Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

Published: April 14, 2023 doi: 10.3791/65242
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Abstract

Retinal pigment epiteli (RPE) tarafından fotoreseptör dış segmentlerin günlük fagositozu, lipofussin adı verilen hücre içi yaşlanma pigmentinin birikmesine katkıda bulunur. Lipofusin toksisitesi, en yaygın kalıtsal retinal dejenerasyon olan Stargardt hastalığında iyi bilinmektedir, ancak gelişmiş dünyada geri dönüşümsüz körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD) daha tartışmalıdır. İnsanlarda lipofussin toksisitesini belirlemek zor olmuştur ve Stargardt'ın hayvan modelleri sınırlı toksisiteye sahiptir. Bu nedenle, lipofussin üretimini, klirensini ve toksisitesini daha iyi anlamak için insan RPE'sini in vivo olarak taklit eden in vitro modellere ihtiyaç vardır. Bugüne kadar hücre kültürü lipofussin modellerinin çoğunluğu hücre hatlarındaydı veya RPE'yi tüm fotoreseptör dış segmentinin parçaları / uçları yerine karmaşık lipofuscin karışımının tek bir bileşeni ile beslemeyi içeriyordu, bu da daha eksiksiz ve fizyolojik bir lipofuscin modeli oluşturuyordu. Burada tarif edilen, lipofussin benzeri materyalin (sindirilemeyen otofloresan materyal veya UAM olarak adlandırılır) yüksek oranda farklılaşmış primer insan doğum öncesi RPE'sinde (hfRPE) ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı RPE'de birikmesini indükleyen bir yöntemdir. UAM, RPE tarafından fagositoz yoluyla alınan ultraviyole ışıkla işlenmiş OS parçalarının tekrar tekrar beslenmesiyle kültürlerde birikmiştir. UAM'nin lipofuscin in vivo olarak yaklaştığı ve ondan farklı olduğu anahtar yollar da tartışılmaktadır. Bu lipofussin benzeri birikim modeline eşlik ederek, UAM granüllerinin geniş otofloresan spektrumunu eşzamanlı antikor boyamasından ayırt etmek için görüntüleme yöntemleri tanıtılmıştır. Son olarak, UAM'nin RPE fagositoz kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, dış segment fragmanı / uçlarının alımını ve parçalanmasını ölçmek için yeni bir yöntem tanıtılmıştır. "Toplam Tüketim Kapasitesi" olarak adlandırılan bu yöntem, klasik dış segment "nabız kovalamaca" testlerinde bulunan RPE fagositoz kapasitesinin potansiyel yanlış yorumlarının üstesinden gelir. Burada tanıtılan modeller ve teknikler, lipofussin üretimi ve klirens yollarını ve varsayılan toksisiteyi incelemek için kullanılabilir.

Introduction

Retinal pigment epiteli (RPE), fotoreseptör dış segment uçlarının veya fragmanlarının günlük alımı ve bozulması da dahil olmak üzere üstteki fotoreseptörler için kritik destek sağlar (bu protokol boyunca, OS kısaltması, tüm dış segmentlerden ziyade OS uçları veya fragmanları anlamına gelir). Post-mitotik RPE'deki bu günlük alım sonunda fagolizozomal kapasiteyi aşırı yükler ve lipofussin adı verilen sindirilemeyen, otofloresan hücre içi materyalin birikmesine yol açar. İlginç bir şekilde, birkaç çalışma RPE lipofuscin'in OS fagositoz 1,2 olmadan birikebileceğini de göstermiştir. Lipofuscin, görsel siklus retinoidlerinden türetilen çapraz bağlı adduktlar da dahil olmak üzere birçok bileşene sahiptir ve 80 yaşın üzerindekiler için RPE hücre hacminin yaklaşık% 20'sini işgal edebilir3.

Lipofuscin'in toksik olup olmadığı sıcak bir şekilde tartışılmıştır. Stargardt hastalığı, fotoreseptörlerin ve RPE'nin otozomal resesif dejenerasyonudur ve ABCA4'teki bir mutasyon, fotoreseptör dış segmentlerinde bulunan görme döngüsü retinoidlerinin yanlış işlenmesini tetikler. Yanlış retinoid işleme, bis-retinoid N-retinylidene-N-retinilethanolamine (A2E) dahil olmak üzere bis-retinoid türlerinin anormal çapraz bağlanmasına ve oluşumuna yol açar. Çalışmalar A2E toksisitesi için çoklu mekanizmalar göstermiştir 4,5. Lipofuscin, klinik görüntüleme sırasında fundus otofloresan sinyallerine katkıda bulunur ve hem Stargardt'ın hastaları hem de hayvan modelleri, retinal dejenerasyondan önce fundus otofloresansının arttığını gösterir, bu da lipofussin seviyeleri ile toksisite arasında bir korelasyon olduğunudüşündürmektedir 6,7. Bununla birlikte, yaşla birlikte, lipofuscin tüm insanlarda RPE dejenerasyonunu tetiklemeden birikir. Ayrıca, RPE dejenerasyonunun sadece yaşlı hastalarda meydana geldiği yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD), hastalığın erken ve orta formlarına sahip olanlar, yaşa uygun hastalıksız insanlardan daha az fundus otofloresan sinyaline sahiptir8. Bu klinik bulgular histolojik düzeyde de doğrulanmıştır 9,10.

RPE lipofussin birikiminin hayvan modelleri de lipofussin toksisitesi hakkında bazı belirsizlikler bırakmıştır. ABCA4 nakavt faresi, pigmentli bir arka plan üzerinde retinal dejenerasyon göstermezken, albino bir arka planda veya mavi ışığa maruz kaldığında11,12 gösterir. Ayrıca, ABCA4 nakavtı yoluyla elde edilen lipofuscinin toksisitesi, AMD13'te görüldüğü gibi, doğal yaşlanma ile ortaya çıkan daha yavaş biriken lipofusinden farklıdır.

Lipofussin birikiminin in vitro modelleri, lipofussin birikiminin RPE sağlığı üzerindeki etkilerini incelemek için bir alternatif sunmaktadır. Bu tür modeller, tek retinoid bileşenlerin beslenmesinden işletim sisteminin beslenmesine kadar lipofuscin bileşenlerinin manipüle edilmesine izin verir ve hayvan RPE'sinden ziyade insanda çalışmaya izin verir. Son birkaç on yılda, RPE lipofuscin'i kültürde modellemek için birçok yöntem geliştirilmiştir. Diğer gruplarla birlikte, Dr. Boulton'un grubu, 4 ila 85yaşları arasındaki donörlerden 4 ila 7 insan birincil RPE hücresinin geçişinde üç aya kadar günlük olarak sığır OS'yi besledi. Alternatif olarak, otofajinin inhibisyonu da pasajlarda lipofussin birikimine yol açmıştır 3 ila 7 birincil insan RPE kültürleri15. Bununla birlikte, oldukça farklılaşmış, pasaj 1, primer insan prenatal RPE (hfRPE) kültürlerinde sub-ölümcül lizozomal inhibisyon, günlük olarak tekrarlanan OS ilavesiyle bile lipofuscin'i indükleyememiştir16.

Daha indirgemeci bir yaklaşım olarak, diğerleri kültürlere, özellikle bis-retinoid A2E 4,17'ye tek lipofuscin bileşenlerini beslemişlerdir. Bu tür çalışmalar, bireysel lipofussin bileşenleri için potansiyel doğrudan toksisite mekanizmalarını tanımladıkları için değerlidir, örneğin lizozomal kolesterol ve seramid homeostazı18'i içerir. Aynı zamanda, A2E19'un toksisitesi hakkında tartışmalar vardır ve doğrudan hücrelere beslenmesi, fotoreseptör OS'nin fagositozunu içeren lipofussin birikimi için tipik yolu atlatır. Boulton ve Marshall, lipofuscin'in tüm bileşenlerini RPE kültürlerine ulaştırma girişiminde, lipofuscin'i insan gözlerinden saflaştırdı ve bunu hem fetal hem de yaşlı insan donörlerinden türetilen 4 ila 7 insan birincil RPE kültürüne besledi20. Yenilikçi olsa da, bu yöntem tekrarlanan deneyler için sınırlı bir lipofuscin kaynağını temsil eder.

OS'nin RPE kültürlerine tekrar tekrar beslenmesi birçok sistemde lipofussin üretirken, oldukça farklılaşmış birincil RPE kültürlerinde bunu başaramaz16. Foto-oksitleyici OS, in vivo lipofussin oluşumu sırasında doğal olarak ortaya çıkan bis-retinoid oluşumu gibi çapraz bağlanma reaksiyonlarını indükler. Bu, RPE kültür sistemlerinde lipofussin benzeri granül oluşumunu hızlandırabilir, hatta lipofussin birikimine karşı oldukça farklılaşmış ve dirençli olanlarbile16. Burada, Wihlmark'ın yayınlanmış protokol21'inden modifiye edilmiş, oldukça farklılaşmış hfRPE ve insan iPSC-RPE'sinde lipofussin benzeri granül birikimini indükleyen bir yöntem tanıtılmıştır. Bu yöntem, in vivo lipofuscinogenez için olduğu gibi aynı kaynağı (fotoreseptör OS) ve yolu (fagolizozomal OS alımı) kullanan lipofussin benzeri granülleri indükleme avantajına sahiptir. Ayrıca, insan RPE'sini in vivo22,23,24 çoğaltmak için yapılan birçok çalışmada oldukça farklılaşmış ve doğrulanmış insan RPE kültürleri üzerinde yapılır. Bu lipofussin benzeri granüller sindirilemeyen otofloresan materyal (UAM) olarak adlandırılır ve bu protokolde UAM'yi in vivo lipofuscin ile karşılaştıran veri ve tartışma sağlar. Yüksek oranda farklılaşmış insan RPE'sinde UAM yüklü kültürleri oluşturma ve değerlendirme yöntemlerinin yanı sıra, RPE OS fagositozunu değerlendirmek için güncellenmiş bir yöntem de tanıtılmıştır. OS fagositozunu ölçmek için Western blotting, immünositokimya ve FACS25,26,27 dahil olmak üzere birçok mükemmel nabız kovalama yöntemi tanıtılmıştır. Bununla birlikte, işletim sistemi nabız kovalamacasının başlarında, zayıf işletim sistemi alımına yol açan koşullar, içselleştirilmiş işletim sisteminin hızlı bir şekilde bozulmasını teşvik eden koşullarla birleştirilebilir. Burada sunulan yöntem, RPE ("Toplam Tüketim Kapasitesi") tarafından tamamen tüketilen/bozulan tanıtılan işletim sisteminin toplam miktarını ölçer ve bu belirsizliğin ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. "Toplam Tüketim Kapasitesi" yöntemi kullanılarak OS fagositoz oranları üzerindeki etkiler de dahil olmak üzere, bu protokolleri kullanan lipofussin toksisitesi hakkındaki bilgilerin, lipofuscin'in in vivo toksisitesine ışık tutmak için kullanılması beklenmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan dokusunun edinimi ve kullanımını içeren mevcut protokol, Michigan Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00105486) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Foto-oksitlenmiş dış segment uçlarının ve parçalarının hazırlanması

NOT: Koyulaştırılmış sığır retinaları satın alınmış ve buz üzerinde sevk edilmiştir (bkz. Bu retinalardan, işletim sistemi daha önce yayınlanmış bir protokol23'ü takiben saflaştırıldı.

  1. UV lambası ile çapraz bağlama dış segmenti
    1. Slaytları sterilize etmek için politetrafloroetilen kaplı slaytları (bakınız Malzeme Tablosu) 10 dakika boyunca %70 etanol içine tamamen bir biyogüvenlik kabinine daldırın. Slaytların steril 100 mm'lik bir hücre kültürü kabında hava ile kurumasını bekleyin.
    2. Her slaytı yeni bir 100 mm hücre kültürü kabına yerleştirin ve her dikdörtgene 200 μL serum içeren hücre kültürü ortamı (eldeki RPE kültürleri için tipik olarak hangi ortam kullanılırsa kullanılsın) ekleyin, ardından 100 mm'lik hücre kültürü kabına (kapaksız) ampul doğrudan slayta bakacak şekilde elde taşınan 254 nm UV ışığı (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin, ve 20 dakika boyunca pozlayın. Bu çalışma için özel olarak kullanılan medya ve medyanın bileşenleri için spesifik ürün numaraları daha önce22,23 yayınlanmıştır. Bu medya, bu protokol boyunca "RPE medyası" olarak adlandırılır.
      NOT: Ortamın UV ile işlenmesi cam yüzeyi bloke eder ve sonraki adımlarda işletim sisteminin yapışmasını önler.
    3. 37 ° C'de dondurulmuş OS alikotlarını çözün (elde veya su banyosu yoluyla ). Gerekli işletim sistemi miktarı uygulamaya bağlıdır. Genel olarak, slayttaki dikdörtgen başına 500 μL'ye kadar 2 x 108 OS/mL işlenebilir.
    4. Çözüldükten sonra, işletim sistemini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'de döndürün. Peletin kazara kaybolmasını önlemek için biyogüvenlik kabinindeki süpernatantı vakum yerine pipet kullanarak derhal aspire edin.
    5. Peletleri steril PBS ile nazikçe askıya alın.
      NOT: Yeniden askıya alınan hacmi ve beklenen konsantrasyonu takip edin. Örneğin, peletin 500 μL PBS ile 1 x 108 OS/mL'lik 1 mL'lik bir tüpten yeniden askıya alınması 2 x 108 OS/mL verir. Politetrafloroetilen kaplı kızakta dikdörtgen başına maksimum hacim ve konsantrasyon 500 μL, 2 x 108 OS/mL'dir.
    6. Slaytlardaki ortamı aspire edin ve slaytın her dikdörtgenine 500 μL'ye kadar 2 x 108 OS/mL PBS çözeltisi yerleştirin. El tipi UV ışığını, ampul doğrudan işletim sistemine bakacak şekilde hücre kültürü kabının üzerine (kapaksız) yerleştirin. İşletim sistemi çözümünü 40 dakika boyunca 254 nm ışığa maruz bırakın.
      NOT: 40 dakikalık maruz kalma sırasında, UV lambasını ve kabını bir havlu veya emici ped ile örtün, biyogüvenlik kabini kanadını kapatın ve üfleyiciyi kapatın. Bu, herhangi bir önemli buharlaşmanın meydana gelmesini önleyecektir. Bu protokolde kullanılan UV lambası bir araştırmacı tarafından kullanılamıyorsa, uygun miktarda çapraz bağlamanın elde edilmesini sağlamak için iki alternatif vardır. Birincisi, adım 1.2'de özetlenen kantitatif UV maruziyetini, adım 1.2'de özetlenen cihazla veya 1.2'de söz konusu cihazla aynı nicel radyant maruziyeti sağlayabilen başka bir cihazla takip etmektir. Diğer bir alternatif, OS'yi Şekil 1C'de görülen Coomassie boyası üzerindeki çapraz bağlanma derecesini indükleyen bir süre UV ışınlamasına maruz bırakmaktır.
    7. İşlenmiş OS PBS çözeltisini steril mikrosantrifüj tüplerinde toplayın, kaplanmış slaydın dikdörtgenini 200-500 μL PBS (2-3x) ile yeniden yıkayın ve her yıkamayı mikrosantrifüj tüpünde toplayın. İşiniz bittiğinde, neredeyse tüm işletim sistemlerinin slayttan çıkarıldığını doğrulamak için bir doku kültürü odası mikroskobu altındaki slayda bakın.
    8. OS PBS çözümünü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'de döndürün, PBS'yi biyogüvenlik kabininde bir pipettörle aspire edin ve RPE kültürleri için kullanılacak 500 μL standart ortamda yeniden askıya alın (örneğin, bölüm 1.1.2'de tanımlanan "RPE ortamı"). Resüspansiyon hacmi, istenen foto-oksitlenmiş OS (OxOS) konsantrasyonuna göre ayarlanabilir.
    9. Süspansiyonun 10 μL'sini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, 50-100x'i daha fazla hücre kültürü ortamıyla seyreltin ve OS'leri bir hemositometre ile sayın.
    10. İşletim sistemi sayısına bağlı olarak, OxOS süspansiyonunu son stok konsantrasyonuna kadar seyreltin. 24 kuyulu Transwell'lerde (yüzey alanı 0,33cm2; bakınız Malzeme Tablosu) yüksek olgun RPE kültürlerini beslemek için, 2 x 107 OS/mL'lik bir nihai ortam konsantrasyonu önerilir.
      1. Bunu başarmak için, OxOS'u standart RPE kültür ortamında askıya alınmış 5,6 x 107 OS/mL konsantrasyonda 25 μL alikotlara dağıtın. 25 μL'lik bir aliquot'u çözdükten sonra, tüm aliquot'u 45 μL standart RPE kültür ortamı ile karıştırarak her bir OxOS Transwell beslemesi için 70 μL'lik nihai ortam hacmi ve 2 x 107 OS/mL'lik OS konsantrasyonu sağlayın.
    11. OxOS'u alıntılamadan önce, OS alımını ve lipofussin birikimini kolaylaştıran fagositoz köprüleme ligandlarını (Protein S ve MFG-E8, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 24 kuyucuklu bir Transwell'deki köprüleme ligandlarının çalışma konsantrasyonları, insan saflaştırılmış Protein S için 4 μg / mL ve insan rekombinant MFG-E8 için 1.5 μg / mL'dir. Böylece, 5.6 x 107 OS / mL'de 25 μL OxOS alikotları için, Protein S için stok konsantrasyonu 11.2 μg / mL'dir ve MFG-E8 için 4.2 μg / mL'dir.
      NOT: Köprüleme ligand konsantrasyonları, 24 kuyucuklu Transwell'lerde hfRPE kültürleri için optimize edilmiştir ve 0.33cm2 kuyu başına yaklaşık 320.000 hücre sayısına sahiptir. Ligand konsantrasyonlarının diğer RPE tipleri ve hücre yoğunlukları için ayarlanması gerekebilir, çünkü fagositoz reseptör mevcudiyetini aşan ligandlar paradoksal olarak OS alımını bloke edebilir28.
    12. Alikotları sıvı azotta dondurun.
      NOT: Birden fazla donma-çözme, işletim sistemi bütünlüğü için son derece zararlıdır.
  2. UV çapraz bağlayıcı cihazla dış segment çapraz bağlama
    NOT: Sırasıyla 1.1.2 ve 1.1.6 adımlarının yerini alan aşağıdaki adımlar dışında adım 1.1'i izleyin:
    1. (adım 1.1.2'nin yerini alır) Her slaytı yeni bir 100 mm hücre kültürü kabına yerleştirin ve her dikdörtgene 200 μL serum içeren hücre kültürü ortamı (örneğin -"RPE ortamı" veya başka bir ikame) ekleyin, ardından slaytları bir Ultraviyole Çapraz Bağlayıcı cihazına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu), cam yüzeyi bloke etmek ve sonraki adımlarda işletim sisteminin yapışmasını önlemek için 3-6 J /cm2'lik bir radyant maruziyette 254 nm UV ile muamele edin.
    2. (adım 1.1.6'nın yerini alır) Slaytlardaki ortamı aspire edin ve slaytın her dikdörtgenine steril PBS'de 500 μL'ye kadar 2 x10 8 OS /mL yerleştirin. Slaytları Ultraviyole Crosslinker cihazına yerleştirin, tedavi radyant maruziyetini gerektiği gibi ayarlayın (3-9 J /cm2) ve 254 nm'de tedavi edin.
      NOT: İhtiyaç duyulan radyant maruziyeti, otofloresan derecesine kadar 3-9 J /cm2 arasında radyant maruziyet titre edilerek dikkatlice belirlenebilir ve protein çapraz bağlama (Şekil 1B ve Şekil 1C'de görüldüğü gibi) elde edilir.
      DİKKAT: İşletim sisteminin biyogüvenlik kabini dışında kullanılması kontaminasyona neden olabilir. İşletim sisteminin UV Crosslinker Cihazına maruz kalmasından sonra, steril pipet uçlarıyla işletim sistemini toplayın, steril mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve biyogüvenlik başlığındaki diğer tüm adımları uygulayın.
  3. Oksitlenmiş işletim sisteminin karakterizasyonu
    1. Görüntüleme ile otofloresan emisyon spektrumunu ölçmek
      1. İşlenmemiş OS ve OxOS'tan 20-50 μL stok çözeltisini iki ayrı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'de santrifüj, peletleri tamponlanmış (örneğin PBS)% 4 paraformaldehit içinde yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin.
      2. Sabitlemeden sonra, yukarıdaki gibi aşağı doğru döndürün, PBS x 2 ile yıkayın (yıkamalar arasında aşağı doğru eğirin), ardından 30 μL'den daha az PBS'de tekrar askıya alın.
      3. Bir mikroskop slaydına birkaç mikrolitre süspansiyon yerleştirin, montaj ortamı ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve son olarak bir kapak kayması.
      4. OxOS'u konfokal mikroskopta görüntüleyin (bkz.
        NOT: OxOS otofloresansı çok çeşitli lazer dalga boyları tarafından uyarılabilir, ancak tipik olarak 405 nm veya 488 nm lazer çizgisi kullanılır. Emisyon benzer şekilde geniştir, ancak tipik bir GFP / FITC uyarma / emisyon filtresi kurulumu otofloresanı görüntülemek için yeterlidir.
      5. OxOS emisyon spektrumunu ölçmek için, konfokal mikroskopta λ-tarama kullanın. Tipik λ tarama ayarları arasında 405 nm veya 488 nm ile uyarma ve lazer uyarma hattından kırmızıya kayan 10 nm'den yaklaşık 800 nm'ye kadar değişen emisyon tespiti ve λ adım boyutu 10 nm'dir. Her mikroskopi sisteminin λ modunun nasıl kullanılacağına dair kendi talimatları vardır ve okuyucunun kendi özel konfokalleri için kılavuza başvurması gerekir.
    2. Alternatif olarak, otofloresanı akış sitometrisi ile sayısallaştırın.
      1. Mikrosantrifüj tüplerinde 2 x 10 7 işlenmemiş işletim sistemini ve ayrı ayrı 2 x 107 OxOS'u döndürün ve 1 mL PBS'de yeniden askıya alın.
        NOT: Akış sitometrisi çözülmeden hemen sonra yapılırsa fiksasyon gerekli değildir.
      2. İşlenmemiş OS ve OxOS örneklerini akış sitometresine yükleyin (bkz. İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) değerlerini FSC-SSC dağılım grafiğinde kabul edilebilir bir yayılmaya ayarlayın. Kirletici küçük parçacıkları dışlamak için PBS'yi bir kontrol olarak kullanın. İşletim sisteminin hücrelerden önemli ölçüde daha küçük olduğunu unutmayın.
      3. Otofloresan ölçümü için akış sitometresinin standart FITC kanalını kullanın. En az 10.000 olay sayın. Floresan yoğunluğunu temsil etmek için FITC histogramının nabız alanı değerini kullanın.
        NOT: Bu çalışma için, tüm veriler üreticinin talimatları izlenerek akış sitometresi analiz yazılımı (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılarak analiz edilmiştir.
    3. OxOS'ta çapraz bağlama derecesini değerlendirin
      1. Mikrosantrifüj tüplerinde 2 x 10 7 işlenmemiş işletim sistemini ve ayrı olarak 2 x 107 OxOS'u döndürün. Süpernatantı çıkarın ve 1.2x Laemmli Numune Tamponu ekleyerek peleti doğrudan lize edin (örtmek için yeterli; bkz. Vorteks, oda sıcaklığında 30 dakika bekletin, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 12000 x g'ye eşit veya daha büyük bir seviyede döndürün ve süpernatan toplayın.
        NOT: OxOS'ta protein çapraz bağlanma derecesinin değerlendirilmesi, UV tedavisinin yeterliliği hakkında bir fikir verir. Tedavi edilmemiş OS ve OxOS arasında karşılaştırma yapılır ve Coomassie boyamasına hakim olan monomerik rodopsin bandı (Şekil 1C, ok) sadece algılanabilir olduğunda, daha yüksek dereceli agregaların ortaya çıkması ve jelin üstünde bir protein yayması ile yeterli çapraz bağlanma meydana gelir.
        DİKKAT: İşletim sistemini lize etmek için Numune Arabelleği kullanırken, daha sonra lizis çözeltisini ısıtmayın, çünkü bu rodopsin agregasyonunu tetikleyebilir. Ayrıca, SDS'yi çökelteceğinden, depolamaya hazır olana kadar lized işletim sistemini soğutmaktan kaçının. Kullanılmayan lizatlar -20 °C'de tutulabilir. Yeniden çözülürse, kullanmadan önce lizatların oda sıcaklığında tamamen çözüldüğünden emin olun.
      2. Yüksek SDS ve indirgeyici konsantrasyonlarına toleranslı bir protein testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün29. Uygun protein tahlil reaktifleri hakkında öneriler için Malzeme Tablosuna bakın ve bu reaktifler için üretici protokolünü takip edin.
      3. İşlenmemiş OS ve OxOS numunelerini SDS-PAGE elektroforezi30 ile standart tris-glisin SDS tamponu kullanarak% 4 -% 15 gradyan jel üzerinde çalıştırın. Jel, numuneler yığına girene kadar 80 V'ta, daha sonra oda sıcaklığında 50-60 dakika boyunca 120 V'ta çalıştırılır.
      4. Standart protokolleri kullanarak jeli Coomassie mavisi ile lekeleyin31. Coomassie boyaması, UV tedavisi ile indüklenen çapraz bağlamanın yeterliliğini gösterecektir.

2. RPE kültürlerinde lipofussin benzeri granüllerin (UAM) oluşturulması

  1. OxOS beslemeleri: miktar, sıklık ve fagositoz köprüleme ligandları
    NOT: Beslenmeler, Bharti laboratuvarı (iPSC-RPE için)32 tarafından özetlenen protokole veya Sheldon Miller laboratuvarı22,23'ten uyarlanan hfRPE için daha önce özetlenen protokolümüze göre yetiştirilen 1. pasajdaki insan iPSC-RPE veya hfRPE kültürlerinde gerçekleşir. Aşağıdaki tüm hesaplamalar, OxOS veya OS'nin bir adet 24 delikli Transwell'e (6,5 mm çap, 0,33cm2 büyüme alanı) beslenmesine dayanmaktadır.
    1. 37 °C'de 5,6 x 107 OxOS/mL'nin 25 μL'sini çözün ve OxOS aliquot'a 45 μL hücre kültürü ortamı ekleyerek 70 μL'lik son hacim elde edin.
      NOT: Adım 1'de hazırlanan OxOS alikotları, MFG-E8 ve Protein S ligandlarını köprüleyen fagositoz içerecektir. Bununla birlikte, eğer bu ligandlar donmadan önce alikotlara eklenmemişse, bu adımda eklenebilirler, böylece beslenecek hücrelerdeki ligandların nihai konsantrasyonunun Protein S için 4 μg / mL ve MFG-E8 için 1.5 μg / mL olmasını sağlarlar. Adım 1.1.11'de belirtildiği gibi, köprüleme ligandlarının konsantrasyonlarının diğer RPE tipleri veya hücre yoğunlukları için değiştirilmesi gerekebilir.
    2. Transwell'den apikal medyayı çıkarın ve apikal odaya fagositoz köprüleme ligandları ile 70 μL 2 x 107 OxOS / mL ekleyin. 24 saat sonra, çıkarın ve yeni bir OxOS beslemesi ile değiştirin. Beslenme, hafta içi günlerde günlük olarak gerçekleşir, hafta sonları atlanır, 20 besleme tamamlanana kadar (~ 1 ay). Bazolateral hücre kültürü ortamını (400-550 μL) haftada 2-3 kez değiştirin.
    3. 20 beslemenin tamamlanmasının ardından, kuyu için normal ortam değişikliklerine devam edin.
      NOT: Yapışkan OxOS'u RPE apikal yüzeyinden temizlemek için birkaç ek ortam değişikliği gerekir, bu nedenle UAM yüklü kültürlerle yapılan deneyler, OxOS beslemeleri sona erdikten en az 1-2 hafta sonra yapılmalıdır.
      DİKKAT: OxOS beslemeleri yoluyla UAM birikimi için uygun kontrollere sahip olmak önemlidir. Günlük medya değişiklikleri RPE biyolojisini etkileyebileceğinden, aşağıdaki kontrol kuyuları önerilir: Kontrol 1: OxOS ile tedavi edilen grupla aynı sayıda besleme için hafta içi günlerde günlük olarak medyayı değiştirin. Kontrol 2: RPE işlenmemiş işletim sistemini hafta içi her gün OxOS beslemeleriyle aynı konsantrasyon ve hacimde, aynı sayıda besleme için besleyin.
  2. Lipofussin benzeri granüllerle yüklü kültürlerin sağlığının trans-epitelyal elektrik direnci (TEER) ve hücre ölümü tahlilleri ile izlenmesi
    NOT: OxOS beslemeleri sırasında ve sonrasında, RPE sıkı bağlantı bütünlüğü ve hücre ölümü değerlendirilerek RPE kültürlerinin sağlığı ölçülebilir. Trans-epitelyal elektrik direncinin (TEER) ölçülmesi yoluyla sıkı bağlantı bütünlüğünün değerlendirilmesinin, genel hücre sağlığı için hassas bir belirteç olduğu daha önce gösterilmiştir33. Laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı gibi hücre ölümünün daha geleneksel non-invaziv belirteçleri de kullanılabilir.
    1. TEER gerçekleştirin
      NOT: TEER, genellikle üreticinin talimatlarını izleyerek bir trans epitelyal elektrik direnci (TEER) ölçüm cihazı ve TEER elektrodu ile test edilir (bkz.
      1. TEER elektrodunu sterilize etmek için, elektrodu temizlemek için% 70 etanol içine batırılmış bir görev sileceği kullanın ve ardından elektrot probunun uçlarını 10 dakika boyunca% 70 etanol içine daldırın.
      2. Elektrodun tamamen kurumasını bekleyin, ardından elektrodu steril ortama daldırın.
      3. Probu steril ortamdan çıkarın ve TEER elektrodunun iki probunu kültürlü bir Transwell'in apikal ve bazolateral odalarına yerleştirin; daha uzun prob ucu bazolateral odaya sığar.
        NOT: Apikal odanın tabanını TEER elektrodu ile pratik yapmadan kazımak kolaydır ve bu tür kazıma, akıcı RPE tek katmanı bozulduğu için TEER okumalarını önemli ölçüde değiştirecektir. Bu nedenle, yeni başlayanların deneysel RPE kültürleri üzerinde test yapmadan önce önemli olmayan Transwell'ler üzerinde pratik yapmaları önerilir. Ayrıca, RPE kültürlerinin her plakası test edildikten sonra, deneyci standart bir doku kültürü mikroskobu altında RPE tek katmanının kazınıp kazınmadığını kontrol etmelidir.
      4. Apikal ve bazolateral problar Transwell'e yerleştirildikten sonra, TEER'i kaydetmek için okuma düğmesine basın veya ölçüm cihazının ayak anahtarına basın. Plakalar veya hücre grupları arasında, elektrot probunu steril ortamla yıkayın. Enfeksiyon yüksek bir endişe ise, plakalar arasında yeniden sterilize edin.
      5. Ölçüm cihazından direnç okumasını alarak, ortam içeren ancak hücre içermeyen boş bir Transwell'in değerini çıkararak (genellikle 0.33cm2 yüzey alanına sahip 24 kuyulu bir Transwell için 100-110 Ω) ve ardından Transwell'in yüzey alanı ile çarparak TEER'i hesaplayın.
        NOT: TEER değerleri hücre yüzey alanına normalleştirilmiş olarak bildirilmelidir. Sağlıklı hfRPE kültürleri için tipik değerler 350-1100Ωcm2 arasında değişmektedir. TEER değerleri sıcaklık düştükçe artar. Bu nedenle, kültürleri 37 ° C'lik bir inkübatörden oda sıcaklığındaki bir davlumbaza çıkarırken, TEER değerleri plaka boyunca artma eğiliminde olacaktır. Bu değişkenliğe karşı korunmak için, ya hızlı bir şekilde çalışın (eğer yaşanıyorsa) ya da plaka sıcaklığının oda sıcaklığıyla dengelenmesi için 10-15 dakika bekleyin.
    2. LDH salınım testi yapın
      NOT: LDH'nin hücre kültürü süpernatantına salınması, hücre ölümü sırasında meydana gelir ve standart bir kit ile ölçülür (bkz.
      1. 24 saatlik bir inkübasyondan sonra süpernatantı hücrelerin üstünden toplayın ve standart ortam kullanarak 1:100'e kadar seyreltin.
      2. Adım 2.2.2.1'deki tüm değerleri normalleştirmek için önemli olan toplam olası LDH salınımını, 24 delikli bir Transwell'deki kontrol hücrelerinden 100 μL apikal ortama 2 μL% 10 triton X-100 ekleyerek indükleyin. Triton / hücre süpernatant karışımını 37 ° C'de 15 dakika inkübe ettikten sonra, şimdi lize edilmiş hücrelerin üzerindeki ortamı karıştırın ve toplam olası LDH salınımını ölçmek için toplayın.
      3. Süpernatanlar toplandıktan sonra, üreticinin standart talimatlarını kullanarak tahlili gerçekleştirin, kitin tampon çözeltisini kullanarak 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra lüminesansı ölçün.
        NOT: Tüm LDH değerleri, olası toplam LDH salınımı miktarına normalleştirilir.
  3. Lipofussin benzeri granül spektrumu ve bileşiminin karakterizasyonu
    1. Otofloresan nicelleştirme ve spektrumlarının elde edilmesi
      1. UAM yüklü kültürleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 PFA ile sabitleyin, ardından PBS 5x yıkayın.
      2. Apikal odada az miktarda PBS bulundurun ve Transwell'i baş aşağı çevirin. Bir diseksiyon mikroskobu ve bir tıraş bıçağı kullanarak, yarı gözenekli membranı Transwell'den kesin, membran ve Transwell'in birleşme noktasında kesme kuvveti uygulayın.
        NOT: Transwell membranı, kesikler tutarlı olmadığında bükülme ve kırışma eğilimi gösterdiğinden, kesimin Transwell'in dudağına ne kadar yakın yapıldığı konusunda tutarlı olun.
      3. Transwell zarı kesildikten sonra, Transwell zarının parçalarına hücrelerle dokunmaktan kaçınmaya dikkat ederek, forseps kullanarak hemen bir mikroskop slaydına yerleştirin. Hücrelere dokunmaktan kaçınırken, fazla PBS'yi bir görev silme ile uzaklaştırın. Montaj ortamı ve kapak fişi ekleyin. Transwell'i kapatırken Transwell'in hangi tarafının "sağ taraf yukarı" olduğunu takip ettiğinizden emin olun.
      4. Adım 1.3.1.4 ve adım 1.3.1.5 ile aynı ayarları ve prosedürleri kullanarak otofloresan yoğunluğunu ve spektrumlarını elde edin.
        NOT: UAM'yi görüntülerken, önemli bir karışıklık, OxOS'un otofloresan olması ve genellikle OxOS beslemesinin tamamlanmasından sonra günlerce ve hatta bazen haftalarca RPE apikal yüzeyine yapışmasıdır. Sonuç olarak, UAM'yi ölçerken, ölçülen otofloresansın OxOS'tan değil, UAM'den geldiğinden emin olmak için bir yöntem kullanılması gerekir. En kolay yöntem, lipofussin kültürlerini bir rodopsin antikoru ile birlikte boyamaktır. Örneğin, anti-rodopsin antikoru 4D2, 1:1000 seyreltmede ve standart PFA-fiksasyon immünositokimya protokolü34 ile kullanılabilir. Rodopsin için ikincil antikor, UAM ve OxOS otofloresansı bu dalga boyunda en zayıf olma eğiliminde olduğundan, çok kırmızı boya konjuge bir antikor olmalıdır (örneğin, 647 nm'ye yakın bir uyarma maksimumu ile). Konfokal görüntüler daha sonra iki kanalda sırayla elde edilebilir, UAM ve OxOS otofloresansını 405 nm lazerle heyecanlandırır ve 415 nm'den 550 nm'ye kadar emisyon sağlarken, sindirilmemiş OxOS'u gösteren artık rodopsin, ayrı bir kanaldaki standart uzak kırmızı boya görüntüleme parametreleriyle uyarılabilir. Satın alma sonrasında, rodopsin kanalı, yapışkan kalan OxOS'tan gelen otofloresanı gidermek için ImageJ gibi bir programda çıkarma maskesi olarak kullanılabilir ve nicelleştirmek için sadece UAM otofloresansını geride bırakır.
        DİKKAT: Foto-oksitlenmemiş işletim sistemleri bile bir miktar otofloresan gösterir ve titiz yıkamada bile, bazı işletim sistemleri ve OxOS'lar RPE yüzeyine yapışır. Bu nedenle, yukarıdaki NOT'ta önerildiği gibi, rodopsin immünoboyama kullanarak bir çıkarma maskesi üretmeden, OxOs veya standart işletim sistemi ile beslenen kültürlerde UAM otofloresan seviyelerinin doğru bir şekilde ölçülmesi mümkün değildir.
    2. Lipofussin benzeri granüllerin ve diğer immünofloresan belirteçlerin eşzamanlı tespitini gerçekleştirin
      NOT: Adım 2.3.1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, lipofuscin'in geniş otofloresan spektrumu, floresan birlikte boyama seçeneklerini sınırlar. Birlikte boyamayı kolaylaştırmak için aşağıdaki yöntemler düşünülebilir.
      1. Çok kırmızı bir florofor kullanın. Lipofuscin'den gelen otofloresan, yakın kızılötesinde zayıftır. Bu nedenle, ilgilenilen bir antijenin floresan tespiti için çok kırmızı bir boya kullanmak, konfokal mikroskopta kanal ayarlarının dikkatli bir şekilde ayarlanmasıyla birlikte, genellikle otofloresanı birlikte boyanan floresandan ayırt edebilir.
      2. Lipofuscin'in uzun floresan emisyon kuyruğundan yararlanın.
        NOT: Lipofuscin çok geniş bir floresan emisyon spektrumuna sahip olduğundan, genellikle düşük nm dalga boyunda (örneğin 405 nm lazer) uyarılabilir ve spektrumun turuncu / kırmızı kısmında (örneğin 585-635nm) hala tespit edilen emisyona sahip olabilir. Uyarma ve emisyon dalga boylarının bu eşsiz kombinasyonu genellikle başka bir birlikte boyanan florofor etrafında uyarlanabilir.
        1. 500-530 nm'de emisyon tespiti ile 488 nm civarında pik uyarıma sahip bir florofor kullanarak ilgilenilen antijeni tespit edin. 405 nm uyarma ve 585-635 nm emisyon ile otofloresan algılama için ayrı bir kanal kurun. Bu ikinci kanal sadece UAM'yi tespit ederken, ilk kanal ilgilenilen antijeni artı lipofusin tespit edecektir.
        2. ImageJ gibi ücretsiz bir program kullanarak, UAM sinyalini ilk kanaldan (hem antijen sinyalini hem de UAM sinyalini içeren) çıkarmak için bu ikinci UAM kanalını çıkarma maskesi olarak kullanın.
      3. Spektral karıştırmayı kullanın. Çoğu modern konfokal mikroskop, spektral bir karıştırma çözme seçeneği içerir. Bu, birinin sadece UAM ile bir numunenin spektrumunu ve sadece ilgilenilen birlikte boyanan floroforla başka bir numunenin elde edilmesini sağlar. Hem UAM hem de birlikte boyanan floroforu içeren deneysel numune daha sonra elde edilebilir ve sinyalin yüzde kaçının otofloresan ve birlikte boyamadan geldiğini hesaplamak için doğrusal karıştırmama yöntemlerine tabi tutulabilir.
        NOT: Spektral karıştırma için kapsamlı kılavuzlar çoğu modern konfokal mikroskopta mevcuttur.
      4. Floresan ömür boyu görüntülemeyi kullanın. UAM ile birlikte boyanan bir florofor arasındaki emisyon spektrumu benzer olsa da, floresan ömürlerinin önemli ölçüde farklı olması muhtemeldir. Genel olarak, UAM çoğu spesifik florofordan daha kısa floresan ömrü gösterir. Ömür boyu görüntülemeye izin veren bir konfokal mikroskopa erişimle, tipik lipofussin ömründen daha uzun olanları tespit etmek için floresan sinyalleri geçebilir.
        NOT: Genel olarak, floresan ömrünün 2 ns'den daha uzun sinyallere geçit edilmesi, sinyali tamamen ortadan kaldırmasa da, UAM kontaminasyonunu büyük ölçüde azaltır.
      5. Bir otofloresan baskılayıcı kullanımı. Geleneksel olarak, Sudan Black, spesifik immünofloresan boyama35'ten önce otofloresanı söndürmek için kullanılmıştır. Ticari olarak temin edilebilen birkaç otofloresan söndürücü ürün, Sudan Black'in sonuçlarını iyileştirmek için rapor vermektedir ve bu ürünler Malzeme Tablosunda detaylandırılmıştır. Otofloresan söndürme, elbette, lipofusin tespit etme yeteneğini yok edecektir.
    3. Lipofussin benzeri granüllerin bileşimini belirleyin
      1. Nötr lipitleri değerlendirin
        1. UAM yüklü RPE'yi sabitleyin ve kuyucukları (işlenmemiş işletim sistemi ile beslenen) oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 PFA'da kontrol edin ve PBS 5x ile yıkayın.
        2. 10 μg/mL Nil Kırmızısı veya 3.33 μg/mL Bodipy 493/503 kullanarak nötr lipitler için leke 1 saat oda sıcaklığında %3'lük BSA PBS çözeltisi içinde lekelendikten sonra PBS ile 5 dakika 3x yıkanır.
        3. Transwell'i adım 2.3.1.2 ve 2.3.1.3'te olduğu gibi kesin ve bağlayın ve görüntü. Genel olarak, görüntüleme için aşağıdaki uyarma ve emisyon bant genişliklerini kullanın: Nil Kırmızısı - ex 543 nm, em 620-700 nm ve Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Esterleştirilmiş ve esterleştirilmemiş kolesterolü değerlendirin
        1. Adım 2.3.3.1.1'i izleyin
        2. Filipin, esterleştirilmemiş kolesterolü tanıyan, ancak esterleştirilmiş kolesterolü tanımayan floresan bir boyadır36. Bu nedenle, UAM'deki toplam kolesterol miktarını (esterleştirilmemiş ve esterleştirilmiş) değerlendirmek için, önce esterleştirilmiş kolesterolü esterleştirilmemiş kolesterole dönüştürmek için numuneye kolesterol esteraz ile ön işlem uygulayın. Hücreleri 0.1 M potasyum fosfat tamponunda (pH 7.2) 20 U / mL kolesterol esterazı ile tedavi edin (pH 7.2) ( Malzeme Tablosuna bakınız) 3.5 saat boyunca 37 ° C'de, ardından PBS ile 5 dakika 3x yıkayın.
        3. PBS'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca 50 μg / mL filipin ile lekeleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve PBS ile 5 dakika 3x yıkayın. Filipin fotobeyazlatıcıları kolayca olduğu için numuneleri ışıktan uzak tutun.
          NOT: Sadece esterleştirilmemiş kolesterol ölçülecekse, adım 2.3.3.2.2'deki kolesterol esterazı atlanabilir. Esterleştirilmiş kolesterol miktarı ölçülecekse, numunedeki toplam kolesterol ile esterleştirilmemiş kolesterol arasındaki farktan çıkarılabilir.
        4. Transwell'i 2.3.1.2 ve 2.3.1.3 adımlarında olduğu gibi kesin ve bağlayın ve görüntü.
          NOT: Filipin görüntülerken, çok hızlı bir şekilde fotoağarır. Uyarılma yoğunluğunu ve süresini en aza indirmeli ve numunenin oküler aracılığıyla görüntülenmesiyle bile bazı fotobeyazlatmaların meydana gelebileceğini beklemelidir. Bu nedenle, görüntüleme sırasında: (1) filipin kanalı dışında bir floresan kanalı kullanarak görüntü için uygun bir alan aranmalı, (2) konfokal mikroskop yerine geniş bir alanda filipin görüntüsü (ışığa maruz kalmanın yoğunluğunu sınırlamak için) ve (3) bir alanın tekrar tekrar görüntülenmesinden kaçınılmalıdır. Genel olarak, filipin görüntüleme için aşağıdaki uyarma ve emisyon bant genişliklerini kullanın - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Lipofussin benzeri granüllerin RPE fagositozu üzerine etkilerinin değerlendirilmesi: Toplam Tüketim Kapasitesi

NOT: Aşağıdaki OS nabız protokolü ile OS fagositozunu ölçmenin gerekçesi temsili sonuçlar bölümünde detaylandırılmıştır. "Toplam Tüketim Kapasitesi" olarak adlandırılan yöntem, geleneksel OS nabız kovalama fagositoz testleri ile ortaya çıkabilecek fagositoz etkinliği hakkındaki belirsizlikleri önler. Tahliller, 4 x 106 OS/mL içeren 50 μL ortam kullanılarak 24 delikli Transwell plakaları üzerinde yapılır.

  1. Deney için gereken kuyucuk sayısını hesaplayın ve ardından uygun miktarda normal işletim sistemini çözün, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'de döndürün ve standart RPE hücre kültürü ortamında 4 x 106 OS / mL'ye yeniden askıya alın. Fagositoz oranlarını kolaylaştırmak için köprüleme ligandları ekleyin.
    NOT: Beslenecek hücrelerdeki köprüleme ligandlarının nihai konsantrasyonu, Protein S için 4 μg / mL ve MFG-E8 için 1.5 μg / mL'dir. Adım 1.1.11'de belirtildiği gibi, köprüleme ligandlarının konsantrasyonlarının diğer RPE tipleri veya hücre yoğunlukları için değiştirilmesi gerekebilir.
  2. Apikal ortamı çıkarın ve ideal olarak uygun köprüleme ligandı konsantrasyonlarında 50 μL 4 x 106 OS / mL ekleyin.
  3. OS eklenmesinden sonra çeşitli zamanlarda (örneğin - 0 saat, 1 saat, 4 saat ve 24 saat), hem hücreleri hem de üstteki OS içeren süpernatanı lize etmek için proteaz inhibitörleri ile 16.67 μL 4x Laemmli numune tamponu ekleyin. Transwell yüzeyini çizmek için bir P-200 pipeti kullanın, Transwell membranını delmemeye veya zarı Transwell'den ayırmamaya dikkat edin ve kombine hücre süpernatantını artı hücre lizatını birlikte toplayın. Vorteks, aşağı doğru döndürün ve tam denatürasyon için oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
    DİKKAT: İşletim sistemini lize etmek için Numune Arabelleği kullanılmasına rağmen, daha sonra lizis çözeltisini ısıtmayın, çünkü bu rodopsin agregasyonunu tetikleyebilir. Ayrıca, lize edilmiş işletim sistemini depolamaya hazır olana kadar soğutmaktan kaçının, çünkü bu proteini çökeltecektir. Kullanılmayan lizatları -20 ° C'de dondurun, lizatların kullanımdan önce tamamen çözüldüğünden emin olun.
  4. SDS PAGE'de lizatları adım 1.3.3'teki ayarlarla aynı ayarları kullanarak çalıştırın ve kuyu başına eşit miktarda lizat yükleyin. Fagositoz oranları hücre sayısına bağlı olduğundan, hücre sayısını normalleştirmek için GAPDH, β-aktin veya başka bir temizlik proteini kullanılmalıdır.
  5. Western, rodopsin'in N- veya C- terminüsüne karşı antikorlarla lekeleri araştırın. Standart Batı lekeleme koşullarını kullanın ve antikor seyreltmeleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
    NOT: Ana rodopsin bandının altında, birden fazla rodopsin parçası olacaktır. Bu fragmanlar, fagozomun lizozom32,33 ile füzyonundan önce başlayan bir süreç olan kısmen sindirilmiş rodopsini temsil eder. UAM yüklü RPE'deki rodopsin fragmanlarının sayısındaki kontrol RPE'ye kıyasla bir artış, fagolizozom kapasitesinde, fagozom-lizozom füzyonu, lizozomal asitleşme ve / veya degradatif enzim fonksiyonu 16,34,35 düzeyinde bir aşağı akış defektini gösterebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İşletim sisteminin foto-oksidasyonu için kurulum Şekil 1Ai'de gösterilmiştir. Politetrafloroetilen kaplı kızaklar, slaydın geri kalanına yayılmadan açık dikdörtgen başına büyük miktarda çözelti içinde işletim sistemi yüklenmesini sağlar. İşletim sistemli slayt, kapağı kapalı steril bir Petri kabı içinde bulunur ve Şekil 1Aii'de gösterildiği gibi slaytın üzerine bir UV lambası yerleştirilir. Alternatif olarak, slayt Şekil 1Aiii'de gösterildiği gibi bir UV Crosslinker cihazına yerleştirilebilir. Foto-oksidasyondan sonra, OS otofloresansı hem mikroskopi hem de akış sitometrisi ile değerlendirildiği gibi önemli ölçüde artar (Şekil 1B). Foto-oksidasyondan sonra proteinin çapraz bağlanma derecesi, baskın protein bandının (monomerik rodopsin) daha yüksek dereceli agregalara ve yaymaya dönüşümü olarak gösterilen bir Coomassie boyası ile SDS-PAGE ile değerlendirilebilir (Şekil 1C). Foto-oksidasyonun elde taşınan bir UV lambası (Şekil 1Aii) ile UV Crosslinker cihazının (Şekil 1Aiii) karşılaştırılması, elde taşınan UV lambasının, UV Crosslinker cihazından 3 J/cm2 işlemi kadar otofloresan (Şekil 1B) ve UV Crosslinker cihazından 6 J/cm2 tedavisi kadar protein çapraz bağlama ile OxOS ürettiğini göstermektedir (Şekil 1C)). Bir araştırmacının kullanabileceği UV lambası bu protokolde kullanılandan farklıysa, Şekil 1C'deki UV lamba şeridinde görülen bir çapraz bağlama seviyesine ulaşmak için maruz kalma süresini titre etmenizi öneririz. OxOS'un otofloresan spektrumu, hem OS'nin protein yalıtımlı fraksiyonunda hem de OS16'nın lipit izole fraksiyonunda, işlenmemiş işletim sistemi spektrumuna kıyasla hafif maviye kaymıştır.

RPE kültürlerinde UAM birikiminin miktarı, OxOS beslemelerinin sayısına bağlıdır (Şekil 2A) ve yaklaşık 4 hafta boyunca 20 besleme, sağlam miktarda UAM birikimi sağlar. UAM otofloresanını, yıkamadan günler ila haftalar sonra bile RPE apikal yüzeyine yapışmış kalan artık OxOS'un otofloresansından ayırt etmek için, çok kırmızı bir boya ile tespit edilen bir rodopsin antikoru ile boyarız. Bu rodopsin floresan kanalını bir maske olarak kullanarak, OxOS otofloresansını UAM kanalından çıkarabilir ve UAM'den otofloresanı sadece16 olarak ölçtüğümüzden emin olabiliriz. Yukarıda özetlenen boyama protokollerini kullanarak, bu modelde biriken UAM, doğal lipofuscin'e benzer şekilde, Nil Kırmızısı boyama16 tarafından değerlendirildiği gibi, bol miktarda nötr lipitlere sahiptir. Bununla birlikte, esterleştirilmiş veya esterleştirilmemiş kolesterol birikimini çok az buluyoruz veya hiç bulamıyoruz, bu da doğal lipofuscin'de sağlıklı gözlerden gördüğümüz kolesterol birikimi eksikliği ile tutarlıdır (veriler gösterilmemiştir).

Lipofuscin otofloresan ile eşzamanlı olarak ilgilenilen floresan belirteçleri takip etmek, lipofuscin'in çok geniş floresan emisyon spektrumu göz önüne alındığında zordur. Yukarıdaki yöntemler bölümünde, bu sorunun üstesinden gelmek için çeşitli yöntemler ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Yukarıdaki adım 2.3.2.1'de özetlenen yöntem, uzak kırmızıdaki lipofussin için düşük otofloresan emisyon yoğunluğundan yararlanır. Şekil 2Ci'de, UAM ve otofaji markörü LC3'ün kolokalizasyonu, LC3'ün Alexa 647 boyası ile boyanmasıyla değerlendirilmiştir. UAM'nin LC3 kanalına bir miktar akmasına rağmen, lipofuscin ve LC3'ün bu görüntülerde nerede bulunduğu açıktır. Yukarıdaki adım 2.3.2.2'de özetlenen yöntemde, lipofuscin'in çok uzun floresan emisyon spektrumları, yalnızca lipofuscin'den floresan içeren bir emisyon kanalının tasarımına izin verir. Şekil 2Cii'de, UAM 488 nm lazer ile uyarılırken, emisyon hem 500-535 nm hem de 600-645 nm'de tespit edilmiştir. Numune, Alexa 488 boyası ile tespit edilen LC3 ile birlikte boyanır. Alexa 488 kanalı (uyarım: 488 nm, emisyon: 500-535 nm) hem LC3 hem de UAM sinyali içerir. Bununla birlikte, 488 nm uyarma ve 600-645 nm emisyon ile ikinci kanal sadece UAM içerir. Bu ikinci kanal, LC3 sinyalinden istenmeyen UAM sinyalini çıkarmak için Alexa 488 / LC3 kanalına uygulanan bir maske olarak kullanılabilir. Yukarıdaki adım 2.3.2.4'te özetlenen yöntemde, otofloresan lipofuscin'in daha kısa floresan ömrü, lipofuscin'i birlikte boyanan floresandan ayırt etmeyi sağlar. Şekil 2Ciii'de, 2 ns'den önce bir foton sayma dedektörüne gelen tüm floresan sinyalleri elimine edilir, bu da LC3'ten gelen birlikte boyama sinyalini büyük ölçüde korurken UAM otofloresan sinyalinin çoğunu dışarı çıkarır. Lipofuscin ve birlikte boyanan floroforun güçlü bir şekilde birlikte lokalizasyonu varsa, lipofuscin'i birlikte boyanan floresandan ayırt etmek için yöntemlerin bir kombinasyonu gerekli olabilir.

Çok sayıda çalışma RPE lipofussin birikiminin OS fagositoz oranları 5,36,37,38,39 üzerine etkisini ortaya koyduğundan, UAM yüklü kültürlerde OS fagositoz kapasitesi değerlendirildi. Tipik fagositoz testleri, OS'li ("nabız") hücrelerin kısa bir inkübasyonunu ve ardından bağlanmamış işletim sisteminin yıkanmasını ve bir "kovalamaca" süresi için OS'siz ortamın değiştirilmesini içerir. Kovalamaca sırasında, işletim sistemi bozuldukça, RPE içinde OS'de en bol bulunan protein olan rodopsin kaybı olur. Kovalamaca sırasında çeşitli zaman noktalarında, işletim sistemi içermeyen ortam çıkarılır, ardından RPE lizatları içinde kalan rodopsin için hücre lizisi ve SDS-PAGE takip edilir. Bununla birlikte, OS nabız periyodu OS'nin hem alımı hem de bozulmasından oluştuğundan, yüksek alım ve bozunmaya sahip RPE ("fagositoz verimli" hücreler), kovalama periyodunun başlarında, düşük alım ve bozulmaya sahip RPE ("fagositoz verimsiz" hücreler) ile aynı rodopsin seviyelerine sahip olabilir. Bu, Zhang ve ark. 23 tarafından çalışmada şematik olarak temsil edilmiştir. Bu belirsizliğin üstesinden gelmek için, burada "sadece nabız" tahlili kullanıldı. Bu yöntemde, işletim sistemi RPE'ye darbelenir ancak yıkanmaz. OS eklenmesinden sonra çeşitli zamanlarda, medya ve hücre lizatı birlikte toplanır. Medya sindirilmemiş işletim sistemi içerir ve hücre lizatı, hücre yüzeyinde bozulmamış işletim sisteminin, içselleştirilmiş kısmen sindirilmiş işletim sisteminin ve lizozomdan başarıyla geçen tamamen sindirilmiş işletim sisteminin bir kombinasyonunu içerir. Bir kontrol olarak, hücreler işletim sistemine maruz kalır, ancak daha sonra hücre lizatı ve işletim sistemi içeren süpernatant hemen toplanır. Bu kontrol, hücrelere ne kadar toplam rodopsin verildiğini ortaya koymaktadır. Lizat artı süpernatant, işletim sistemi girişinden sonra çeşitli noktalarda toplandığından, toplam rodopsin sinyalinin hangi kısmının kaybolduğu değerlendirilebilir, bunu şimdi tamamen bozulmuş olan tüm tanıtılan / başlatılan işletim sisteminin miktarı için bir belirteç olarak kullanılabilir. Bu tahlilin okunması "Toplam Tüketim Kapasitesi" olarak adlandırılır, çünkü tüm işletim sistemi bozulmasını doğru bir şekilde ölçer ve yukarıda açıklanan bir nabız kovalama deneyinin kafa karıştırıcı yorumlarına tabi değildir.

Şekil 3A ve Ek Şekil 1, Toplam Tüketim Kapasitesi testini kullanarak kalan rodopsinin Batı lekesini göstermektedir. Hücrelere beslenen işletim sistemi miktarı, rodopsin bandı tarafından 0 saatte ölçülür. Ana rodopsin bandı, kontrol ve UAM yüklü RPE örnekleri arasında eşit verimlilikle parçalanır (4 saat ve 24 saatte tek ok). Bununla birlikte, ana rodopsin bandının altında görünen kısmen bozulmuş rodopsin parçalarına bakıldığında gruplar arasında bir fark vardır. Fragman bolluğundaki farklılıklar, UAM grubunda lizozomal kapasitenin azaldığı anlamına gelir, çünkü proteolitik olarak parçalanmış rodopsin fragmanları normal lizozomal fonksiyonla hızla parçalanmalıdır. Ana rodopsin fragmanının bolluğu artmadan bu parçaların bolluğunun artması, UAM yüklü kültürlerde lizozomal bozunma kapasitesinde daha ince kusurlar olduğunu düşündürmektedir. Önceki çalışmalar, lipofuscin'in gerçekten de OS fagositoz44'te kusurları indükleyebileceğini öne sürmüştür, ancak daha önce hiçbir çalışma, lipofuscin'in özellikle rodopsin fragmanları üzerindeki etkilerini incelememiştir, bu da işlev bozukluğunun fagolizozomal bozunmanın son aşamalarına daha kesin bir şekilde saptanmasını sağlar. Şekil 3B, iki farklı anti-rodopsin antikoru kullanılarak ana rodopsin bandının ve rodopsin fragmanlarının Batı lekelenmesini göstermektedir. Antikor 4D2, rodopsin'in N-terminusunu tanır ve N-terminal fragmanları, rodopsin'in lizozomda parçalanan son kısmıdır. Buna karşılık, antikor 1D4, fagozom-lizozom füzyonundan önce bile parçalanan rodopsin'in C-terminusunu tanır. Böylece, hangi fragmanların hangi antikorla boyandığını anlamak, lizozomal öncesi ve lizozomal 32,40,41 olan rodopsin işleme kusurları hakkında bir fikir verir.

Figure 1
Resim 1: Foto-oksitlenmiş dış segment (OxOS) arıtımı ve karakterizasyonu. (A) 254 nm UV el tipi lamba (ii) veya UV Crosslinker cihazı (iii) ile muamele edilmiş politetrafloroetilen kaplı bir slayt üzerinde OS'nin tasviri. (B) Tedavi edilmemiş (normal) OS (RegOS) ile karşılaştırıldığında, tedavi edilen OS (OxOS), konfokal görüntüleme (solda) (ölçek çubuğu = 10 μm) ve akış sitometrisinde (sağda) gösterildiği gibi otofloresansı arttırmıştır. El tipi UV lambası ile muamele edilen OxOS'un otofloresan yoğunluğu, 3 J /cm2'lik bir radyant maruziyetinde UV Crosslinker Cihazı ile muamele edilen işletim sistemine benzerdi (hata çubuğu = S.E.M.). (C) UV MARUZIYETININ neden olduğu OS proteininin çapraz bağlantısını gösteren SDS-PAGE. El tipi UV lambası aracılığıyla OxOS çapraz bağlama, 6 J / cm2'lik bir radyant pozlamada UV Crosslinker Cihazı ile muamele edilen işletim sistemine benzerdi. Monomerik rodopsin bir okla vurgulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: hfRPE kültürlerinde OxOS kaynaklı lipofussin benzeri granüllerin görüntülenmesi. ( A) OxOS tarafından indüklenen otofloresan granüller (yeşil), 20 beslemeden sonra 5 beslemeye kıyasla önemli ölçüde daha fazla birikmiştir. Rodopsin antikoru (macenta) ile kalıntı OxOS boyası. Ölçek çubuğu = 10 μm. (B) OxOS (yeşil) tarafından indüklenen UAM, filipin boyama (kırmızı) ile değerlendirildiği gibi serbest kolesterol veya kolesterol esteri ile zenginleştirilmemiştir. Skele çubuğu = 10 μm. (C) Lipofussin varlığında floresan birlikte boyanması için görüntüleme yöntemleri. (i ) UAM kanamasını en aza indiren otofaji belirteci LC3'ü (macenta) boyamak için uzak kırmızı florofor (Alexa 647) kullanımı. Standart yeşil kanal uyarma ve emisyon filtresi kurulumuyla görüntülenen saf UAM (yeşil). Ölçek çubuğu = 2 μm. (ii) Orantılı görüntülemenin kullanılması, Alexa 488 ile etiketlenmiş LC3 boyamadan UAM otofloresansının deşifre edilmesine yardımcı olur. Uyarma 488 nm, yeşil kanal emisyon bandpası 500-535 nm, kırmızı kanal emisyon bandpası ise 600-645 nm'dir. Kırmızı kanal, LC3 sinyalini yeşil kanaldan izole etmek için çıkarma maskesi olarak uygulanabilir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (iii) Lipofuscin/UAM'ın floresan ömrü tipik olarak spesifik boyalardan daha kısa olduğundan, UAM otofloresansı, bir foton sayma dedektörüne 2 ns'den daha kısa sürede gelen floresan sinyallerinin geçitlenmesiyle azaltılabilir. Üst görüntü geçit olmadan. Alt görüntü, yalnızca 2 ns'den daha uzun bir ömre sahip floresan sinyallerini tutan gating ile. UAM sinyalinde, üst ve alt görüntüler arasındaki belirli LC3 sinyaline (Alexa 488 ile etiketlenmiş) kıyasla daha büyük bir göreceli azalma vardır. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: OS fagositozunu ölçmek için "Toplam Tüketim Kapasitesi" yöntemi. (A) Batı lekesi ile test edildiği gibi, OS'nin RPE kültürüne girmesinden sonra hem hücre lizatında hem de süpernatantta kalan toplam rodopsin proteini. 50 μL ortamda düzenli işletim sistemi beslendikten sonra, hem şartlandırılmış ortam / süpernatant hem de hücreler 0, 4 ve 24 saatte birlikte lize edildi. 0 saatlik zaman noktası, her bir Transwell'e beslenen toplam işletim sistemi miktarını gösteren bir kontrol görevi görür. Sağlam rodopsin bandı (tek ok), kontrol ve UAM yüklü RPE hücreleri arasında farklı değildi, bu da UAM'nin RPE fagositozu üzerinde büyük bir etkisi olmadığını düşündürmektedir. Bununla birlikte, çift oklarla gösterilen rodopsin'in bölünme ürünleri, UAM grubunda daha yüksekti ve bu da fagolizozomal sistemde hafif bir bozunma disfonksiyonu olduğunu düşündürüyordu. Eşit GAPDH seviyeleri, fagositoz oranlarını etkileyebilecek kuyucuklar arasındaki hücre sayısının eşit olduğunu göstermektedir. (B) Farklı rodopsin antikorları farklı bozunma fragmanlarını tanır. 4D2, lizozomal bozunmanın son adımlarına kadar bozulmamış olan rodopsin'in N-terminusunu tanır. Bu nedenle tanıdığı parçalar küçüktür (çift ok). Buna karşılık, 1D4, fagolizozomal süreçte daha önce parçalanan rodopsin'in C-terminusunu tanır. Bu nedenle bu antikor, daha yüksek moleküler ağırlığa sahip rodopsin fragmanlarını (çift oklar) tanır. Her iki antikor da bozulmamış rodopsini (tek ok) tanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Şekil 3A'ya karşılık gelen düzenlenmemiş leke. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RPE lipofuscin on yıllardır çalışılırken, toksisitesi 2,9,16,42 tartışılmaktadır. Hayvan modellerinden lipofuscin'in toksisitesi hakkında belirsizlik göz önüne alındığında11, insan RPE'sini kullanan in vitro modeller değerlidir. Bir dizi in vitro lipofussin birikim modeli tanımlanmıştır, ancak hiçbiri hem OS beslenmesini hem de yüksek olgun ve farklılaşmış insan RPE kültürlerini kullanmamıştır. Bu kombinasyon ideal bir modeli temsil eder, çünkü OS besleme in vivo lipofussin birikimi yöntemini özetler ve oldukça olgun insan RPE kültürleri RPE davranışını in vivo olarak en iyi şekilde kopyalar. İlginçtir ki, oldukça farklılaşmış hfRPE kültürleri kullanıldığında, rutin işletim sistemi maruziyetinin, tekrarlanan beslemelerden sonra bile, lipofussin benzeri materyali indüklemek için yetersiz olduğu keşfedilmiştir16. Böylece, bu protokol kontrollü bir şekilde foto-oksitleyici OS (OxOS) ile lipofussin birikim sürecini hızlandırır. OxOS'un hem insan iPSC-RPE hem de hfRPE kültürlerine beslenmesi, sindirilemeyen otofloresan malzeme (UAM) olarak adlandırılan lipofussin benzeri granüllerin sağlam birikimine neden oldu. UAM birikimi, sağlıklı insan RPE'sini in vivo 22,23,29,43,44 taklit eden kültür sistemlerinde lipofusin modellenmesine izin verir. Hem önceki bir yayında hem de bu çalışmada, UAM'nin sağlıklı yaşlı yetişkinlerden elde edilen doğal lipofuscin ile karşılaştırıldığında kapsamlı karakterizasyonu hem benzerlikleri hem de farklılıkları göstermektedir. UAM, lipofuscin granüllerinin melanolipofuscin16'yı oluşturmak için melanin granülleriyle kaynaşma eğilimi de dahil olmak üzere lipofuscin'in ultrayapısını in vivo olarak taklit eder. Hem UAM hem de lipofuscin önemli nötr lipitler içerir, rodopsin içermez ve kolesterolde önemli bir zenginleştirme içermez (Önceki yayınımız16'dan Şekil 2A, B, yukarıdaki Şekil 2A, B ve yayınlanmamış veriler). Ayrıca doğal lipofussin granül boyutunu ve spektrumunu UAM'dakilerle karşılaştırdık (Önceki yayınımız16'dan Şekil 3). UAM granülleri başlangıçta doğal lipofuscin'e kıyasla biraz daha büyük ve maviye kaymıştır, ancak kültürde önemli süreler boyunca, UAM emisyon spektrumlarında daha küçük bir boyuta ve kırmızıya kaymaya kompakttır ve doğal lipofuscin'in boyutuna ve spektrum profiline çok daha benzer hale gelir.

OxOS UAM modeli, otofaji indükleyicilerinin lipofussin granüllerinin önlenmesi ve çıkarılması üzerindeki etkileri50 ve lipofuscin'in RPE polaritesi ve metabolizması üzerindeki etkileri16 dahil olmak üzere bir dizi uygulama için kullanılmıştır. Ayrıca, bu granüllerin kültürlenmiş RPE'de bir yıldan fazla bir süre devam ettiği gösterilmiştir, bu da lipofussin spektrumlarının, morfolojisinin ve davranışının uzun süre boyunca evrimini incelemeyi sağlar16. Model için diğer uygulamalar arasında kompleman aktivasyonu51, lizozomal stabilite ve inflamatuar yanıtlar 52 ve mitokondriyal uzlaşma53 üzerine lipofussin birikiminin incelenmesi yer almaktadır.

Bu protokolün birkaç kritik adımı vardır. İlk olarak, RPE kültürleri oldukça farklılaşmış ve olgun olmalıdır. OxOS beslemeleri ancak RPE en az 8 hafta boyunca Transwells'te kaldıktan ve oldukça olgun RPE'nin tüm özelliklerini elde ettikten sonra başlamalıdır (Finnemann ve ark. tarafından detaylandırılan 5 'P'ler - morfolojide poligonal, postmitotik, pigmentli, polarize ve fagositik54). İkincisi, işletim sistemi oldukça kırılgandır ve pipetleme sırasında dikkatle kullanılmalıdır. Son olarak, işletim sisteminin toplam UV akısına maruz kalmaya oranı, bozulmadan kalan ancak yine de UAM'yi indükleyebilen OxOS üretmek için kritik öneme sahiptir; Bu oran bu protokolde rafine edilmiştir. Belirli sayıda işletim sistemi için çok fazla UV ışığı aşırı çapraz bağlanmaya neden olur ve işletim sistemindeki kritik kimyasal yapıları tahrip eder. Belirli sayıda işletim sistemi için çok az UV ışığı, kültürde UAM'yi indükleyemez.

Protokoldeki değişiklikler büyük ölçüde OxOS besleme süresini veya konsantrasyonunu değiştirmeyi içerir. Ampirik olarak, yaklaşık 4 hafta boyunca 20 besleme, sağlam miktarda UAM birikimi üretir. Bunun ötesindeki beslemeler kademeli olarak UAM birikimine katkıda bulunabilirken, daha az beslemenin yalnızca sporadik UAM birikimine neden olması muhtemeldir. Besleme sayısı, deneycinin ve deneycinin amacına, ihtiyaçlarına ve kaynaklarına göre ayarlanabilir. Daha az farklılaşmış RPE kültürlerinde (daha yüksek geçiş sayısı, hücre hatları veya epitelyal-mezenkimal geçiş özellikleri gösteren kültürler), sağlam UAM indüksiyonu için daha az besleme ve daha düşük OxOS konsantrasyonlarına ihtiyaç vardır.

Protokolün birkaç sınırlaması vardır. İşletim sisteminin foto-oksidasyonu için el tipi bir UV lambasının kullanılması, işletim sistemine verilen toplam radyant maruziyetin hassas bir şekilde ölçülmesini önler. Bununla birlikte, el lambasını kullanarak işletim sisteminin foto-oksidasyonu, bu çalışmada, radyant maruz kalma için parametrelerin sağlanmasına yardımcı olmak için Şekil 1'deki çok daha pahalı (ancak kantitatif) bir UV Crosslinker Cihazı ile ilişkilendirilmiştir. Deneycilerin, çapraz bağlama / rodopsin yayma paterni, Şekil 1C'deki Western lekesinin UV lamba sütununda görülenleri taklit edene kadar UV maruziyetinin süresini değiştirmeleri önerilir.

Yöntemin ikinci bir sınırlaması, lipofussin birikiminin in vivo özelliklerinin çoğundan yoksun olmasıdır. Gerçekten de, bu protokol boyunca, lipofussin benzeri granüller, bu ayrımı netleştirmek için sindirilemeyen otofluroesan malzeme (UAM) olarak adlandırılır. Foto-oksitleyici işletim sistemi, hastalık durumlarında fotoreseptör dış segmentlerinde meydana gelen doğal kimyasal çapraz bağlamanın bir kısmını özetler, ancak çapraz bağlama büyük ölçüde hızlandırılır ve UAM modelinde muhtemelen daha spesifik değildir. Ayrıca, yaklaşık bir aylık OxOS beslemelerine rağmen, UAM modeli, lipofuscin'in insanlarda birikmesi için geçen on yıllara kıyasla, lipofuscin indükleyen işletim sistemine hala "akut" bir maruziyeti temsil etmektedir. Kültürde daha uzun süreli lipofussin birikimi ile daha az fenotipik etki olabilir. Bununla birlikte, UAM granülleri burada sunulan kültür sisteminde bir yıldan fazla sürdüğü için, RPE sağlığı üzerindeki uzun vadeli etkilerini inceleme fırsatı vardır16.

RPE fagositoz kapasitesini değerlendirmek için burada sunulan "Toplam Tüketim Kapasitesi" yönteminin bir sınırlaması, fagositoz defektlerinin OS bağlanmasına karşı alıma karşı bozulmaya bağlı olup olmadığını ayırt edememesidir. Gerçekten de, fagositoz testinin amacı, fagositoz sürecinin belirli adımlarının işlev bozukluğuna mekanik bir bakış açısı olduğunda, geleneksel OS nabız kovalama testleri daha uygundur. "Toplam Tüketim Kapasitesi" ölçümü, amaç basitçe kontrol altındaki RPE kültürünün OS fagositoz yeterliliğini deneysel koşullara karşı açık bir şekilde ölçmek olduğunda kullanılmalıdır.

Sonuç olarak, yüksek oranda farklılaşmış insan RPE kültürlerinde lipofussin benzeri granül birikimi için bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem, lipofussin birikimi için fizyolojik süreci - foto-oksitlenmiş OS'nin tekrarlanan beslenmeleri - insan RPE'sini in vivo olarak güçlü bir şekilde özetlemek için tekrarlanan çalışmalarda gösterilen RPE kültür modelleriyle birleştirir. Lipofussin benzeri granüllerle dolu elde edilen kültürler, lipofuscin etkilerinin RPE biyolojisi üzerindeki değerlendirilmesinden, lipofussin birikimini modüle etmek için önemli olan küçük moleküllerin, genlerin ve sinyal yolaklarının testlerine kadar sayısız uygulama için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma, kısmen, Vitreo-Retinal Cerrahi Vakfı (VRSF), Görme için Mücadele (FFS) ve Uluslararası Retina Araştırma Vakfı (IRRF) tarafından verilen hibelerle desteklenmektedir. J.M.L.M. şu anda Ulusal Göz Enstitüsü'nden (EY033420) bir K08 hibesi ile desteklenmektedir. HFT araştırması için hiçbir federal fon kullanılmadı. Daha fazla destek James Grosfeld Initiative for Dry AMD ve aşağıdaki özel bağışçılardan geliyor: Barbara Dunn ve Dee &; Dickson Brown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dish Corning #353003 Others also work
24-well Transwells Corning #3470
Anti-LC3 antibody Cell Signaling Technology #4801S 1:1000 dilution
Anti-rhodopsin antibody 1D4 Abcam #5417 1:1000 dilution. Epitope is C-terminal.
Anti-rhodopsin antibody 4D2 EnCor Biotech MCA-B630 1:5000 dilution for western blot, 1:1000 dilution for immunostaining. Epitope is N-terminal.
Autofluorescence quencher Biotium #23007 TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher
Autofluorescence quencher Vector Laboratories SP-8400 Vector TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit
Bodipy 493/503 Life Technologies D3922
Cholesterol esterase  Life Technologies From A12216 kit
Confocal microscope Leica Leica Stellaris SP8 with FALCON module
Dark-adapted bovine retinas W. L. Lawson Company Dark-adapted bovine retinas (pre-dissected) Contact information:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
Filipin Sigma-Aldrich F4767
Flow cytometer Thermo Fisher Attune NxT
Flow cytometer analysis software  BD FlowJo
Handheld UV light  Analytik Jena US UVGL-55
Human MFG-E8 Sino Biological 10853-H08B
Human purified Protein S Enzyme Research Laboratories HPS
Laemmli sample buffer Thermo Fisher J60015-AD
LDH assay Promega J2380 LDH-Glo Cytotoxicity Assay
Mounting media Invitrogen P36930 Prolong Gold antifade reagent
Nile red Sigma-Aldrich #72485
Polytetrafluoroethylene-coated slides Tekdon Customized Customized specifications: PTFE mask with the following "cut-outs" -  3 glass rectangles, each measuring 17 mm x 9 mm, oriented so that the 17 mm side is 4 mm from the top of the slide and 4 mm from the bottom of the slide, assuming a standard microscope slide of 25 mm x 75 mm. Each rectangle is spaced at least 6 mm away from other rectangles and the edges of the slide. Print PTFE mask on a slide with frosted glass on one side to allow for labeling of the slide.
Protease inhibitors  Cell Signaling Technology #5872
Protein assay Bio-Rad #5000122 RC DC protein assay
TEER electrode World Precision Instruments STX3
Trans-epithelial electrical resistance (TEER) meter World Precision Instruments EVOM3
Ultraviolet crosslinker device Analytik Jena US UVP CL-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215 (2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, Clifton, N.J. 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, Clifton, N.J. 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582 (2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39 (2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170 (2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118 (2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. 0, 51-60 (2014).

Tags

Biyoloji Sayı 194 Lipofuscin Retinal Pigment Epiteli (RPE) Fotoreseptör Dış Segment Uçları veya Fragmanları (OS) Fagositoz Stargardt Hastalığı Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonu (AMD) Sindirilemeyen Otofloresan Materyal (UAM)
Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. … More

Zhang, Q., Autterson, G., Miller, J. M. L. Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures. J. Vis. Exp. (194), e65242, doi:10.3791/65242 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter