / Ring: Pipeline for analyse av multiplex immunfluorescensfarginger. [github.com])
- Bruk den eksporterte tabellen til først å definere de forskjellige celletypene basert på samlokaliseringsfargene. For eksempel definere cytotoksiske T-celler ved dobbelt-positive CD3 + / CD8 + celler.
- Deretter rekonstruerer du et forenklet bilde av lysbildet på et punktplott ved hjelp av koordinatene som er eksportert fra bildeanalyseprogramvaren og ggplot2 (Figur 3). Ved hjelp av disse dataene kan flere typer analyser utføres:
- Tetthet analyse
MERK: Den enkleste analysen er en tetthetsanalyse.- Utfør en tetthetsanalyse for alle celletyper ved hjelp av hele lysbildet for biopsier eller et bestemt område av vevet. For eksempel, beregne tettheten av CD3 + og CD8 + T-celler i sentrum av svulsten og marginen av svulsten (figur 4A-C).
- For å beregne disse tetthetene, bruk bildeanalyseprogramvare for å produsere en bestemt dataramme per prøve med fenotypen og koordinatene til hver celle. Gjennom en klyngefunksjon (k-nærmeste nabo) på R, opprett et polygonobjekt ved hjelp av grensene til den studerte biopsien, og beregne tettheten av celletyper av interesse inne i den.
MERK: Dette gjør det mulig å sammenligne tettheten av forskjellige celletyper mellom forskjellige forhold (for eksempel forskjellige tidspunkter, behandlingstyper, vevstyper og respons på behandlingen) og lokaliseringer (sentrum av svulsten, marginen til svulsten, stromafibrose og nekroseområdet) avhengig av den biologiske hypotesen. På grunn av den høye nærheten mellom kreftceller, peritumorale celler og tumorinfiltrerende celler, kan bildeanalyseprogramvaren oppdage dobbeltpositive celler som immun- og kreftceller samtidig. I så fall må man bioinformatisk korrigere dette problemet ved å nevne hva disse dobbeltpositive cellene er. I dette tilfellet ble CD3+CD8+cytokeratin+-celler merket som cytotoksiske celler fordi cytokeratinpositiviteten skyldtes tumorcellene rundt de infiltrerende lymfocyttene.
- Varmekart
- Bruk tettheten til hver celletype fra forskjellige paneler og ved å bruke en normalisering (f.eks. Skaleringssentrering), tegn varmekart (figur 5) som representerer cellemengden i populasjonen av prøver.
- Ved å bruke hierarkisk, ikke-veiledet clustering basert på celletetthet, klynge pasienter med lignende TME-sammensetninger, og korrelere disse klyngene med kliniske parametere som behandlingsrespons og overlevelse.
MERK: Heatmaps og clusterization kan enkelt utføres med R ComplexHeatmap-pakken9.
- Romlig cellefordeling
- Beregn bioinformatisk avstandene mellom cellene (f.eks. immun- og tumorceller; Figur 6A, B) basert på cellekoordinatene gitt av bildeanalysen. Bruk median- og gjennomsnittsavstandene mellom celletypene av interesse for å sammenligne cellenærheten over alle prøvene i en kohort.
- Romlige beskrivende funksjoner
- Bruk krysstype nærmeste nabo G-cross-funksjon, tilgjengelig gjennom R spatstat-pakken10, for å bestemme sannsynligheten for en celle av interesse, X (f.eks. En tumorcelle), som møter nærmeste celle, Y (f.eks. En T-celle), innenfor en viss radius rundt celle X.
- Beregn arealet under den empiriske kurven for å få en numerisk verdi som representerer tumorinfiltrasjonen av CD3+ T-celler rundt tumorcellene11 (figur 6C). Bruk andre romlige beskrivende funksjoner, for eksempel F-funksjonen eller J-funksjonen12.
- Analyse av immunskår
- Beregn Immunoscore (I), utviklet av teamet av Galon7,8, ved å bruke tettheten av CD3 + og CD8 + T-celler i midten av svulsten og den invasive marginen til svulsten.
MERK: Poengsummen varierer fra I0 til I4. En lav tetthet av både CD3+ og CD8+ T-celler i midten og marginen av svulsten er assosiert med en score på I0, mens en høy tetthet av CD3+ og CD8+ T-celler i begge regioner er assosiert med en score på I4. Nylig ble den prognostiske effekten av Immunocore validert i en studie med prøver fra 2,681 stadium I-III tykktarmskreftpasienter fra 14 sentre i 13 land7. For å bli beregnet krever Immunoscore imidlertid en kirurgisk resektert prøve som inneholder både sentrum og margin av svulsten. For biopsier, som vanligvis mangler margin, er det nylig utviklet en biopsitilpasset Immunoscore13. - For å beregne den biopsitilpassede immunscoren, konverter verdien av CD3+ og CD8+ T-celletettheten til en persentil, og bruk deretter gjennomsnittlig persentil av CD3+- og CD8+ T-celler for skåring i en av tre kategorier (dvs. lav, middels og høy)13.
- Beregn Immunoscore (I), utviklet av teamet av Galon7,8, ved å bruke tettheten av CD3 + og CD8 + T-celler i midten av svulsten og den invasive marginen til svulsten.
- Hotspot-analyse
- Bruk hotspot-analyse, ved å bruke quadratcount-funksjonen (spatstat)10, for å sammenligne tettheten av forskjellige celletyper i det mest infiltrerte området av vevet. For eksempel er det mulig å beregne en "Immunoscore-like" score ved å bruke verdien av CD3- og CD8 T-celletettheten til de mest infiltrerte kvadratene i vevet (figur 7). Bruk denne metoden for analyse av hvilken som helst celletype med en ikke-homogen fordeling over vevet.
- Tetthet analyse
Representative Results
Etter denne protokollen bør flere parametere undersøkes for å sikre at vevet er riktig farget. For det første bør TSA-fargingen vise et godt dynamisk område når du bruker lave eksponeringstider (vanligvis 2-100 ms) under skanneprosessen. En lav eksponeringstid innebærer at forsterkningen har blitt gjort riktig under reaksjonen med HRP. For antigener farget med det sekundære antistoffet direkte koblet til fluorokrom, kan eksponeringstiden være mye lengre, noe som kan føre til fotobleking (en reduksjon i signalintensiteten på grunn av lang eksponeringstid). For det andre er det viktig å verifisere at hver farging viser et høyt SNR. Et høyt bakgrunnssignal med et lavt antigensignal kan være en indikasjon på at det primære antistoffet ikke er spesifikt nok, at de endogene peroksidasene ikke ble inaktivert riktig, eller at ett trinn i protokollen ikke ble gjort tilstrekkelig. For det tredje, avhengig av glideskanneren og filtersettene som brukes til skanningen, er det mulig å se overlapping mellom to farger (f.eks. AF555, AF594 og AF647). Valg av riktige filtersett på skanneren og riktig primær antistofffortynning er avgjørende for å unngå mulige kryssdeteksjoner. Kvalitetskontroll består av deteksjon av enkeltfargede celler for hver markør på den skannede filen. Til slutt er det også viktig å legge til en positiv og negativ kontroll for hver fargegruppe. For immunceller er mandlene en god positiv kontroll. Et representativt resultat av optimal farging er vist i figur 1.
Figur 1 Lokalavansert endetarmskreft farget av multiplex immunfluorescens. Forkortelser: PD-1 = programmert celledødsprotein 1; PD-L1 = Programmert død-ligand 1; ROR-γ = RAR-relatert foreldreløs reseptor gamma; CD3 = klynge av differensiering 3; hPanCK = humant pan-cytokeratin. Hver antigenfarging skannes i gråtoner, og fargene som presenteres i figuren er pseudofarger. Skala bar lav forstørrelse: 200 μm; Skala bar høy forstørrelse: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Påvisning av lokalavansert endetarmskreft ved hjelp av et bildeanalyseprogram. Uten prosentandelen av fullstendighetsparameteren riktig innstilt, oppdager programvaren to CD8 + celler (grønn sirkel) fordi de er nær hverandre, men bare en celle er farget. Å bruke 70% fullstendighet bidrar til å unngå denne falske positive deteksjonen. grønn = hPanCK; gul = CD3; Oransje = CD8. Skala bar: 100 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Bildeanalyse og R-dot-plot-rekonstitusjon av metastase for kolorektal leverkreft. På multipleksfargingen (venstre) er humant pan-cytokeratin i gult, CD3 er i grønt, CD8 er i lyseblått og IDO er i oransje. På punktplottet (til høyre) er humane pan-cytokeratin+-celler i gult, CD3+CD8-celler er i grønt, CD3+CD8+-celler er i blått og IDO+-celler er i oransje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av en kirurgisk del av en HNSCC. (A) En kirurgisk del av en HNSCC. Kreftceller er synlige i grønt. Peritumorale celler visualiseres rundt tumorøyene (CD3 i gult og CD8 i lilla). (B) Sentrum av svulsten (i gult med en svart kant) beregnes bioinformatisk av den nærmeste naboalgoritmen basert på avstanden mellom tumorøyene fra et enkelt område. Rundt dette området beregnes en invasiv margin (lysegul med grå kant) på en vilkårlig 500 μm basis. (C) Invasive T-celler er uthevet med svarte prikker i midten av svulsten og grå prikker i invasiv margin. Andre T-celler er uthevet i lysegrønne prikker. Skala bar: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Varmekart over tettheten av ulike celletyper lokalavanserte endetarmskreftbiopsier. Varmekartet ble tegnet ved hjelp av uovervåket gruppering av tetthetene til forskjellige celletyper fra forskjellige multiplexpaneler med ComplexHeatmap-pakken. Skalering og sentrering ble brukt til normalisering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Avstander mellom CD4+- og CD8+-cellene til hver IDO+- eller tumorcelle. Humane pan-cytokeratin + -celler er i gult, CD3 + CD8-celler er i grønt, CD3 + CD8 + -celler er i blått og IDO + -celler er i oransje. (A) Den nærmeste avstanden mellom tumorceller og hver CD8 + T-celle. (B) Barplots av avstandene mellom IDO + celler og hver CD8 + T-celle (blå) eller CD4 + T-celle (grønn). (C) Eksempel på en prøve analysert av G-cross-funksjonen. Y-aksen viser sannsynligheten for at en tumorcelle møter en CD3+-lymfocytt i en radius fra 0-200 μm rundt tumorcellen. Tre kurver vises; den teoretiske kurven er i stiplet grønt (Poisson-fordeling), den korrigerte empiriske kurven med km-korreksjon er i svart, og den korrigerte empiriske kurven med kantkorreksjon er i stiplet rødt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Illustrasjon av en kvadrattelling. Grenseberegning og kvadrattelling ble utført ved hjelp av spatstats-pakken. De mest infiltrerte rutene (hotspots) kan brukes til nedstrømsstatistikk. CD4 er i grønt, CD8 er i rødt, og tumorceller er i gult. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Optimalisering av antistofffortynning og antigenhenting. Kromogen påvisning av PD-1 ved bruk av tre forskjellige fortynninger og to forskjellige antigenuthentingsløsninger av det primære antistoffet (Citrate pH 6 og EDTA pH 9). Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Primær antistoff | Fortynning | Uthenting av antigen | Sekundært antistoff | Fluorokrom | Posisjon |
| PD-1 | 1/100 | EDTA (pH 9) | Anti-kanin | AF647 | 1 |
| PD-L1 | 1/1000 | EDTA (pH 9) | Anti-kanin | AF488 | 2 |
| ROR-γ | 1/200 | EDTA (pH 9) | Anti-mus | ATT0-425 | 3 |
| CD3 | 1/100 | Sitrat (pH 6) | Anti-kanin | AF555 | 4 |
| hPanCK | 1/50 | Sitrat (pH 6) | Anti-mus kombinert med AF750 | 5 | |
Tabell 1: Eksempel på et optimalisert multiplekspanel. Forkortelser: PD-1 = programmert celledødsprotein 1; PD-L1 = Programmert død-ligand 1; ROR-γ = RAR-relatert foreldreløs reseptor gamma; CD3 = klynge av differensiering 3; hPanCK = humant pan-cytokeratin; AF = AlexaFluor; EDTA = etylendiamintetraeddiksyre. CD3 brukes til å oppdage T-lymfocytter; PD-1 brukes til å oppdage utmattede lymfocytter; ROR- γ brukes til å oppdage Th-17; og hPanCK brukes til å oppdage tumorceller. Posisjonskolonnen angir rekkefølgen som det sekvensielle multiplekset må utføres i.
Discussion
De viktigste parametrene å ta hensyn til for å optimalisere multipleksfarging er fortynningen, spesifisiteten og antigengjenfinningen som brukes for hvert primære antistoff. Før du starter en multipleksprotokoll, må hvert primære antistoffs optimale fortynning og optimale epitoputhenting (pH 6 eller pH 9) testes ved bruk av kromogen farging (DAB). Vi anbefaler å teste tre fortynninger for hver antigenuthentingsbuffer: fortynningen som vanligvis spesifiseres av merket som kommersialiserer antistoffet, den samme fortynningen delt to ganger, og den samme fortynningen multiplisert to ganger (figur 8). Å velge riktig fortynning er et svært viktig skritt for å verifisere antistoffspesifisiteten og optimalisere signal-støy-forholdet (SNR) til fargingen. Etter å ha valgt riktig fortynning i DAB, bør den samme fortynningen testes for hvert primære antistoff ved bruk av uniplex TSA. Når fortynnings- og epitophentingsbufferen er valgt for hver antigenfarging, er det også viktig å sette opp sekvensen av multiplekset riktig. Spesielt er noen antigener bedre farget ved den første posisjonen og andre i den siste posisjonen. Vi anbefaler å teste multipleksmerkingen med alle mulige rekkefølgepermutasjoner for å velge hvilken antigenfarging som skal komme først, andre osv. Dette er også et svært viktig skritt fordi noen skjøre antigener kan brytes ned etter flere runder med epitoputhenting, og noen antigener er bedre farget etter flere runder med epitopgjenfinning. For eksempel er SNR alltid høyere i den siste posisjonen for CD3 og i den første posisjonen for PD-1-farging. Videre kan fargingen av flere samlokaliserte antigener hindres av en paraplyeffekt (metning av tyramidreaktive steder). Dette kan dempes ved å redusere tyramidkonsentrasjonen. Når ekspresjonen av ett antigen er betinget av ekspresjonen av et annet (CD8 finnes bare på CD3-uttrykkende T-celler), anbefaler vi å farge antigenet med det bredeste uttrykket (CD3 i dette tilfellet) etter det andre. Til slutt er det også et viktig skritt å velge riktig fluorokrom for hver antigenfarging i henhold til skannerens spesifikasjoner for å unngå kryssdeteksjon.
De største fordelene med denne teknikken er forsterkningen og signal-støy-forholdet som er oppnådd. Imidlertid kommer denne teknikken med en begrensning, som er at fargingen er sekvensiell, og fluorokromene er kovalent bundet til vevet. Likevel, etter å ha utført alle tyramidsignalforsterkningsrundene, er det også mulig å legge til en siste farging med et sekundært antistoff direkte koblet til et fluorokrom (ingen TSA). I noen paneler brukte vi denne metoden for å legge til farging i 750-kanalen. Dette var nødvendig fordi ingen tyramid-AF750 var kommersielt tilgjengelig på den tiden. Merk at eksponeringstiden (under skanningen) av antigenet farget med AF750 vil være mye lengre enn for de andre antigenene farget med TSA. I så fall anbefaler vi å farge et høyt uttrykt protein som cytokeratin eller øke konsentrasjonen av det primære antistoffet. Ved å gjøre det er det mulig å flekke maksimalt fem til seks antigener per lysbilde i en batch, avhengig av fluorescensskanneren.
I opposisjon bruker flere kommersielt tilgjengelige teknikker seriefarging med flere runder med farging, skanning og stripping eller fotobleking for å forbedre antall antigener som kan farges på en enkelt vevsseksjon. Imidlertid er disse teknikkene ofte tidkrevende, dyre, har ingen signalforsterkning, krever avanserte beregningstrinn for å slå sammen serielle skanninger riktig, og kan etter vår erfaring indusere irreversibel vevsskade på grunn av de mange prosedyretrinnene. Likevel har det blitt rapportert at opptil 30 antigener kan farges på ett enkelt vev ved hjelp av denne metoden14.
Avslutningsvis er metoden vår en robust, reproduserbar, brukervennlig og kostnadseffektiv immunhistofluorescensteknikk som kan brukes i ethvert laboratorium som har en fluorescensglideskanner. Ethvert kommersialisert primært antistoff egnet for IHC kan brukes, og panelene er ikke spesifikke for noen kommersielle sett. Bildeanalysen kan gjøres på flere forskjellige programmer, inkludert åpen kildekode-programmer som QuPath og R. Vi tror imidlertid at denne metoden til og med kan forbedres i fremtiden for store antigenpaneler, noe som gjør det mulig å utføre seriell farging / skanning av det samme lysbildet med forskjellige paneler av antigener og med fordelen av signalforsterkning.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Derouane F for hennes hjelp og støtte. Nicolas Huyghe er stipendiat støttet av et stipend fra Belgian National Fund for Scientific Research (Télévie/FNRS 7460918F).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-CD3 primary antibody | Abcam | ab16669 | rabbit monocolonal |
| anti-CD8 primary antibody | DAKO | M710301 | mouse monoclonal |
| anti-hPanCK primary antibody | DAKO | M3515 | mouse monoclonal |
| anti-PD-1 primary antibody | Cell Signalling | D4W2J | rabbit monocolonal |
| anti-PD-L1 primary antibody | Cell Signalling | 13684 | rabbit monocolonal |
| anti-RORC primary antibody | Sigma | MABF81 | mouse monoclonal |
| ATTO-425 | ATTOtec | ||
| Axioscan Z1 | Zeiss | Light source: Colibri 7 (385, 430, 475, 555, 590, 630, 735 nm) Filtersets: Excitation 379/34 – beam splitter 409 – emission 440/40; Excitation 438/24 – beam splitter 458 – emission 483/32; Excitation 490/20 – beam splitter 505 – emission 525/20; Excitation 546/10 – beam splitter 556 – emission 572/23; Excitation 592/21 – beam splitter 610 – emission 630/30; Excitation 635/18 – beam splitter 652 – emission 680/42; Excitation 735/40 – beam splitter QBS 405 + 493 + 611 + 762 - emission QBP 425/30 + 524/51 + 634/38 + 785/38; Objective: Plan-Apochromat 20x/0.8; Camera : Orca Flash 4.0 V3 | |
| Borosilicate Cover Glass | VWR | 631-0146 | |
| Envision+ anti-mouse | DAKO | K4001 | |
| Envision+ anti-rabbit | DAKO | K4003 | |
| Fluorescence mounting medium | DAKO | S3023 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 750 | ThermoFischer | A-21037 | |
| HALO software | Indicalabs | ||
| Hoescht | Sigma | 14533 | |
| Superfrost plus microscope slides | Fisherscientific/Epredia | 10149870 | |
| Tyramide-AF488 | ThermoFischer | B40953 | |
| Tyramide-AF555 | ThermoFischer | B04955 | |
| Tyramide-AF647 | ThermoFischer | B04958 |
References
- Ge, P., et al. Profiles of immune cell infiltration and immune-related genes in the tumor microenvironment of colorectal cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109228 (2019).
- Fridman, W. H. The immune microenvironment as a guide for cancer therapies. Oncoimmunology. 1 (3), 261-262 (2012).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: Impact on clinical outcome. in Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Calu, V., et al. Key biomarkers within the colorectal cancer related inflammatory microenvironment. Scientific Reports. 11 (1), 7940 (2021).
- Havel, J. J., Chowell, D., Chan, T. A. The evolving landscape of biomarkers for checkpoint inhibitor immunotherapy. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 133-150 (2019).
- Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
- Mlecnik, B., et al. Integrative analyses of colorectal cancer show immunoscore is a stronger predictor of patient survival than microsatellite instability. Immunity. 44 (3), 698-711 (2016).
- Gu, Z., Eils, R., Schlesner, M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 32 (18), 2847-2849 (2016).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial Point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2022).
- Barua, S., et al. Spatial interaction of tumor cells and regulatory T cells correlates with survival in non-small cell lung cancer. Lung Cancer. 117, 73-79 (2018).
- Parra, E. R. Methods to determine and analyze the cellular spatial distribution extracted from multiplex immunofluorescence data to understand the tumor microenvironment. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 668340 (2021).
- El Sissy, C., et al. A diagnostic biopsy-adapted immunoscore predicts response to neoadjuvant treatment and selects patients with rectal cancer eligible for a watch-and-wait strategy. Clinical Cancer Research. 26 (19), 5198-5207 (2020).
- Bolognesi, M. M., et al. Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).
