Summary
Deze studie maakt gebruik van temperatuur en materiaalsamenstelling om de vloeispanningseigenschappen van vloeivloeistoffen te regelen. De vaste stofachtige toestand van de inkt kan de printstructuur beschermen en de vloeistofachtige toestand kan de afdrukpositie continu vullen, waardoor het digitale licht dat 3D-printen van extreem zachte bioinks verwerkt, wordt gerealiseerd.
Abstract
Nauwkeurige printfabricage van bioinks is een voorwaarde voor tissue engineering; de Jacobs werkcurve is het hulpmiddel om de precieze printparameters van digital light processing (DLP) te bepalen. De verwerving van werkcurven verspilt echter materialen en vereist een hoge vervormbaarheid van materialen, die niet geschikt zijn voor biomaterialen. Bovendien zijn de vermindering van celactiviteit als gevolg van meervoudige blootstellingen en het falen van structurele vorming als gevolg van herhaalde positionering beide onvermijdelijke problemen bij conventionele DLP-bioprinting. Dit werk introduceert een nieuwe methode voor het verkrijgen van de werkcurve en het verbeteringsproces van continue DLP-printtechnologie op basis van een dergelijke werkcurve. Deze methode voor het verkrijgen van de werkcurve is gebaseerd op de absorptie en fotorheologische eigenschappen van de biomaterialen, die niet afhankelijk zijn van de vervormbaarheid van de biomaterialen. Het continue DLP-printproces, verkregen door het verbeteren van het printproces door de werkcurve te analyseren, verhoogt de afdrukefficiëntie meer dan tienvoudig en verbetert de activiteit en functionaliteit van cellen aanzienlijk, wat gunstig is voor de ontwikkeling van tissue engineering.
Introduction
Tissue engineering1 is belangrijk op het gebied van orgaanherstel. Door het gebrek aan orgaandonatie kunnen sommige ziekten, zoals leverfalen en nierfalen, niet goed worden genezen en krijgen veel patiënten geen tijdige behandeling2. Organoïden met de vereiste functie van de organen kunnen het probleem oplossen dat wordt veroorzaakt door het ontbreken van orgaandonatie. De constructie van organoïden hangt af van de vooruitgang en ontwikkeling van bioprinttechnologie3.
Vergeleken met extrusie-type bioprinting4 en inkjet-type bioprinting5, zijn de printsnelheid en afdruknauwkeurigheid van de digital light processing (DLP) bioprinting methode hoger 6,7. De afdrukmodule van de extrusiemethode is regel voor regel, terwijl de afdrukmodule van de inkjetmethode punt-voor-punt is, wat minder efficiënt is dan de laag-voor-laag afdrukmodule van DLP-bioprinting. De gemoduleerde blootstelling aan ultraviolet (UV) licht aan een hele laag materiaal om een laag in DLP-bioprinting uit te harden en de functiegrootte van het beeld bepaalt de nauwkeurigheid van DLP-afdrukken. Dit maakt DLP-technologie zeer efficiënt 8,9,10. Vanwege overcuring van het UV-licht is de precieze relatie tussen de uithardingstijd en het afdrukformaat belangrijk voor zeer nauwkeurige DLP-bioprinting. Bovendien is continu DLP-afdrukken een wijziging van de DLP-afdrukmethode die de afdrukefficiëntie aanzienlijk kan verbeteren11,12,13. Voor continu DLP-afdrukken zijn nauwkeurige afdrukomstandigheden de belangrijkste factoren.
De relatie tussen de uithardingstijd en het afdrukformaat wordt de Jacobs-werkcurve genoemd, die veel wordt gebruikt bij DLP-afdrukken14,15,16. De traditionele methode om de relatie te verkrijgen is om het materiaal gedurende een bepaalde tijd bloot te stellen en de uithardingsdikte te meten om een gegevenspunt te verkrijgen over de belichtingstijd en uithardingsdikte. Door deze bewerking minstens vijf keer te herhalen en de gegevenspunten aan te passen, krijgt u de Jacobs-werkcurve. Deze methode heeft echter duidelijke nadelen; het moet veel materiaal verbruiken om de uitharding te bereiken, de resultaten zijn sterk afhankelijk van de afdrukomstandigheden, de bioinks die worden gebruikt in DLP-bioprinting zijn duur en zeldzaam en de vervormbaarheid van de bioinks is meestal niet goed, wat kan leiden tot onnauwkeurige metingen van de uithardingsdikte.
Dit artikel biedt een nieuwe methode om de uithardingsrelatie te verkrijgen volgens de fysische eigenschappen van de bioink. Het gebruik van deze theorie kan continu DLP-printen optimaliseren. Deze methode kan worden gebruikt om de uithardingsrelatie sneller en nauwkeuriger te verkrijgen; de continue DLP-uitharding kan daardoor beter worden bepaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Theoretische voorbereiding
- Definieer drie parameters: vloeistofabsorptie (Al), vaste stofabsorptie (As) en drempeltijd (tT)17.
- Herschrijf de traditionele Jacobs-werkcurve met behulp van deze drie parameters17 volgens vergelijking 1:
(Vergelijking 1)
Hier is t H de uithardingstijd van een enkele laag enH is de hoogte van een enkele laag.
(Vergelijking 1)2. Parameterverwerving
- Meet de drempeltijd van de bioink met behulp van een reometer die is uitgerust met een element voor temperatuurregeling.
- Gebruik een 365 nm lichtbron om het testplatform van de rheometer bloot te leggen en de lichtintensiteit op een bepaalde waarde te brengen.
- Stel de reometer in om de Time-Moduli-gegevens te krijgen gedurende een periode van 300 s en neem elk gegevenspunt om de 0,3 s door de opties voor tijdinstellingen in de rheometersoftware. Klik op de knop Test starten van de rheometer om de test te starten en klik tegelijkertijd op de startknop van de lichtbron.
- Gerekend vanaf het begin van de blootstelling, wanneer de opslagmodulusgegevens gelijk zijn aan de verliesmodulusgegevens, wordt de overeenkomstige tijd herkend als de drempeltijd. Neem handmatig op.
- Bouw de absorptietestapparatuur zoals getoond in het vorige werk17. Gebruik twee bovenste en onderste glasplaten om de ringvormige geprinte structuur (5 mm binnendiameter, 10 mm buitendiameter) met een dikte van 500 μm vast te klemmen, zodat de binnenste cirkel van de ring een kamer vormt. Plaats de kamer op het testgebied van de lichtintensiteitsmeter en stel de lichtbron in om het kamergebied bloot te leggen.
OPMERKING: Figuur 1 toont het schematische diagram van fotoreologische testresultaten en gegevensverwerkingsresultaten, en de absorptietestapparatuur.- Meet de invallende lichtintensiteit (Ii) wanneer de testkamer niet is gevuld met materiaal van de absorptietestapparatuur door het display van de lichtintensiteitsmeter van de testapparatuur af te lezen.
- Vul de testkamer met 10 μLof bioink.
- Stel de testkamer met bioink bloot aan UV-licht bij 365 nm. Verkrijg de lichtintensiteit (Ilh) van de absorptietestapparatuur door het display van de lichtintensiteitsmeter van de testapparatuur af te lezen.
- Verkrijg de lichtintensiteit wanneer de bioink is uitgehard (Ish) van de absorptietestapparatuur door het display van de lichtintensiteitsmeter van de testapparatuur af te lezen wanneer de waarde niet langer verandert. Deze waarde is de vaste absorptie, iksh.
- Bereken de vloeistofabsorptie en vaste stofabsorptie met behulp van vergelijkingen 2 en 3:
Vergelijking 2
Vergelijking 3
- Verkrijg de Jacobs-werkcurve volgens de verkregen parameters.
Vergelijking 2
Vergelijking 3
Figuur 1: Testresultaten en apparatuur . (A) Schematisch schema van fotoreologische testresultaten en gegevensverwerkingsresultaten. B) Absorptietestapparatuur. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Li et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Continue DLP-afdrukparameterinstellingen
- Gebruik DLP-software om DLP-afdrukken te bereiken en de set afdrukparameters in de software als volgt.
- Stel de belichtingstijd van de eerste enkele laag in als de drempeltijd (tT) in de parameterinstellingen van de software.
- Bereken de belichtingstijd van het uitharden van 10 μmthick materialen volgens vergelijking 1 en trek de drempeltijd af om de werkelijke belichtingstijd voor het uitharden van een enkele laag te verkrijgen.
- Stel het tijdsinterval tussen aangrenzende lagen in op 0 s in de parameterinstellingen van de software.
- Start de printer door te klikken op de knop Start in de afdruksoftware. Wanneer het afdrukproces is voltooid, voltooit u het afdrukken door op de knop Stoppen in de afdruksoftware te klikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel toont een nieuwe methode om uithardingsparameters te verkrijgen en introduceert een nieuwe manier om continu DLP-afdrukken te bereiken, waarbij de efficiëntie van deze methode bij het bepalen van de werkcurve wordt aangetoond.
We hebben drie verschillende materialen gebruikt bij DLP-afdrukken om de nauwkeurigheid van de theoretische werkcurve te verifiëren die is verkregen met de methode die in dit artikel is geïntroduceerd. De materialen zijn 20% (v/v) polyethyleen (glycol) diacrylaat (PEGDA), 0,5% (w/v) lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfineer (LAP) met verschillende concentraties UV-absorber-0,1% (w/v), 0,15% (w/v) en 0,2% (w/v) Brilliant blue. De gegevens over de werkelijke uithardingsdikte met de theoretische werkcurven zijn weergegeven in figuur 2.
Figuur 2: Vergelijking tussen de theoretische werkcurve en de werkelijke afdrukgegevens . (A) 0,1% (w/v) absorber. (B) 0,15% (m/v) absorber. (C) 0,2% (m/v) absorber. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De theoretische werkcurve kan worden gebruikt om de werkcurve nauwkeurig te berekenen. Wat de materiaalsamenstelling ook is, het hoge toeval van de werkelijke drukresultaten en de theoretische resultaten bewijzen de effectiviteit van de methode.
We hebben ook de totale afdruktijd van de traditionele DLP-afdrukmethode vergeleken met de continue DLP-afdrukmethode die in dit artikel is ontwikkeld. Zoals weergegeven in figuur 3, hoe kleiner de dikte van de afdruklaag, hoe duidelijker de verbetering van de continue DLP-afdrukefficiëntie. De uithardingsefficiëntie vertienvoudigde.
Figuur 3: Efficiëntievergelijking tussen traditioneel DLP-afdrukken en continu DLP-afdrukken. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Li et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De verwerving van de theoretische werkcurve kan worden gebruikt om het DLP-proces te verbeteren en de vooruitgang van DLP-technologie te bevorderen, maar zonder de verwerving van de theoretische werkcurve is het onmogelijk om de nieuwe afdrukmethode nauwkeurig te controleren. Bovendien, hoe kleiner de dikte van de afdruklaag, hoe beter de afdrukkwaliteit, wat betekent dat de continue DLP-afdrukmethode die in dit artikel wordt voorgesteld, tegelijkertijd een hoge efficiëntie en een hoge getrouwheid kan bereiken.
Figuur 4: Vergelijking van afdrukresultaten tussen traditioneel DLP-afdrukken en continu DLP-afdrukken . (A) Het uitgeharde model met behulp van de traditionele methode. (B) Het uitgeharde model met behulp van onze continue DLP-afdrukmethode. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Li et al.11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
In tegenstelling tot de traditionele methode die herhaalde printexperimenten vereist, hoeft deze methode alleen de relevante materiaaleigenschappen van het materiaal te testen. Er is slechts een zeer kleine hoeveelheid materiaal nodig om de bijbehorende werkcurve nauwkeurig te verkrijgen. De traditionele methode verspilt niet alleen materiaal, maar is ook sterk afhankelijk van meetmethoden om de nauwkeurige vormdikte van verschillende blootstellingstijden te bepalen. Voor materialen met een slechte vervormbaarheid is het moeilijk om de drukdikte nauwkeurig te verkrijgen, dus de werkcurve is onnauwkeurig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De kritieke stappen van dit protocol worden beschreven in sectie 2. Het is noodzakelijk om de lichtintensiteit die wordt gebruikt in de fotorheologietest en de afdruklichtintensiteit in de eigenlijke tests te verenigen. De absorptietestapparatuur is het belangrijkste onderdeel. De vorm van de testkamer moet dezelfde zijn als die van het lichtgevoelige gebied van de lichtintensiteitsmeter. Vanwege de eigenschappen van de materialen die voortdurend veranderen tijdens het hele uv-lichtblootstellingsproces, moet de lichtintensiteit blijven veranderen6. Volgens de definitie van vloeistofabsorptie en vaste stofabsorptie in vergelijking 1 wordt het uithardingsproces vereenvoudigd. Het nemen van de gegevens aan het begin van de blootstelling als vloeistofabsorptie en de gegevens wanneer de lichtintensiteit constant is, omdat de vaste stofabsorptie de meest kritieke bewerking is.
Het is vermeldenswaard dat deze methode een onvermijdelijke beperking heeft, namelijk de vereenvoudiging van het uithardingsproces. Aangezien de theoretische modellering van deze methode geen rekening houdt met factoren zoals zuurstofremming13, zijn er fouten tussen de werkelijke werkcurve en de theoretische werkcurve. Verder, als de externe verstoring groot is, kan de theoretische werkcurve niet nauwkeurig worden gebruikt voor onderzoek.
De traditionele methode om de Jacobs werkcurve te verkrijgen vereist meerdere printen met verschillende belichtingstijden15. De werkcurve wordt verkregen door de afdrukdikte te meten die overeenkomt met de belichtingstijd en de gegevens aan te passen. Deze methode vereist veel materiaal en is zeer inefficiënt. Het afdrukvermogen van het materiaal beperkt de nauwkeurigheid van de werkcurve en de observatie en meting van de structuur versterken ook de fout. De methode in dit artikel om de werkcurve te verkrijgen kan veel materialen besparen, nauwkeurige werkcurven kunnen alleen worden verkregen door eenvoudige materiaaleigenschapstests en de nauwkeurigheid van de werkcurve kan worden gegarandeerd, onafhankelijk van de vervormbaarheid van het materiaal. In het DLP-bioprintonderzoek kan het materiaal, wanneer het zeer zacht is (E < 10 kPa), niet goed worden afgedrukt, en dit zal de drukdiktegegevens beïnvloeden die met de traditionele methode worden verkregen, waardoor de nauwkeurigheid van de werkcurvewordt beïnvloed 18. De in dit protocol genoemde methode kan een oplossing bieden voor de bepaling van de DLP-printprocesparameters van zachte biomaterialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar de steun van de National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 12125205, 12072316, 12132014) en de China Postdoctoral Science Foundation (Grant No. 2022M712754).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brilliant Blue | Aladdin (Shanghai, China). | 6104-59-2 | |
| DLP software | Creation Workshop | N/A | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | N/A | LAP; synthesized | |
| Light source | OmniCure | https://www.excelitas.com/product-category/omnicure-s-series-lamp-spot-uv-curing-systems | 365 nm |
| Polyethylene (glycol) diacrylate | Sigma-Aldrich | 455008 | PEGDA Mw ~700 |
| Rheometer | Anton Paar, Austria | MCR302 |
References
- Berthiaume, F., Maguire, T. J., Yarmush, M. L. Tissue engineering and regenerative medicine: history, progress, and challenges. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 2 (1), 403-430 (2011).
- Ng, W. L., Chua, C. K., Shen, Y. -F. Print me an organ! Why we are not there yet. Progress in Polymer Science. 97, 101145 (2019).
- Sun, W., et al.
- Jiang, T., Munguia-Lopez, J. G., Flores-Torres, S., Kort-Mascort, J., Kinsella, J. M. Extrusion bioprinting of soft materials: An emerging technique for biological model fabrication. Applied Physics Reviews. 6 (1), 011310 (2019).
- Ng, W., et al. L.cControlling droplet impact velocity and droplet volume: Key factors to achieving high cell viability in sub-nanoliter droplet-based bioprinting. International Journal of Bioprinting. 8 (1), 424 (2021).
- Yu, K., et al. Printability during projection-based 3D bioprinting. Bioactive Materials. 11, 254-267 (2022).
- Zhong, Z., et al. Bioprinting of dual ECM scaffolds encapsulating limbal stem/progenitor cells in active and quiescent statuses. Biofabrication. 13 (4), (2021).
- Huh, J., et al. Combinations of photoinitiator and UV absorber for cell-based digital light processing (DLP) bioprinting. Biofabrication. 13 (3), (2021).
- Saed, A. B., et al. Functionalized poly l-lactic acid synthesis and optimization of process parameters for 3D printing of porous scaffolds via digital light processing (DLP) method. Journal of Manufacturing Processes. 56, 550-561 (2020).
- Ng, W. L., et al. Vat polymerization-based bioprinting-process, materials, applications and regulatory challenges. Biofabrication. 12 (2), 022001 (2020).
- Li, Y., et al. High-fidelity and high-efficiency additive manufacturing using tunable pre-curing digital light processing. Additive Manufacturing. 30, 100889 (2019).
- Kelly, B. E., et al. Volumetric additive manufacturing via tomographic reconstruction. Science. 363 (6431), 1075-1079 (2019).
- Tumbleston, J. R., et al. Continuous liquid interface production of 3D objects. Science. 347 (6228), 1349-1352 (2015).
- Classens, K., Hafkamp, T., Westbeek, S., Remmers, J. J. C., Weiland, S. Multiphysical modeling and optimal control of material properties for photopolymerization processes. Additive Manufacturing. 38, 101520 (2021).
- Gong, H., Beauchamp, M., Perry, S., Woolley, A. T., Nordin, G. P. Optical approach to resin formulation for 3D printed microfluidics. RSC Advances. 5 (129), 106621-106632 (2015).
- Hofstetter, C., Orman, S., Baudis, S., Stampfl, J. Combining cure depth and cure degree, a new way to fully characterize novel photopolymers. Additive Manufacturing. 24, 166-172 (2018).
- Li, Y., et al. Theoretical prediction and experimental validation of the digital light processing (DLP) working curve for photocurable materials. Additive Manufacturing. 37, 101716 (2021).
- Wang, M., et al. Molecularly cleavable bioinks facilitate high-performance digital light processing-based bioprinting of functional volumetric soft tissues. Nature Communications. 13 (1), 3317 (2022).
