Summary
توضح هذه المقالة استخدام تطبيق برمجي، mAbScale، لحساب الكتل لعلاجات البروتين القائمة على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
Abstract
كتل العلاج الحيوي هي وسيلة للتحقق من الهوية والسلامة الهيكلية. يوفر قياس الطيف الكتلي (MS) للبروتينات السليمة أو الوحدات الفرعية للبروتين أداة تحليلية سهلة لمراحل مختلفة من تطوير المستحضرات الصيدلانية الحيوية. يتم تأكيد هوية البروتين عندما تكون الكتلة التجريبية من MS ضمن نطاق خطأ الكتلة المحدد مسبقا للكتلة النظرية. في حين توجد العديد من الأدوات الحسابية لحساب الأوزان الجزيئية للبروتين والببتيد ، إلا أنها إما لم تكن مصممة للتطبيق المباشر على كيانات العلاج الحيوي ، أو لديها قيود على الوصول بسبب التراخيص المدفوعة ، أو تتطلب تحميل تسلسلات البروتين إلى خوادم المضيفة.
لقد طورنا روتينا لحساب الكتلة المعيارية يتيح التحديد السهل للكتل المتوسطة أو أحادية النظائر والتركيبات الأولية للبروتينات السكرية العلاجية ، بما في ذلك الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb) والأجسام المضادة ثنائية النوعية (bsAb) واتحادات الأدوية والأجسام المضادة (ADC). ستسمح الطبيعة المعيارية لإطار الحساب المستند إلى Python بتوسيع هذه المنصة لتشمل طرائق أخرى مثل اللقاحات وبروتينات الاندماج وقليل النيوكليوتيدات في المستقبل ، ويمكن أن يكون هذا الإطار مفيدا أيضا لاستجواب بيانات قياس الطيف الكتلي من أعلى إلى أسفل. من خلال إنشاء تطبيق سطح مكتب مستقل مفتوح المصدر بواجهة مستخدم رسومية (GUI) ، نأمل في التغلب على القيود المتعلقة بالاستخدام في البيئات التي لا يمكن فيها تحميل معلومات الملكية إلى الأدوات المستندة إلى الويب. توضح هذه المقالة خوارزميات وتطبيق هذه الأداة ، mAbScale ، على طرق علاجية مختلفة قائمة على الأجسام المضادة.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين ، تطورت العلاجات الحيوية لتصبح الدعامة الأساسية لصناعة الأدوية الحديثة. أدى جائحة SARS-CoV2 والظروف الأخرى التي تهدد الحياة إلى زيادة الحاجة إلى تطوير أسرع وأوسع لجزيئات المستحضرات الصيدلانية الحيوية1،2،3.
الوزن الجزيئي للعلاج الحيوي أمر بالغ الأهمية لتحديد الجزيء ، بالاقتران مع المقايسات التحليلية الأخرى. يتم استخدام كتل الوحدات الفرعية السليمة والمخفضة طوال دورات حياة الاكتشاف والتطوير كجزء من استراتيجيات التحكم التي تهدف إلى الحفاظ على الجودة ، كما هو موضح في QTPP (ملف تعريف المنتج المستهدف للجودة)4.
يعتمد التطور التحليلي في صناعة المستحضرات الصيدلانية البيولوجية بشكل كبير على قياسات الكتلة لتحليل الكتلة السليمة والتوصيف العميق باستخدام رسم خرائط الببتيد أو مراقبة طريقة متعددة السمات (MAM). في قلب هذه التقنيات التي تستخدم منصات قياس الطيف الكتلي الحديثة (MS) هي القدرة على توفير قياسات كتلة دقيقة عالية الدقة (HR / AM). تنتج معظم أدوات HR / AM دقة جماعية في نطاق 0.5-5 جزء في المليون ، والتي تتناسب مع نطاق الكتلة. تتيح القدرة على قياس الكتل بدقة للجزيئات الكبيرة السليمة التعرف السريع والواثق على علاجات الجزيئات الكبيرة. وبما أنه لا يمكن تحقيق الاستبانة النظيرية باستخدام الظروف التجريبية النموذجية للجزيئات الكبيرة (>10 كيلو دالتون)، يجب حساب متوسط الكتل للمقارنة وتحديد 5,6.
يمثل طيف كتلة البروتين النموذجي السليم أو الفرعي ملف تعريف البروتيوفورم العام ، والذي يحتوي على معلومات مركبة عن الأشكال الجزيئية المختلفة الناتجة عن تعديلات ما بعد الترجمة (PTM) وأي اختلافات في البنية الأولية ، مثل المقاطع أو متغيرات التسلسل. إن الطبيعة السهلة نسبيا وعالية الإنتاجية لهذه القياسات تجعلها جذابة للتوصيف وكضوابط مراقبة أثناء العملية 7,8. عادة ما يتطلب تحليل البيانات لهذه التجارب من المستخدم تحديد مساحة البحث للأشكال الجزيئية (نطاق PTMs أو الأشكال الجزيئية الأخرى). بالنسبة للبروتينات الغليكوزيلاتية ، فإن مساحة البحث هذه مدفوعة إلى حد كبير بعدم تجانس الجليكوفورم. إن مجموعات من PTMs المتعددة ، وتكوينات رابطة ثاني كبريتيد ، والاختلافات الأخرى على طول الهيكل الأساسي تجعل حساب جميع الأشكال الجزيئية الممكنة مهمة شاقة. لذلك ، فإن الحساب اليدوي للأشكال الجزيئية المحتملة هو عملية مستهلكة للوقت والموارد مع احتمال كبير للخطأ البشري.
هنا ، نقدم أداة حساب الكتلة التي تم تطويرها مع الأخذ في الاعتبار أهم ميزات جزيئات العلاج الحيوي ، مثل mAbs و bsAbs و ADCs وما إلى ذلك. تتيح الأداة سهولة دمج متغيرات مساحة البحث من أجل الحساب المتسق للكتل والتراكيب الأولية. وستمكن الطبيعة المعيارية لهذه الأداة من مواصلة تطويرها وتطبيقها على حساب الكتلة ومطابقة الكتلة بالنسبة للطرائق الأخرى.
تسمح وحدة واجهة المستخدم الرسومية للمستخدم بتحديد مدخلات حساب الكتلة ، كما هو موضح في الشكل 1 ؛ على وجه التحديد ، يقوم المستخدم بإدخال تسلسلات الأحماض الأمينية المكونة من حرف واحد لسلاسل الأجسام المضادة الخفيفة والثقيلة. يتم تضمين التعديلات الشائعة لتدوير N-terminal الثقيل وقص اللايسين C-terminal كخانات اختيار. علاوة على ذلك ، يمكن إضافة / طرح الصيغة الكيميائية / التركيب الأولي من سلاسل البروتين هذه من خلال مربع نص Chem Mod المعني. يتيح ذلك للمستخدم المرونة في إضافة تركيبة عنصرية تتضمن تعديلات متعددة بعد الترجمة أو حمولة جزيء صغير في حالة ADC. نظرا لأن معظم mAbs العلاجية مصممة لإزالة مواقع الجليكوزيل في سلسلة الضوء ، يتم ترك الجليكوزيل في سلسلة الضوء اختياريا ويمكن تحديده باستخدام خانة اختيار في واجهة المستخدم الرسومية.
الاختلاف النموذجي في تحليل الكتلة السليمة للأجسام المضادة هو تحليل كتلة الوحدة الفرعية المختزلة ، حيث يتم فصل السلسلة الخفيفة عن السلسلة الثقيلة عن طريق تقليل روابط ثاني كبريتيد السلاسل البينية. اعتمادا على قوة عامل الاختزال المستخدم ، قد تكون أو لا تكون روابط ثاني كبريتيد داخل السلسلة مشقوقة. يتمتع المستخدمون بالمرونة في إدخال العدد الإجمالي لروابط ثاني كبريتيد اعتمادا على النوع الفرعي IgG أو في حالةADC 9 المترافق بالسيستين.
يحسب التطبيق الكتل بطريقة من أسفل إلى أعلى ، حيث يتم حساب التراكيب الأولية أولا للسلاسل الثقيلة الفردية والسلاسل الخفيفة. بعد ذلك ، يتم حساب Lys-Clipping ذات السلسلة الثقيلة (HC) N-terminal cyclization عن طريق ضبط التراكيب الأولية المحسوبة. ثم يتم تطبيق أي تعديلات كيميائية محددة على السلاسل الثقيلة و / أو الخفيفة. اعتمادا على نوع التحليل وأنماط رابطة ثاني كبريتيد المحددة من قبل المستخدم ، يتم ضبط عدد الهيدروجين لسلسلتي عديد الببتيد. يتم حساب كتل HC الغليكوزيلاتي والسلسلة الخفيفة (LC) (اختيارية) بناء على مدخلات المستخدم. أخيرا ، يتم دمج كتل HC و LC متعددة ، ويتم تحديث أرقام روابط ثاني كبريتيد تلقائيا لحساب الكتلة السليمة.
مع الجزيئات الأكبر مثل البروتينات السليمة ، لا يمكن قياس الكتل أحادية النظائر بسبب عيب الكتلة المضافة عند استخدام مطياف الكتلة مع قوة حل نموذجية. بدلا من ذلك ، يتم قياس الكتل الاسمية أو المتوسطة أو الإبلاغ عنها5،10،11،12،13. يمكن أن يختلف متوسط الكتل الأولية بناء على المصدر المستخدم للكتل المنسقة14,15. في حين أن الاختلافات في الكتل الأولية قد تكون صغيرة ، إلا أنها يمكن أن تضيف ما يصل إلى قيم مهمة لحسابات الوزن الجزيئي للجزيء الكبير. يوضح الجدول التكميلي 1 متوسط الكتل الأولية المستخدمة افتراضيا في تطبيق البرنامج. بالنسبة للبيئات الخاضعة للتنظيم مثل مجال البحث والتطوير في مجال المستحضرات الصيدلانية الحيوية (R&D) ، من المهم الحفاظ على كتل جزيئية متسقة لأن التغييرات في الكتل قد تعني تغييرات في الكيان الجزيئي أثناء الإيداعات التنظيمية. لتمكين الاتساق في استخدام الكتل الأولية ، يتم تضمين قاموس للكتل الأولية مع أداة البرنامج كملف نصي لقيمة مفصولة بفواصل (csv): Element_Mass.csv (ملف الترميز التكميلي 1). وبالمثل ، يتم تضمين قائمة منسقة من تركيبات الجليكان التي تظهر عادة على mAbs: Glycan .csv (ملف الترميز التكميلي 2). يتم حفظ كلا الملفين في نفس موقع المجلد كتطبيق قابل للتنفيذ ويمكن للمستخدم تعديلهما لاستخدام قائمة كتلة عنصرية محددة أو مكتبة جليكان.
الشكل 1: واجهة المستخدم الرسومية لتطبيق mAbScale. تسمح وحدة واجهة المستخدم الرسومية للمستخدم بتحديد الإدخال لحساب الكتلة. يقوم المستخدم بإدخال تسلسلات الأحماض الأمينية المكونة من حرف واحد لسلاسل الأجسام المضادة الخفيفة والثقيلة. يتم تضمين التعديلات الشائعة لتدوير N-terminal الثقيل وقص ليسين C-terminal كخانات اختيار. يمكن إضافة / طرح الصيغ الكيميائية / التركيبات الأولية من خلال مربع نص Chem Mod المعني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يظهر سير العمل عالي المستوى ل mAbScale في الشكل 2. تحتوي كل خطوة على فروع قرار داخلية وحلقات وتوافقيات أكثر تطورا. يتم تقديم سير عمل خوارزمي مفصل يصف عملية الحساب في الشكل التكميلي 1. يتم حفظ إخراج التطبيق بتنسيق جدول بيانات في المجلد المحدد من قبل المستخدم. يتكون ملف الإخراج من أوراق عمل منفصلة متعددة ، والتي يمكن تصنيفها على أنها مدخلات المستخدم ، وحسابات الوزن الجزيئي ، ومراجع لمتوسط اشتقاقات الكتلة النظيرية (يتم توفير مثال المخرجات في الجداول التكميلية). تتضمن أوراق عمل إدخال المستخدم تسلسلات الأحماض الأمينية البروتينية والمعلومات الأخرى التي أدخلها المستخدم ، ومتوسط الكتل الأولية ، وكتل الجليكان ، والتي تستخدم لحساب التركيب الأولي والأوزان الجزيئية المختلفة. تشمل أوراق حساب الوزن الجزيئي التركيب الكيميائي لأشكال مختلفة ، والكتلة المخفضة مع وبدون الجليكوزيل والتعديل الكيميائي ، والكتلة السليمة مع وبدون الجليكوزيل والتعديل الكيميائي. سيتم إنشاء الأوراق التي تحتوي على كتل نصف الأجسام المضادة تلقائيا إذا قام المستخدم بإدخال اثنين من HCs مختلفين و / أو اثنين من LCs مختلفة في صفحة إدخال المستخدم ، نظرا لأن الأجسام المضادة النصفية هي شوائب أولية يجب تحديدها وقياسها كميا بالنسبة إلى heterodimer المطلوب. يمكن الوصول إلى الكود المصدري ل mAbScale من خلال المستودع التالي: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
الشكل 2: نظرة عامة على الخطوات المتبعة في حساب التراكيب والكتل الأولية باستخدام التطبيق. يمكن استخدام الترميز اللوني للربط بتدفق العملية الموصوف في الشكل التكميلي 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. فتح تطبيق mAbscale
- افتح تطبيق البرنامج بالنقر المزدوج على أيقونة الملف القابل للتنفيذ.
2. إدخال التسلسل
- أدخل تسلسلات السلسلة الثقيلة والسلسلة الخفيفة في مربعات النص المعنية المميزة ب 1 بدون أي مسافات.
- بالنسبة إلى bsAbs، أضف سلاسل ثقيلة أو خفيفة إضافية في المجموعة الثانية من مربعات النص التي تحمل علامة 2. اترك 2 فارغا ل mAbs ذات السلاسل الثقيلة والسلاسل الخفيفة المتطابقة.
- حدد خانات الاختيار N-Terminal Cyclization و/أو C-Terminal Clipping ، إذا كانت هذه المتغيرات الطرفية ذات السلسلة الثقيلة قابلة للتطبيق.
- أضف أي تعديلات كيميائية ، بما في ذلك الرابط والحمولة لجزيئات ADC ، إلى مربعات نص Heavy Chain Chem Mod و / أو Light Chain Chem Mod .
- حدد التعديلات على هيئة تركيبات عنصرية، مثل CaCl2. ستتم إضافة التعديل إلى الوحدة الفرعية أو السلسلة البروتينية المعنية.
ملاحظة: يمكن أيضا طرح التركيب الكيميائي من وحدة فرعية أو سلسلة عن طريق بادئة التركيب الأولي بعلامة -. على سبيل المثال ، سوف يطرح -H2O جزيء ماء من تكوين الوحدة الفرعية والكتلة.
- حدد التعديلات على هيئة تركيبات عنصرية، مثل CaCl2. ستتم إضافة التعديل إلى الوحدة الفرعية أو السلسلة البروتينية المعنية.
3. تحديد عدد روابط ثاني كبريتيد
- حدد عدد روابط ثاني كبريتيد في جزيئات البروتين في مربع النص الذي يحمل علامة إجمالي عدد ثاني كبريتيدات.
- أدخل عدد ثاني كبريتيد HC غير المختزل في مربع النص ثاني كبريتيد HC غير المختزل وعدد ثاني كبريتيد LC غير المختزل في مربع النص ثاني كبريتيد LC غير المختزل، بناء على مدى الاختزال (الكامل مقابل الجزئي).
ملاحظة: يتضمن تحليل الكتلة المخفضة للوحدات الفرعية mAb تقليل / فصل السلاسل الثقيلة والخفيفة المرتبطة بثاني كبريتيد. - إذا كان الجليكوزيل موجودا على سلسلة ضوء mAb ، فحدد خانة الاختيار السلسلة الخفيفة هي جليكوزيلاتيد .
4. إعداد مجلد الإخراج وتشغيل التطبيق
- انقر فوق الزر "استعراض" لتحديد مجلد إخراج لمربع نص مجلد الإخراج .
- أدخل اسم ملف الإخراج بدون امتداد ملف (يتم حفظه تلقائيا ك .xlsx) في مربع نص ملف Excel (بدون تحويلة ).
- انقر فوق الزر إرسال لبدء التطبيق. يمكن العثور على ملف الإخراج في المجلد المعين.
ملاحظة: يمكن تخصيص الكتل الأولية وقائمة الجليكان عن طريق تحرير الملفات النصية المحددة Element_Mass.csv (ملف الترميز التكميلي 1) و Glycan.csv (ملف الترميز التكميلي 2) ، على التوالي. يجب وضع هذه الملفات في نفس المجلد مثل mAbScale.exe (ملف الترميز التكميلي 3) الملف القابل للتنفيذ التطبيق. سيتم إغلاق التطبيق تلقائيا بعد تنفيذ واحد. سيتعين على المستخدم بدء تشغيل التطبيق مرة أخرى إذا كانت هناك حاجة إلى حساب ثان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختيار مجموعة متنوعة من mAbs لتمثيل أنواع مختلفة من mAbs. تم اختيار معيار mAb المتاح تجاريا لتمثيل mAb التقليدي بسلاسل ثقيلة متطابقة وسلاسل ضوئية متطابقة وموقع جليكوزيل واحد مرتبط ب N في منطقة Fc. كما تم اختيار mAb مع غليكوزيل إضافي مرتبط بسلسلة خفيفة N ، و mAb ثنائي النوع ، و mAb مقترن بالأجسام المضادة (ADC) لتوسيع استخدام التطبيق. يتم تلخيص التركيب الكيميائي والكتلة المحسوبة والكتلة المقاسة وخطأ الكتلة في أمثلة mAbs هذه في الجدول 1. تم تأكيد التركيبات الكيميائية للبروتين والكتل المحسوبة التي أبلغ عنها mAbScale بواسطة GPMAW16 ، وهو برنامج لتحليل البنية الأولية للبروتين والببتيد.
لتحليل الكتلة السليمة ، تم تخفيف عينات mAb إلى 1 مجم / مل باستخدام ماء درجة LC-MS وحقنها للتحليل. بالنسبة للتحليل المختزل ، تمت معالجة العينات أولا بثنائي إيثريثريتول وتم تحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لشق روابط ثاني كبريتيد بين السلاسل. تم تحليل جميع العينات باستخدام نظام Acquity UPLC المقترن بمطياف الكتلة. تم استخدام عمود BEH 200 SEC لتحلية المياه عبر الإنترنت وفصل السلاسل الثقيلة والخفيفة باستخدام طريقة متساوية مع الماء / الأسيتونيتريل (65:35) و 0.1٪ TFA كمرحلة متنقلة. تم تشغيل مطياف الكتلة في وضع الأيونات الموجبة ، وتم الحصول على البيانات بنطاق مسح من 700-5000 م / ض.
تم استخدام سير العمل السليم والمخفض لشركة Protien Metrics، Inc. (PMi) Byos لمعالجة الأطياف الخام السليمة والمخفضة ، على التوالي. تم ضبط نطاق كتلة البروتين على 143,000-163,000 Da لفك الالتفاف الكتلي السليم ، و 47,000-53,000 Da لفك كتلة HC ، و 20,000-27,000 Da لفك كتلة LC. بالنسبة للكتلة الآلية / انتقاء الذروة ، تم تعيين الحد الأدنى للفرق بين قمم الكتلة على 15 Da ، وكان الحد الأقصى لعدد قمم الكتلة محدودا ب 10. تم إدخال / اختيار قائمة بالجليكان المتوقع لعلامة تبويب مطابقة الكتلة ، وتم تعيين الحد الأعلى لتحمل مطابقة الكتلة على 10 دا.
كانت أخطاء الكتلة الصغيرة بين الكتل المحسوبة والكتل المقاسة ضمن معايير قبول خطأ الكتلة العادية (≤10 Da ل mAbs سليمة ، ≤5 Da للسلاسل الثقيلة المخفضة والسلاسل الخفيفة ، على التوالي) ، مما يشير إلى أن الكتل المحسوبة كانت دقيقة17.
لحساب الكتل النظرية ADC ، يمكن إضافة تعديل كيميائي مع التركيب الأولي للرابط / الحمولة إلى وحدات فرعية mAb محددة. ومع ذلك ، سيتم تضمين الوزن الجزيئي لكتلة نسبة حمل الدواء فقط في الناتج. يجب إضافة الكتلة الجزيئية المركبة للأجسام المضادة ذات نسب حمل الدواء المختلفة يدويا من قبل المستخدم. يمكن إضافة هذه القدرات في إصدار لاحق من mAbScale أو يمكن تعديلها بدعم من المجتمع ، نظرا لطبيعة المصدر المفتوح لهذا المشروع.
الجدول 1: مقارنة الكتل المحسوبة والمقاسة لمختلف وحدات mAb الفرعية والأشكال الجزيئية. يتم تلخيص التركيبات الكيميائية والكتل المحسوبة والكتل المقاسة وأخطاء الكتلة لمثال mAbs في هذا الجدول. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
الشكل التكميلي 1: سير العمل الخوارزمي التفصيلي لمقياس mAbScale. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
الجدول التكميلي 1: متوسط الكتل الأولية المحسوبة المستخدمة في mAbScale14,15. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 1: قائمة الكتل الأولية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 2: قائمة الجليكانات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
ملف الترميز التكميلي 3: التطبيق المجمع- mAbScale القابل للتنفيذ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر mAbScale واجهة مستخدم سهلة الاستخدام مع المرونة لتغيير اللبنات الأساسية لحسابات الكتلة والعناصر. من المتوقع أن يكون لدى المستخدمين فهم أساسي للجزيء المستهدف لاستخدام التطبيق ، واشتقاق الكتل الصحيحة ، وتفسير النتائج. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون ورقة إخراج الكتلة السليمة أو المخفضة ساحقة بسبب الصفوف العديدة من الكتل السليمة أو المخفضة ، نظرا لأن قاعدة بيانات الجليكان الافتراضية تحتوي على 88 جليكان مرتبط ب N توجد عادة في جزء Fc من الأجسام المضادة العلاجية ، ويحسب التطبيق جميع كتل الجليكوفورم المحتملة المضمنة في قاعدة البيانات18 ، 19. في حين أن معظم العلاجات mAbs مصممة لإزالة الجليكوزيل في منطقة Fab ، فقد تحتفظ بعض mAbs بموقع الجليكوزيل هذا ، وهذا يمكن أن يزيد من العدد الإجمالي للبروتيوفورمات الغليكوزيلاتي. ينصح المستخدمون بتنظيم قاعدة بيانات جليكان تركز على أنسب أشكال جليكوف لجزيء معين لتقليل تعقيد الناتج ومواءمة النتائج بشكل أفضل مع الكتل المقاسة لتحديد ذروة الكتلة.
يزداد مستوى التعقيد بشكل أكبر مع bsAbs بسبب عدم تجانس السلاسل الخفيفة والثقيلة. يولد تطبيق البرنامج هذا جميع التباديل والتوليفات الممكنة مع تسلسلات LC و HC المقدمة والأشكال السكرية للسماح بتوليد جميع المنتجات الثانوية المحتملة من الاقتران الخاطئ أو غير الكامل للوحدات الفرعية للأجسام المضادة ، مثل الأجسام المضادة النصفية. هذا يترك الأمر للمستخدم لتصفية الأشكال البروتينية الأكثر ملاءمة لاستخدامها. يقسم إخراج البرنامج المخرجات الغليكوزيلاتي وغير الغليكوزيلاتي إلى أوراق عمل منفصلة ، مما يسهل على المستخدم مراجعتها. يتم أيضا فصل الكتل الجزيئية السليمة والمخفضة ، ويتم سرد جميع مجموعات الأجسام النصفية الممكنة ل bsAbs في ورقة عمل مخصصة لزيادة تبسيط امتصاص النتائج المعالجة.
يتمثل أحد قيود إصدار البرنامج الحالي في أن التطبيق يحسب كتل ADC بنسبة دواء إلى جسم مضاد واحدة فقط في وقت واحد ، حيث يتم إدخال البنية الكيميائية للحمولة في مربعات النص Heavy Chain Chem Mod و Light Chain Chem Mod . لكل نسبة دواء إلى جسم مضاد (DAR) ، يجب إدخال التركيب الأولي من قبل المستخدم لإعادة الحساب.
يتم توفير القدرة على حساب الكتل للبروتينات السليمة من خلال العديد من التطبيقات ، ولكنها إما تتطلب ترخيصا تجاريا ليتم شراؤها أو هي أدوات قائمة على الويب تتطلب تحميل تسلسلات البروتين16،20،21. توفر هذه التطبيقات مرونة محدودة للغاية للمستخدم لإضافة تعديلات كيميائية مخصصة أو دمج الروابط داخل الجزيئات بسهولة ، مثل ثاني كبريتيدات. علاوة على ذلك ، تكون قيمة التطبيقات المستندة إلى الويب محدودة عندما يتعلق الأمر بمعلومات الملكية والسرية ، كما هو الحال في تطوير الأدوية أو غيرها من البيئات الخاضعة للرقابة ، لأنه لا يمكن تحميل معلومات تسلسل العلاج الحيوي إلى خوادم خارجية. وبالتالي ، يجب على الباحثين الاعتماد إما على الحسابات اليدوية أو الإجراءات الروتينية البرنامجية التي تكون أقل مرونة ويصعب نشرها ويمكن أن تؤدي إلى تناقضات.
لقد طورنا إطارا مفتوح المصدر لحساب الكتلة الجزيئية والتركيب الأولي مع التركيز على تخفيف القيود المرتبطة بالتطبيقات الحالية. سيتغلب تطبيق سطح المكتب المستقل المزود بواجهة المستخدم الرسومية على القيود المرتبطة بتحميل معلومات الملكية إلى خوادم خارجية ويتيح سهولة الوصول للمستخدمين. يمكن استخدام هذه الأداة لطرق العلاج الحيوي الأكثر شيوعا ، بما في ذلك mAbs و bsAbs و ADCs. علاوة على ذلك ، يمكن تخصيص مجموعة التعديلات وكتل عناصر المصدر بسهولة لتناسب احتياجات المستخدم. ستسمح الطبيعة المرنة لسير العمل هذا بالتطوير المستقبلي ليشمل تطبيقات لطرائق علاجية أخرى ، مثل علاجات البروتين غير mAb ، واللقاحات متعددة الوحدات الفرعية ، وقليل النيوكليوتيدات أو mRNA. من خلال جعل هذا الإطار مفتوح المصدر ، نأمل في إشراك المجتمع في مزيد من التطوير والتكيف مع الطرائق الأخرى ، وكذلك في إضافة المزيد من الميزات ، مثل حساب الأجزاء النظرية لاستجواب بيانات MS من أعلى إلى أسفل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يتم إصدار هذا البرنامج بموجب ترخيص Apache 2.0. حقوق الطبع والنشر (2022) لشركة جلاكسو سميث كلاين للأبحاث والتطوير المحدودة. كل الحقوق محفوظة. مرخص بموجب ترخيص Apache ، الإصدار 2.0 ("الترخيص") ؛ لا يجوز لك استخدام هذا الملف إلا وفقا للترخيص. يمكنك الحصول على نسخة من الترخيص في http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. ما لم يكن ذلك مطلوبا بموجب القانون المعمول به أو متفقا عليه كتابيا ، يتم توزيع البرامج الموزعة بموجب الترخيص على أساس "كما هي" ، دون ضمانات أو شروط من أي نوع ، سواء كانت صريحة أو ضمنية. راجع الترخيص لمعرفة اللغة المحددة التي تحكم الأذونات والقيود بموجب الترخيص. L.C. هو موظف في شركة جلاكسو سميث كلاين (GSK). طور T.H. و K.K. هذا البرنامج كموظفين في GSK وهما الآن شركاء في Merck و Moderna ، على التوالي.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون روبرت شوستر على المساعدة في التحقق من البيانات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
References
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kintzing, J. R., Filsinger Interrante, M. V., Cochran, J. R. Emerging strategies for developing next-generation protein therapeutics for cancer treatment. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (12), 993-1008 (2016).
- Wang, M. -Y., et al. SARS-CoV-2: Structure, biology, and structure-based therapeutics development. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 587269 (2020).
- ICH Q8 (R2) Pharmaceutical Development - Scientific Guideline. European Medicines Agency. , Available from: https://www.ema.europa.eu/en/ch-q8-r2-pharmaceutical-development-scientific-guideline (2018).
- Donnelly, D. P., et al. Best practices and benchmarks for intact protein analysis for top-down mass spectrometry. Nature Methods. 16 (7), 587-594 (2019).
- Gadgil, H. S., Pipes, G. D., Dillon, T. M., Treuheit, M. J., Bondarenko, P. V. Improving mass accuracy of high performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry of intact antibodies. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 17 (6), 867-872 (2006).
- Beck, A., Sanglier-Cianférani, S., Van Dorsselaer, A. Biosimilar, biobetter, and next generation antibody characterization by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (11), 4637-4646 (2012).
- Camperi, J., Goyon, A., Guillarme, D., Zhang, K., Stella, C. Multi-dimensional LC-MS: the next generation characterization of antibody-based therapeutics by unified online bottom-up, middle-up and intact approaches. Analyst. 146 (3), 747-769 (2021).
- Liu, H., May, K. Disulfide bond structures of IgG molecules. mAbs. 4 (1), 17-23 (2012).
- Jakes, C., Füssl, F., Zaborowska, I., Bones, J. Rapid analysis of biotherapeutics using protein a chromatography coupled to orbitrap mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (40), 13505-13512 (2021).
- Robotham, A. C., Kelly, J. F. Chapter 1 - LC-MS characterization of antibody-based therapeutics: Recent highlights and future prospects. Approaches to the Purification, Analysis and Characterization of Antibody-Based Therapeutics. Matte, A. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 1-33 (2020).
- Valeja, S. G., et al. Unit mass baseline resolution for an intact 148 kDa therapeutic monoclonal antibody by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (22), 8391-8395 (2011).
- Fornelli, L., Ayoub, D., Aizikov, K., Beck, A., Tsybin, Y. O. Middle-down analysis of monoclonal antibodies with electron transfer dissociation orbitrap fourier transform mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (6), 3005-3012 (2014).
- Berglund, M., Wieser, M. E. Isotopic compositions of the elements 2009 (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry. 83 (2), 397-410 (2011).
- Wang, M., et al. The Ame2012 atomic mass evaluation. Chinese Physics C. 36 (12), 1603-2014 (2012).
- Peri, S., Steen, H., Pandey, A. GPMAW--A software tool for analyzing proteins and peptides. Trends in Biochemical Sciences. 26 (11), 687-689 (2001).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. The Journal of Biological Chemistry. 286 (29), 25451-25458 (2011).
- De Leoz, M. L. A., et al. interlaboratory study on glycosylation analysis of monoclonal antibodies: Comparison of results from diverse analytical methods. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 11-30 (2020).
- Cymer, F., Beck, H., Rohde, A., Reusch, D. Therapeutic monoclonal antibody N-glycosylation - Structure, function and therapeutic potential. Biologicals. 52, 1-11 (2018).
- Baker, P. R., Trinidad, J. C., Chalkley, R. J. Modification site localization scoring integrated into a search engine. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (7), (2011).
- Chalkley, R. J., Clauser, K. R. Modification site localization scoring: Strategies and performance. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (5), 3-14 (2012).
