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Biology

प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुप्रस्थ वर्गों और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट को अनरोल्ड करने के लिए बेहतर तरीके

Published: September 22, 2023 doi: 10.3791/65239
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

Summary

मक्के के पत्तों के प्रिमोर्डिया को गहराई से घेरा और लुढ़का जाता है, जिससे उनका अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। यहां, हम प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुप्रस्थ खंड तैयार करने और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट को अनरोल करने के तरीके प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मक्का (ज़िया मेस) और अन्य घासों (पोएसी) में, पत्ती प्रिमोर्डिया को पत्ती के भीतर गहराई से घेरा और घुमाया जाता है, जिससे पत्ती के शुरुआती विकास का अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है। यहां, हम प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुप्रस्थ वर्गों और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट तैयार करने के तरीकों का वर्णन करते हैं। पहली विधि पुरानी पत्तियों के ऊपरी हिस्सों को हटाने के लिए एक तार स्ट्रिपर का उपयोग करती है, पत्ती प्रिमोडियम की नोक को उजागर करती है और अधिक सटीक अनुप्रस्थ खंड नमूनाकरण के लिए इसके माप की अनुमति देती है। दूसरी विधि इमेजिंग के लिए पूरे पत्ती प्रिमोर्डिया को अनरोल और माउंट करने के लिए स्पष्ट, डबल-साइडेड नैनो टेप का उपयोग करती है। हम मक्का में फ्लोरोसेंट प्रोटीन संवाददाताओं की कल्पना और विश्लेषण में दो तरीकों की उपयोगिता दिखाते हैं। ये विधियां मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया की विशिष्ट आकृति विज्ञान द्वारा प्रस्तुत चुनौतियों का समाधान प्रदान करती हैं और मक्का और अन्य घास प्रजातियों में पत्ती शारीरिक और विकासात्मक लक्षणों की कल्पना और मात्रा निर्धारित करने के लिए उपयोगी होंगी।

Introduction

घास की फसलें वैश्विक आबादीके लिए भोजन और जैव ईंधन का एक प्रमुख स्रोत हैं1, और पत्ती शरीर रचना में सुधार से उनकी उत्पादकता 2,3 बढ़ाने की क्षमता है। हालांकि, घास में पत्ती शरीर रचना विज्ञान को कैसे विनियमित किया जाता है, इसकी हमारी वर्तमानसमझ सीमित है और पत्ती प्रिमोर्डिया के विश्लेषण की आवश्यकता है, क्योंकि पत्ती के कई शारीरिक और शारीरिक लक्षण विकास में पूर्वनिर्धारित हैं 5,6,7. सेलुलर इमेजिंग तकनीक, जैसे फ्लोरेसेंस और कॉन्फोकल इमेजिंग, घास पत्ती शरीर रचना विज्ञान और सेलुलर लक्षणों का अध्ययन करने के लिए अपरिहार्य हैं, लेकिन इन तकनीकों को घास पत्ती प्रिमोर्डिया पर लागू करना मुश्किल है क्योंकि वे पत्ती के भीतर गहराई से घिरे और लुढ़के हुए हैं। हमने इस मुद्दे को अनुप्रस्थ वर्गों को तैयार करने के तरीकों को विकसित करके संबोधित किया और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल विश्लेषण के लिए पूरे पत्ते के माउंट को अनरोल किया, जो घास पत्ती शरीर रचना विज्ञान और विकास का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणालीहै।

मक्का की पत्ती, सभी घास की पत्तियों की तरह, एक पट्टे जैसी ब्लेड से बनी होती है, जिसमें एक म्यान होता है जो तने के चारों ओर लपेटता है और 9,10,11,12,13 का विकास करता है। पत्तियां शूट एपिकल मेरिस्टेम (एसएएम) से एक डिस्टिकस पैटर्न में विकसित होती हैं, जहां प्रत्येक नई पत्ती पिछली पत्ती के विपरीत स्थिति में शुरू होती है, जिसके परिणामस्वरूप ऊर्ध्वाधर अक्ष (चित्रा 1 ए)14 के साथ पत्तियों के दो रैंक होते हैं। प्रत्येक पत्ती प्रिमोडियम के विकास चरण को एसएएम के सापेक्ष इसकी स्थिति से पहचाना जाता है, जिसमें निकटतम प्रिमोडियम को प्लास्टोक्रोन 1 (पी 1) के रूप में नामित किया जाता है और निम्नलिखित प्रिमोर्डिया को पी 2, पी 3, और इसी तरह (चित्रा 1 बी, सी)2 के रूप में नामित किया जाता है। विकास के दौरान (चित्रा 1 डी), पत्ती प्रिमोडियम पहले एसएएम (पी 1) के आधार के चारों ओर अर्धचंद्राकार पुष्ट के रूप में दिखाई देता है, और फिर एक हुड के आकार के प्राइमोडियम में बढ़ता है जो मेरिस्टेम (पी 2) 9,10,11 पर फैला होता है। हुड के बेसल मार्जिन तब पार्श्व रूप से फैलते हैं और एक-दूसरे को ओवरलैप करते हैं क्योंकि नोक ऊपर की ओर बढ़ती है, जिससे शंकु के आकार का प्राइमोडियम (पी 3-पी 5)10 बनता है। प्रिमोडियम तब तेजी से लंबाई में बढ़ता है, और आधार पर शीथ-ब्लेड सीमा लिगुल के गठन के साथ अधिक प्रमुख हो जाती है, पत्ती के अक्षीय पक्ष (पी 6 / पी 7) पर फ्रिंज जैसा प्रक्षेपण। अंत में, स्थिर-अवस्था विकास के दौरान पत्ती खुलती है क्योंकि यह छिद्र से निकलती है, जिसमें विभाजित कोशिकाएं ब्लेड के छोटे बेसल क्षेत्र के भीतर प्रतिबंधित होती हैं, जिससे समीपस्थ-डिस्टल अक्ष (पी 7 / पी 8) 15 के साथ कोशिकाओं के विस्तार और अंतर के साथ एक ढाल बनती है। मक्का अंकुर के शूट एपेक्स में विकास के विभिन्न चरणों में कई प्रिमोर्डिया होते हैं, जिससे यह पत्ती के विकास का अध्ययनकरने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बन जाता है।

प्रारंभिक पत्ती के विकास के सटीक विश्लेषण के लिए अन्य विकास या रूपात्मक मापदंडों के संबंध में प्राइमोडियम विकास के अलग-अलग चरणों को परिभाषित करने के लिए स्टेजिंग या मानकीकृत मानदंडों के उपयोग की आवश्यकता होती है। चूंकि पत्ती प्रिमोर्डिया घास की शूटिंग के भीतर छिपी होती है, इसलिए जांचकर्ता आमतौर पर पौधे की उम्र या उभरती पत्तियों के आकार जैसे मापदंडों का उपयोग पत्ती प्रिमोर्डिया 9,16 के चरणों और आकारों के लिए भविष्यवाणियों के रूप में करते हैं। मक्का में, पौधे की कालानुक्रमिक आयु या तो रोपण या अंकुरण (डीएपी / डीएजी) 17,18 के बाद के दिनों की संख्या से निर्धारित की जाती है। वानस्पतिक अवस्था (वी चरण) को एक दृश्य कॉलर के साथ सबसे ऊपरी पत्ती द्वारा निर्धारित किया जाता है, ब्लेड और म्यान के बीच अक्षीय पक्ष पर एक पीली रेखा जो लिगुल और ऑरिकल्स की स्थिति से मेल खाती है, ब्लेड के आधार पर वेज के आकार के क्षेत्रों की एक जोड़ी (चित्रा 1 ए, बी) 17,19। 20 और 25 डीएजी के बीच, एसएएम एक पुष्पक्रम मेरिस्टेम में बदल जाता है औरनई पत्तियों का उत्पादन बंद कर देता है। मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया की वृद्धि दर पर्यावरण और पौधे के जीनोटाइप के आधार पर भिन्न हो सकती है। इस कारण से, पौधे की उम्र और उभरती पत्तियों का आकार पत्ती प्रिमोर्डिया के आकार की सटीक भविष्यवाणी नहीं कर सकता है; हालांकि, इन मापदंडों का उपयोग प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए प्रिमोर्डिया चरणों और आकारों की सीमा की भविष्यवाणी करने में मदद कर सकता है।

अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण मक्का और अन्य घासों में पत्ती शरीर रचना विज्ञान और विकास की जांच के लिए एक लोकप्रिय तरीका है क्योंकि यह शूट21,22,23 में एक ही खंड में कई प्लास्टोक्रॉन के नमूने की अनुमति देता है। यह विधि ताजा नमूनों की सेलुलर इमेजिंग के लिए भी सुविधाजनक है, क्योंकि आसपास की पत्तियां एक मचान के रूप में काम करती हैं जो सेक्शनिंग और माउंटिंग24 के दौरान लीफ प्रिमोर्डिया को जगह में रखती हैं। हालांकि, इस विधि का एक नुकसान यह है कि एक बरकरार शूट से अलग करते समय प्राइमोडियम के भीतर लक्ष्य प्लास्टोक्रोन और क्षेत्र का सटीक रूप से पता लगाना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अलावा, क्योंकि पत्ती की वृद्धि प्लास्टोक्रोन में और समीपस्थ-डिस्टल अक्ष2,5 के साथ भिन्न होती है, इसलिए गलत नमूने के परिणामस्वरूप किसी दिए गए खंड में प्राइमोडियम के विकास चरण और क्षेत्र की गलत व्याख्या हो सकती है। इसलिए, घास पत्ती प्रिमोर्डिया के शारीरिक और विकासात्मक विश्लेषण की सटीकता और प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए सटीक अनुप्रस्थ अनुभाग नमूनाकरण के लिए एक विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है।

होल-लीफ माउंट विश्लेषण ऊतक और सेलुलर प्रक्रियाओं की व्यापक और एकीकृत जांच को सक्षम बनाता है जो पूरे अंग के पैमाने पर होते हैं, जैसे कि प्रोलिफेरेटिव ग्रोथ25 और नसपैटर्निंग 26,27,28। विधि पत्ती का एक पैराडर्मल अवलोकन प्रदान करती है, जिससे अलग-अलग प्रक्रियाओं और पैटर्न की खोज होती है जो अन्यथा अनुप्रस्थ अनुभाग विश्लेषण24,27 का उपयोग करके पता लगाना मुश्किल होगा। एराबिडोप्सिस के विपरीत, जहां29,30 के पूरे पत्ते के माउंट की इमेजिंग के लिए पहले से ही स्थापित तरीके हैं, वर्तमान में घास में अनरोल्ड होल-लीफ माउंट की इमेजिंग के लिए कोई मानक विधि नहीं है। पृथक मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया को उतारने के लिए एक पिछले प्रोटोकॉल में असामान्य सामग्री शामिल थी और सेलुलर इमेजिंग31 के लिए उपयुक्त नहीं थी। उन्नत इमेजिंग तकनीक, जैसे कि कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), प्रिमोर्डिया 11,32,33 को अलग और अनरोल किए बिना 3 डी शारीरिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन वे महंगे हैं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। मक्का और अन्य घासों में पत्ती प्रिमोर्डिया के लुढ़के और शंक्वाकार आकृति विज्ञान द्वारा लगाए गए बाधाओं को दूर करने के लिए एक तकनीक विकसित करना उनके शारीरिक और विकासात्मक लक्षणों में जांच को आगे बढ़ाएगा।

यहां, हम प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए अनुप्रस्थ खंड तैयार करने और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट को अनरोल करने के तरीके प्रस्तुत करते हैं। हमने इन तरीकों का उपयोग नस संख्या को मापने और फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) 24 के साथ मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया में स्थानिक-अस्थायी हार्मोन वितरण को मैप करने के लिए किया। पहली विधि में तार स्ट्रिपर (चित्रा 1 ई) के साथ मक्का के पौधों से पुरानी पत्तियों के ऊपरी हिस्से को हटाना शामिल है। प्राइमोडियम (पी 5-पी 7) की नोक को उजागर करके, पुराने आसपास के पत्तों को पूरी तरह से हटाने के बिना इसकी लंबाई निर्धारित करना संभव हो जाता है, इस प्रकार आसान और सटीक सेक्शनिंग सक्षम होती है। दूसरी विधि में स्पष्ट, डबल-पक्षीय नैनो टेप (चित्रा 1 एफ) के साथ पूरे पत्ती प्रिमोर्डिया (पी 3-पी 7) को अनरोलिंग और माउंट करना शामिल है। ये विधियां विभिन्न एफपी24 की कल्पना करने के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन फ्लोरोसेंट रंजक और समाशोधन अभिकर्मकों का उपयोग करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है। इसके अलावा, हम इमेजजे / फिजी34 में चपटे जेड-स्टैक, सिलाई छवियों और विलय चैनलों के लिए कुछ प्रक्रियाओं की रूपरेखा तैयार करते हैं, जो दो तरीकों द्वारा उत्पादित छवियों पर लागू होते हैं। ये विधियां मक्का के पत्तों की नियमित प्रतिदीप्ति या कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए उपयोगी हैं, लेकिन उन्हें अन्य मॉडल घास प्रजातियों, जैसे चावल, सेतारिया और ब्रैकीपोडियम के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया का संगठन और आकृति विज्ञान और विधियों का अवलोकन । (ए) मक्का अंकुर का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। मक्का में एक डिस्टिकस फाइलोटैक्सी होती है, जिसमें नई पत्ती पिछली पत्ती के विपरीत स्थिति में शुरू होती है। पत्ती संख्या कालानुक्रमिक क्रम को इंगित करती है जिसमें पत्तियां अंकुरण से उभरी हैं (यानी, पहली पत्ती, एल 1; दूसरी पत्ती, एल 2; तीसरी पत्ती, एल 3; आदि)। प्रत्येक पत्ती में एक डिस्टल ब्लेड और एक बेसल म्यान होता है जिसे एक कॉलर द्वारा चित्रित किया जाता है जो लिगुल और ऑरिकल से मेल खाता है। कॉलर के साथ सबसे ऊपरी पत्ती दिखाई देती है जो वनस्पति अवस्था को दर्शाती है। इस उदाहरण में अंकुर वी 2 चरण में है, जिसमें एल 2 कॉलर (तीर) दिखाई देता है। कैंची आइकन मेसोकोटिल (मी) में उस स्थान को इंगित करता है जहां अंकुर को एकत्र करने के लिए काटा जाना चाहिए। (बी) विच्छेदित शूट का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व जिसमें अलग-थलग एल 1 से एल 4 दिखाया गया है, जिसमें पत्ती प्रिमोर्डिया एल 5 से एल 9 को (सी) में एक बढ़ी हुई छवि के रूप में दिखाया गया है। प्लास्टोक्रोन संख्या एसएएम के सापेक्ष प्राइमोडियम की स्थिति को इंगित करती है, जिसमें सबसे कम उम्र की पत्ती प्रिमोडियम (पी 1) एसएएम के सबसे करीब है और पुरानी पत्ती प्रिमोर्डिया (पी 2, पी 3, पी 4, और इसी तरह) क्रमिक रूप से2 से दूर है। (डी) पी 1 से पी 5 तक मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया की आकृति विज्ञान का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ई) मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण के लिए विधि का योजनाबद्ध अवलोकन। (1) पुरानी पत्तियों को तार स्ट्रिपर से ट्रिम करें। (2) प्राइमोडियम को मापें और शूट को सेक्शन करें। (3) इमेजिंग और प्रसंस्करण के लिए एक स्लाइड पर अनुभाग माउंट करें (4, 5). (च) मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे-माउंट विश्लेषण के लिए विधि का योजनाबद्ध अवलोकन। (1) प्राइमोडियम निकालने के लिए आसपास की पत्तियों को हटा दें। (2) नैनो टेप पर प्राइमोडियम फ्लैट को काटें और अनरोल करें। (3) इमेजिंग और प्रसंस्करण के लिए नमूना माउंट करें (4, 5). संक्षेप: एल = पत्ती; बीएल = ब्लेड; एसएच = म्यान; सीओ = कॉलर; मी = मेसोकोटिल; वी = वानस्पतिक; पी = प्लास्टोक्रॉन; एसएएम = शूट एपिकल मेरिस्टेम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

1. मक्का पत्ती के विकास का मंचन और प्रयोग को डिजाइन करना

  1. पौधों को उगाना और पत्ती के विकास का मंचन करना
    1. प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले पौधों की आयु और विकास चरण का निर्धारण करें और पत्ती के विकास का विस्तृत मंचन करें।
      नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि मंचन उत्परिवर्ती या ट्रांसजेनिक लाइनों के समान आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले पौधों पर किया जाए जो प्रयोगों में उपयोग किए जाएंगे। एसएएम आनुवंशिक पृष्ठभूमि और विकास की स्थिति के आधार पर 20 से 25 डीएजी के बीच नई पत्तियों का उत्पादन बंद कर देता है। इस कारण से, यहां वर्णित विधियां 7-14 डीएजी आयु वर्ग के मक्का रोपाई के लिए आदर्श हैं।
    2. एक उपयुक्त पौधे देखभाल प्रोटोकॉल35 का पालन करते हुए एक ग्रीनहाउस या विकास कक्ष में मक्का के पौधों को उगाएं।
    3. पौधों को वांछित आयु या वी चरण में एक छोटे चाकू या कैंची की जोड़ी के साथ मेसोकोटिल पर काटकर इकट्ठा करें, जो मिट्टी की सतह के नीचे का तना है (चित्र 1 ए)। अंकुर के बगल में मिट्टी में काटने के उपकरण को सावधानी पूर्वक डालें और मेसोकोटिल को काटने के लिए इसे 45 डिग्री कोण पर आधार पर नीचे स्लाइड करें।
    4. अंकुर को मिट्टी से बाहर निकालें और किसी भी शेष गंदगी या मिट्टी के कणों को दूर करें जो पौधे से चिपके हो सकते हैं। हाथ से युवा पौधों में उभरते शूट को कवर करने वाले सुरक्षात्मक आवरण, कोलोप्टाइल को हटा दें।
    5. प्रत्येक पौधे के लिए, वी चरण, पत्तियों की संख्या और व्हरल से निकलने वाली अंतिम पत्ती की लंबाई रिकॉर्ड करें। भविष्य के संदर्भ के लिए पौधों की तस्वीरें लें।
    6. पुराने पत्तों को एक-एक करके हटा दें। ऐसा करने के लिए, पौधे को मेसोकोटिल या तने के अवशेषों से पकड़ें, और म्यान के आधार से प्रत्येक पत्ती को उत्पाद ति करें और धीरे से एक दंत जांच (चित्रा 1 बी) के साथ एक चक्कर लगाने वाले फैशन में म्यान को फहराएं।
      नोट: आसपास की पत्तियों को हटाने के लिए एक त्वरित विधि के लिए चरण 2.1 देखें।
    7. लगभग 2x आवर्धन पर एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, नमूने को सूखने से रोकने के लिए नम पोंछे पर शूट एपेक्स के बाकी हिस्सों को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें। धीरे-धीरे प्रत्येक पत्ती प्रिमोडियम को एक मुड़ी हुई सुई या बारीक बल की एक जोड़ी के साथ दंत जांच के साथ तब तक घुमाएं जब तक कि एसएएम, पी 1, और पी 2 दिखाई न दें (चित्रा 1 डी)। प्रत्येक प्लास्टोक्रॉन की उपस्थिति और माप रिकॉर्ड करें।
      नोट: पूरक फ़ाइल 1 में मक्का के पौधों में पत्ती विकास मंचन का एक उदाहरण देखें।
  2. प्रयोग की योजना बनाना
    नोट: प्रयोग की सावधानीपूर्वक योजना बनाने से दक्षता में सुधार हो सकता है। उदाहरण के लिए, अनुप्रस्थ अनुभाग विश्लेषण में, विशिष्ट प्लास्टोक्रोन या क्षेत्रों की इमेजिंग करते समय काटने के लिए अनुमानित स्थान निर्धारित करना विच्छेदन समय को कम कर सकता है। चित्रा 2 मानकीकृत नमूनाकरण का एक उदाहरण दिखाता है। इसके अलावा, एफपी या फ्लोरोसेंट जांच के गुणों के आधार पर इमेजिंग मापदंडों को अनुकूलित करने से प्रयोगों की दक्षता में सुधार हो सकता है।
    1. विशिष्ट प्लास्टोक्रोन, प्रिमोडियम क्षेत्रों और ऊतकों पर प्रयोग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक गाइड के रूप में स्टेजिंग जानकारी का उपयोग करें। कुछ नमूनों पर नीचे अनुभाग 2 और / या 3 का पालन करने के लिए एफपी या रुचि के अन्य फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करें।
      नोट: https://www.maizegdb.org/data_center/stock पर उपलब्ध मक्का एफपी मार्कर लाइन 36-42 बीज स्टॉक देखें।
    2. प्रत्येक एफपी रिपोर्टर या जांच के लिए इष्टतम छवि अधिग्रहण पैरामीटर निर्धारित करें, जिसमें उपयुक्त डिटेक्टर या फ़िल्टर, उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, पिनहोल आकार और अन्य सेटिंग्स शामिल हैं। प्रत्येक प्रयोग के लिए कार्य परिस्थितियों को पुन: उत्पन्न करने के लिए सेटिंग्स सहेजें.
      नोट: विकासशील पत्तियों के कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी के लिए कुछ तकनीकी दिशानिर्देशों के लिए लिन्ह और स्कार्पेला30 देखें।
    3. एफपी रिपोर्टर43 के आधे जीवन और अन्य गुणों के आधार पर इमेजिंग समय की योजना बनाएं।
      नोट: एक प्रयोग की योजना बनाते समय विच्छेदन और इमेजिंग के बीच के समय पर भी विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि इस अवधि के दौरान ताजा पौधे के नमूने निर्जलीकरण और सेलुलर परिवर्तनों के अधीन होते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण के लिए नमूना योजना। (ए, बाएं) 7 डीएजी मक्का अंकुर का समीपस्थ शूट, पी 7 पर एक उजागर चौथी पत्ती (एल 4) दिखाता है। टूटी हुई रेखाएं प्रिमोडियम के साथ सात नमूना बिंदुओं को इंगित करती हैं, 0.5 मिमी से 10 मिमी तक (ए, दाएं) पत्ती प्रिमोर्डिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, प्रत्येक प्लास्टोक्रॉन के अनुमानित आकार और स्थिति के साथ: पी 7 (सफेद); पी 6 (मैजेंटा); पी 5 (नीला); पी 4 (हरा); और एसएएम (पीला) तक पी 3। (B-H) अनुप्रस्थ वर्गों की प्रतिदीप्ति छवियां 10 मिमी (बी) से 0.5 मिमी (एच) तक ए में दिखाए गए नमूना बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रिमोर्डिया (ए) में प्लास्टोक्रोन रंग योजना के अनुसार छद्म रंग हैं। अनुभागों को ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए लॉन्गपास-उत्सर्जन यूवी फिल्टर का उपयोग करके एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था। स्केल बार = 200 μm (B-H)। इस आंकड़े को रोबिल और मैकस्टीन24 से अनुमति के साथ संशोधित और पुन: पेश किया गया है। संक्षेप: डीएजी = अंकुरण के बाद के दिन; पी = प्लास्टोक्रॉन; एसएएम = शूट एपिकल मेरिस्टेम; † = पत्ती म्यान या पूर्व-लिगुल उचित; * = शूट एपिकल मेरिस्टेम; ** = स्टेम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ वर्गों की इमेजिंग

  1. आसपास की पुरानी पत्तियों को अलग करना और पत्ती प्राइमोडियम को मापना
    1. अंकुर को मिट्टी की सतह के नीचे मेसोकोटिल पर एक छोटे चाकू या कैंची की जोड़ी से सावधानीपूर्वक काटकर इकट्ठा करें, जैसा कि चरण 1.1.3-1.1.4 (चित्रा 1 ए) में वर्णित है।
    2. उपयोग किए जाने वाले सही तार स्ट्रिपर छेद का आकार निर्धारित करें और शूट के साथ कट कहां बनाया जाएगा। सुनिश्चित करें कि छेद लक्ष्य प्राइमोडियम को फिट करने के लिए पर्याप्त बड़ा है।
    3. शूट के अधिक बाहर के हिस्से को काटना शुरू करें और धीरे-धीरे आधार की ओर काम करें जब तक कि प्राइमोडियम की नोक उजागर न हो जाए।
    4. कट बनाने के लिए, वायर स्ट्रिपर को शूट के सामने जबड़े के साथ पकड़ें। शूट को चयनित छेद पर रखें और पत्ती के छेद को काटने के लिए स्ट्रिपर हैंडल को एक साथ निचोड़ें।
      नोट: गलती से लक्ष्य प्राइमोडियम को काटने से बचने के लिए, तार स्ट्रिपर में छेद के साथ शूट के केंद्र को सावधानीपूर्वक संरेखित करें। बड़े पौधों के लिए, स्ट्रिपर का उपयोग करने से पहले हाथ से आसपास की कुछ पत्तियों को मैन्युअल रूप से हटाने की सिफारिश की जाती है।
      सावधानी: वायर स्ट्रिपर्स में तेज जबड़े होते हैं जो सावधानी से उपयोग नहीं किए जाने पर कट या अन्य चोटों का कारण बन सकते हैं।
    5. हैंडल को एक साथ निचोड़ना जारी रखते हुए, पत्तियों के ऊपरी हिस्से को ट्रिम करने के लिए स्ट्रिपर को शूट से दूर स्लाइड करें। सुनिश्चित करें कि प्राइमोडियम में लक्ष्य क्षेत्र आसपास की पत्तियों से घिरा रहता है (पूरक चित्र एस 1 सी, डी)।
      नोट: ऊपरी पत्तियों को ट्रिम करने के बाद, शूट को एक उजागर प्राइमोडियम टिप (पी 5, पी 6, या पी 7) के साथ छोड़ दिया जाता है, जो कट की स्थिति और उपयोग किए गए वायर स्ट्रिपर छेद के आकार पर निर्भर करता है; चित्रा 1 ई)। यह प्रिमोडियम युवा प्रिमोर्डिया के आकार और चरण का अनुमान लगाने के लिए संदर्भ के रूप में काम करेगा। पी 6 अपने आकार की सीमा और पिन जैसी आकृति विज्ञान के कारण मक्का के पौधों में उपयोग के लिए सबसे व्यावहारिक संदर्भ है।
    6. प्राइमोडियम की नोक से शूट के आधार तक की लंबाई को मापने के लिए एक शासक का उपयोग करें। माप रिकॉर्ड करें।
      नोट: प्राइमोडियम की लंबाई को थोड़ा कम करके आंका जाएगा क्योंकि प्रिमोर्डिया के आधार पर कुछ मिलीमीटर स्टेम होते हैं (चित्रा 2 ए)।
  2. लीफ प्रिमोडियम की फ्रीहैंड सेक्शनिंग और इमेजिंग।
    1. लगभग 0.8x आवर्धन पर एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, शूट को एक चिकनी सतह पर स्थिर रखें, जैसे कि ग्लास कटिंग बोर्ड या अन्य खरोंच प्रतिरोधी सामग्री। प्राइमोडियम की लंबाई के साथ वांछित बिंदुओं पर शूट के पतले वर्गों (0.25-0.8 मिमी) को काटने के लिए रेजर ब्लेड या स्केलपेल का उपयोग करें।
    2. शूट के बाहर के हिस्से को छोड़ने के लिए लक्ष्य क्षेत्र से थोड़ा ऊपर एक प्रारंभिक कट बनाएं, और फिर लक्ष्य क्षेत्र के चारों ओर पतले खंड प्राप्त करें। साफ कट बनाने के लिए, ब्लेड को शूट के लंबवत पकड़ें और इसे चिकनी, यहां तक कि गति के साथ अंदर की ओर स्लाइड करें।
      नोट: बड़े प्राइमोर्डिया (पी 6 या पी 7) के लिए कुछ मिलीमीटर सेक्शनिंग छूट हो सकती है। हालांकि, छोटे प्रिमोर्डिया (पी 5 और पहले) के लिए, 1 मिमी नमूनाकरण में महत्वपूर्ण अंतर कर सकता है, क्योंकि ये प्रिमोर्डिया शूट के आधार के पहले कुछ मिलीमीटर के भीतर ढेर हो जाते हैं ( चित्रा 2 ए, एफ-एच देखें)। बेहतर सेक्शनिंग के लिए दोधारी रेजर ब्लेड का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
      सावधानी: किसी भी आकस्मिक कट या चोटों से बचने के लिए रेजर ब्लेड और स्केलपेल का उपयोग करते समय सावधानी बरतें।
    3. रेजर ब्लेड को नियमित रूप से बदलें, क्योंकि पत्ती म्यान आसानी से ब्लेड को सुस्त कर सकते हैं। नमूने को सूखने से बचाने के लिए सेक्शनिंग के प्रत्येक दौर के बाद शूट को नम वाइप्स के साथ कवर करें।
    4. पत्ती अनुभाग को एक साफ ग्लास स्लाइड (75 मिमी x 25 मिमी) पर माउंट करें, सीधे अनुभाग पर पानी की एक बूंद (या 50% ग्लिसरॉल) लागू करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, और शीर्ष पर एक कवरस्लिप (22 मिमी x 22 मिमी) रखें।
    5. यदि फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग कर रहे हैं, तो डाई समाधान को अनुभाग में लागू करें, शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें, और आवश्यकतानुसार इसे इनक्यूबेट करें।
      नोट: डाई के प्रकार के आधार पर, अगले चरण में आगे बढ़ने से पहले पत्ती अनुभागों को संसाधित करने के लिए अतिरिक्त कदम आवश्यक हो सकते हैं। ये संदर्भ44,45,46,47 प्लांट सेल इमेजिंग में फ्लोरोसेंट रंगों के सामान्य विवरण और उपयोग प्रदान करते हैं। एक न्यूक्लियस-स्टेनिंग फ्लोरोसेंट डाई, 5-एथिनाइल-2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू), मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया48 के अनुप्रस्थ वर्गों पर प्रभावी ढंग से उपयोग किया गया है। इसके विपरीत, प्लाज्मा झिल्ली-धुंधला रंग, जैसे फी माओ 4-64 (एफएम 4-64) और प्रोपिडियम आयोडाइड, संतोषजनक परिणाम नहीं देते हैं (चित्रा 3 ए-डी)।
    6. स्लाइड को एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें और फ्लोरोफोरे30 की कल्पना करने के लिए आवश्यकतानुसार फोकस और सेटिंग्स को समायोजित करें। चयनित मक्का एफपी रिपोर्टर लाइनों के लिए उपयोग की जाने वाली रोशनी और छवि अधिग्रहण सेटिंग्स के लिए तालिका 1 देखें।
      नोट: मोटे खंड पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस के उच्च स्तर का उत्पादन कर सकते हैं। कुछ इमेजिंग और नमूना तैयारी रणनीतियों पर विचार करें जो इस समस्या को कम करने में मदद कर सकते हैं30,49 (तालिका 2 देखें)।
      सावधानी: आंखों की क्षति के जोखिम को कम करने के लिए शक्तिशाली प्रकाश स्रोतों और लेजर के साथ काम करते समय सावधानी बरतें और सुरक्षात्मक चश्मा पहनें।
    7. विभिन्न आवर्धन और पहचान चैनलों (उज्ज्वल-क्षेत्र रोशनी सहित) पर पत्ती अनुभाग के माध्यम से छवि। पूरे अनुप्रस्थ खंड को चित्रित करने के लिए 4x आवर्धन का उपयोग करें और विशिष्ट ऊतकों को चित्रित करने के लिए 20x या 40x आवर्धन का उपयोग करें। तेजी से फोटोब्लीचिंग से नमूनों की रक्षा के लिए एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए उच्च आवर्धन पर एक्सपोजर समय को कम करें (तालिका 1 देखें)।
    8. पूरे अनुभाग या रुचि के विशिष्ट क्षेत्रों (आरओआई) की छवियों को कैप्चर करें। यदि आवश्यक हो, तो एक जेड-स्टैक प्राप्त करें, जो विभिन्न फोकल गहराई30 पर कैप्चर की गई छवियों की एक श्रृंखला है।
    9. जेड-स्टैक प्राप्त करने के लिए, पहले नमूने में ऊपरी और निचले पदों का निर्धारण करें, फिर इन पदों के बीच कैप्चर किए जाने वाले ऑप्टिकल वर्गों की संख्या। कम ऑप्टिकल वर्गों के परिणामस्वरूप एक बड़ा जेड-स्टेप आकार होता है, जो प्रत्येक खंड के बीच की दूरी है। एफपी के गुणों और उपयोग किए गए आवर्धन के आधार पर, मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ वर्गों की इमेजिंग के लिए 1 और 12 μm के बीच जेड-स्टेप आकार के साथ तीन से 25 ऑप्टिकल वर्गों को कैप्चर करें।
      नोट: जेड-स्टैक को समतल करने के लिए, एक उपयुक्त वॉल्यूम रेंडरिंग तकनीक50 का उपयोग करें जिसे माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर के माध्यम से या इमेजजे / फिजी34 का उपयोग करके पूरा किया जा सकता है (चरण 4.1 और 4.2 देखें)।
    10. यदि उपलब्ध हो, तो सभी छवि फ़ाइलों और उनके संबद्ध मेटाडेटा को सहेजें।

तालिका 1: चयनित मक्का एफपी संवाददाताओं के प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली रोशनी और छवि अधिग्रहण सेटिंग्स। संक्षेप: एफपी = फ्लोरोसेंट प्रोटीन; TRITC = टेट्रामेथिलरोडामाइन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; डब्ल्यूएलएल = सफेद प्रकाश लेजर; आर-आयन = आर्गन आयन लेजर; एचवाईडी = हाइब्रिड डिटेक्टर; एयू = एयरी यूनिट; हर्ट्ज = हर्ट्ज, स्कैन लाइन प्रति सेकंड। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

3. इमेजिंग ने मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट को अनरोल किया।

  1. प्रिमोर्डिया को विच्छेदित करना और नैनो टेप के साथ ग्लास स्लाइड तैयार करना
    1. अंकुर को मिट्टी की सतह के नीचे मेसोकोटिल पर एक छोटे चाकू या कैंची की एक जोड़ी के साथ सावधानीपूर्वक काटकर इकट्ठा करें, जैसा कि चरण 1.1.3-1.1.4 (चित्रा 1 ए) में वर्णित है।
    2. पौधे को विच्छेदित करने से पहले स्पष्ट, डबल-पक्षीय नैनो टेप (पूरक चित्रा एस 1 एच) के साथ ग्लास स्लाइड (75 मिमी x 25 मिमी) तैयार करें। नैनो टेप का एक आयताकार टुकड़ा काटें और इसे एक साफ ग्लास स्लाइड के केंद्र में चिपका दें। टेप के शीर्ष पर सुरक्षात्मक प्लास्टिक फिल्म को न निकालें।
      नोट: छवि के लिए नमूने के आकार के अनुसार उपयोग करने के लिए टेप का आकार निर्धारित करें ( पूरक चित्रा एस 1 आई, जे में ओवरसाइज़्ड नमूनों के उदाहरण देखें)। नैनो टेप या तो ऐक्रेलिक या पॉलीयुरेथेन जेल सामग्री में उपलब्ध है। दोनों प्रकार प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल इमेजिंग24 के लिए प्रभावी हैं। टेप के मलिनकिरण को रोकने के लिए, इसे अंधेरे कंटेनर में संग्रहीत करके प्रकाश के लंबे समय तक संपर्क से बचाएं।
    3. चरण 2.1 में वर्णित एक तार स्ट्रिपर के साथ पुरानी पत्तियों के ऊपरी हिस्से को हटाकर शूट को विच्छेदित करना शुरू करें।
    4. शूट को मेसोकोटिल द्वारा पकड़ें और प्रिमोर्डिया को निकालने के लिए दंत जांच के साथ आसपास की पत्तियों को सावधानीपूर्वक हटा दें। ऐसा करने के लिए, शूट के आधार से पत्तियों को हटा दें और उन्हें एक समय में तब तक फहराएं जब तक कि रुचि का प्राइमोडियम उजागर न हो जाए।
    5. वैकल्पिक रूप से, शूट के बेसल क्षेत्र (पूरक चित्रा एस 1 ई-जी) पर एक कट बनाकर पत्ती प्रिमोर्डिया को सीधे निकालने के लिए वायर स्ट्रिपर का उपयोग करें।
      नोट: इस विधि में प्रिमोर्डिया को तोड़ने का अधिक जोखिम होता है।
  2. प्राइमोडियम को माउंट करना और इमेजिंग करना।
    1. टेप से सुरक्षात्मक फिल्म निकालें। टेप पर उजागर प्राइमोडियम बिछाएं। बेस पर प्राइमोडियम को काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें, बेसल स्टेम और हाइपोकोटिल को छोड़ दें (चित्रा 1 एफ)।
    2. एक मुड़ी हुई सुई (0.25-0.6 मिमी का टिप व्यास) के साथ दंत जांच का उपयोग करके प्रिमोडियम को अनरोल करें। 3 मिमी (पी 3 से प्रारंभिक पी 4) से छोटे प्रिमोर्डिया के लिए एक माइक्रोप्रोब (0.15-0.2 मिमी का टिप व्यास) का उपयोग करें।
    3. सुई की नोक को सतह के समानांतर रखें और बाहरी बेसल मार्जिन को फहराएं, धीरे से इसे टेप के खिलाफ दबाएं।
    4. चिकनी अनरोलिंग के लिए, सुई की नोक को 100% ग्लिसरॉल में डुबोकर पत्ती की आंतरिक सतह (अक्षीय) को चिकनाई दें।
    5. टेप का पालन करने वाले बाहरी मार्जिन के साथ, सुई की नोक को पत्ती की लंबी धुरी के समानांतर संरेखित करें। टेप पर पत्ती को खोलने और समतल करने के लिए सुई को धीरे से साइड में स्लाइड करें (चित्रा 1 एफ)।
      नोट: उतारते समय पत्ती को तोड़ना या नुकसान पहुंचाना आम है, खासकर एक मजबूत मिडरिब के साथ बड़े प्रिमोर्डिया में (चित्रा 3 ई-जी देखें)। पत्ती को जोर से उतारना इसकी सतह को चोट पहुंचा सकता है और इमेजिंग के दौरान कलाकृतियों का उत्पादन कर सकता है (चित्रा 3 एच)। इन समस्याओं के अनुशंसित समाधान के लिए तालिका 2 और चर्चा देखें।
    6. अनरोल्ड प्रिमोडियम में पानी की एक बूंद लगाएं। तुरंत पानी की बूंद और प्राइमोडियम के ऊपर एक कवरस्लिप रखें। धीरे से कवरस्लिप के किनारों को दबाएं ताकि वे टेप का पालन करें।
      नोट: टेप का पालन करने के लिए अतिरिक्त क्षेत्रों के साथ बड़े आयताकार कवरलिप्स (50 मिमी x 24 मिमी या 60 मिमी x 24 मिमी) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। हवा के बुलबुले के गठन को कम करें, जो पत्ती को विकृत कर सकता है और असमान प्रकाश अपवर्तन का कारण बन सकता है (चित्रा 3 आई-के देखें)। सुनिश्चित करें कि कवरस्लिप पूरी तरह से टेप का पालन करता है, क्योंकि माउंटेड प्रिमोडियम के मार्जिन एक शिथिल रूप से पालन किए गए कवरस्लिप के नीचे वापस आ सकते हैं (चित्रा 3 एल देखें)।
    7. स्लाइड को एपिफ्लोरेसेंस ( पूरक चित्रा एस 1 के देखें) या कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें और फ्लोरोफोरे30 की कल्पना करने के लिए आवश्यकतानुसार फोकस और सेटिंग्स को समायोजित करें। चयनित मक्का एफपी रिपोर्टर लाइनों के लिए उपयोग की जाने वाली रोशनी और छवि अधिग्रहण सेटिंग्स के लिए तालिका 1 देखें।
    8. विभिन्न डिटेक्शनचैनलों के माध्यम से पूरे पत्ते या एक विशिष्ट आरओआई की छवि बनाएं। पूरे पत्ते की छवि बनाने के लिए, या तो पत्ती की मोज़ेक छवियों को मैन्युअल रूप से कैप्चर करें या कम आवर्धन (4x या 10x) पर माइक्रोस्कोप के टाइलिंग ऑपरेशन का उपयोग करें।
      नोट: यहां तक कि सबसे कम आवर्धन पर, मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया एपिफ्लोरेसेंस या कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के साथ छवि बनाने के लिए बहुत बड़ा हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप लंबे समय तक इमेजिंग समय हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप फोटोब्लीचिंग ( चित्रा 3 एम देखें) या पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस में वृद्धि हो सकती है। इसलिए, 5 मिमी से बड़े पूरे पत्ते के नमूनों की इमेजिंग के लिए प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    9. कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए, जेड-स्टैक्स प्राप्त करना जो पत्ती की मोटाई को शामिल करता है, आवश्यक होगा (चरण 2.2.9 देखें)।
    10. यदि उपलब्ध हो, तो सभी छवि फ़ाइलों और उनके संबद्ध मेटाडेटा को सहेजें।

तालिका 2: मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ वर्गों और पूरे माउंट की इमेजिंग में सामान्य समस्याओं का निवारण करना। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: उप-अनुप्रस्थ खंड और मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया की पूरी-माउंट तैयारी। (ए-डी) प्लाज्मा झिल्ली मार्कर, पीआईपी 2-1-सीएफपी (ए), और प्लाज्मा झिल्ली-बाध्यकारी फ्लोरोसेंट डाई, एफएम 4-64 (बी) के साथ पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ वर्गों की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां, संबंधित उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों (सी, डी) के साथ। जब पीआईपी 2-1-सीएफपी की तुलना में, एफएम 4-64 सेल रूपरेखा के उप-विज़ुअलाइज़ेशन को प्रदर्शित करता है। (ई-एम) पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां फाड़ने (ई-जी), चोट लगी सतहों† (एच), हवा के बुलबुले * (आई-के), रोल्ड बैक मार्जिन (एल), और फोटोब्लीच्ड क्षेत्रों की उपस्थिति दिखाती हैं। लीफ प्रिमोर्डिया एक्सप्रेस डीआईआई-वीनस (ई-जी), जीएआर 2-वाईएफपी (एच-जे), एमडीआईआई-वीनस (के), पिन 1 ए-वाईएफपी (एल), और डीआर 5-आरएफपी (एम)। स्केल बार = 200 μm (A-D); 500 μm (E-M)। चित्रा 3 ए को रोबिल और मैकस्टीन24 से अनुमति के साथ संशोधित और पुन: प्रस्तुत किया गया है, जबकि चित्रा 5 बी-एम लेखकों से अप्रकाशित डेटा हैं। संक्षेप: पी = प्लास्टोक्रॉन; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरएफपी = लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन; सीएफपी = सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन; PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; डीआईआई-शुक्र = पीजेडएमयूबी: डीआईआई: वाईएफपी-एनएलएस; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-शुक्र = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; बीएफ = उज्ज्वल क्षेत्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. इमेजजे / फिजी का उपयोग करके छवियों को संसाधित करना

  1. अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (एमआईपी) का उपयोग करके चपटे जेड-स्टैक
    1. फिजी लॉन्च करें और छवियों का ढेर खोलें, या छवि का चयन करके कई अलग-अलग छवियों से एक नया स्टैक बनाएं ढेर | मेनू से स्टैक करने के लिए छवियां।
    2. छवि स्टैक का चयन करें। मेनू से, छवि का चयन करें | ढेर | जेड-प्रोजेक्ट ...। Z-Project संवाद बॉक्स में, प्रोजेक्शन प्रकार ड्रॉप-डाउन मेनू से अधिकतम तीव्रता चुनें. अधिकतम तीव्रता z-प्रोजेक्शन बनाने के लिए ठीक क्लिक करें।
      नोट: चपटा छवि जेड-स्टैक्स50 में उच्चतम तीव्रता के साथ पिक्सेल का 2 डी प्रक्षेपण है। यह विधि फ्लोरोफोरे की कल्पना करने के लिए उपयुक्त है, लेकिन मोटी अनुप्रस्थ वर्गों और पूरे पत्ती के माउंट की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों में शारीरिक विशेषताएं नहीं हैं।
    3. फ़ाइल का चयन करके छवि को TIFF (टैग की गई छवि फ़ाइल प्रारूप) के रूप में सहेजें | इस रूप में सहेजें | टिफ। फ़ाइल के लिए कोई नाम दर्ज करें और सहेजें क्लिक करें.
      नोट: प्रतिदीप्ति और कॉन्फोकल छवियों को संग्रहीत करने के लिए टीआईएफएफ का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि यह छवि को सहेजने पर गुणवत्ता और विवरण को बरकरार रखता है।
  2. एक्सटेंडेड डेप्थ ऑफ फील्ड (ईडीएफ) प्लगइन51 का उपयोग करके चपटे जेड-स्टैक
    1. EDF प्लगइन52 स्थापित करें। http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ से Extended_Depth_Field.jar फ़ाइल (संस्करण 17.05.2021) डाउनलोड करें और इसे ImageJ / FIJI के "प्लगइन्स" फ़ोल्डर में रखें।
    2. फिजी लॉन्च करें और छवियों का ढेर खोलें, या छवि का चयन करके कई अलग-अलग छवियों से एक नया स्टैक बनाएं ढेर | मेनू से स्टैक करने के लिए छवियां।
    3. छवि स्टैक का चयन करें। मेनू से, प्लगइन्स का चयन करें | क्षेत्र की विस्तारित गहराई | ईडीएफ आसान मोड। फ़ील्ड की विस्तारित गहराई संवाद बॉक्स में, वांछित गुणवत्ता और प्रसंस्करण गति सेट करने के लिए गति / गुणवत्ता के तहत स्लाइडर का उपयोग करें, और स्थलाकृति के लिए चिकनाई का स्तर सेट करने के लिए ऊंचाई-मानचित्र रेग । पुनर्निर्मित छवि बनाने के लिए चलाएँ क्लिक करें.
      नोट: ईडीएफ स्टैक को सबसे अच्छा फोकस51 प्रोजेक्ट करके एक तेज, समग्र 2 डी छवि में जोड़ता है। यह तकनीक सीमित गहराई के फोकस पर काबू पाने के लिए उपयोगी है और मोटे अनुप्रस्थ वर्गों या पूरे पत्ती के माउंट की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियों के पुनर्निर्माण के लिए उपयुक्त है। फ्लोरोफोरे की कल्पना करने के लिए इस फ़िल्टर को लागू करते समय सावधानी बरतें क्योंकि, एमआईपी के विपरीत, ईडीएफ पिक्सेल तीव्रता को प्रभावित करते हुए छवि के विपरीत को समायोजित करता है।
    4. फ़ाइल का चयन करके छवि को TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें | इस रूप में सहेजें | टिफ। फ़ाइल के लिए कोई नाम दर्ज करें और सहेजें क्लिक करें.
  3. संग्रह सिलाई प्लगइन53 का उपयोग करके छवियों को एक साथ सिलाई करना
    1. छवियों या छवि ढेर के संग्रह को एक ही निर्देशिका में एक साथ सिले जाने के लिए सहेजें।
    2. इमेजजे / फिजी लॉन्च करें और प्लगइन्स का चयन करें | सिलाई | मेनू से ग्रिड/संग्रह सिलाई। ग्रिड/संग्रह सिलाई संवाद बॉक्स में, टाइप ड्रॉप-डाउन मेनू से अज्ञात स्थिति चुनें, और तब ऑर्डर से निर्देशिका में सभी फ़ाइलें चुनें. क्लिक करें OK.
    3. ग्रिड स्टिचिंग में: अज्ञात स्थिति, निर्देशिका संवाद बॉक्स में सभी फ़ाइलें, निर्देशिका पाठ फ़ील्ड में निर्देशिका पथ लिखकर या चिपकाकर या ब्राउज़ करें क्लिक करके छवियों का स्थान निर्दिष्ट करें... निर्देशिका का पता लगाने के लिए. सिलाई प्रक्रिया शुरू करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
      संग्रह सिलाई प्लगइन में अज्ञात स्थिति विकल्प उनके अतिव्यापी क्षेत्रों का विश्लेषण करके सन्निहित छवियों के एक सेट से एक समग्र छवि का पुनर्निर्माण करता है। इसलिए, यह विकल्प अनुप्रस्थ वर्गों या पूरे पत्ती के माउंट की छवियों के मोज़ेक को सिलाई के लिए उपयोगी है जो टाइल स्कैनिंग ऑपरेशन का उपयोग करके प्राप्त नहीं किए जाते हैं।
    4. जब सिलाई समाप्त हो जाती है, तो सिले हुए छवि के साथ एक नई विंडो दिखाई देगी। फ़ाइल का चयन करके छवि को TIFF फ़ाइल के रूप में सहेजें | इस रूप में सहेजें | टिफ। फ़ाइल के लिए कोई नाम दर्ज करें और सहेजें क्लिक करें.
      नोट: माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में छवि पुनर्निर्माण आदेशों का उपयोग करके या इमेजजे / फिजी में जैव-प्रारूप आयात विकल्पों के माध्यम से 2 डी और 3 डी छवियों के बड़े मोंटाज की सिलाई भी पूरी की जा सकती है।
  4. मर्ज चैनल आदेश का उपयोग कर एकाधिक चैनलों का संयोजन
    1. ImageJ / FIJI लॉन्च करें और विलय किए जाने वाले छवियों या छवि ढेर खोलें।
      नोट: छवि स्टैक को चरण 4.1 या 4.2 का उपयोग करके पहले चपटा किया जा सकता है। एमआईपी को आम तौर पर चपटे फ्लोरोफोरे चैनलों के लिए अनुशंसित किया जाता है, जबकि ईडीएफ उज्ज्वल-क्षेत्र चैनलों या अलग-अलग गहराई के फोकस वाले अन्य चैनलों को चपटा करने के लिए बेहतर अनुकूल है।
    2. छवि के साथ छवियों की चमक और कंट्रास्ट समायोजित करें | समायोजित करें | चमक/कंट्रास्ट। पैरामीटर समायोजित करने के लिए स्लाइडर्स या इनपुट फ़ील्ड ्स का उपयोग करें, फिर लागू करें क्लिक करें. वैकल्पिक रूप से, प्रक्रिया का चयन करके एक रैखिक हिस्टोग्राम स्ट्रेचिंग विधि का उपयोग करें कंट्रास्ट बढ़ाएं...। संतृप्त पिक्सेल का प्रतिशत सेट करें, सामान्य करें का चयन करें, फिर ठीक क्लिक करें.
      नोट: छवियों के बीच फ्लोरोफोरे सिग्नल तीव्रता की मात्रा या तुलना करते समय, आमतौर पर चमक या कंट्रास्ट को समायोजित नहीं करना सबसे अच्छा होता है क्योंकि यह छवि में सापेक्ष पिक्सेल तीव्रता को बदल सकता है, जो माप और तुलना को प्रभावित कर सकता है।
    3. चैनलों के बीच अंतर करने के लिए, लुकअप टेबल (एलयूटी) का उपयोग करके विशिष्ट छवियों पर छद्म रंग लागू करें। ऐसा करने के लिए, छवि का चयन करें, फिर ImageJ / FIJI मेनू से, छवि का चयन करें, लुकअप टेबल पर क्लिक करें, और ड्रॉप-डाउन सूची से उपयुक्त LUT चुनें।
    4. मेनू से, छवि का चयन करें | रंग | चैनलों का मर्ज करें. प्रत्येक चैनल (C1, C2, C3...) के लिए, उस चैनल को असाइन की जाने वाली छवि का चयन करने के लिए ड्रॉप-डाउन सूची का उपयोग करें। चैनलों को मर्ज करने के लिए ठीक क्लिक करें.
    5. फ़ाइल का चयन करके नई छवि को TIFF के रूप में सहेजें | इस रूप में सहेजें | टिफ। फ़ाइल के लिए कोई नाम दर्ज करें और सहेजें क्लिक करें.

Representative Results

मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया का अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण
हमने एफपी के साथ मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ वर्गों में नस संख्या को मापने और हार्मोन प्रतिक्रिया पैटर्न को चिह्नित करने के लिए प्रोटोकॉल खंड 2 का उपयोग किया (चित्रा 4)24)। पत्ती के विकास और नस के गठन में पौधे हार्मोन ऑक्सिन की भूमिका का आकलन करने के लिए, हमने ऑक्सिन की कमी वाले मक्का उत्परिवर्ती के पत्ती प्रिमोर्डिया में नसों की संख्या को निर्धारित किया। प्रारंभिक प्लास्टोक्रोन में, विकासशील नसें मक्का पत्ती प्राइमोडियम21,22 की औसत कोशिका परत में अलग-अलग सेलुलराइजेशन प्रदर्शित करती हैं। हालांकि, पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल तकनीकों22 का उपयोग करके नसों की पहचान और गिनती श्रम-गहन और समय लेने वाली हो सकती है। इस प्रकार, नसों को मापने के लिए, हमने मक्का ऑक्सिन एफ्लक्स प्रोटीन मार्कर पीजेडएमपिन 1 ए का उपयोग किया: जेडएमपिन 1 ए: वाईएफपी41 (पिन 1 ए-वाईएफपी) इसके बाद, जो विकासशील नसों और प्रोकैम्बियल स्ट्रैंड (पीसीएस) को चिह्नित करता है; चित्रा 4 ए)। प्रोटोकॉल अनुभाग 2 का उपयोग करके, हम अनुप्रस्थ अनुभाग नमूनाकरण को मानकीकृत करने में सक्षम थे, जो सेक्शनिंग (चित्रा 4 बी, सी) से पहले प्रिमोर्डिया को मापकर था। हमने एक प्रवृत्ति की खोज की जिसमें vt2 में एक व्यापक प्राइमोडियम और सामान्य से अधिक नसें होती हैं (चित्रा 4 डी, ई)24, जो पूरी तरह से विस्तारित पत्तियों55 के आंकड़ों के अनुरूप है, यह दर्शाता है कि vt2 में दोष पत्ती के विकास में जल्दी शुरू हुआ। प्रोटोकॉल अनुभाग 2 का उपयोग करते हुए, हम पत्ती प्रिमोर्डिया में हार्मोन प्रतिक्रिया एफपी संवाददाताओं के अभिव्यक्ति पैटर्न की व्यवस्थित रूप से जांच करने में सक्षम थे (चित्रा 4 एफ-आई में छवियों के उदाहरण देखें)। एक मानकीकृत अनुप्रस्थ अनुभाग नमूना योजना के माध्यम से, हमने विभिन्न प्लास्टोक्रॉन और पत्ती प्रिमोर्डिया के क्षेत्रों में ऑक्सिन, साइटोकिनिन (सीके), और गिबेरेलिक एसिड (जीए) प्रतिक्रियाओं के वितरण को मैप किया, और नए प्रतिक्रिया पैटर्न की खोज की, जिनकी हम परिकल्पना करते हैं कि पत्ती के विकास औरनस गठन के लिए निहितार्थ हैं। इसलिए, ये प्रतिनिधि परिणाम मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल खंड 2 की उपयोगिता को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 4
चित्रा 4: मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए-ई) ऑक्सिन एफ्लक्स प्रोटीन मार्कर पिन 1 ए-वाईएफपी के साथ सामान्य और लुप्त हो रहे टैसल 2 के पत्ती प्रिमोर्डिया में नस संख्या और प्राइमोडियम चौड़ाई का परिमाणीकरण। (ए) पी 5 से पी 7 के अनुप्रस्थ वर्गों की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां विकासशील नसों और प्रोकैम्बियल स्ट्रैंड ्स में पिन 1 ए-वाईएफपी को व्यक्त करती हैं। अनुप्रस्थ वर्गों को एफआईटीसी फिल्टर (495-519 एनएम उत्तेजना) का उपयोग करके एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था। इमेजजे में क्रमशः मल्टी-पॉइंट और फ्रीहैंड लाइन टूल का उपयोग करके नसों की संख्या और प्राइमोडियम चौड़ाई की मात्रा निर्धारित की गई थी। (बी) ऊपरी पत्ती के साथ एक मक्का अंकुर को चौथी पत्ती (एल 4) की नोक को उजागर करने के लिए एक तार स्ट्रिपर के साथ हटा दिया जाता है। ब्रैकेट अनुमानित प्राइमोडियम लंबाई तक फैला हुआ है, जिसमें डैश ्ड लाइन मध्य-लंबाई का संकेत देती है। (सी) पी 5 से पी 7 तक अलग-अलग प्राइमोडियम आकृतियों का योजनाबद्ध आरेख, यह दर्शाता है कि मध्य-लंबाई (क्षैतिज डैश्ड लाइन) पर नस संख्या और प्राइमोडियम चौड़ाई प्राइमोडियम के विकास चरण के आधार पर कैसे भिन्न हो सकती है। (D, E) सामान्य और vt2 के L4 के मध्य लंबाई खंड पर प्रिमोडियम चौड़ाई (D) और नस संख्या (E) का माप। ट्रेंडलाइन माप के 10 मिमी रोलिंग औसत ± औसत (एसईएम) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है। (F-I) पत्ती प्रिमोर्डिया के अनुप्रस्थ वर्गों की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां पिन 1 ए-वाईएफपी, ऑक्सिन प्रतिक्रिया रिपोर्टर, डीआर 5-आरएफपी, साइटोकिनिन प्रतिक्रिया रिपोर्टर, टीसीएस-टमाटर, गिबेरेलिक एसिड-उत्तरदायी मार्कर, जीएआर 2-वाईएफपी और एमडीआईआई-वीनस, ऑक्सिन सिग्नलिंग इनपुट रिपोर्टर डीआईआई-वीनस का एक उत्परिवर्तित संस्करण हैं। एफपी चैनलों को प्रत्येक छवि में उज्ज्वल-क्षेत्र चैनल पर सुपरइम्पोज किया जाता है। स्केल बार = 200 μm (A); 10 मिमी (बी); 100 μm (F-I)। इस आंकड़े को रोबिल और मैकस्टीन24 से अनुमति के साथ संशोधित और पुन: पेश किया गया है। संक्षेप: डीएजी = अंकुरण के बाद के दिन; पी = प्लास्टोक्रॉन; vt2 = लुप्त हो रहा टैसल 2; पीसीएस = प्रोकैम्बियल स्ट्रैंड; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एफआईटीसी = फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट; आरएफपी = लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-टमाटर = TCSv2::NLS-tdटमाटर; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-शुक्र = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया का पूरे-माउंट विश्लेषण
हमने मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया (चित्रा 5) के पूरे पत्ते के माउंट में एफपी अभिव्यक्ति की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल खंड 3 का पालन किया। PIN1a-YFP के साथ नस पैटर्न की कल्पना करके, हमने पाया कि शुरुआती प्लास्टोक्रोन के दौरान पूरे प्राइमोडियम में नसों का गठन होता है, लेकिन यह प्रक्रिया बाद में विकास में समीपस्थ क्षेत्रों में प्रतिबंधित हो जाती है (चित्रा 5 ए)24। अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण के पूरक, पूरे पत्ती माउंट विश्लेषण ने नस निर्माण के दौरान हार्मोन प्रतिक्रिया के ऊतक- और चरण-विशिष्ट पैटर्न का खुलासा कियाहै। एक उदाहरण सीके प्रतिक्रिया रिपोर्टर टीसीएसवी 2 का अभिव्यक्ति पैटर्न है:: एनएलएस-टीडीटोमेटो37 (टीसीएस-टमाटर), पिन 1 ए-वाईएफपी अभिव्यक्ति (चित्रा 5 बी) 24 के सापेक्ष। प्रोटोकॉल अनुभाग 3 का पालन करके, हम पत्ती प्रिमोर्डिया (चित्रा 5 डी-एफ; अप्रकाशित डेटा) में एफपी अभिव्यक्ति के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण दोनों करने में सक्षम थे। हमने एक ऑक्सिन प्रतिक्रिया रिपोर्टर, DR5rev:: mRFPer41 (DR5-RFP), और एक GA-उत्तरदायी मार्कर, p Zm GAR2::ZmGAR2: YFP39 (GAR2-YFP) के अभिव्यक्ति पैटर्न की जांच की, जो vt2 और बौने पौधे 3 (d3) के एकल और दोहरे उत्परिवर्ती के पूरे पत्ती माउंट में है, जो एक जीए-कमी उत्परिवर्ती56 (चित्रा 5 डी) है। हमने पीजेडएमसाइक्लिन-डी 2 बी का उपयोग करके सामान्य और वीटी 2 लीफ प्रिमोर्डिया के बीच सेल प्रसार के सापेक्ष स्तर की भी तुलना की: जेडएमसाइक्लिन-डी 2 बी: वाईएफपी42 (साइक्लिन-डी 2 बी-वाईएफपी), जो सेल चक्र57 (चित्रा 5 ई, एफ) में जी 1 / एस संक्रमण के लिए एक मार्कर है। जबकि सामान्य और वीटी 2 के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, साइक्लिन-डी 2 बी-वाईएफपी अभिव्यक्ति प्रारंभिक प्लास्टोक्रॉन31 के ज्ञात सेल प्रसार प्रोफ़ाइल के अनुरूप थी। हम निष्कर्ष निकालते हैं कि प्रोटोकॉल खंड 3 मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे माउंट का विश्लेषण करने के लिए एक प्रभावी तरीका है, जो उनके लुढ़के हुए आकृति विज्ञान के कारण छवि बनाना मुश्किल है।

Figure 5
चित्रा 5: मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया के पूरे-माउंट विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए) 7 डीएजी मक्का के पौधों के पत्ती प्रिमोर्डिया की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां विकासशील नसों और प्रोकैम्बियल किस्में दिखाती हैं, जैसा कि ऑक्सिन एफ्लक्स प्रोटीन मार्कर पिन 1 ए-वाईएफपी द्वारा चिह्नित किया गया है। पी 3-पी 6 प्रिमोर्डिया को आधार से हटा दिया गया, अनरोल किया गया, और अक्षीय पक्ष के साथ चपटा किया गया। इनसेट पी 3 और पी 4 के क्लोज-अप दिखाते हैं। पी 5 और पी 6 में, धराशायी रेखाएं प्रोलिफेरेटिव ज़ोन के डिस्टल छोर को सीमांकित करती हैं, जहां अधिकांश प्रोकैम्बियल स्ट्रैंड अभी भी विकसित और विस्तारित हो रहे हैं। (बी, सी) पी 5 प्राइमोडियम के समीपस्थ सीमांत क्षेत्र में पिन 1 ए-वाईएफपी और साइटोकिनिन प्रतिक्रिया रिपोर्टर, टीसीएस-टमाटर की अभिव्यक्ति दिखाने वाली प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। (डी) पी 4 प्रिमोर्डिया की प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियां ऑक्सिन प्रतिक्रिया रिपोर्टर, डीआर 5-आरएफपी, और गिबेरेलिक एसिड-उत्तरदायी मार्कर, जीएआर 2-वाईएफपी की अभिव्यक्ति को दर्शाती हैं और सामान्य और एकल और दोहरे उत्परिवर्ती में गायब हो रहे टैसेल 2 और बौने पौधे 3 हैं। (ई) पी 3 और / या पी 4 की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां साइक्लिन-डी 2 बी-वाईएफपी की अभिव्यक्ति दिखाती हैं, जो सेल चक्र में जी 1 / एस संक्रमण के लिए एक रिपोर्टर है। (च) सामान्य और वीटी2 के पी3/पी4 लीफ प्रिमोर्डिया में कोशिका प्रसार की सापेक्ष मात्रा, इमेजजे/फिजी का उपयोग करके प्राइमोडियम के क्षेत्र में साइक्लिन-डी2बी-वाईएफपी सिग्नल के एकीकृत घनत्व को मापकर निर्धारित की जाती है। सलाखों माध्य माप ± माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 500 μm (A, D, E); 200 μm (B); 100 μm (C). चित्रा 4 ए-सी को रोबिल और मैकस्टीन24 से अनुमति के साथ संशोधित और पुन: प्रस्तुत किया गया है, जबकि चित्रा 4 डी-एफ लेखकों से अप्रकाशित डेटा है। संक्षेप: डीएजी = अंकुरण के बाद के दिन; पी = प्लास्टोक्रॉन; vt2 = लुप्त हो रहा टैसल2; d3 = बौना पौधा 3; वाईएफपी = पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन; आरएफपी = लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन; PIN1a-YFP = pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-टमाटर = TCSv2::NLS-tdटमाटर; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; साइक्लिन-डी 2 बी-वाईएफपी = पी जेडएम साइक्लिन-डी 2 बी::जेडएमसाइक्लिन-डी 2 बी: वाईएफपी; एनएस = कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं; एयू = मनमानी इकाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: मक्का के पौधों में पत्ती विकास मंचन के उदाहरण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले पौधे के नमूने और सामग्री। (ए, बी) एक तार स्ट्रिपर का उपयोग करके ऊपरी पत्ती के साथ 7-8 डीएजी का मक्का अंकुर निकाला जाता है। (बी) इनसेट में उजागर पी 6 प्रिमोडियम के साथ शूट का क्लोज-अप दिखाया गया है। (C-G) अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण (सी, डी) के लिए ऊपरी घास के साथ मक्का के अंकुरों के अंकुर और आसपास की पत्तियों को पूरे-माउंट विश्लेषण (ई-जी) के लिए पूरी तरह से हटा दिया गया। (एच) पॉलीयुरेथेन जेल का एक रोल दो तरफा नैनो टेप को स्पष्ट करता है। (I, J) पी 6 लीफ प्रिमोडियम (आई) और पी 8 पत्ती (जे) के समीपस्थ क्षेत्र को नैनो टेप के साथ ग्लास स्लाइड पर अनरोल और लगाया गया। (के) एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के चरण पर लगाए गए एक अनरोल्ड लीफ प्रिमोडियम के साथ एक ग्लास स्लाइड। संक्षिप्त नाम: डीएजी = अंकुरण के बाद के दिन। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हम सेलुलर इमेजिंग के लिए मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया तैयार करने के लिए दो तरीके प्रस्तुत करते हैं। पहली विधि (प्रोटोकॉल खंड 2) अनुप्रस्थ खंड विश्लेषण के लिए प्रिमोडियम के माप की अनुमति देती है, जबकि दूसरी विधि (प्रोटोकॉल खंड 3) पूरे-माउंट विश्लेषण के लिए प्रिमोडियम के अनरोलिंग और चपटेपन को सक्षम बनाती है। ये विधियां मक्का पत्ती प्रिमोर्डिया24 (जैसा कि चित्र 4 और चित्रा 5 में दिखाया गया है) में एफपी की सेलुलर इमेजिंग की सुविधा प्रदान करती हैं और मक्का के पत्तों को विकसित करने की इमेजिंग की चुनौतियों के लिए सरल समाधान प्रदान करती हैं। प्रोटोकॉल खंड 2 विच्छेदन समय को कम करता है और केवल स्टेजिंग पैरामीटर9,16 पर निर्भर होने के बजाय सेक्शनिंग से पहले प्रिमोर्डिया को मापकर नमूना सटीकता में सुधार करता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नैनो टेप के साथ, प्रोटोकॉल खंड 3 मक्का में पूरे पत्ते के प्रिमोर्डिया की इमेजिंग की लंबे समय से चली आ रही समस्या को हल करता है। यह प्रोटोकॉल पिछली विधि पर सुधार करता है, जिसमें डायलिसिस ट्यूबिंग 31 का उपयोग किया गया था, और सीटी और एमआरआई11,32,33 का बहुत सस्ता विकल्प है। हालांकि, जब पत्ती शारीरिक लक्षणों को देखने और इष्टतम परिणाम उत्पन्न करने की बात आती है, तो दोनों प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं होती हैं, जिन्हें तालिका 2 में उल्लिखित किया गया है और नीचे अधिक विस्तार से चर्चा की गई है।

प्रोटोकॉल खंड 2 में, हमें पत्ती प्रिमोर्डिया के मोटे अनुप्रस्थ वर्गों में सेल की रूपरेखा को देखने में कठिनाई का सामना करना पड़ा, और सेल की दीवार- या प्लाज्मा झिल्ली-बाध्यकारी फ्लोरोसेंट रंगों के साथ काउंटरस्टेनिंग ने संतोषजनक परिणाम प्रदान नहीं किए। उदाहरण के लिए, एफएम 4-64 ने प्लाज्मा झिल्ली एफपी मार्कर की तुलना में उप-मानक परिणाम उत्पन्न किए, पी जेडएम पीआईपी 2-1::जेडएमपीआईपी 2-1: सीएफपी39 (पीआईपी 2-1-सीएफपी; चित्रा 3 ए-डी)। इस सीमा को दूर करने के लिए, हम पतले ऊतक वर्गों (~ 0.1 मिमी)58 का उत्पादन करने के लिए एक वाइब्रेटोम का उपयोग करने की सलाह देते हैं जो सेल की रूपरेखा की ज्वलंत उज्ज्वल-क्षेत्र इमेजिंग या काउंटरस्टेनिंग प्रोटोकॉल47,59 को अनुकूलित करने की अनुमति देगा।

प्रोटोकॉल खंड 3 में, मुख्य सीमा फाड़ने, क्षति, या हवा के बुलबुले के बिना पत्ती को ऊपर उठाने की कठिनाई है, जैसा कि प्रोटोकॉल चरण 3.2.5-3.2.6 (चित्रा 3 ई-के) में विस्तृत है। चूंकि मक्का का पत्ता द्विपक्षीय रूप से सममित होता है, इसलिए पूरे पत्ते वाले पर्वत के बजाय आधा पत्ती वाला पर्वत विज़ुअलाइज़ेशन9 के लिए पर्याप्त हो सकता है। ऐसा करने के लिए, प्राइमोडियम को अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ रेजर ब्लेड से काटा जा सकता है, इसे मिडरिब तक घुमाने के बाद, पत्ती के केवल आधे हिस्से को लगाया जा सकता है। प्रोटोकॉल खंड 3 की एक और सीमा यह है कि पत्ती की मोटाई गहरी इमेजिंग के दौरान फ्लोरोफोरे सिग्नल के ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन को सीमित कर सकती है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, ऊतक समाशोधन तकनीक60 को नियोजित करना संभव है। हालांकि, हमने पाया कि ClearSee61, आमतौर पर पौधों के ऊतकों की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला समाशोधन अभिकर्मक, प्रोटोकॉल के साथ संगत नहीं है क्योंकि यह नमूना और कवरस्लिप को नैनो टेप से अलग करने का कारण बनता है। इस समस्या का एक संभावित समाधान पत्ती के नमूने पर एक अर्धपारगम्य झिल्ली31 लागू करना हो सकता है, जिससे इसे नैनो टेप द्वारा जगह पर रखते हुए समाशोधन समाधान के साथ इलाज किया जा सके। ऐसी विधि जो तरल समाधानों को अनरोल्ड पत्ती पर लागू करने की अनुमति देती है, का उपयोग सीटू संकरण और इम्यूनोलोकलाइजेशन तकनीकों में पूरे-माउंट आरएनए के लिए भी किया जा सकता है, जिन्हें पहले मक्का पुष्पक्रम विकसित करने के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन पूरे पत्ती प्रिमोर्डिया62,63 के लिए नहीं।

हमने मक्का के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन किया, जिसमें अंकुर चरण में भी बड़ी पत्ती प्रिमोर्डिया है। चावल, जौ, गेहूं, सेतारिया और ब्रैकीपोडियम 16,23,64,65,66 जैसे बहुत छोटे पत्ती प्रिमोर्डिया के साथ अन्य घास प्रजातियों को इन प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से लागू करने के लिए अतिरिक्त सटीक उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, ये प्रोटोकॉल लाइव सेल इमेजिंग के लिए अभिप्रेत नहीं थे, जो ऊतक गठन और सेलुलर प्रतिक्रियाओं की वास्तविक समय की गतिशील प्रक्रियाओं को कैप्चर करता है। हालांकि, जैसा कि फ्लोरोसेंट जांच, इमेजिंग प्रौद्योगिकियां और कंप्यूटिंग क्षमताएं पौधोंके लिए लाइव सेल इमेजिंग में आगे बढ़ रही हैं, भविष्य के शोध घास पत्ती प्रिमोर्डिया की अनूठी विशेषताओं के अनुरूप लाइव सेल इमेजिंग रणनीतियों को विकसित करने के लिए इन प्रोटोकॉल पर निर्माण कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक मक्का जेनेटिक्स कोऑपरेशन, मक्का सेल जीनोमिक्स प्रोजेक्ट, डेव जैक्सन (कोल्ड स्प्रिंग हार्बर लेबोरेटरी, एनवाई), ऐनी डब्ल्यू सिल्वेस्टर (समुद्री जैविक प्रयोगशाला, शिकागो विश्वविद्यालय, आईएल), एंड्रिया गैलावोटी (रटगर्स विश्वविद्यालय, एनजे), और कैरोलिन जी रासमुसेन (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड) को उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक स्टॉक प्रदान करने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। मिसौरी-कोलंबिया कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ उनकी सहायता के लिए। जेएमआर को जे विलियम फुलब्राइट फैलोशिप, द डायने पी और रॉबर्ट ई शार्प फंड और नेशनल साइंस फाउंडेशन के प्लांट जीनोम रिसर्च प्रोग्राम (आईओएस -1546873) द्वारा पीएम द्वारा समर्थित किया गया था। सीडीटीसी, ईडीसीडीपी और आरजेआरआर को डीओएसटी-एसईआई एस एंड टी अंडरग्रेजुएट स्कॉलरशिप द्वारा समर्थित किया जाता है। डीओडीएल फादर थॉमस स्टीनबुगलर एसजे अकादमिक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है। आरजेआरआर को एडकेशन इंटरनेशनल-पाथवेज टू हायर एजुकेशन स्कॉलरशिप द्वारा समर्थित किया गया है। इस काम को स्कूल ऑफ साइंस एंड इंजीनियरिंग और रिजाल लाइब्रेरी, एटेनियो डी मनीला विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm thick EZlifego Store (Amazon) B07YB1ZXG6 1 roll
Bellucci Pick Curved micro probe 16.8 cm, 6.6 in Bausch & Lomb N1692 9 1 pc
Clayman guide microprobe Sinskey hook angled shaft, 11.6 cm, 4.6 in Storz Opthalmic Instruments E0542 1 pc
Dental Probe, Bent Needle, 14 cm (5.5 in) Ted Pella 13553 1 pc
DOWELL 10-22 AWG Wire Stripper Dowell Store (Amazon) 10-22 AWG 1 pc
Feather Double Edge Carbon Steel Blades Ted Pella 121-9 pkg/10; for fine sectioning
Frosted End Glass Microscope Slides, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mm Ted Pella 260442 pkg/144
GEM Single Edge, Stainless Steel Uncoated Blades Ted Pella 121-1 box/200; for general cutting/sectioning
Glycerol Thermo Scientific PI17904 1 liter
ImageJ/FIJI with EDF plugin (version 17.05.2021) and Grid/Collection Stitching plugin National Institutes of Health (NIH) USA version 2.9.0/1.54s The EDF plugin was developed by Alex Prudencio, Jesse Berent, and Daniel Sage for the Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). The grid/collection stitching software was developed by Stephan Preibisch for the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Small 111.76 mm x 213.36 mm Kimtech Science 34155 box/280 ply
Micro Cover Glasses, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260140 1 ounce
PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm thick Yecaye Store (Amazon) L354 W1.18 2 rolls
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260166 1 ounce
Superslip Cover Glasses, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm thick Ted Pella 260168 1 ounce
Tempered Glass Cutting Board Hacaroa (Amazon) B09XMXBT5S 4 pc

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References

  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535 (2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119 (2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038 (2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781 (2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061 (2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349 (2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163 (2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12 (2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369 (2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721 (2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101 (2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506 (2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

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