Summary
Descriviamo un metodo per raccogliere in modo efficiente l'emolinfa quantificabile da piccoli artropodi per analisi successive.
Abstract
Gli artropodi sono noti per trasmettere una varietà di virus di importanza medica e agricola attraverso la loro emolinfa, che è essenziale per la trasmissione del virus. La raccolta dell'emolinfa è la tecnologia di base per lo studio delle interazioni virus-vettore. Qui, descriviamo un nuovo e semplice metodo per la raccolta quantitativa di emolinfa da piccoli artropodi usando Laodelphax striatellus (la piccola cavalletta bruna, SBPH) come modello di ricerca, poiché questo artropode è il principale vettore del virus della striscia di riso (RSV). In questo protocollo, il processo inizia pizzicando delicatamente una gamba dell'artropode congelato con una pinzetta a punta fine e premendo l'emolinfa fuori dalla ferita. Quindi, una semplice micropipetta composta da un capillare e un bulbo di pipetta viene utilizzata per raccogliere l'emolinfa trasudativa dalla ferita secondo il principio delle forze capillari. Infine, l'emolinfa raccolta può essere sciolta in un tampone specifico per ulteriori studi. Questo nuovo metodo per raccogliere emolinfa da piccoli artropodi è uno strumento utile ed efficiente per ulteriori ricerche sugli arbovirus e sulle interazioni vettore-virus.
Introduction
Sia i virus animali che quelli vegetali possono essere trasmessi dagli artropodi e questi virus rappresentano una grave minaccia per la salute umana e causano enormi perdite economiche in agricoltura 1,2,3. È importante sottolineare che l'emolinfa degli artropodi, che funge da sistema circolatorio e un elemento vitale del sistema immunitario negli artropodi, svolge un ruolo importante nella regolazione della trasmissione arbovirale. I virus acquisiti attraverso l'intestino degli artropodi vengono trasportati ad altri tessuti solo dopo essere sfuggiti con successo all'ambiente emolinfatico avverso 4,5,6,7. Il ciclo di vita dei virus nell'emolinfa degli artropodi comporta la sopravvivenza del virus nel plasma fluido, l'ingresso nell'emocita e il trasporto ad altri tessuti, e vari meccanismi di interazione virus-vettore si verificano nell'emolinfa 8,9,10,11,12. Ad esempio, la trasmissione verticale di RSV da parte dell'SBPH dipende da un'interazione molecolare tra la proteina vitellogenina SBPH e la proteina del capside RSV (virus della striscia di riso)13,14. Alcuni virus possono sfuggire alla risposta immunitaria dell'emolinfa legando specifici fattori vettoriali15,16,17,18. Pertanto, lo studio delle interazioni vettore-virus nell'emolinfa degli artropodi è importante per sviluppare una migliore comprensione della trasmissione dell'arbovirus.
L'emolinfa di alcuni piccoli insetti, come cavallette, cicaline e alcune zanzare, è difficile da raccogliere a causa delle loro dimensioni. Per affrontare questo problema, sono stati sviluppati diversi metodi per raccogliere l'emolinfa, tra cui l'inserimento di un ago da siringa direttamente nel corpo dell'insetto per estrarre un microvolume dell'emolinfa, la raccolta dell'essudato dal sito della ferita con pinzette a punta fine e la centrifugazione diretta. Questi metodi hanno permesso la misurazione dei livelli relativi di espressione genica e dei titoli virali all'interno dell'emolinfa 19,20,21. Tuttavia, un metodo efficace per quantificare il volume dell'emolinfa, necessario per il conteggio degli emociti, la quantificazione delle proteine e l'analisi dell'attività enzimatica, non è attualmente disponibile per questi piccoli insetti.
Il SBPH (piccola cavalletta marrone) è un tipo di piccolo insetto vettore con una lunghezza del corpo di circa 2-4 mm. L'SBPH è in grado di trasmettere una varietà di virus vegetali, tra cui RSV, virus nano grezzo del mais e virus nano striato nero del riso22,23,24. L'interazione tra SBPH e RSV è stata studiata in modo approfondito negli ultimi dieci anni. Per facilitare il lavoro con gli SBPH, abbiamo sviluppato un metodo nuovo e semplice per raccogliere l'emolinfa. Questo metodo, che si basa sul principio delle forze capillari, utilizza un capillare con un segno di scala per acquisire l'emolinfa dell'insetto in modo preciso e quantificabile. Questo ci permette di raccogliere un volume specifico di emolinfa da piccoli insetti in modo efficiente e di studiare l'ambiente emolinfatico di piccoli vettori in modo più dettagliato.
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Protocol
1. Allevamento di insetti
- Aumentare le SBPH utilizzate in questo esperimento nelle piantine di riso (Oryza sativa cv. Nipponbare). Piantare 20 piantine di riso in un'incubatrice (65 mm x 200 mm) e crescere a 25 °C sotto un fotoperiodo di 16 ore di luce e 8 ore di buio.
2. Dissezione degli SBPH per la raccolta dell'emolinfa
- Mettere gli SBPH in una provetta da centrifuga e metterli in un bagno di ghiaccio per 10-30 minuti.
NOTA: Non posizionare gli SBPH nel bagno di ghiaccio per meno di 10 minuti, altrimenti gli insetti potrebbero rianimarsi. - Posizionare un SBPH congelato su un vetrino (vedi Tabella dei materiali) sotto uno stereomicroscopio (vedi Tabella dei materiali) con l'addome rivolto verso l'alto. Regola la messa a fuoco sulle sei zampe dell'insetto.
- Preparare due pinzette ad alta precisione (vedi Tabella dei materiali) con punte ultrasottili. Usa una pinzetta per premere sul corpo dell'insetto per tenerlo in posizione, e usa l'altra per estrarre con attenzione una delle zampe dall'insetto.
NOTA: Per gli insetti con un guscio duro, un bisturi oftalmico può essere utilizzato per tagliare una delle gambe. - Premere delicatamente il petto dell'insetto con una pinzetta per far fluire l'emolinfa attraverso la ferita.
NOTA: L'emolinfa si presenta come goccioline trasparenti senza alcun flocculo bianco visibile. Scartare il lipide se c'è qualche floccullo bianco, che rappresenta la contaminazione del corpo grasso.
3. Raccolta dell'emolinfa con micropipette
- Preparare una micropipetta. Inserire un tubo capillare (vedere Tabella dei materiali) con un volume di 1 μL nel bulbo della pipetta (vedere Tabella dei materiali). Per misurazioni accurate, assicurarsi che la linea della scala sia visibile.
NOTA: è necessario un piccolo foro presente sulla parte superiore della lampadina della pipetta. - Quando si raccoglie l'emolinfa, tenere il bulbo della pipetta della micropipetta e posizionare il tubo capillare vicino alla ferita dell'insetto. Raccogli l'emolinfa che trasuda dalla ferita semplicemente toccando la punta del capillare all'emolinfa.
- Bloccare leggermente il piccolo foro sulla parte superiore del bulbo della pipetta con il dito per interrompere il processo di assorbimento quando il liquido all'interno del tubo capillare raggiunge la linea di calcare desiderata.
NOTA: Raccogliere un campione di 1 μL di emolinfa incessantemente e rapidamente per evitare la contaminazione lipidica e l'ostruzione del tubo. - Premere il bulbo della pipetta per scaricare l'emolinfa raccolta in 100 μL di tampone PBS (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
NOTA: Il tubo capillare viene inserito nel tampone PBS. - Passare a un nuovo tubo capillare quando si raccoglie un altro campione di emolinfa da 1 μL.
4. Colorazione blu Coomassie
- Raccogliere 3 campioni di emolinfa con lo stesso volume (1 μL) dalle larve del 3° stadio secondo i protocolli descritti nella fase 3 e scaricare l'emolinfa raccolta nel tampone PBS per ottenere un volume totale di 100 μL.
- Aggiungere 25 μL di tampone di carico proteico 5x (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% W/V Bromophenol Blue, 50% W/V glicerolo, 5% W/V β-mercaptoetanolo) in 100 μL dei campioni emolinfatici diluiti e riscaldare per denaturare le proteine.
- Caricare 20 μL dei campioni bolliti su un gel proteico SDS-PAGE al 10% (vedere Tabella dei materiali) per separare le proteine.
- Colorare il gel in una soluzione di Coomassie Blue (mescolare 1 g di Coomassie Brilliant Blue R-250 con 250 mL di isopropanolo, 100 mL di acido acetico glaciale e 650 mL di ddH2O e filtrare eventuali particelle usando carta da filtro) per 1 ora a temperatura ambiente, quindi decolorare il gel per 1 ora con soluzione decolorante (100 mL di acido acetico, 400 mL di metanolo, 500 mL di ddH2O).
5. Determinazione della concentrazione proteica
- Diluire 10 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) a 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml e 0,3125 mg/ml con tampone PBS utilizzando il metodo di diluizione a due volte.
- Aspirare 5 μL di tampone PBS e ogni concentrazione di soluzioni BSA nella fase 5.1, aggiungere 1 mL di 1x reagente colorante Bradford (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare il tampone PBS nel reagente colorante Bradford come controllo e zero a OD = 595 nm. Misurare i valori di assorbanza di ciascuna delle restanti concentrazioni proteiche e fare una curva standard.
- Aggiungere 1 μL di emolinfa da SBPH larvali, femminili o maschili in 100 μL di tampone PBS, quindi centrifugare i campioni a 1.000 x g per 10 minuti a 4 °C per rimuovere gli emociti.
- Aspirare 90 μL di surnatante in una nuova provetta da centrifuga e misurare i valori di assorbanza del surnatante secondo le istruzioni riportate al punto 5.2.
- Calcolare le concentrazioni proteiche dei campioni emolinfatici secondo l'equazione di regressione della curva standard. Includere tre repliche biologiche con tre repliche tecniche negli esperimenti.
6. Rilevamenti microscopici
- Utilizzare micropipette per raccogliere emolinfa da 10-15 SBPH in diverse fasi di sviluppo. Aggiungere l'emolinfa raccolta in un tubo contenente 20 μL di soluzione di paraformaldeide al 4% (vedere Tabella dei materiali). Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti per fissare l'emolinfa.
- Pipettare 20 μL di emociti fissi al centro di un vetrino rivestito di silano (vedere Tabella dei materiali).
- Asciugare la goccia in uno stendino.
NOTA: Evitare un'eccessiva asciugatura. - Coprire il campione con il reagente antisbiadimento d'oro 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (vedi Tabella dei materiali) e ispezionare il vetrino al microscopio invertito (vedere Tabella dei materiali).
7. Quantificazione cellulare
- Raccogliere 1 μL di emolinfa dagli SBPH con una micropipetta e scioglierlo in 20 μL di tampone PBS.
- Diluire i campioni di emolinfa cinque volte con tampone PBS.
- Pipettare 20 μL di soluzione emolinfatica al centro della camera di conteggio delle cellule (vedere Tabella dei materiali). Coprire la goccia con un coprislip (vedere Tabella dei materiali).
- Contare le cellule nei cinque quadrati della camera di conteggio delle cellule (Figura supplementare 1), al microscopio invertito (vedi Tabella dei materiali). Includere tre repliche biologiche con tre repliche tecniche in ciascuno degli esperimenti.
Cellule/μL = conteggio totale di cinque quadrati centrali × fattore di diluizione 5 × × 104
8. Analisi statistiche
- Eseguire analisi statistiche con il software corrispondente (vedi Tabella dei materiali). Creare un nuovo file e selezionare la colonna, importare i dati e generare un grafico a dispersione con una barra.
- Calcola la media e la SD per ciascun gruppo di dati utilizzando le statistiche delle colonne e utilizza uno strumento ANOVA unidirezionale per valutare il significato delle differenze tra i gruppi. Determinare la media e la SD da tre repliche biologiche con tre esperimenti indipendenti.
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Representative Results
Modello di micropipetta e raccolta dell'emolinfa
Abbiamo sviluppato una semplice micropipetta la cui azione si basa sulle forze capillari del tubo capillare. La micropipetta è composta da un tubo capillare e da un bulbo per pipetta (Figura 1A). I tubi capillari sono disponibili in diverse dimensioni di volume che vanno da 1 μL a 20 μL e i volumi dei tubi capillari sono selezionati in base alle esigenze. I tubi capillari con volumi più piccoli non sono suggeriti perché le aperture extra fini dei tubi di volume più piccolo possono rendere difficile l'assorbimento di liquidi come l'emolinfa. La lampadina della pipetta contiene un foro sulla parte superiore che non può essere tappato durante la raccolta dell'emolinfa. Questa lampadina per pipette è comoda per trattenere la micropipetta durante la raccolta del liquido (Figura 1B) e aiuta anche a trasferire il liquido raccolto dal tubo capillare nel tampone di raccolta.
Per raccogliere facilmente l'emolinfa, in questo lavoro, gli SBPH sono stati prima congelati nel ghiaccio o nel frigorifero. Questi SBPH congelati sono stati quindi localizzati su un vetrino sotto uno stereomicroscopio e una delle gambe di ciascun SBPH è stata estratta con pinzette a punta fine (Figura 1C). Per garantire una grande ferita e una raccolta ottimale dell'emolinfa, è meglio staccare la gamba alla radice (Figura 1Ca, b). Al fine di ridurre al minimo il rischio di contaminazione da parte del corpo grasso, sono state raccolte solo gocce liquide chiare senza alcun floccolo bianco (Figura 1Cc). La micropipetta è stata utilizzata per assorbire i volumi desiderati di emolinfa (Figura 1Cd). Per raccogliere 1 μL di emolinfa, è stato necessario sezionare circa 30-40 SBPH larvali o 8-15 SPBH adulti.
Analisi dell'emolinfa raccolta
Per valutare l'accuratezza della micropipetta come metodo per valutare il volume dell'emolinfa raccolta, abbiamo testato le concentrazioni proteiche di diversi campioni. L'emolinfa dalle larve è stata raccolta utilizzando una micropipetta con un volume capillare di 1 μL e tre campioni di proteine sono stati raccolti separatamente e testati eseguendo un gel SDS-PAGE. I risultati hanno mostrato che la quantità di proteine nelle tre corsie era quasi uguale (Figura 2A). Per le larve, il contenuto proteico totale era di 3,707 mg/ml ± 1,382 mg/ml. Abbiamo anche raccolto lo stesso volume di emolinfa da SBPH adulti femminili e maschili, e questi hanno mostrato concentrazioni proteiche di 3,515 mg / ml ± 1,400 mg / ml e 3,621 mg / ml ± 0,860 mg / ml, rispettivamente (Tabella 1). Non ci sono state differenze significative nella proteina tra i tre campioni (Figura 2B).
Inoltre, abbiamo anche osservato gli emociti all'interno dell'emolinfa larvale raccolta per valutare la qualità e la purezza dei campioni di emolinfa. Gli emociti variavano in dimensioni tra 2-20 nm e non è stato rilevato alcun corpo grasso (Figura 2C). La maggior parte delle cellule identificate erano plasmatociti, di diametro compreso tra 5 e 15 nm e spesso apparivano in aggregati25. Abbiamo quindi contato le concentrazioni cellulari dell'emolinfa da larve, femmine adulte e maschi adulti, e le concentrazioni cellulari identificate erano 1.794 x 10 5 / μL ± 0.614 x 10 5 / μL, 1.256 x 10 5 / μL ± 0.603 x 10 5 / μL e 1.553 x 10 5 / μL ± 0.474 x 10 5 / μL, rispettivamente (Tabella 2). La conta delle cellule emocitarie nelle larve, nelle femmine adulte e nei maschi adulti non ha mostrato differenze significative (Figura 2D). Questi risultati indicano che il metodo di raccolta delle micropipette è un modo affidabile e accurato per raccogliere l'emolinfa dagli SBPH.
Figura 1: Schema del modello di micropipetta e della raccolta dell'emolinfa . (A) Composizione della micropipetta. La micropipetta è costituita da un capillare e una lampadina per pipetta. I volumi capillari vanno da 1 a 20 μL. La lampadina della pipetta ha un piccolo foro sulla parte superiore e inferiore. Il capillare viene inserito nel foro inferiore e la scala è visibile. (B) Schema riassuntivo della raccolta dell'emolinfa con una micropipetta. L'addome degli insetti viene tenuto rivolto verso l'alto mentre una gamba viene staccata, viene indotto il deflusso dell'emolinfa e l'emolinfa viene raccolta nella pipetta sotto uno stereomicroscopio. (C) Processo di raccolta dell'emolinfa con una micropipetta. Una delle zampe viene staccata alla radice con una pinzetta a punta fine (a), e il corpo dell'insetto viene premuto per far fuoriuscire l'emolinfa (b, c). L'emolinfa dalla ferita viene raccolta nel capillare (d). Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Analisi dell'emolinfa SBPH . (A) Colorazione blu di Coomassie che mostra tre repliche dell'emolinfa larvale raccolta. L'orlo indica emolinfa. (B) Concentrazioni proteiche totali dell'emolinfa delle SBPH larvali, femminili e maschili. (C) Immagini microscopiche che mostrano le cellule presenti nell'emolinfa negli SBPH con ingrandimento 20x e 60x, rispettivamente. Il nucleo era colorato con DAPI (blu). Barra della scala = 50 μm. (D) Densità degli emociti delle SBPH larvali, femminili e maschili. La media e la SD sono state calcolate da tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Emolinfa | Concentrazione proteica (mg/ml) |
| Larva | 3,707±1,382 |
| Femmina | 3.515±1.400 |
| Maschio | 3,621±0,860 |
Tabella 1: Concentrazioni proteiche di emolinfa da diversi SBSP. I dati sono stati ottenuti da tre repliche biologiche.
| Emolinfa | Concentrazione cellulare (105 / μL) |
| Larva | 1,794±0,614 |
| Femmina | 1,256±0,603 |
| Maschio | 1,553±0,474 |
Tabella 2: Le concentrazioni totali di emociti nell'emolinfa da diversi SBSP. I dati sono stati ottenuti da tre repliche biologiche.
Figura supplementare 1: Determinazione del numero di celle. I quattro quadrati d'angolo (1, 2, 3 e 4) e il quadrato centrale (5) vengono contati nella camera di conteggio delle celle. Per le celle di bordo, vengono conteggiati solo i due limiti (in alto e a sinistra). Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
L'emolinfa è il mezzo del sistema circolatorio negli artropodi e gli arbovirus possono invadere altri tessuti degli artropodi solo se sono in grado di sopravvivere all'ambiente emolinfatico ostile. La raccolta di un campione di alta qualità di emolinfa è il primo passo nello studio delle interazioni vettore-virus che si verificano nell'emolinfa. È stato riportato che l'emolinfa degli insetti può essere ottenuta da diversi siti sul corpo dell'insetto, tra cui una ferita sulla gamba anteriore, un'incisione minore nella zona della testa o una ferita lacrimale all'addome26,27,28,29. Diversi metodi di raccolta possono funzionare per alcune acquisizioni. Il metodo che prevede la creazione di una piccola incisione sull'articolazione testa-collo è più adatto per la raccolta di emolinfa da grandi insetti come le apimellifere 26. Creare una ferita nella zona della testa dell'SBPH è impegnativo in quanto può danneggiare altri organi e introdurre contaminazione da altri tessuti. Dopo aver fatto una ferita lacrimale all'addome, gli insetti vengono immersi nel tampone e quindi il tampone viene centrifugato per estrarre l'emolinfa. Questo è un metodo conveniente per raccogliere lipidi da piccoli insetti21. Tuttavia, poiché vi è un'elevata quantità di corpo grasso all'interno dell'emocele di SBPH, una ferita sulla parte del corpo può causare perdite di corpo grasso dalla ferita e portare alla contaminazione dell'emolinfa. Questo metodo è più adatto per la raccolta di emolinfa da SBPH adulti, che hanno meno corpo grasso delle larve. Per prevenire efficacemente la contaminazione del corpo grasso, si consiglia di fare una ferita sul sito della gamba piuttosto che direttamente sul corpo. In precedenti studi sull'emolinfa SBPH, sono state utilizzate pinzette a punta fine per facilitare la raccolta di piccole gocce di liquido dalla ferita13. Sebbene l'emolinfa raccolta fosse chiara dalle impurità, il volume dell'emolinfa non è stato misurato. In questo studio, abbiamo sviluppato una semplice micropipetta che può essere utilizzata per raccogliere in modo accurato e quantitativo l'emolinfa da insetti vettori molto piccoli.
Per una raccolta emolinfatica di successo, è necessario prendere in considerazione diversi passaggi critici. In primo luogo, è essenziale anestetizzare gli insetti a 4 ° C per 15 minuti al fine di produrre emolinfa priva di corpo adiposo. In secondo luogo, è più semplice ottenere emolinfa pura tirando fuori la prima gamba. In terzo luogo, la raccolta dell'emolinfa dovrebbe essere fatta in modo continuo e rapido, altrimenti l'emolinfa potrebbe coagulare sul fondo e bloccare il capillare.
La tecnica di raccolta capillare è stata ampiamente utilizzata per la raccolta del sangue animale30,31. Abbiamo modificato la tecnica per adattarla alle caratteristiche distintive dell'emolinfa degli insetti. Poiché gli SBPH possiedono una piccola dimensione corporea, è stato scelto un capillare con un volume minimo di 1 μL. L'uso di un capillare con un volume inferiore a 1 μL non è raccomandato. È interessante notare che l'emolinfa contiene un'alta densità di proteine e un numero considerevole di cellule (Figura 2), che elevano la sua densità liquida e rendono difficile l'assorbimento dell'emolinfa attraverso capillari con volumi più piccoli.
Il metodo di raccolta dell'emolinfa per capillare è una tecnica semplice, economica e praticabile che consente la quantificazione affidabile e precisa dell'emolinfa. Questo metodo di recente sviluppo potrebbe anche essere applicato per la raccolta di altri fluidi traccia da piccoli vettori, come la melata. È fondamentale sottolineare che gli insetti rimangono vivi dopo l'estrazione dell'emolinfa usando questo metodo. Ciò è utile per gli studi che coinvolgono altri organi degli insetti o per la raccolta ripetuta di emolinfa. Questo lavoro presenta una preziosa tecnologia per lo studio dell'entomologia e delle interazioni virus-vettore.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal National Key R&D Program of China (n. 2022YFD1401700) e dalla National Science Foundation of China (n. 32090013 e n. 32072385).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% SDS-PAGE protein gel | Bio-rad | 4561035 | Protein separation and detection |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | For fixation of the cells or tissues |
| Bradford dye reagent | Bio-rad | 5000205 | Protein concentration detection |
| Capillary | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Cell counting chamber | ACMEC | AYA0810 | Hemocytes counting |
| Glass slide | Gitoglas | 10127105A | For holding insects |
| Glass slide coated with silane | Sigma | S4651-72EA | For holding microscope samples |
| Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Nucleus staining |
| Microscope cover glass | Gitoglas | 10212424C | For microscopic observation |
| Pipette bulb | Hirschmann | 9000101 | For collecting hemolymph |
| Prism 8.0 software | GraphPad Software | / | Statistical analyses |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | For insect dissection |
| Tweezers | Tianld | P5622 | For insect dissection |
| Zeiss inverted microscope | Zeiss | Observer Z1 | Hemocytes observation |
References
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