Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Användning av MicroSiM (μSiM) barriärvävnadsplattform för modellering av blod-hjärnbarriären

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65258
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 3, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology

Summary

Denna rapport tillhandahåller protokoll för montering, cellodling och analyser på μSiM-plattformen för konstruktion av blod-hjärnbarriärmodeller.

Abstract

MicroSiM (μSiM) är en membranbaserad odlingsplattform för modellering av blod-hjärnbarriären (BBB). Till skillnad från konventionella membranbaserade plattformar ger μSiM experimentalister nya möjligheter, inklusive avbildning av levande celler, obehindrad parakrin signalering mellan "blod" och "hjärn"-kammare, och förmågan att direkt avbilda immunofluorescens utan behov av extraktion/återmontering av membran. Här demonstrerar vi den grundläggande användningen av plattformen för att etablera monokultur (endotelceller) och samkultur (endotelceller och pericyter) modeller av BBB med hjälp av ultratunna nanoporösa kiselnitridmembran. Vi visar kompatibilitet med både primära cellkulturer och humana inducerade pluripotenta stamcellskulturer (hiPSC). Vi tillhandahåller metoder för kvalitativ analys av BBB-modeller via immunofluorescensfärgning och demonstrerar användningen av μSiM för kvantitativ bedömning av barriärfunktion i en småmolekylär permeabilitetsanalys. De metoder som tillhandahålls bör göra det möjligt för användare att etablera sina barriärmodeller på plattformen, vilket främjar användningen av vävnadschipteknik för att studera mänskliga vävnader.

Introduction

Levande vävnader delas upp av specialiserade celler som skapar och upprätthåller barriärer och reglerar vilka celler och molekyler som transporteras från ett fack till ett annat. Felaktig reglering av barriärfunktioner kan vara källan till både akuta sjukdomar och kroniska sjukdomar. Blod-hjärnbarriären (BBB) är den mest restriktiva vävnadsbarriären i människokroppen1. Dysfunktion i BBB ligger till grund för ett brett spektrum av sjukdomar i centrala nervsystemet (CNS), inklusive Alzheimers sjukdom2, Parkinsons sjukdom3,4 och multipel skleros 5,6. Skada på BBB är också kopplad till långvarig kognitiv försämring som ett resultat av akuta störningar, såsom sepsis7, COVID-198 och postoperativt delirium9. Utvecklingen av läkemedel med potential att behandla hjärnsjukdomar har varit frustrerande svår på grund av utmaningen att avsiktligt bryta mot BBB för att leverera bioaktiva molekyler till mål i hjärnan10. Av dessa skäl är metoder för att studera BBB-funktion in vitro av största vikt för förståelsen och behandlingen av sjukdomar i CNS.

De grundläggande metoderna för att mäta barriärfunktion in vitro innebär att ett monolager eller samkultur etableras på ett semipermeabelt membran och att man mäter det motstånd som cellerna ger mot antingen diffusion av små molekyler eller små elektriska strömmar11,12,13,14. Även om framväxten av mikrofysiologiska system (MPS) har gett ett överflöd av val för modellering av BBB i 3D15,16, gör mångfalden av systemgeometrier det svårt att jämföra permeabilitetsmätningar mellan MPS eller med etablerade litteraturvärden. Fastställandet av tillförlitliga baslinjevärden är särskilt viktigt inom BBB-forskning där, på grund av den omfattande barriärregleringen av hjärnans vaskulära endotelceller, permeabilitetsvärden in vitro granskas noggrant12,17,18. Av dessa skäl kommer permeabilitetsmätningar över monolager som etablerats på 2D-membran att förbli en stapelvara i BBB-studier i många år framöver. Detta gäller för andra vävnadsbarriärer, inklusive epitelbarriärer, där absoluta värden för permeabilitet vid baslinjen används för att validera och jämföra in vitro-modeller 19,20,21.

Med målet att etablera ett värdefullt nytt verktyg för BBB-forskarsamhället har vi introducerat 22 och avancerade23,24,25,26 mikroenhetenmed en kisel m-embranplattform(μSiM) för användning i barriärvävnadsmodellering under de senaste 5 åren. Plattformens möjliggörande egenskap är ett ultratunt (<100 nm tjockt) membran med hundratals miljoner nanoporer 27,28 eller en blandning av nanoporer och mikroporer29. De fristående membranchipsen tillverkas på ett 300 μm kiselchip som stabiliserar de ultratunna strukturerna30 och gör att de kan hanteras av pincetter för montering av enheter. På grund av sin ultratunna natur har membranen en permeabilitet som är två storleksordningar högre än för konventionella spåretsade membran som används i kommersiella membranodlingsenheter31,32. I praktiken innebär detta att membranets hinder för diffusion av molekyler som är mindre än nanoporerna (<60 nm) är försumbart33. Således, för cellulära barriärer, kommer endast cellerna och matriserna de deponerar att bestämma hastigheten för transport av små molekyler från de apikala till basala facken som separeras av membranet34. Enhetens design och membranens ultratunna natur ger också många fördelar för optisk mikroskopi. Dessa inkluderar 1) förmågan att följa levande kulturer med hjälp av faskontrast eller ljusfältsavbildning, 2) förmågan att fluorescerande färga och avbilda på plats utan att behöva extrahera och överföra membranet till ett täckglas, och 3) det faktum att membranen är tunnare än konfokala "skivor" så att direkta samkulturer har ett mer naturligt avstånd mellan celltyperna än vad som kan uppnås med 6-10 μm tjocka spåretsade membran.

Nyligen avancerade vi plattformen till ett modulärt format för att underlätta snabb montering34 och anpassning35,36. Vi utnyttjade det modulära formatet för att distribuera enhetskomponenter mellan våra biotekniska och samarbetande hjärnbarriärlaboratorier. Vi utvecklade sedan gemensamt protokoll för enhetsmontering, monokultur och samodling, immunofluorescensfärgning och permeabilitet för små molekyler och visade att dessa metoder var reproducerbara mellan laboratorier. Med hjälp av dessa protokoll visade vi också att den modulära plattformen stöder en validerad BBB som utvecklats med hjälp av den utökade endotelodlingsmetoden (EECM) för att skapa mikrovaskulära endotelceller i hjärnan (BMEC) från humana inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs)37. Syftet med den aktuella rapporten är att granska dessa metoder mer i detalj och, med hjälp av den medföljande videon, underlätta en bredare användning av plattformen i BBB-communityt.

Protocol

1. Montering av μSiM-enhet

OBS: Denna metod beskriver monteringen av enheterna. Membranspånet har en dikessida och en platt sida, som kan monteras dike uppåt eller nedåt. Trench-down-enheter används oftast för cellodling.

  1. I en steril miljö (t.ex. en biosäkerhetshuv), förbered allt material för montering, inklusive monteringsfixturer, komponenter, membranchips och pincett.
  2. Placera membranchipet på mitten av fixtur A1 med hjälp av chippincett. Den plana ytan på spånan är vänd nedåt och dikesområdet är vänt uppåt för dikesgrävningsanordningar och vice versa för dikningsanordningar.
    OBS: Följande monteringssteg illustreras genom att använda dikesgrävningsanordningen som example, vilket möjliggör ett plant tillväxtområde i den övre kammaren.
  3. Fäst komponent 1 på chipet. Dra först av de blå skyddsskikten på båda sidor av komponent 1 med en rak pincett och placera den i fixtur A1, med den övre kammaren nedåt. Tryck försiktigt ned komponent 1 tills det tryckkänsliga limmet (PSA) vidrör chipet.
  4. Sätt fixtur A2 på fixtur A1 och applicera ett fast tryck i olika hörn för att säkerställa en tät passning av spånan och komponenten.
    OBS: Se till att inte ta bort PSA-skiktet. Det är ett genomskinligt och styvare lager jämfört med de blå skyddsskikten.
  5. Fäst komponent 2 till komponent 1 med chipet. Förbered först komponent 2 genom att ta tag i ett hörn av komponent 2 med en rak pincett och dra av den från arket. Ta sedan tag i den icke-PSA "triangeln" på komponent 2 och ta tillsammans bort det tjocka, genomskinliga skyddsskiktet och det blå lagret på komponent 2, vilket exponerar PSA-ytan. Placera komponent 2 i fixtur B1, PSA-sidan uppåt.
  6. Placera komponent 1 med membranchipet i fixtur B1, den övre kammaren uppåt.
  7. Sätt fixtur B2 på komponent 1 och applicera ett fast tryck i olika hörn av fixtur B2.
  8. Ta ut den monterade enheten ur fixturen och använd en rak pincett för att trycka ut eventuella luftbubblor på enhetens undersida och täta kanterna på kanalerna, undvik kontakt med membranområdet. Före användning för cellodling, ultraviolett (UV)-sterilisera nymonterade enheter i 20 minuter.

2. Cellodling

OBS: Denna metod beskriver protokoll för primära och hiPSC-härledda kulturer på plattformen. Metoderna beskriver endotelcellsmonokultur i den övre kammaren i enheten och samodling av pericyter och endotelceller med pericyter i den nedre kammaren och endotelceller i den övre kammaren i dikesmonterade enheter. För kammarens mått och volymer, se tabell 1. Det här är de vanligaste formaten; Andra cellodlingslayouter kan dock användas beroende på användarens behov.

  1. Förberedelse av cellodlingskammare
    1. Montera enheterna enligt protokollet som beskrivs i avsnitt 1.
    2. Placera enheterna i sterila slangklämmor. Före cellodling, sterilisera clamps genom att blötlägga dem i etanol i ≥20 min. Sterilisera på nytt efter varje försök för återanvändning.
    3. Odla enheterna i en stor steril petriskål. För extra luftfuktighet, lägg till en liten petriskål eller 50 ml koniskt rörlock fyllt med sterilt vatten.
    4. Tvätta apparaternas övre kammare två gånger med 100 μl sterilt vatten. För cellodling i bottenkammaren, tvätta bottenkammaren med 20 μL sterilt vatten.
  2. hCMEC/D3 cellinje (BBB) monokultur
    1. Bered cellodlingskammaren enligt avsnitt 2.1.
    2. Täck de övre kamrarna med 25 μg/cm2 kollagen I och 5 μg/cm2 humant fibronektin blandat i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Låt den sitta i 1-2 timmar vid 37 °C eller över natten vid 4 °C.
    3. Ta bort beläggningslösningen och tillsätt 100 μl förvärmt endotelmedium utan tillväxtfaktor (analysmedium) till den övre kammaren och 20 μL till den nedre kammaren. För att bereda analysmediet, blanda 100 ml endotelialt basalmedium + 400 μl human fibroblastisk tillväxtfaktor + 40 μl hydrokortison + 100 μl gentamicinsulfat + 2 ml fosterbovint serum.
    4. Passage hCMEC/D3-celler enligt tillverkarens protokoll; trypsinisera cellerna i en 37 °C inkubator i 3-5 minuter och stoppa sedan trypsiniseringen genom tillsats av förvärmt endotelmedium. Överför cellsuspensionen till ett centrifugrör och centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Återsuspendera cellpelleten i analysmedia och så cellerna i de övre kamrarna med en densitet av 40 000-60 000 celler/cm2. Inkubera enheterna vid 37 °C med 5 % koldioxid (CO 2 ) i2-4 timmar för att underlätta cellvidhäftning. Till exempel, för att uppnå 40 000 celler/cm2 på 0,37 cm 2-chipet, tillsätt 100 μL av en celllösning med en koncentration på 150 000 celler/ml till den övre kammaren.
      OBS: Vi odlar och passerar hCMEC/D3 enligt Hudecz et al.38, med hjälp av en modifierad formulering av endotelial tillväxtmedia-2 (EGM-2) för cellunderhåll och ett tillväxtfaktorreducerat "analysmedium" efter subkultur för analyser. Andra medieformuleringar bör vara kompatibla med enheterna, även om vi rekommenderar medieformuleringarna från Hudecz et al.38 om användarna upplever problem med hCMEC/D3-överlevnad.
    5. Efter 2-4 timmar för cellvidhäftning, byt ut mot färskt analysmedium i båda kamrarna för att avlägsna döda eller ofästa celler.
    6. Håll enheterna vid 37 °C med 5 % CO 2, byt analysmediet i båda kamrarna var2-3:e dag tills experimentet utförs. Analyser utförs vanligtvis efter 2 veckors odling.
  3. hiPSC-härledd EECM-BMEC-liknande cellmonokultur
    1. Bered cellodlingskammaren enligt avsnitt 2.1.
    2. Bered kollagen IV från human placentalösning genom att tillsätta 5 ml 0,5 mg/ml ättiksyra till 5 mg kollagen IV för att skapa en 1 mg/ml lösning. Låt lösningen stå i ≥4 timmar vid 4 °C tills den är helt färdigfärdig. Lösningen är stabil vid 4 °C i 2 veckor.
    3. Täck de övre kamrarna med 100 μL av ett 4:1:5-förhållande av kollagen IV, bovint fibronektin och sterilt vatten. Täck vid 37 °C i 2-4 timmar.
    4. Ta bort beläggningslösningen och tillsätt 100 μL rumstemperatur hECSR till den övre kammaren och 20 μL till den nedre kammaren.
    5. Passage EECM-BMEC-liknande celler enligt Nishihara et al.37; Tillsätt en blandning av cellavskiljande enzymer till cellerna och överför till en 37 °C inkubator i 5-8 minuter. Pipettera celllösningen för att singularisera och tillsätt till 4x volymen endotelmedium i ett centrifugrör. Centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur; återsuspendera cellerna i hECSR och frö i de övre kamrarna med en densitet av 40 000 celler/cm2. Inkubera enheterna vid 37 °C med 5 % CO 2 i2-4 timmar för att underlätta cellvidhäftning. Till exempel, för att uppnå 40 000 celler/cm2, tillsätt 100 μL av en celllösning vid 150 000 celler/ml.
    6. Efter 2-4 timmar för cellvidhäftning, byt ut mot färsk hECSR i båda kamrarna för att avlägsna döda eller ofästa celler.
    7. Håll enheterna vid 37 °C med 5 % CO 2 och byt hECSR i båda kamrarna var1-2:e dag fram till experimentet. Analyser utförs vanligtvis på dag 6 av odlingen.
  4. hCMEC/D3 och primär human hjärnvaskulär pericyt (HBVP) samkultur
    1. Innan enheten monteras, belägg membranchipsen med 2 μg/cm2 poly-L-lysin (PLL) blandat i PBS. Applicera 50-80 μL PLL i en droppe endast på den sida som kommer att vara vänd nedåt i den slutliga enhetsmonteringen. Slutför beläggningsprocessen på antingen 1-2 timmar vid 37 °C eller över natten vid 4 °C.
    2. Ta bort beläggningslösningen. Tvätta membranchipsen med sterilt ultrarent vatten och låt dem torka.
    3. Montera enheterna enligt det protokoll som beskrivs i avsnitt 1 ovan, med den PLL-belagda sidan nedåt, och förbered cellodlingskammaren enligt avsnitt 2.1.
    4. Belägg de övre kamrarna enligt punkt 2.2.2.
    5. Tillsätt 50 μl förvärmt pericytmedium till de övre kamrarna och tillsätt 20 μl till de nedre kanalerna.
    6. Passage HBVP enligt tillverkarens protokoll; trypsinisera cellerna i en 37 °C inkubator i 3-5 minuter och avbryt sedan trypsiniseringen genom tillsats av förvärmt pericytmedium. Överför cellsuspensionen till ett centrifugrör och centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Återsuspendera cellpelleten i pericytmedium och så cellerna i bottenkamrarna med en densitet av 14 000-25 000 celler/cm2. Vänd på enheterna men behåll ett luftgränssnitt med de övre kamrarna för att underlätta gasutbytet.
      OBS: Luftgränssnittet som krävs under inversion kan uppnås genom att vända enheterna efter att ha placerat dem inuti slangen clamps och tryck ner i alla hörn innan de vänds, eller genom att placera enheterna upp och ner på parallella remsor av akryl eller silikon tillräckligt långt ifrån varandra för att hålla de övre kamrarna fria. Sådddensiteten kan behöva optimeras för varje användare. För att uppnå 14 000 celler/cm2, tillsätt 20 μL av en cellsuspension vid ~590 000 celler/ml. Observera att 20 μL pipetteras in i bottenkammaren för att undvika bubblor, men densiteten beräknas med hjälp av bottenkammarens volym på 10 μL.
    7. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 % CO 2 i2-4 timmar i inverterat läge för att underlätta cellvidhäftning.
    8. Efter 2-4 timmar för cellvidhäftning, vänd enheterna upprätt och byt ut dem mot färskt pericytmedium i båda kamrarna för att ta bort döda eller ofästa celler.
    9. Efter pericytsådd, så hCMEC/D3 i den övre kammaren, enligt steg 2.2.4–2.2.5. Byt båda kamrarna till analysmediet.
    10. Håll enheterna vid 37 °C med 5 % CO 2 och byt analysmedium i båda kamrarna var1-2:e dag tills experimentet utförs. Samodling av primär cell upprätthålls vanligtvis i 6-8 dagar före analyserna.
      OBS: Om HBVP-monokulturerna ska jämföras med hCMEC/D3-monokulturer eller hCMEC/D3- och HBVP-samkulturer, byt sedan ut pericytmediet mot analysmediet 2-3 dagar efter sådd av HBVP:erna.
  5. hiPSC-härledd EECM-BMEC-liknande cell och hjärnpericytliknande cell (BPLC) samkultur
    1. Bered cellodlingskammaren enligt avsnitt 2.1 och belägg de övre kamrarna enligt punkterna 2.3.2–2.3.3.
    2. Ta bort beläggningslösningen och tillsätt 50 μL rumstemperatur Essential 6 Medium + 10 % Fetal Bovine Serum (E6 + 10 % FBS) till den övre kammaren.
    3. Passage av BPLC:erna enligt Gastfriend et al.39; tillsätt en cellavlossningsenzymblandning till cellerna och överför till en 37 °C inkubator i 5-15 min, tills ~90 % av cellerna är rundade. Pipettera celllösningen för att singularisera och tillsätt 4x volymen DMEM/F12 i ett 50 ml centrifugrör, med hjälp av en 40 μm cellsil för att filtrera och helt singularisera cellerna. Överför till ett 15 ml centrifugrör, centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur, återsuspendera cellpelleten i E6 + 10 % FBS och så cellerna i bottenkamrarna med en densitet av 14 000-25 000 celler/cm2. Vänd på enheterna men behåll ett luftgränssnitt med den övre kammaren för att underlätta gasutbytet.
      OBS: Luftgränssnittet som krävs under inversion kan uppnås genom att vända enheterna efter att ha placerat dem inuti slangen clamps och tryck ner i alla hörn innan de vänds, eller genom att placera enheterna upp och ner på parallella remsor av akryl eller silikon med tillräckligt långt avstånd från varandra för att hålla de övre kamrarna fria. Sådddensiteten kan behöva optimeras för varje användare. För att uppnå 14 000 celler/cm2, tillsätt 20 μL av en cellsuspension vid ~590 000 celler/ml. Observera att 20 μL pipetteras in i bottenkammaren för att undvika bubblor, men densiteten beräknas med hjälp av bottenkammarens volym på 10 μL.
    4. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 % CO 2 i2-4 timmar i inverterat läge för att underlätta cellvidhäftning.
    5. Efter 2-4 timmar för cellvidhäftning, vänd enheterna upprätt och byt ut dem mot färsk E6 + 10 % FBS i båda kamrarna för att ta bort döda eller ofästa celler.
    6. En dag efter pericytsådd, så EECM-BMEC-liknande celler i den övre kammaren, enligt steg 2.3.5-2.3.6. Växla båda kamrarna till hECSR.
    7. Håll enheterna vid 37 °C med 5 % CO 2 och byt analysmediet i båda kamrarna var1-2:e dag tills experimentet utförs. hiPSC-härledd samodling upprätthålls vanligtvis i 7 dagar för BPLC och 6 dagar för EECM-BMEC-liknande celler före analyser.
      OBS: Om BPLC-monokulturerna kommer att jämföras med EECM-BMEC-monokulturer eller EECM-BMEC- och BPLC-samkulturer, byt sedan E6 + 10 % FBS mot hECSR 1 dag efter sådd av BPLC.

3. Immunocytokemi

OBS: Denna metod beskriver ett protokoll för immunocytokemisk färgning och avbildning av celler odlade i membranets ovan- och/eller undersida. Syftet med detta experiment är att bestämma närvaron och placeringen av nyckelproteiner som bör finnas i BBB, såsom adherens och tight junction-proteiner och cellidentitetsproteiner. Alternativa och levande färgningsmetoder är också kompatibla med plattformen.

  1. Fixering och färgning på enheterna
    1. Lägg de primära antikropparna på is för att tina.
    2. Bered en 4 % paraformaldehydlösning (PFA) vid rumstemperatur (t.ex. späd 16 % PFA i 3 gånger volymen PBS) eller kyl 100 % metanol vid -20 °C.
    3. Skapa en lämplig blockeringslösning enligt tabell 2. Förvara på is.
      OBS: Vortexing av lösningen kan vara nödvändig för att helt lösa upp Triton X-100.
    4. Fixera cellerna genom att pipettera 20 μL fixeringsmedel (t.ex. PFA eller metanol) i den nedre kammaren och 50 μL i den övre kammaren. Inkubera enheterna i 10 minuter (PFA) eller 2 minuter (metanol) vid rumstemperatur.
    5. Tvätta i 3 x 5 minuter genom att pipettera 20 μL PBS genom den nedre kammaren och 100 μL i den övre kammaren.
    6. Blockera i 30 minuter vid rumstemperatur genom att tillsätta 20 μl blockeringslösning till den nedre kammaren och 50 μl blockeringslösning till den övre kammaren. Kontrollera om det finns bubblor i bottenkammaren.
    7. Bered den primära antikroppslösningen genom att späda ut antikroppen eller antikropparna i den blockerande lösningen enligt tabell 2. Förvara på is.
    8. Färga med de primära antikropparna genom att tillsätta 20 μl av den primära antikroppslösningen till den nedre kammaren och ersätta volymen i den övre kammaren med 50 μl av den primära antikroppslösningen. Kontrollera om det finns bubblor i bottenkammaren. Inkubera i 1 timme i rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
    9. Tvätta i 3 x 5 minuter genom att pipettera 20 μL PBS genom den nedre kammaren och 100 μL i den övre kammaren.
    10. Bered den sekundära antikroppslösningen genom att späda ut antikroppen eller antikropparna i den blockerande lösningen enligt tabell 2. Förvara på is skyddad från ljus.
    11. Färga med sekundära antikroppar genom att tillsätta 20 μl sekundär antikroppslösning till den nedre kammaren och ersätta den övre kammarens volym med 50 μl av den sekundära antikroppslösningen. Kontrollera om det finns bubblor i bottenkammaren. Inkubera i 1 h i rumstemperatur skyddad från ljus.
    12. Tvätta i 3 x 5 minuter genom att pipettera 20 μL PBS genom den nedre kammaren och 100 μL i den övre kammaren.
    13. Gör en nukleär fläcklösning. Späd ut Hoechst 1:10 000 i PBS. Tillsätt 20 μL av kärnfärgningslösningen till den nedre kammaren och ersätt volymen av den övre kammaren med 50 μL av kärnfärgningslösningen. Kontrollera om det finns bubblor i bottenkammaren. Inkubera i 3 minuter i rumstemperatur skyddad från ljus.
    14. Ta bort fläcken genom att tillsätta 20 μL PBS till den nedre kammaren och ersätta volymen på den övre kammaren med 100 μL PBS. Ta en bild av apparaterna omedelbart eller förvara dem vid 4 °C med petriskålen insvept i parafilm och skyddad från ljus tills den är klar för bildbehandling.
  2. Konfokal avbildning
    OBS: Det här avsnittet beskriver avbildning av enheterna med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop med roterande skiva med ett 40x objektiv med långt arbetsavstånd (LWD) (vatten, WD 590-610, numerisk bländare 1.15) som ett example. För arbetsavstånd och linskompatibilitet, se kompletterande material i McCloskey et al.34. Bilder av hela membranområdet tas också med ett 10x-objektiv för att säkerställa att 40x-bilderna är representativa för hela fältet. Dessa tas vanligtvis i widefield.
    1. Slå på mikroskopet och öppna bildbehandlingsprogrammet.
    2. Ställ in kanalerna enligt egenskaperna hos den sekundära antikroppen och kärnfläcken med hjälp av konfokalbildsläge. Optimera lasereffekten och exponeringstiden för att säkerställa att signalen är ovanför bakgrunden och minskar bildartefakter.
      1. För Hoechst kärnfärgning, använd excitation 405, emission 450/50 Bandpass (BP), 500 ms exponeringstid, 50 % lasereffekt. För etiketter som använder en sekundär antikropp konjugerad till Alexa Fluor (AF) 488, använd excitation 488, emission 525/50BP, 500 ms exponeringstid och 50 % lasereffekt. För etiketter som använder en sekundär antikropp konjugerad till AF568, använd excitation 561, emission 600/50BP, 500 ms exponeringstid och 100 % lasereffekt.
    3. Placera enheten i hållaren för objektglaset med den övre kammaren uppåt och sätt in den i mikroskopet med hjälp av en hållare för objektglas. Slå på Live och välj kanal för kärnkraftsfläcken. Hitta membranet med ett lågt objektiv och se till att det genomskinliga kiselnitridmembranområdet är centrerat, eftersom ljus inte kommer att överföras genom det blå, fasta silikonområdet. När enheten är korrekt centrerad och celskiktet har hittats, byt till 40x-objektivet, blöt objektivet och fokusera på membranregionen med hjälp av kärnfläcken som guide.
    4. Aktivera z-stack-avbildning och ställ in skanningsläget på Start/Slut. Ställ in stegstorlek eller antal. Använd grovjusteringsratten på mikroskopet, ställ in skanningsstarten till toppen av endotelcellskiktet, med kärnfläcken som guide, och skanna änden längst ner på pericytskiktet, med kärnfläcken som guide. Kontrollera alla kanaler för att säkerställa att allt kommer att fångas i bildfältet.
      OBS: Vi använder vanligtvis autosteg, vilket är ~0.2 μm skivor.
    5. Ställ in bildnamnet och tryck på Hämta för att börja avbilda. Upprepa på olika regioner efter behov.
    6. Bearbeta de konfokala bilderna med ImageJ40 eller Imaris.
      1. För att bearbeta i Imaris, dra bildfilen till programmet för att öppna. Välj Avsnitt på den övre menyraden för att se en 2D-bild av x-y-planet med motsvarande vyer av x-z- och y-z-planen. Välj 3D-vy på den övre menyraden för att se en 3D-bild . Klicka på bilden och dra den för att rotera. Välj Ögonblicksbild i den övre menyraden för att ta en bild.

4. Provtagningsanalys av permeabilitet för små molekyler

OBS: I detta avsnitt beskrivs en metod för kvantitativa mätningar av cellkulturernas barriäregenskaper. Syftet med detta experiment är att detektera koncentrationen av en fluorescerande liten molekyl som passerar genom celllagren och kommer in i plattformens bottenkammare. Dessa data används sedan för att beräkna cellulär permeabilitet.

  1. Provtagningsteknik
    1. Montera enheterna enligt protokollet som beskrivs i avsnitt 1 och odla de önskade cellinjerna enligt beskrivningen i avsnitt 2. Inkludera ytterligare en enhet som fungerar som en cellfri, belagd styrenhet för att mäta systemets permeabilitet.
      OBS: Minst tre tekniska replikat per villkor rekommenderas. Endast ett replikat av den belagda kontrollen krävs dock.
    2. Innan provtagningsanalysen påbörjas ska mediet i den nedre kammaren bytas ut mot ett nytt medium. Kontrollera sammanflödet av endotelmonolagret i varje enhet under mikroskopet. Observera eventuella luckor i cellmonolager, eftersom detta kommer att påverka diffusionen av färgämne i bottenkammaren.
      OBS: En hälsosam endotelkultur bör vara 100 % konfluent.
    3. Bered den fluorescerande lösningen av små molekyler (t.ex. 150 μg/ml Lucifer Yellow, 457 Da) i ett cellodlingsmedium. Bered överskottsvolym av den fluorescerande lösningen av små molekyler som ska användas för beredning av standardlösningarna som tjänar som referenser för att beräkna koncentrationen av den fluorescerande småmolekylen som provtas från bottenkanalen.
      OBS: Vi rekommenderar beredning av 400 μL överskottslösning som standardlösning med den högsta koncentrationen av den fluorescerande lilla molekylen.
    4. Byt ut mediet i den övre brunnen mot 100 μL av den fluorescerande lösningen av små molekyler.
      OBS: Vi rekommenderar att du använder en hydrofob penna för att rita cirklar runt provtagningsportarna och vänta tills det hydrofoba bläcket har torkat helt innan du tillsätter fluorescerande färglösning. Detta förhindrar spridning av mediet från den nedre kanalen runt provtagningsporten i steg 4.1.7. Vi rekommenderar att du sprider ut tillsatsen av den fluorescerande småmolekylära lösningen i den övre brunnen - vänta 2 minuter innan du tillsätter den fluorescerande lösningen till nästa enhet, eller arbeta i grupper om 3 (tillsätt lösningen i tre enheter samtidigt och vänta 5 minuter för att lägga till nästa tre enheter).
    5. Inkubera enheterna vid 37 °C, 5 % CO2 i 1 timme.
    6. Under 1 timmes inkubation i föregående steg bereds standardlösningar genom att utföra 2-faldiga seriespädningar från den fluorescerande lösningen av små molekyler som beretts i steg 4.1.3. Pipett 50 μL av varje lösning i den platta svarta 96-hålsplattan i tre exemplar. Använd blankt cellodlingsmedium som standardlösning vid baslinjen.
      OBS: För att bereda standardlösningar rekommenderar vi 11 seriespädningar vid en slutlig volym på 200 μL och användning av cellodlingsmedium som blank för att mäta den fluorescerande intensiteten vid baslinjen.
      1. Överför 200 μl 400 μl av överskottet av fluorescerande småmolekylär lösning som beretts i steg 4.1.3 till ett rör som innehåller 200 μl medium, blanda väl och överför 200 μl av denna lösning till nästa rör som innehåller 200 μl medium. Upprepa 1:2 spädningar tills det finns totalt 10 rör. Pipett 50 μL av den mest koncentrerade standardlösningen i kolumn 1 i tre exemplar i 96-hålsplattan (B1, C1, D1), den 2:a mest koncentrerade lösningen i kolumn 2 (B2, C2, D2), och så vidare. För den 12:e kolonnen i plattan, pipett 50 μL blankt medium i tre exemplar (B12, C12, D12).
    7. Utför följande steg för att sample den fluorescerande småmolekyllösningen från bottenkanalen.
      1. Ta bort den fluorescerande lösningen av små molekyler från brunnen för att stoppa diffusionsprocessen.
      2. Placera en spets som innehåller 50 μL medium i den övre porten för att fungera som en behållare genom att föra in spetsen med 50 μL i porten, lyfta enheten och försiktigt mata ut spetsen medan du håller i toppen för stabilisering. Ställ ner enheten. Se till att det inte finns några bubblor i pipettspetsen eller luft i pipettens spets för att undvika att lägga till bubblor i bottenkammaren under provtagningen.
      3. Tillsätt 50 μl medium i den övre brunnen för att förhindra att cellmonolagret bryts sönder under provtagningen.
      4. För provtagning av lösningen från den nedre kanalen, tryck en pipetter med en tom pipettspets till dess första motstånd, sätt in spetsen i provtagningsporten och vänd ut 50 μL av lösningen från den nedre kanalen. Överför direkt till den platta svarta 96-hålsplattan som innehåller standardlösningarna.
        OBS: Vi rekommenderar att du kontrollerar cellmonolagret under mikroskopet omedelbart efter provtagning. Att dra media från den nedre kanalen kan ibland resultera i störningar i celskiktet i den övre brunnen, vilket kan orsaka inkonsekventa permeabilitetsmätningar. Att arbeta snabbt genom stegen i 4.1.7 hjälper till att förhindra detta.
    8. Mät fluorescensintensiteten i en mikroplattläsare med hjälp av lämpliga excitations- och emissionsvåglängdsparametrar för den fluorescerande lilla molekylen som används. För Lucifer Yellow, använd 428 nm excitation och 536 nm emission, med optimal förstärkning. Fluorescensen mäts från toppen av plattan. Lägg till plattan i plattläsaren, markera brunnarna med sample (inklusive standardkurvan) och välj Start för att läsa plattan.
  2. Beräkning av permeabilitetsvärdet (se tilläggsfil 1 för mall)
    1. Subtrahera det genomsnittliga värdet för fluorescensintensiteten för det tomma mediet från alla uppmätta värden för fluorescensintensitet.
    2. Använd ekvation (1) för att beräkna systemets permeabilitet Ps:
      Equation 1Nej (1)
      där [A]A är koncentrationen av den fluorescerande lilla molekylen som samlats upp från den nedre kanalen, V är den volym som provtagits och tillsatts plattan (0,050 ml), [A]L är koncentrationen av den fluorescerande lilla molekylen som tillförts den övre brunnen (t.ex. 0,15 mg/ml), t är inkubationstiden (i s eller min beroende på önskade enheter), och S är membranytan (0,014 cm2).
      1. Beräkna [A]A med hjälp av den ekvation som erhålls genom att rita en standardkurva från fluorescensintensitetsutgångarna och de kända koncentrationerna av standardlösningarna. Beräkna koncentrationerna (x) av de experimentella proverna genom att infoga deras fluorescensintensitetsvärden (y) i ekvationen.
        OBS: Använd den del av standardkurvan som är linjär. Vi rekommenderar att du mäter membranytans area från en bild av membranet som tagits under mikroskopet eftersom membranarean kan variera beroende på partinumret och kan påverka de beräknade permeabilitetsvärdena avsevärt om de skiljer sig från den belagda kontrollen.
    3. Använd ekvation (2) för att beräkna permeabiliteten för cellmonolagret Pe:
      Equation 2Nej (2)
      där PS är systemets permeabilitet beräknad i steg 4.2.2 och PC är systempermeabilitetsvärdet för den cellfria, belagda kontrollanordningen.

Representative Results

Monteringen av en dikesgrävningsanordning visas i figur 1. Fixturerna styr monteringen av komponenterna och membranchipet. Komponent 1 är i första hand akryl med en PSA-yta för bindning till chipet och en öppning till bottenkammaren och portar för pipettåtkomst till bottenkammaren. Komponent 2 är kanalskiktet och innehåller en icke-vidhäftande, PSA-fri "triangel" uppe till höger för grepp. Trench-down-enheter ger ett platt cellodlingsområde i den övre kammaren, medan trench-up-enheter har en plan yta för cellodling i den nedre kammaren.

Vi utförde endotelmonokulturer och samkulturer av hCMEC/D3 och HBVP och av hiPSC IMR90-4-härledda EECM-BMEC-liknande celler och BPLC:er och tog fasbilder med hjälp av ett Nikon Eclipse Ts2 faskontrastmikroskop och 10x objektiv (Figur 2). Optimala såddtätheter för primär cellodling visas (bilder tagna 1 dag efter sådd), liksom undersådda HBVP:er (Figur 2A). Slutliga fasbilder från samodling och monokultur (6 dagars endotelcellodling) kan vara svåra att urskilja (figur 2C), och bekräftelse av framgångsrik samodling av primär cell kan kräva immunofluorescensfärgning (se protokoll avsnitt 3). Låga, höga och optimala HIPSC-härledda BPLC-såddtätheter illustreras också (figur 2B). hiPSC-härledd samkultur är tydligare att särskilja i faskontrastavbildning jämfört med primära samkulturer (Figur 2D). Låg BPLC-sådd resulterar i dålig pericyttäckning och pericytklumpning, medan översådd resulterar i att pericytskiktet skalar av membranet. Att byta ut mediet i bottenkammaren för snabbt kan dessutom leda till pericytförlust, eftersom dessa celler är mycket känsliga för skjuvning. Optimal täckning av pericyter är ~90 % för en BBB-modell, utan luckor i endotelskiktet.

Representativa bilder av immunfärgad hiPSC-härledd samodling illustreras i figur 3 (6 dagars endotelcellodling). IMR90-4-härledda BPLC:er färgades för pericytmarkören PDGFRβ, och IMR90-4-härledda EECM-BMEC-liknande celler färgades för vidhäftningsmarkören VE-cadherin. Hoechst användes för att färga kärnorna. Bilderna togs på ett Spinning Disc konfokalmikroskop med ett 40x LWD-objektiv med 0,2 μm skivor och bearbetades med Imaris. Båda cellagren kan visualiseras även om det tunna nanomembranet inte syns.

Vi utförde den provtagningsbaserade permeabilitetsanalysen av små molekyler med samma experimentella förhållanden i två fysiskt avlägsna laboratorier vid University of Bern, Schweiz, och University of Rochester, NY, USA för att visa resultatens reproducerbarhet mellan laboratorier (Figur 4)34. hiPSC IMR90-4-härledda EECM-BMEC-liknande celler odlades i μSiM-enheten i 2, 4 eller 6 dagar och på transbrunnsfilter i 6 dagar. Analysen utfördes med 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da) i båda laboratorierna. Hög variabilitet i permeabiliteten hos endotelcellerna som odlats under 2 dagar i enheten indikerar att 2 dagars odling var otillräcklig för barriärmognad. Det fanns inga signifikanta skillnader i permeabilitet mellan laboratorierna vid barriärmognad från 4 dagar och framåt. Vi visade också att permeabiliteten hos endotelcellerna som odlats i μSiM- och transwellfilter under 6 dagar matchade detidigare publicerade 40.

Figure 1
Figur 1: Steg för μSiM-montering . (A) Förbered chipet genom att placera det på fixtur A1. Placera spåndiket uppåt för en sista dikesgrävning. Placera spåndiket nedåt för en sista dikningsanordning. (B) Fäst komponent 1 på chipet genom att ta bort skyddsmaskerna från komponent 1 och placera den med framsidan nedåt i FA1. Fäst genom att applicera tryck med fixtur A2. C) Limma fast komponent 2 och komponent 1 genom att ta bort komponent 2 från arket och dra av de övre skyddsskikten. Placera kanalen upp i fixtur B1 och placera komponent 1 ovanpå komponent 2 med framsidan uppåt. Fäst genom att applicera tryck med fixtur B2. Förkortningar: = fixtur An; FBn = fixtur Bn. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Schematisk bild av samodling och representativa faskontrastbilder av cellodling i produkter. A) Placering av pericyt- och endotelcellssådd. (B) Sidovy schematisk över cellernas placering tvärs över membranchipets dike. (C) Representativa bilder av låga och optimala såddtätheter för primär HBVP och hCMEC/D3 hjärnans endotelcellinje. Bilderna togs 1 dag efter sådd (HBVP) och 2 timmar efter sådd (hCMEC/D3). (D) Representativa bilder av låga, höga och optimala såddtätheter för hiPSC-härledda pericytliknande celler i hjärnan. Bilderna togs 1 dag efter sådd. (E) Representativa bilder av slutlig HBVP- och hCMEC/D3-samkultur och hCMEC/D3-monokultur. Bilderna togs 8 dagar efter HBVP-sådd och 7 dagar efter hCMEC/D3-sådd. (F) Representativa bilder av misslyckad och framgångsrik BPLC- och EECM-BMEC-liknande cellsamodling och EECM-BMEC-liknande cellmonokultur. Bilderna togs 7 dagar efter BPLC-sådd och 6 dagar efter EECM-BMEC-sådd. Undersådda BPLC-kulturer misslyckas med att ha tillräcklig täckning, medan översådda BPLC-kulturer kommer att växa överkonfluenta och börja klumpa ihop sig/dra sig tillbaka. Skalstreck = 100 μm (C-F). Förkortningar: HBVPs = human brain vascular pericytes; hiPSC = humaninducerad pluripotent stamcell; BPLC = hiPSC-härledda pericytliknande celler i hjärnan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa bilder av immunfärgad hiPSC-härledd cellsamodling i produkter. Cellerna färgades för endotelcellsmarkören VE-cadherin (grön), pericytmarkören PDGFRβ (röd) och kärnfärgningen (blå). Två lager av celler kan ses i närheten av varandra, endast åtskilda av ett tunt nanomembran av kiselnitrid (vit pil markerar membranets placering på vänster bild). Skalstapel = 50 μm. Förkortningar: hiPSC = humaninducerad pluripotent stamcell; PDGFRβ = trombocythärledd tillväxtfaktorreceptor beta. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Provtagningsbaserad permeabilitetsanalys för små molekyler. (A) Schematisk bild av det experimentella arbetsflödet. (B) Demonstration av reproducerbarheten mellan två fysiskt avlägsna laboratorier vid universitetet i Bern (UniBe), Schweiz, och University of Rochester (UR), NY, USA: hiPSC-härledda endotelceller odlades i μSiM-anordningen i 2, 4 eller 6 dagar och i transwellfilter i 6 dagar. Permeabilitetsanalys utfördes med 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da). Den röda stapeln indikerar tidigare publicerade natriumfluoresceinpermeabilitetsdata (376 Da) för samma hiPSC-härledda endotelceller odlade i 6 dagar i transwellfilter40. N = 4-16 per grupp. Tvåvägs ANOVA med Tukeys post hoc-test användes, och jämförelser visades endast för relevanta p < 0,05. C) Påvisande av cytokinsvar med hjälp av hiPSC-härledda EECM-BMEC-liknande celler odlade i μSiM under 2 dagar. 0,1 ng/ml TNFα + 2 IE/ml IFNγ) eller mediekontroll (icke-stimulerad, NS) tillsattes till den övre kammaren i 20 timmar före permeabilitetsanalys med 150 μg/ml Lucifer Yellow. N = 3 per grupp. Elevens t-test, p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Såddyta i den övre kammaren Volym för toppbrunn Såddyta för bottenkammare Nedre kanalvolym
~37 mm2 100 μL (rymmer ≥115 μL) ~42 mm2 10 μL (pipett 20 μL för att undvika bubblor)

Tabell 1: Kritisk μSiM-yta och kritiska volymer.

Mål Fixativ Blockerande lösning Utspädning
VE-cadherin 4 % PFA eller 100 % MeOH 5 % GS + 0,4 % Tx-100 eller 10 % GS + 0,3 % Triton X-100 1:50
CD31 4 % PFA eller 100 % MeOH 5 % GS + 0,3-0,4 % Triton X-100 1:100
Claudin-5 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:200
ZO-1 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:200
Ockludin 100% MeOH 5-10% GS + 0,3% Triton X-100 1:50
PDGFRβ 4% PFA 5 % GS + 0,4 % Triton X-100 1:100
NG2 4% PFA 5 % GS + 0,4 % Triton X-100 1:100
Geten α-mus IgG Alexa Fluor 488 1:200
Geten α-mus IgG Alexa Fluor 568 1:200

Tabell 2: Antikroppar och infärgningsmetoder validerade för samkulturell immunocytokemi i μSiM-produkter. Förkortningar: PFA = paraformaldehyd; MeOH = metanol; GS = getserum.

Tilläggsfil 1: Mall för beräkning av permeabilitetsvärde. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Även om membranspån har utformats för stabilitet, kan de spricka eller gå sönder om de hanteras felaktigt under monteringen. Därför är det viktigt att ta tag i chipet i chippincettens skåror och försiktigt placera det i fixturen. Vid hantering av enheterna i allmänhet måste extra försiktighet iakttas för att inte stöta eller tappa enheterna. Under bindningen av membranchipet till fixtur A1 måste chipet läggas plant och centrerat på pelaren i fixtur A1 för att undvika membransprickor under bindningen till komponent 1. Dessutom måste all kontakt med de exponerade PSA-skikten undvikas efter att skyddsmaskerna har tagits bort. Vid hantering av komponent 2 efter att skyddsmaskerna tagits bort är det lämpligt att hålla den längs komponentens kant och använda en pincett för att ta tag i triangelhörnet som är PSA-fritt.

Medan cellodlingsprotokoll beskrevs för möjliga BBB-modeller, kan BMEC/pericyt-samodlingsmodellen för BBB som beskrivs här vara tillräcklig eller otillräcklig beroende på det fysiologiska sammanhanget och frågor av intresse. Till exempel sker handeln med immunceller till stor del i hjärnans postkapillära venoler41,42. I dessa regioner separerar ett perivaskulärt utrymme BMEC/pericytbarriären från glia-limitanerna som etableras av astrocyter. I postkapillära venoler består den neurovaskulära enheten (NVU) av två fysiskt separerade barriärer i serie, och astrocytiska ändfötter kommer inte direkt i kontakt med BMEC/pericyt-blodbarriären, vilket är väl representerat av den nuvarande modellen. Om målet är en NVU-modell som tar hänsyn till effekten av astrocytutsöndrade faktorer på blodbarriären, kan ett astrocytfack läggas till enheten som möjliggör lösligt faktorutbyte genom det perivaskulära utrymmet. Detta exempel illustrerades tidigare34 och skulle kunna utvidgas till att omfatta andra celler som mikroglia och neuroner i ett 3D-"hjärnfack". Plattformens modulära arkitektur gör det möjligt att använda enkla monteringsstrategier för att uppnå dessa omkonfigurationer så att plattformen är så enkel eller komplex som behövs för att hantera de aktuella hypoteserna. Varje cellodlingsuppsättning; måste dock optimeras för nya cellinjer och multikulturer. Till exempel, på grund av egenskaperna hos kiselnitridmembranen, kan beläggningslösningar behöva justeras jämfört med vävnadsodlingsplattor. Införandet av fibronektin hjälper vanligtvis till med cellbindning och överlevnad. Vidare kunde användarna odla endotelceller och pericyter i motsatta riktningar. I detta fall kan det till exempel vara nödvändigt att ändra hur permeabilitetsmätningarna görs och tolkas. Att tillhandahålla steg för denna typ av kultur ligger dock utanför ramen för detta dokument.

En annan utmaning man kan stöta på under cellodling är den snabba avdunstningen av media eftersom enheterna kan vara känsligare för förändringar i miljön jämfört med vanliga vävnadsodlingsplattor och kolvar. Om överdriven avdunstning ses eller celltillväxt saktas ner måste alla kritiska inkubatorparametrar mätas för att säkerställa korrekta inställningar. Mer vatten kan tillsättas till vävnadslocket eller den lilla petriskålen som placeras inuti cellodlingskammaren, eller så måste media bytas oftare. Vidare kan bubblor komma in i den nedre kanalen och fastna i diket för dikesgrävningsanordningar. Även om de kan tas bort är det lättast att undvika att lägga till bubblor i första hand. För att göra detta är det viktigt att kontrollera att det inte finns några bubblor i pipettspetsen eller luft i änden av pipettspetsen innan du pipetterar media i bottenkammaren. Dessutom kan medieavdunstning i kanalen leda till ett mellanrum mellan medieytan och babords överdel. En liten volym media kan pipetteras in i en port tills mediet når ytan på den motsatta porten, varefter mediet kan bytas ut i den motsatta porten. Medan hECSR- och E6 + 10 % FBS-media inte bör värmas upp i vattenbadet, kan andra medier förvärmas för att minska bubbelbildningen. Om en bubbla kommer in i bottenkammaren kan den avlägsnas genom att snabbt pipettera 100 μL genom kanalen. Denna metod kan dock leda till kontaminering mellan kamrar eller media som spills över enhetens yta. Det kan också störa cellskikten. Alternativt kan mediet först tas bort från kanalen och sedan återinföras med en volym på 50 μL. Om du tar bort mediet först kan det dock leda till att fler bubblor bildas i kanalen. Om en bubbla inte är direkt under membranområdet kan den lämnas kvar i kanalen utan att cellodlingen påverkas.

Pericytbindning och tillväxt, som visas i figur 2, kan vara utmanande. Att använda en optimerad såddtäthet är avgörande för bildandet av ett lager med ett fysiologiskt relevant förhållande mellan pericyter och endotelceller. Vidare, eftersom pericyterna är känsliga för skjuvning, bör alla medieutbyten i kanalen göras mycket långsamt för att skydda cellerna. För BPLC-odling kan förbättrad vidhäftning uppnås genom att belägga bottenkammaren med 800 μg/ml kollagen typ IV eller 100 μg/ml fibronektin.

Immunocytokemi i enheter som beskrivs här möjliggör kvalitativ analys av cellhälsa och funktion. Metoder för färgning i vävnadsodlingsplattor eller andra plattformar bör vara direkt översättbara till plattformen. För cellodling i endast den övre kammaren, efter fixering, kan PBS tillsättas i den nedre kammaren och lämnas för de återstående stegen, med blockering och färgning endast i den övre kammaren. Detta minimerar riskerna för att membranen går sönder eller att det kommer in bubblor i bottenkammaren. För färgning av samkulturer rekommenderar vi att du använder båda kamrarna i alla steg. Det är viktigt att notera att viskositeten hos fixeringsmedlet och PBS skiljer sig från medias. Således kan det vara lättare att lägga till bubblor i bottenkammaren, och extra försiktighet bör iakttas för att kontrollera pipettspetsarna för luft i slutet av spetsen innan pipettering i bottenkammaren.

Protokollet som beskrivs för permeabilitetsanalysen för små molekyler möjliggör funktionell och kvantitativ bedömning av barriärfunktionen hos endotelcellerna som odlas i μSiM-enheten. Ett problem som kan uppstå under denna analys är att luftbubblor dras in i pipetten under provtagningen från den nedre kanalen vid protokollsteg 4.1.7.4. För att undvika detta problem är det viktigt att se till att spetsen är förseglad i porten innan provtagningen påbörjas och sample bör inte dras för snabbt. Om det inte löser problemet kan storleken på de spetsar som används vara för små eller för stora för att passa in i portarna; använd tipsen som anges i materialförteckningen. Om oväntat höga permeabilitetsvärden mäts trots ett konfluentt monolager som ser friskt ut, måste monolagrets integritet kontrolleras för störningar under provtagningen. Vi rekommenderar att du alltid kontrollerar monolagret under mikroskopet omedelbart efter provtagningen. Om monolagret fortfarande verkar intakt och friskt kan provet fixeras och biologiska markörer för barriärfunktion kan bedömas, till exempel genom immunfärgning av korsningsproteinerna. Omvänt, om oväntat låga permeabilitetsvärden mäts, är det viktigt att se till att 50 μL media provtas från bottenkanalen utan några luftbubblor. Om medium kommer ut från provtagningsporten så snart reservoarspetsen är placerad, måste detta medium samlas upp innan pipetten monteras i provtagningsporten, eftersom det mesta av den fluorescerande småmolekylen kommer att finnas i den första 10 μL-volymen som provtas från bottenkanalen. Att rita cirklar runt portarna med en hydrofob penna eller placera en hydrofob tejp med ett hål runt porten förhindrar att passivt pumpade medier sprids. Om bubblor dras ut under provtagningen eller om hela 50 μL-provet inte avlägsnas får provet inte användas. Alternativt kan den exakta volymen bestämmas och användas i permeabilitetsberäkningen; Detta bör dock endast göras om den borttagna volymen är ≥40 μL, vilket motsvarar ~98-99% färgåtervinning34.

Disclosures

J.L.M. är en av grundarna av SiMPore och har en ägarandel i företaget. SiMPore kommersialiserar ultratunna kiselbaserade teknologier, inklusive de membran som används i denna studie.

Acknowledgments

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. och L.W. finansierades av NIH-anslaget R33 HL154249. J.L.M. finansierades av R44 GM137651. M.M. finansierades av Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. M.T. finansierades av RF1 AG079138. K.C. finansierades av International Foundation for Ethical Research.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
CD31 Polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific PA5-32321
Claudin-5 mouse IgG antibody, 4C3C2 Thermo Fisher Scientific 35-2500
Goat α-Mouse IgG Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11001
Goat α-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 Thermo Fisher Scientific A11011
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
NG2, mouse IgG2a, 9.2.27 Millipore  MAB2029
Occludin mouse IgG antibody, OC-3F10 Thermo Fisher Scientific 33-1500
PDGFRβ, rabbit IgG antibody, 28E1 Cell Signaling Technology 3169
VE-cadherin mouse IgG2B Clone # 123413 R&D Systems MAB9381
ZO-1 rabbit IgG antibody, polyclonal Thermo Fisher Scientific 40-2200
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
100% Methanol VWR 101443-718 Can be substituted with similar products
16% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908 Can be substituted with similar products
Accutase Thermo Fisher Scientific A1110501
Acetic acid Sigma-Aldrich 695092
B27 supplement Thermo Fischer Scientific 17504044
bFGF R&D Systems 233-FB-025
Collagen IV from human placenta Sigma-Aldrich C5533
Collagen, Type I solution from rat tail Sigma-Aldrich C3867-1VL Can be substituted with similar products
DMEM/Ham’s F12 Thermo Fisher Scientific 11320033
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit Lonza CC-3162
Essential 6 medium Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal bovine serum (FBS) Peak Serum PS-FB1
Fibronectin from bovine plasma Sigma-Aldrich F1141
Fibronectin human protein, plasma ThermoFisher Scientific 33016015 Can be substituted with similar products
hESFM Thermo Fisher Scientific 11111044
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma-Aldrich 861502
Normal goat serum Thermo Fisher Scientific 500627 Can be substituted with similar products
PBS without calcium, magnesium Cytiva SH30256.01 Can be substituted with similar products
Pericyte Medium ScienCell 1201 Use complete kit (includes supplements)
Poly-L-Lysine, 10 mg/mL ScienCell 0413
Triton X-100 JT Baker X198-05 Can be substituted with similar products
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water Invitrogen™ 10977015 Can be substituted with similar products
Experimental models: Cell lines
Blood-brain barrier hCMEC/D3 cell line Sigma-Aldrich SCC066
Human brain vascular pericytes ScienCell 1200
iPS(IMR90)-4 human induced pluripotent stem cells WiCell RRID:CVCL_C437
Glassware and Plasticware
150 mm TC-treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid Falcon 353025
Clamps VWR MFLX06832-10
Corning tissue culture plates (6-well) Corning 3506
Flat 96-well non-binding microplates Greiner Bio-One 655900
Microscope Slide Device Holder  SiMPore USIM-SB Dimensions compatible with micropscope slide holders
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fischer Scientific 339653 Tube caps can be filled with water for cell culture
P20-200 pipette tips VWR 76322-516 Alternate brands may not seal as effectively into ports
Transwell filters (12 well, 12 mm, 0.4 μm pore size, PC) CoStar 3401
Instruments
10X Objective (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD00105 Air; WD: 4 mm; NA 0.45
10X Objective (For Nikon) Nikon Instruments Inc. MRP40102 Air; WD: 6.2 mm; NA 0.25
40X Objective (LWD) (For Andor) Nikon Instruments Inc. MRD77410 Water immersion; WD: 590-610 mm; NA 1.15
Andor Spinning Disc Confocal microscope Oxford Instruments, Andor
Nikon Eclipse Ts2 Phase Contrast Microscope Nikon Instruments Inc. Can be substituted with similar products
TECAN Infinite M200 TECAN Can be substituted with similar products
Other
Advanced PAP Pen Millipore Sigma Z672548 2 mm tip is recommended
Assembly kit with fixtures SiMPore USIM-JIGSET Including fixure A1, A2, B1, and B2
Camera Adapter for Microscopes AmScope CA-CAN-SLR Canon SLR / D-SLR Φ23.2 - Φ30 adapter fits Nikon Eclipse Ts2
Canon EOS Rebel SL3 DSLR Camera Canon EOS 250D, BH #CAEDRSL3B, MFR #3453C001 Can be substituted with similar products
Cell strainer, 40 µm Millipore Sigma (Corning) CLS431750
Component 1 SiMPore USIM-C1
Component 2 SiMPore USIM-C2
Membrane chips SiMPore NPSN100-1L Other chips formats are available
SMD handling tweezer double angle Techni-Tool 758TW003 "Chip Tweezers"
Stainless steel precision type GG tweezer Techni-Tool 758TW534 "Straight Tweezers"
Software
Fiji ImageJ For image processing
Fusion Oxford Instruments, Andor Instructions for version 2.3.0.44
i-control TECAN Instructions for version 2.0
Imaris Oxford Instruments For image processing. Instructions for version 9.9.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405 (2019).
  2. Nation, D. A., et al. Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction. Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).
  3. Ferrari, C. C., Tarelli, R. Parkinson's disease and systemic inflammation. Parkinsons Disease. 116 (3), 436813 (2011).
  4. Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing. Pharmaceutics. 14 (7), 1451 (2022).
  5. Nishihara, H., et al. Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis. Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).
  6. Ortiz, G. G., et al. Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis. Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).
  7. Orhun, G., et al. Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis. Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).
  8. Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222 (2022).
  9. Hughes, C. G., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients. Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).
  10. Saraiva, C., et al. Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases. Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).
  11. Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery. Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).
  12. Abbott, N. J., et al. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).
  13. Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
  14. Bischoff, I., et al. Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay. Scientific Reports. 6, 23671 (2016).
  15. van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research. Tissue Barriers. 4 (1), e1142493 (2016).
  16. Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
  17. Girard, S. D., et al. High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features. FASEB Journal. 37 (2), e22770 (2023).
  18. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines. 12 (6), 685 (2021).
  19. Lea, T., et al. Caco-2 cell line. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).
  20. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  21. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  22. Mossu, A., et al. A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).
  23. Castro Dias, M., et al. Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880 (2021).
  24. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  25. Khire, T. S., et al. Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).
  26. Salminen, A. T., et al. Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).
  27. DesOrmeaux, J. P. S., et al. Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates. Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).
  28. Hill, K., et al. Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis. Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750 (2020).
  29. Salminen, A. T., et al. Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models. Small. 15 (6), e1804111 (2019).
  30. Gillmer, S. R., et al. Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests. Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).
  31. Ishimatsu, R., et al. Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes. Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).
  32. Kim, E., et al. A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope. Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).
  33. Snyder, J. L., et al. An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes. Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).
  34. McCloskey, M. C., et al. The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804 (2022).
  35. Mansouri, M., et al. The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802 (2022).
  36. Su, S. -H., et al. A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring. Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030 (2023).
  37. Nishihara, H., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions. STAR Protocols. 2 (2), 100563 (2021).
  38. Hudecz, D., et al. Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model. ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).
  39. Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest. Current Protocols. 1 (1), e21 (2021).
  40. Nishihara, H., et al. Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions. FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).
  41. Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
  42. Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. What is the blood-brain barrier (not). Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).

Tags

Bioteknik utgåva 203
Användning av MicroSiM (μSiM) barriärvävnadsplattform för modellering av blod-hjärnbarriären
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCloskey, M. C., Kasap, P.,… More

McCloskey, M. C., Kasap, P., Trempel, M., Widom, L. P., Kuebel, J., Chen, K., Gaborski, T. R., Engelhardt, B., McGrath, J. L. Use of the MicroSiM (µSiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier. J. Vis. Exp. (203), e65258, doi:10.3791/65258 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter