Summary
Описана процедура изучения динамики метаболизма митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках с использованием формата многолуночного планшета и автоматизированной иммунофлуоресцентной визуализации для обнаружения и количественной оценки синтеза и распределения мтДНК. Это может быть дополнительно использовано для исследования влияния различных ингибиторов, клеточных стрессов и подавления генов на метаболизм мтДНК.
Abstract
Подавляющее большинство клеточных процессов требует непрерывного снабжения энергией, наиболее распространенным переносчиком которой является молекула АТФ. Эукариотические клетки производят большую часть своего АТФ в митохондриях путем окислительного фосфорилирования. Митохондрии являются уникальными органеллами, потому что у них есть собственный геном, который реплицируется и передается следующему поколению клеток. В отличие от ядерного генома, в клетке есть несколько копий митохондриального генома. Детальное изучение механизмов, ответственных за репликацию, восстановление и поддержание митохондриального генома, имеет важное значение для понимания правильного функционирования митохондрий и целых клеток как в нормальных, так и в болезненных условиях. Здесь представлен метод, позволяющий с высокой пропускной способностью количественно определять синтез и распределение митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках человека, культивируемых in vitro . Этот подход основан на иммунофлуоресцентном обнаружении активно синтезируемых молекул ДНК, меченных включением 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU), и одновременном обнаружении всех молекул мтДНК с анти-ДНК-антителами. Кроме того, митохондрии визуализируются с помощью специфических красителей или антител. Культивирование клеток в многолуночном формате и использование автоматизированного флуоресцентного микроскопа облегчают изучение динамики мтДНК и морфологии митохондрий в различных экспериментальных условиях за относительно короткое время.
Introduction
Для большинства эукариотических клеток митохондрии являются важными органеллами, поскольку они играют решающую роль во многих клеточных процессах. Прежде всего, митохондрии являются ключевыми поставщиками энергии для клеток1. Митохондрии также участвуют в регуляции клеточного гомеостаза (например, внутриклеточный окислительно-восстановительныйпотенциал 2 и кальциевый баланс3), клеточной сигнализации 4,5, апоптозе6, синтезе различных биохимических соединений 7,8 и врожденном иммунном ответе9. Митохондриальная дисфункция связана с различными патологическими состояниями и заболеваниями человека10.
Функционирование митохондрий зависит от генетической информации, расположенной в двух отдельных геномах: ядерном и митохондриальном геномах. Митохондриальный геном кодирует небольшое количество генов по сравнению с ядерным геномом, но все гены, кодируемые мтДНК, необходимы для жизни человека. Митохондриальный белковый механизм, необходимый для поддержания мтДНК, кодируется нДНК. Основные компоненты митохондриальной реплисомы, а также некоторые факторы митохондриального биогенеза уже идентифицированы (рассмотрено в предыдущих исследованиях11,12). Тем не менее, механизмы репликации и поддержания митохондриальной ДНК все еще далеки от понимания. В отличие от нДНК, митохондриальный геном существует в нескольких копиях, что обеспечивает дополнительный слой для регуляции экспрессии митохондриальных генов. В настоящее время гораздо меньше известно о распределении и сегрегации мтДНК внутри органелл, в какой степени эти процессы регулируются, и если да, то какие белки участвуют13. Модель сегрегации имеет решающее значение, когда клетки содержат смешанную популяцию мтДНК дикого типа и мутировавшей. Их неравномерное распределение может привести к образованию клеток с пагубным количеством мутировавшей мтДНК.
До сих пор белковые факторы, необходимые для поддержания мтДНК, были идентифицированы в основном биохимическими методами, биоинформационным анализом или исследованиями, связанными с заболеванием. В данной работе для обеспечения высокой вероятности выявления факторов, ранее избежавших идентификации, описана иная стратегия. Метод основан на мечении мтДНК во время репликации или репарации 5-бром-2'-дезоксиуридином (BrdU), нуклеозидным аналогом тимидина. BrdU легко включается в зарождающиеся нити ДНК во время синтеза ДНК и, как правило, используется для мониторинга репликации ядерной ДНК14. Однако разработанная здесь процедура была оптимизирована для обнаружения BrdU, включенного в мтДНК, с использованием иммунофлуоресценции антител против BrdU.
Этот подход позволяет проводить высокопроизводительную количественную оценку синтеза и распределения мтДНК в клетках человека, культивируемых in vitro. Для проведения испытаний в различных экспериментальных условиях за относительно короткое время необходима стратегия с высокой пропускной способностью; Поэтому в протоколе предлагается использовать многолуночный формат для культивирования клеток и автоматизированную флуоресцентную микроскопию для визуализации. Протокол включает трансфекцию клеток HeLa человека с библиотекой миРНК и последующий мониторинг репликации или репарации мтДНК с использованием метаболической маркировки вновь синтезированной ДНК с помощью BrdU. Такой подход сочетается с иммуноокрашиванием ДНК с помощью антиДНК-антител. Оба параметра анализируются с помощью количественной флуоресцентной микроскопии. Кроме того, митохондрии визуализируются с помощью специального красителя. Чтобы продемонстрировать специфичность протокола, окрашивание BrdU было протестировано на клетках, лишенных мтДНК (клетки rho0), на клетках HeLa при подавлении хорошо известных факторов поддержания мтДНК и на клетках HeLa после лечения ингибитором репликации мтДНК. Уровни мтДНК также измерялись независимым методом, а именно кПЦР.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Приготовление смеси миРНК
- За день до начала эксперимента семенные клетки (например, HeLa) помещают в чашку диаметром 100 мм так, чтобы на следующий день они достигли слияния 70%-90%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все операции должны проводиться в стерильных условиях в ламинарной проточной камере. - Приготовьте соответствующее количество миРНК, разбавленной до концентрации 140 нМ в среде Opti-MEM (см. Таблицу материалов). В качестве резервуара можно использовать 96-луночную плиту.
- Добавьте 5 мкл раствора миРНК (или среды Opti-MEM для контрольных образцов) в каждую лунку черной 384-луночной микропланшетки для клеточной культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества тестируемых образцов миРНК можно использовать электронную или многоканальную пипетку. - Приготовьте соответствующее количество раствора реагента для трансфекции RNAiMAX (см. Таблицу материалов) в среде Opti-MEM. Добавьте 1 мкл РНКиМАКС на каждые 100 мкл среды.
- Добавьте 10 мкл раствора реагента для трансфекции в каждую лунку 384-луночного планшета. Удобнее и быстрее всего это сделать с помощью дозатора реагентов.
- Инкубируют миРНК с реагентом для трансфекции в течение 30 мин при комнатной температуре.
2. Подготовка клеток к трансфекции
- Во время инкубации (этап 1.6) аспирируйте среду с помощью всасывающего устройства (см. Таблицу материалов) и промойте клетки 3 мл PBS.
- Добавьте 1,5 мл трипсина, разбавленного 1:2 в PBS, и инкубируйте клетки при 37 ° C в течение 10 мин.
- Проверьте, не отсоединились ли ячейки; если это так, добавьте 3 мл среды DMEM с 10% FBS. Тщательно суспендируйте клетки и перенесите их в пробирку объемом 15 мл. Возьмите не менее 150 мкл суспензии и подсчитайте клетки в камере для подсчета клеток (см. Таблицу материалов).
- Приготовьте клеточную суспензию в соответствующей концентрации (35 000 / мл для линии HeLa) в среде DMEM с 10% FBS, пенициллином и стрептомицином.
3. Трансфекция клеток
- Добавьте 20 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 384-луночной пластины с помощью дозатора реагентов. Это приведет к тому, что в лунку будет засеяно 700 клеток.
- Инкубируют клетки в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем помещают их в инкубатор на 72 ч (37 °C и 5%CO2).
4. Регистрация BrdU
- Приготовьте 90 мкМ раствор BrdU (см. Таблицу материалов) в среде DMEM с 10% FBS.
- Через 56 ч после трансфекции миРНК (за 16 ч до фиксации клетки) добавляют по 10 мкл 90 мкМ раствора BrdU в каждую лунку 384-луночного планшета (конечная концентрация BrdU составляет 20 мкМ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Действие должно быть выполнено как можно быстрее; Поэтому лучше всего использовать дозатор реагентов, электронную пипетку или дозатор с несколькими дозаторами. Не забудьте подготовить контрольные скважины без добавления BrdU. - Инкубируют клетки в течение 16 ч (37 °C и 5%CO2).
5. Маркировка митохондрий
- Готовят 20 мкМ раствор BrdU в ДМЭМ с 10% FBS и добавляют к нему раствор митохондриального слежения за красителем (см. Таблицу материалов) до концентрации 1,1 мкМ.
- Через 15 ч после начала включения BrdU (за 1 ч до фиксации клетки) добавляют по 10 мкл раствора митохондриального следящего красителя (см. Таблицу материалов) в каждую лунку 384-луночной пластины (конечная концентрация красителя составляет 200 нМ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дозатор реагентов, электронную дозатор или дозатор с несколькими дозаторами. Не забывайте сохранять контрольные лунки без добавления BrdU, но с добавлением красителя для отслеживания митохондрий. - Инкубируют клетки в течение 1 ч (37 °C и 5%CO2).
6. Фиксация клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Все промывки удобнее всего проводить с помощью микропластинчатой шайбы, в то время как добавление реагентов наиболее быстро осуществляется с помощью дозатора реагентов.
- Используя микропланшетную мойку (см. Таблицу материалов), дважды промойте каждую лунку 100 мкл PBS. После второй промывки оставьте 25 мкл PBS в лунке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оставление PBS в лунке снижает вероятность отслоения клеток во время добавления жидкости на следующем этапе. Все стирки завершаются с оставленным PBS; следовательно, раствор, добавленный на следующем этапе, всегда следует готовить в 2-кратной концентрации, так как он будет добавлен в том же объеме, что и оставшийся PBS. - Фиксируют клетки добавлением 25 мкл 8%-ного раствора формальдегида в PBS с 0,4% Triton X-100 и Hoechst 33342 в концентрации 4 мкг/мл (конечные концентрации отдельных реагентов составляют 4%, 0,2% и 2 мкг/мл соответственно) (см. Таблицу материалов).
- Выдерживают пластину в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.
7. Блокировка
- Промойте каждую скважину четыре раза 100 мкл PBS. После последней промывки оставьте в лунке 25 мкл PBS.
- Добавьте 25 мкл 6% BSA в PBS (конечная концентрация BSA составляет 3%) в каждую лунку.
- Выдерживают пластину в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин.
8. Добавление первичных антител
- Аспирируйте BSA с помощью микропланшетной шайбы и оставьте 10 мкл раствора в лунке.
- Добавьте 10 мкл первичного раствора антитела, приготовленного в 3% БСА в PBS. Используйте анти-BrdU в дозе 0,8 мкг/мл и анти-ДНК в дозе 0,4 мкг/мл (конечные концентрации антител составляют 0,4 мкг/мл и 0,2 мкг/мл соответственно) (см. Таблицу материалов).
- Инкубируйте пластину в темноте при температуре 4 °C в течение ночи.
9. Добавление вторичных антител
- Промойте каждую скважину четыре раза 100 мкл PBS. После последней промывки оставьте 10 мкл PBS в лунке.
- Добавьте 10 мкл 4 мкг/мл раствора вторичных антител, приготовленного в 6% БСА в PBS (конечная концентрация составляет 2 мкг/мл). Используйте изотип-специфические антитела (антимышиный IgG1 и антимышиный IgM), конъюгированные с флуорохромами, такими как Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 555 (см. Таблицу материалов).
- Инкубируйте пластинку в темноте при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Промойте каждую скважину четыре раза 100 мкл PBS. После последней промывки оставьте в лунке 50 мкл PBS.
- Запечатайте пластину клейкой герметизирующей пленкой (см. Таблицу материалов) и храните в темноте при температуре 4 °C. Визуализация должна быть выполнена в течение 2 недель.
10. Визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация должна выполняться с помощью автоматизированного широкоугольного микроскопа; Микроскоп должен быть оснащен моторным столиком, снабженным элементами управления для автоматического изображения отдельных участков пластины.
- Проверьте настройки автофокуса в угловых областях пластины (лунки A1, A24, P24, P1) и в центре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации рекомендуется использовать объектив с 20-кратным коротким рабочим расстоянием (см. Таблицу материалов) с максимально возможной числовой апертурой. - Основываясь на гистограммах интенсивности, генерируемых программным обеспечением для визуализации в режиме просмотра в реальном времени, выберите достаточно длительное время экспозиции для отдельных каналов флуоресценции, чтобы результирующее изображение не было перенасыщенным.
- Установите соответствующее количество плоскостей для визуализации по оси z.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поле зрения при 20-кратном увеличении достаточно велико, чтобы не все ячейки находились в одной плоскости фокуса, поэтому необходимо выполнить z-сечение, чтобы увидеть все ячейки в правильной плоскости фокуса. Обычно достаточно пяти самолетов. В зависимости от наличия дискового пространства могут быть сохранены отдельные z-стеки или только проекции максимальной интенсивности. Анализ изображений, показанный в разделе репрезентативных результатов, основан на проекциях максимальной интенсивности. - Выберите соответствующее количество полей обзора для каждой скважины.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от слияния в одном поле зрения можно получить изображение примерно 60-300 ячеек. Как правило, для клеток HeLa со слиянием 60-90% визуализация пяти полей зрения позволяет анализировать от 500 клеток до более чем 1000 клеток. - Выберите лунки для визуализации и начните съемку.
11. Количественный анализ изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Количественный анализ полученных изображений может быть выполнен с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом, такого как Cell Profiler15. Для настоящего исследования анализ проводился с использованием программного обеспечения ScanR 3.0.0 (см. Таблицу материалов).
- Начните анализ с выполнения коррекции фона для всех изображений из всех каналов флуоресценции. В зависимости от размера анализируемых объектов выберите подходящий размер фильтра: 80 пикселей для ядер клеток и 4 пикселя для пятен BrdU и мтДНК.
- Начните сегментацию изображения с создания маски основного объекта на основе отношения интенсивности флуоресцентного сигнала к фону для канала, соответствующего ядрам клетки.
- Создавайте маски для субобъектов, представляющих пятна BrdU и мтДНК соответственно, используя флуоресцентные каналы, подходящие для данных структур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый подобъект присваивается ближайшему основному объекту (ядру клетки). - Установите параметры, которые будут измеряться во время анализа, и измерьте интенсивность отдельных пикселей в каждой маске для всех каналов флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Также необходимо рассчитать количество подобъектов, назначенных данному ядру клетки, и площадь каждого подобъекта. - Определите производные параметры, которые будут рассчитаны на основе полученных данных. Чтобы получить общую интенсивность флуоресценции для канала BrdU или мтДНК, суммируйте интенсивности всех субобъектов, назначенных данному ядру клетки. Чтобы получить среднюю интенсивность флуоресценции, разделите общую интенсивность флуоресценции на сумму площади подобъектов, присвоенных данному ядру клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что созданный субобъект (BrdU или пятно мтДНК) действительно находится в митохондриях, необходимо затворить их на основе интенсивности флуоресценции от красителя отслеживания митохондрий. - Выполните дальнейший анализ данных, полученных с помощью программного обеспечения ScanR, с помощью статистического программного обеспечения R 4.2.216 вместе со следующими пакетами: dplyr17, data.table18, ggplot219 и ggpubr20. Этот шаг не является обязательным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схема процедуры высокопроизводительного исследования динамики синтеза и распределения мтДНК представлена на рисунке 1. Использование многолуночного формата планшета позволяет одновременно анализировать множество различных экспериментальных условий, таких как сайленсинг различных генов с использованием библиотеки миРНК. Условия, используемые для мечения вновь синтезированных молекул ДНК BrdU, позволяют обнаруживать меченную BrdU ДНК в митохондриях клеток HeLa (рис. 2A), но также могут быть использованы в качестве отправных условий для настройки анализа для других типов клеток. Время инкубации с BrdU следует выбирать для отдельных клеточных линий на основе эксперимента по временному ходу (дополнительный рисунок 1). В настоящем исследовании использовались клетки HeLa, так как для скрининга миРНК требуются клетки, которые могут быть трансфицированы с высокой эффективностью. Важно отметить, что сигнал, полученный с помощью антител против BrdU, является специфическим, так как его можно наблюдать только в клетках, обработанных BrdU (рис. 2). Специфика маркировки анти-BrdU и анти-ДНК была дополнительно подтверждена с использованием клеток rho0, лишенных митохондриальной ДНК21 (дополнительный рисунок 2). Как и ожидалось, в этих клетках, независимо от лечения BrdU, в митохондриях не было обнаружено сигнала как для анти-BrdU, так и для антител против ДНК (рис. 2B). Количественная оценка флуоресцентного сигнала от антител против BrdU показала, что клетки rho0, обработанные BrdU, показали такой же низкий уровень флуоресценции, как и клетки, не обработанные BrdU, в то время как сигнал для родительских линий A549 и HeLa был в среднем в 50 раз выше (рис. 2C).
Чтобы показать полезность представленного здесь метода в изучении синтеза и распределения митохондриальной ДНК, был проведен эксперимент, в котором клетки HeLa обрабатывали 2',3'-дидезоксицитидином (ddC), ингибитором синтеза мтДНК22, а экспрессию генов, которые, как известно, необходимы для репликации мтДНК, подавляли с помощью миРНК (рис. 3). Обработка клеток ddC приводила к полному ингибированию инкорпорации BrdU, в то время как используемые миРНК имели различные эффекты. Подавление геликазы Twinkle (TWNK)23 привело к наиболее мощному торможению включения BrdU; более слабый эффект наблюдался для белкаTFAM 24, в то время как подавление митохондриальной ДНК-полимеразы гамма (POLG)25 приводило к умеренному снижению включения BrdU по сравнению с клетками, обработанными отрицательной контрольной миРНК (рис. 3A, B). Использование анти-ДНК-антител в процедуре позволяет контролировать распределение мтДНК в клетке в данных экспериментальных условиях. Подавление TFAM привело к резким изменениям в распределении мтДНК; было обнаружено меньше пятен мтДНК по сравнению с контрольными клетками, но те, которые остались, имели очень высокую интенсивность флуоресценции (рис. 3А). Количественная оценка среднего сигнала флуоресценции от антитела против ДНК показала увеличение в несколько раз при подавлении TFAM по сравнению с другими тестируемыми условиями (рис. 3C).
Специфичность результатов визуализации была проверена путем измерения уровней мтДНК и экспрессии генов с помощью количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР) (рис. 4). Этот метод был подробно описан в другом месте26. Лечение ddC привело к очень сильному снижению уровня мтДНК; более слабый эффект наблюдался в случае сайленсинга TFAM и TWNK, в то время как трансфекция клеток миРНК POLG оказывала очень скромное влияние на количество копий мтДНК (рис. 4А). Количественная оценка экспрессии TFAM и TWNK подтвердила эффективное снижение их экспрессии до ~15%-20% от контрольных уровней, в отличие от POLG, экспрессия которого на уровне мРНК была снижена до 30% (рис. 4B).
Рисунок 1: Схематическое изображение шагов протокола. Масштабные линейки для микроскопических изображений составляют 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Специфическое обнаружение включения BrdU в мтДНК антителами против BrdU. Образцы изображений клеток (A) HeLa и (B) A549 и A549 rho0, подвергнутых иммунофлуоресцентному окрашиванию антителами против BrdU (зеленый) и анти-ДНК (красный). Клетки обрабатывали или не обрабатывали раствором BrdU. Ядерная ДНК (синяя) была помечена Hoechst, а митохондрии (голубой) были визуализированы с помощью красителя, отслеживающего митохондрии. Показано объединенное изображение всех четырех каналов флуоресценции. Шкала представляет собой 10 мкм. (C) Результат количественного определения сигнала от антител против BrdU. Анализ проводился для четырех независимых биологических репликатов; каждый раз анализировалось 100 случайно выбранных клеток для каждого экспериментального условия (N = 400 клеток). В среднем на одну клетку было выявлено 18 очагов BrdU. Прямоугольники представляют собой первый и третий квартили межквартильного диапазона (IQR), медиана представлена горизонтальной линией, усы определяют минимум и максимум, а выбросы определяются как 1,5 x IQR. Был проведен статистический тест Крускала-Уоллиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Результаты ингибирования синтеза мтДНК, включая снижение эффективности включения BrdU и влияние на распределение нуклеоидов. (A) Образцы флуоресцентных изображений клеток HeLa, обработанных в течение 72 часов ddC или миРНК, которые подавляют белки, участвующие в репликации мтДНК. Клетки обрабатывали препаратом BrdU в течение 16 ч до фиксации. Ядерную ДНК (синюю) окрашивали Хёхстом, использовали антитела против BrdU (зеленый) и анти-ДНК (красный), а митохондрии помечали красителем для отслеживания митохондрий. Показано объединенное изображение всех четырех каналов флуоресценции. Масштабная линейка представляет собой 10 мкм. (B, C) Количественная оценка сигналов флуоресценции от (B) анти-BrdU и (C) анти-ДНК-антител. Анализ проводился для четырех независимых биологических репликатов; каждый раз для каждого экспериментального условия анализировалось 650 случайно выбранных клеток (N = 2,600 клеток). В среднем на одну клетку было обнаружено 18 очагов BrdU и 46 очагов мтДНК. Прямоугольники представляют собой первый и третий квартили межквартильного диапазона (IQR), медиана представлена горизонтальной линией, усы определяют минимум и максимум, а выбросы определяются как 1,5 x IQR. Был проведен статистический тест Крускала-Уоллиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Валидация эффективности ингибирования синтеза мтДНК и эффективности тестируемых миРНК. Клетки HeLa обрабатывали в течение 72 ч ddC или указанными миРНК, а затем подвергали выделению ДНК и РНК. (A) Результаты анализа уровня мтДНК с использованием кПЦР. (B) кПЦР-анализ изменений экспрессии генов в указанных условиях. Столбцы представляют собой средние значения четырех независимых биологических реплик; полосы погрешностей представляют собой SEM; был проведен статистический тест ANOVA; был проведен t-критерий для попарного сравнения с образцами Untr (необработанными). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Динамика включения BrdU в мтДНК клеток HeLa. Показаны результаты эксперимента с течением времени, в котором клетки инкубировали с 20 мкМ BrdU в течение заданного времени. Показаны средние значения четырех независимых реплик для каждого момента времени; В каждой реплике было проанализировано 900 случайно выбранных клеток. Столбцы представляют собой средства четырех реплик; был проведен статистический тест ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок 2: Валидация ячеек A549 rho0. (A) Электрофоретический анализ продуктов кПЦР из амплифицирующих фрагментов ДНК генов ND1, кодируемых мтДНК, и генов B2M, кодируемых ядерной ДНК. В качестве матриц в реакции использовали общую ДНК из клеток A549 или A549 rho0. (B) Результаты анализа уровня мтДНК с использованием кПЦР. Столбцы представляют собой средние значения четырех независимых биологических реплик; полосы погрешностей представляют собой SEM; Был проведен Т-критерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исторически сложилось так, что маркировка ДНК путем включения BrdU и обнаружения антител использовалась в репликации ядерной ДНК и исследованиях клеточного цикла 14,27,28. До сих пор все протоколы для обнаружения ДНК, меченной BrdU, включали стадию денатурации ДНК (кислую или термическую) или ферментное расщепление (ДНКазу или протеиназу) для обеспечения воздействия эпитопов и облегчения проникновения антител. Эти протоколы были разработаны для плотно упакованной ядерной ДНК. Однако различная организация мтДНК позволила разработать процедуру без этапа денатурации; Это упростило процедуру и сделало ее более подходящей для высокопроизводительных приложений. Этот подход принес отличные результаты, потому что пропуск этапа денатурации приводит к обнаружению меченной BrdU ДНК только вне ядра (рис. 2 и рис. 3). Следовательно, с помощью этого протокола можно избежать сильного сигнала от ядерной ДНК, который всегда присутствует при включении этапа денатурации и который может вызвать серьезную проблему, маскируя сигнал от меченной BrdU мтДНК29. Кроме того, отсутствие жесткой денатурации обеспечивает лучшую сохранность клеточных структур и не влияет на эффективность окрашивания флуоресцентными красителями, такими как краситель Hoechst или митохондрий (рис. 2 и рис. 3).
Динамика включения BrdU в мтДНК зависит от клеточной линии. При использовании новой клеточной линии рекомендуется проводить эксперимент по включению BrdU. Это исследование установило, что 16 ч является оптимальным временем инкубации BrdU для клеточных линий HeLa. Однако из-за биологической изменчивости линий HeLa из разных лабораторий30 предлагается провести эксперимент с временным ходом BrdU на конкретном варианте HeLa, с которым планируется работать.
Комбинация анти-BrdU и анти-ДНК-мечения в этом протоколе позволяет осуществлять мониторинг синтеза мтДНК и одновременное изучение распределения мтДНК в клетке. Это очень хорошо видно в клетках с глушением TFAM (рис. 3). Снижение уровня TFAM приводит к снижению синтеза мтДНК (снижение общего сигнала анти-BrdU) и кластеризации митохондриальных нуклеоидов, что проявляется существенным увеличением среднего сигнала флуоресценции мтДНК (рис. 3). Следует отметить, что в этом случае увеличение средней интенсивности флуоресценции мтДНК вызвано измененным распределением митохондриальных нуклеоидов и не отражает повышение уровня мтДНК; на самом деле уровни мтДНК снижаются, что выявлено количественным анализом ПЦР (рис. 4А). Удивительные результаты были получены для клеток, трансфицированных миРНК POLG (рис. 3). Можно было бы ожидать, что трансфекция клеток с миРНК-таргетингом POLG, который является репликативной ДНК-полимеразой в митохондриях, значительно уменьшит включение BrdU в мтДНК. Однако в этом исследовании влияние на инкорпорацию BrdU было незначительным (рис. 3), что дополнительно подтверждается измерением уровней мтДНК с помощью кПЦР (рис. 4A). Плохое подавление экспрессии POLG может объяснить этот, казалось бы, противоречивый результат при трансфекции клеток с нанесенной миРНК (рис. 4B). Это подчеркивает потенциальный недостаток использования миРНК для функциональных исследований и предполагает, что существует необходимость в проверке подавления генов.
В целом, был разработан анализ для изучения динамики метаболизма мтДНК в культивируемых клетках, который использует формат многолуночного планшета и иммунофлуоресцентную визуализацию для обнаружения и количественной оценки репликации, репарации и распределения мтДНК. Метод позволяет одновременно изучать множество различных экспериментальных условий. Его можно использовать для изучения влияния различных ингибиторов, клеточных стрессов и подавления генов на метаболизм мтДНК. Хотя анализ имеет высокий потенциал для использования при изучении метаболизма мтДНК в различных физиологических и патологических контекстах, следует отметить, что анализ не позволяет различать репликацию и синтез мтДНК, связанный с репарацией. Это следует учитывать при интерпретации результатов и планировании последующих функциональных экспериментов. Примечательно, что анализ имеет дальнейший потенциал для развития. Например, митохондриальные нуклеоиды, неактивные репликацией (или неактивные при репарации), не обнаруживаются антителами против BrdU. Таким образом, применение анти-ДНК-антител позволяет количественно определять уровни состояния мтДНК, количество нуклеоидов, не поддерживающих репликацию, и распределение нуклеоидов в клетке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным научным центром, Польша (номер гранта/премии: 2018/31/D/NZ2/03901).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,3′-Dideoxycytidine (ddC) | Sigma-Aldrich | D5782 | |
| 384 Well Cell Culture Microplates, black | Greiner Bio-One | #781946 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | B5002-1G | Dissolve BrdU powder in water to 20 mM stock solution and aliquot. Use 20 µM BrdU solution for labeling. |
| Adhesive sealing film | Nerbe Plus | 04-095-0060 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21121 | |
| Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21426 | |
| BioTek 405 LS microplate washer | Agilent | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Cell counting chamber Thoma | Heinz Herenz | REF:1080339 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Cytiva | SH30243.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635 | Formaldehyde is toxic; please read the safety data sheet carefully. |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| IgG1 mouse monoclonal anti-BrdU (IIB5) primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323 | |
| IgM mouse monoclonal anti-DNA (AC-30-10) primary antibody | Progen | #61014 | |
| LightCycler 480 System | Roche | ||
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | #13778150 | |
| MitoTracker Deep Red FM | Thermo Fisher Scientific | M22426 | Mitochondria tracking dye |
| Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 51985-042 | |
| Orca-R2 (C10600) CCD Camera | Hamamatsu | ||
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781-100ML | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| qPCR primer Fw B2M (reference) | CAGGTACTCCAAAGATTCAGG | ||
| qPCR primer Fw GPI (reference gene) | GACCTTTACTACCCAGGAGA | ||
| qPCR primer Fw MT-ND1 | TAGCAGAGACCAACCGAACC | ||
| qPCR primer Fw POLG | TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC | ||
| qPCR primer Fw TFAM | GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT | ||
| qPCR primer Fw TWNK | GCCATGTGACACTGGTCATT | ||
| qPCR primer Rev B2M (reference) | GTCAACTTCAATGTCGGATGG | ||
| qPCR primer Rev GPI (reference gene) | AGTAGACAGGGCAACAAAGT | ||
| qPCR primer Rev MT-ND1 | ATGAAGAATAGGGCGAAGGG | ||
| qPCR primer Rev POLG | GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG | ||
| qPCR primer Rev TFAM | GGACTTCTGCCAGCATAATA | ||
| qPCR primer Rev TWNK | AACATTGTCTGCTTCCTGGC | ||
| ScanR microscope | Olympus | ||
| siRNA Ctrl | Dharmacon | D-001810-10-5 | |
| siRNA POLG | Invitrogen | POLGHSS108223 | |
| siRNA TFAM | Invitrogen | TFAMHSS144252 | |
| siRNA TWNK | Invitrogen | C10orf2HSS125597 | |
| Suction device | NeoLab | 2-9335 | Suction device for cell culture |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| Trypsin | Biowest | L0931-500 | |
| UPlanSApo 20x 0.75 NA objective | Olympus |
References
- Brown, G. C. Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells. The Biochemical Journal. 284, 1-13 (1992).
- Zhang, L., et al. Biochemical basis and metabolic interplay of redox regulation). Redox Biology. 26, 101284 (2019).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: Mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
- Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Mitochondrial TCA cycle metabolites control physiology and disease. Nature Communications. 11 (1), 102 (2020).
- Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. Mitochondrial control of cellular life, stress, and death. Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).
- Rone, M. B., Fan, J., Papadopoulos, V. Cholesterol transport in steroid biosynthesis: role of protein-protein interactions and implications in disease states. Biochimica Et Biophysica Acta. 1791 (7), 646-658 (2009).
- Swenson, S. A., et al. From synthesis to utilization: The ins and outs of mitochondrial heme. Cells. 9 (3), 579 (2020).
- West, A. P., Shadel, G. S., Ghosh, S.
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: In sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Pohjoismäki, J. L. O., Goffart, S. Of circles, forks and humanity: Topological organisation and replication of mammalian mitochondrial DNA. BioEssays. 33 (4), 290-299 (2011).
- Gustafsson, C. M., Falkenberg, M., Larsson, N. -G. Maintenance and expression of mammalian mitochondrial DNA. Annual Review of Biochemistry. 85, 133-160 (2016).
- Nicholls, T. J., Gustafsson, C. M. Separating and segregating the human mitochondrial genome. Trends in Biochemical Sciences. 43 (11), 869-881 (2018).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: Improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2021).
- Wickham, H., François, R., Henry, L., Müller, K. dplyr: A Grammar of Data Manipulation. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=dplyr (2021).
- Dowle, M., Srinivasan, A. data.table: Extension of `data.frame. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=data.table (2020).
- Wickham, H. ggplot2: Elegant graphics for data analysis. , Available from: https://ggplot2.tidyverse.org (2016).
- Kassambara, A. ggpubr: "ggplot2" based publication ready plots. , Available from: https://CRAN.R-project.org/package=ggpubr (2020).
- Hashiguchi, K., Zhang-Akiyama, Q. -M. Establishment of human cell lines lacking mitochondrial DNA. Methods in Molecular Biology. 554, 383-391 (2009).
- Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., Bartnik, E. Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochimica Polonica. 53 (3), 485-495 (2006).
- Spelbrink, J. N., et al. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria. Nature Genetics. 28 (3), 223-231 (2001).
- Campbell, C. T., Kolesar, J. E., Kaufman, B. A. Mitochondrial transcription factor A regulates mitochondrial transcription initiation, DNA packaging, and genome copy number. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (9-10), 921-929 (2012).
- Krasich, R., Copeland, W. C. DNA polymerases in the mitochondria: A critical review of the evidence. Frontiers in Bioscience. 22 (4), 692-709 (2017).
- Kotrys, A. V., et al. Quantitative proteomics revealed C6orf203/MTRES1 as a factor preventing stress-induced transcription deficiency in human mitochondria. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7502-7517 (2019).
- Gratzner, H. G., Pollack, A., Ingram, D. J., Leif, R. C. Deoxyribonucleic acid replication in single cells and chromosomes by immunologic techniques. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 24 (1), 34-39 (1976).
- Leif, R. C., Stein, J. H., Zucker, R. M. A short history of the initial application of anti-5-BrdU to the detection and measurement of S phase. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (1), 45-52 (2004).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) biogenesis: visualization and duel incorporation of BrdU and EdU into newly synthesized mtDNA in vitro. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Liu, Y., et al. Multi-omic measurements of heterogeneity in HeLa cells across laboratories. Nature Biotechnology. 37 (3), 314-322 (2019).
