Summary
यह लेख मोनोक्लोनल एंटीबॉडी-आधारित प्रोटीन चिकित्सीय के लिए द्रव्यमान की गणना के लिए एक सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन, एमएबीस्केल के उपयोग का वर्णन करता है।
Abstract
बायोथेराप्यूटिक द्रव्यमान पहचान और संरचनात्मक अखंडता को सत्यापित करने का एक साधन है। बरकरार प्रोटीन या प्रोटीन सबयूनिट्स का मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) बायोफार्मास्युटिकल विकास के विभिन्न चरणों के लिए एक आसान विश्लेषणात्मक उपकरण प्रदान करता है। प्रोटीन की पहचान की पुष्टि तब की जाती है जब एमएस से प्रयोगात्मक द्रव्यमान सैद्धांतिक द्रव्यमान की पूर्व-परिभाषित द्रव्यमान त्रुटि सीमा के भीतर होता है। जबकि प्रोटीन और पेप्टाइड आणविक भार की गणना के लिए कई कम्प्यूटेशनल उपकरण मौजूद हैं, वे या तो बायोथेराप्यूटिक संस्थाओं के लिए सीधे आवेदन के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए थे, भुगतान किए गए लाइसेंस के कारण पहुंच सीमाएं हैं, या होस्ट सर्वर पर प्रोटीन अनुक्रम अपलोड करने की आवश्यकता है।
हमने एक मॉड्यूलर मास गणना दिनचर्या विकसित की है जो मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी), बायस्पेसिफिक एंटीबॉडी (बीएसएबी), और एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट (एडीसी) सहित चिकित्सीय ग्लाइकोप्रोटीन के औसत या मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान और मौलिक रचनाओं के आसान निर्धारण को सक्षम बनाता है। इस पायथन-आधारित गणना ढांचे की मॉड्यूलर प्रकृति भविष्य में टीके, संलयन प्रोटीन और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स जैसे अन्य तौर-तरीकों के लिए इस मंच के विस्तार की अनुमति देगी, और यह ढांचा टॉप-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा की पूछताछ के लिए भी उपयोगी हो सकता है। ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) के साथ एक ओपन-सोर्स स्टैंडअलोन डेस्कटॉप एप्लिकेशन बनाकर, हम उन वातावरणों में उपयोग के आसपास के प्रतिबंधों को दूर करने की उम्मीद करते हैं जहां मालिकाना जानकारी वेब-आधारित टूल पर अपलोड नहीं की जा सकती है। यह लेख विभिन्न एंटीबॉडी-आधारित चिकित्सीय तौर-तरीकों के लिए इस उपकरण, एमएबीस्केल के एल्गोरिदम और अनुप्रयोग का वर्णन करता है।
Introduction
पिछले दो दशकों में, बायोथेरेप्यूटिक्स आधुनिक दवा उद्योग का मुख्य आधार बनने के लिए विकसित हुए हैं। सार्स-सीओवी2 महामारी और अन्य जानलेवा स्थितियों ने बायोफार्मास्युटिकलअणुओं 1,2,3 के तेज और व्यापक विकास की आवश्यकता को और बढ़ा दिया है।
अन्य विश्लेषणात्मक परखों के साथ संयोजन में, अणु की पहचान के लिए बायोथेराप्यूटिक आणविक भार महत्वपूर्ण है। गुणवत्ता बनाए रखने के उद्देश्य से नियंत्रण रणनीतियों के हिस्से के रूप में खोज और विकास जीवनचक्र में बरकरार और कम सबयूनिट द्रव्यमान का उपयोग किया जाता है, जैसा कि क्यूटीपीपी (गुणवत्ता लक्ष्य उत्पाद प्रोफ़ाइल) 4 में वर्णित है।
बायोफार्मास्युटिकल उद्योग में विश्लेषणात्मक विकास पेप्टाइड मैपिंग या मल्टी-एट्रिब्यूट विधि (एमएएम) निगरानी का उपयोग करके बरकरार द्रव्यमान विश्लेषण और गहरे लक्षण वर्णन के लिए बड़े पैमाने पर माप पर बहुत अधिक निर्भर करता है। आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) प्लेटफार्मों का उपयोग करने वाली इन तकनीकों के केंद्र में उच्च-रिज़ॉल्यूशन सटीक द्रव्यमान (एचआर / एएम) माप प्रदान करने की क्षमता है। अधिकांश एचआर / एएम उपकरण 0.5-5 पीपीएम की सीमा में द्रव्यमान सटीकता उत्पन्न करते हैं, जो द्रव्यमान सीमा के साथ स्केल करते हैं। बरकरार बड़े अणुओं के लिए द्रव्यमान को सटीक रूप से मापने की क्षमता बड़े अणु चिकित्सीय की त्वरित और आत्मविश्वास ी पहचान को सक्षम बनाती है। चूंकि आइसोटोपिक रिज़ॉल्यूशन बड़े अणुओं (>10 केडीए) के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों का उपयोग करके प्राप्त नहीं किया जा सकता है, औसत द्रव्यमान की गणना तुलना और पहचान 5,6 के लिए की जानी चाहिए।
एक विशिष्ट बरकरार या सबयूनिट प्रोटीन मास स्पेक्ट्रम समग्र प्रोटियोफोम प्रोफाइल का प्रतिनिधित्व करता है, जिसमें पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) और किसी भी प्राथमिक संरचना अंतर, जैसे क्लिप या अनुक्रम वेरिएंट के परिणामस्वरूप विभिन्न आणविक रूपों पर समग्र जानकारी होती है। इन मापों की अपेक्षाकृत आसान और उच्च-थ्रूपुट प्रकृति उन्हें लक्षण वर्णन के लिए आकर्षक बनाती है और इन-प्रोसेस मॉनिटरिंग कंट्रोल 7,8 के रूप में। इन प्रयोगों के लिए डेटा विश्लेषण के लिए आमतौर पर उपयोगकर्ता को आणविक रूपों (पीटीएम या अन्य आणविक रूपों की सीमा) के लिए खोज स्थान को परिभाषित करने की आवश्यकता होती है। ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन के लिए, यह खोज स्थान काफी हद तक ग्लाइकोफॉर्म विषमता से प्रेरित है। प्राथमिक संरचना के साथ कई पीटीएम, डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड कॉन्फ़िगरेशन और अन्य विविधताओं के संयोजन सभी संभावित आणविक रूपों की गणना करना एक थकाऊ काम बनाते हैं। इसलिए, संभावित आणविक रूपों की मैन्युअल गणना मानव त्रुटि के लिए उच्च क्षमता के साथ एक समय और संसाधन लेने वाली प्रक्रिया है।
यहां, हम एक बड़े पैमाने पर गणना उपकरण प्रस्तुत करते हैं जिसे बायोथेराप्यूटिक अणुओं की सबसे महत्वपूर्ण विशेषताओं पर विचार करते हुए विकसित किया गया था, जैसे कि एमएबीएस, बीएसएबीएस, एडीसी, आदि। उपकरण द्रव्यमान और मौलिक रचनाओं की सुसंगत गणना के लिए खोज-स्थान चर के आसान समावेश की अनुमति देता है। इस उपकरण की मॉड्यूलर प्रकृति इसे आगे विकसित करने और अन्य तौर-तरीकों के लिए बड़े पैमाने पर गणना और द्रव्यमान मिलान पर लागू करने में सक्षम करेगी।
जीयूआई मॉड्यूल उपयोगकर्ता को द्रव्यमान गणना के लिए इनपुट निर्दिष्ट करने की अनुमति देता है, जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है; विशेष रूप से, उपयोगकर्ता हल्के और भारी एंटीबॉडी श्रृंखलाओं के लिए एकल-अक्षर अमीनो एसिड अनुक्रम दर्ज करता है। भारी-श्रृंखला एन-टर्मिनल साइक्लाइजेशन और सी-टर्मिनल लाइसिन क्लिपिंग के लिए सामान्य संशोधन चेक बॉक्स के रूप में शामिल हैं। इसके अलावा, रासायनिक सूत्र/मौलिक संरचना को संबंधित केम मॉड टेक्स्ट बॉक्स के माध्यम से इन प्रोटीन श्रृंखलाओं से जोड़ा/घटाया जा सकता है। यह उपयोगकर्ता को एक मौलिक संरचना जोड़ने की सुविधा देता है जिसमें एडीसी के मामले में कई पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन या एक छोटा-अणु पेलोड शामिल है। चूंकि अधिकांश चिकित्सीय एमएबी को प्रकाश श्रृंखला में ग्लाइकोसिलेशन साइटों को हटाने के लिए इंजीनियर किया जाता है, इसलिए प्रकाश श्रृंखला में ग्लाइकोसिलेशन को वैकल्पिक छोड़ दिया जाता है और जीयूआई पर चेक बॉक्स का उपयोग करके निर्दिष्ट किया जा सकता है।
एंटीबॉडी के लिए बरकरार द्रव्यमान विश्लेषण पर एक विशिष्ट भिन्नता एक कम सबयूनिट द्रव्यमान विश्लेषण है, जहां इंटरचेन डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को कम करके प्रकाश श्रृंखला को भारी श्रृंखला से अलग किया जाता है। उपयोग किए गए कम करने वाले एजेंट की ताकत के आधार पर, इंट्राचेन डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को क्लीवर किया जा सकता है या नहीं। उपयोगकर्ताओं के पास आईजीजी उपप्रकार के आधार पर या सिस्टीन-संयुग्मित एडीसी9 के मामले में डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड की कुल संख्या दर्ज करने की लचीलापन है।
एप्लिकेशन एक नीचे-ऊपर तरीके से द्रव्यमान की गणना करता है, जिसमें मौलिक रचनाओं की गणना पहले व्यक्तिगत भारी श्रृंखलाओं और प्रकाश श्रृंखलाओं के लिए की जाती है। इसके बाद, भारी श्रृंखला (एचसी) एन-टर्मिनल साइक्लाइजेशन लिस-क्लिपिंग को गणना की गई मौलिक रचनाओं को समायोजित करके हिसाब लगाया जाता है। किसी भी निर्दिष्ट रासायनिक संशोधनों को तब भारी और / या हल्की श्रृंखलाओं पर लागू किया जाता है। विश्लेषण के प्रकार और उपयोगकर्ता द्वारा निर्दिष्ट डाइसल्फ़ाइड-बॉन्ड पैटर्न के आधार पर, हाइड्रोजन की संख्या को दो पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं के लिए समायोजित किया जाता है। ग्लाइकोसिलेटेड एचसी और लाइट चेन (एलसी) (वैकल्पिक) द्रव्यमान की गणना उपयोगकर्ता के इनपुट के आधार पर की जाती है। अंत में, कई एचसी और एलसी द्रव्यमान संयुक्त होते हैं, और बरकरार द्रव्यमान गणना के लिए डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड नंबर स्वचालित रूप से अपडेट किए जाते हैं।
बरकरार प्रोटीन जैसे बड़े अणुओं के साथ, विशिष्ट समाधान शक्ति के साथ मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करते समय योजक द्रव्यमान दोष के कारण मोनोआइसोटोपिक द्रव्यमान को मापा नहीं जा सकता है। इसके बजाय, नाममात्र या औसत द्रव्यमानमापा जाता है या रिपोर्ट किया जाता है 5,10,11,12,13। क्यूरेटेड द्रव्यमान14,15 के लिए उपयोग किए जाने वाले स्रोत के आधार पर औसत मौलिक द्रव्यमान भिन्न हो सकते हैं। जबकि मौलिक द्रव्यमान में अंतर छोटे हो सकते हैं, वे बड़े-अणु आणविक भार गणना के लिए महत्वपूर्ण मूल्यों को जोड़ सकते हैं। सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग में डिफ़ॉल्ट रूप से उपयोग किए जाने वाले औसत मौलिक द्रव्यमान पूरक तालिका 1 में दिखाए गए हैं। बायोफार्मास्युटिकल अनुसंधान और विकास (आर एंड डी) क्षेत्र जैसे विनियमित वातावरण के लिए, लगातार आणविक द्रव्यमान को बनाए रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि द्रव्यमान में परिवर्तन नियामक फाइलिंग के दौरान आणविक इकाई में परिवर्तन का संकेत दे सकता है। तात्विक द्रव्यमान के उपयोग में स्थिरता को सक्षम करने के लिए, मौलिक द्रव्यमान का एक शब्दकोश सॉफ्टवेयर टूल के साथ अल्पविराम-पृथक मान (सीएसवी) पाठ फ़ाइल के रूप में शामिल किया गया है: Element_Mass.csv (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1)। इसी तरह, आमतौर पर एमएबी पर देखी जाने वाली ग्लाइकन रचनाओं की एक क्यूरेटेड सूची शामिल है: ग्लाइकन.csv (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2)। दोनों फ़ाइलें एक निष्पादन योग्य अनुप्रयोग के रूप में एक ही फ़ोल्डर स्थान में सहेजी जाती हैं और उपयोगकर्ता द्वारा एक विशिष्ट मौलिक द्रव्यमान सूची या ग्लाइकन लाइब्रेरी का उपयोग करने के लिए संशोधित की जा सकती हैं।
चित्र 1: mAbScale अनुप्रयोग के लिए GUI इंटरफ़ेस। जीयूआई मॉड्यूल उपयोगकर्ता को द्रव्यमान गणना के लिए इनपुट निर्दिष्ट करने की अनुमति देता है। उपयोगकर्ता हल्के और भारी एंटीबॉडी श्रृंखलाओं के लिए एकल-अक्षर अमीनो एसिड अनुक्रम दर्ज करता है। भारी-श्रृंखला एन-टर्मिनल साइक्लाइजेशन और सी-टर्मिनल लाइसिन क्लिपिंग के लिए सामान्य संशोधन चेक बॉक्स के रूप में शामिल हैं। रासायनिक सूत्र/तात्विक रचनाओं को संबंधित केम मॉड पाठ बॉक्स के माध्यम से जोड़ा/घटाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Protocol
mAbScale के लिए उच्च-स्तरीय वर्कफ़्लो चित्र 2 में दिखाया गया है। प्रत्येक चरण में अधिक परिष्कृत आंतरिक निर्णय शाखाएं, लूप और संयोजन होते हैं। गणना प्रक्रिया का वर्णन करने वाला एक विस्तृत एल्गोरिथम वर्कफ़्लो पूरक चित्र 1 में प्रस्तुत किया गया है। अनुप्रयोग आउटपुट उपयोगकर्ता-चयनित फ़ोल्डर में एक स्प्रेडशीट स्वरूप में सहेजा जाता है। आउटपुट फ़ाइल में कई अलग-अलग कार्यपत्रक होते हैं, जिन्हें उपयोगकर्ता इनपुट, आणविक भार गणना और औसत समस्थानिक द्रव्यमान व्युत्पत्ति के संदर्भ के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है (उदाहरण आउटपुट पूरक तालिकाओं में प्रदान किया जाता है)। उपयोगकर्ता इनपुट वर्कशीट में प्रोटीन अमीनो एसिड अनुक्रम और उपयोगकर्ता द्वारा दर्ज की गई अन्य जानकारी, औसत मौलिक द्रव्यमान और ग्लाइकन द्रव्यमान शामिल हैं, जिनका उपयोग मौलिक संरचना और विभिन्न आणविक भार की गणना करने के लिए किया जाता है। आणविक भार गणना शीट में विभिन्न रूपों की रासायनिक संरचना, ग्लाइकोसिलेशन और रासायनिक संशोधन के साथ और बिना कम द्रव्यमान और ग्लाइकोसिलेशन और रासायनिक संशोधन के साथ और बिना बरकरार द्रव्यमान शामिल हैं। आधे-एंटीबॉडी द्रव्यमान वाली चादरें स्वचालित रूप से उत्पन्न होंगी यदि उपयोगकर्ता उपयोगकर्ता इनपुट पृष्ठ में दो अलग-अलग एचसी और / या दो अलग-अलग एलसी दर्ज करता है, क्योंकि अर्ध-एंटीबॉडी प्राथमिक अशुद्धियां हैं जिन्हें वांछित हेटेरोडिमर के सापेक्ष पहचानने और परिमाणित करने की आवश्यकता होती है। mAbScale के लिए स्रोत कोड निम्न रिपॉजिटरी के माध्यम से एक्सेस किया जा सकता है: https://github.com/kkhatri99/mAbScale।
चित्रा 2: आवेदन का उपयोग करके मौलिक रचनाओं और द्रव्यमान की गणना में शामिल चरणों का अवलोकन। पूरक चित्र 1 में वर्णित प्रक्रिया प्रवाह से लिंक करने के लिए रंग कोडिंग का उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
1. mAbscale अनुप्रयोग खोलना
- निष्पादन योग्य फ़ाइल के लिए आइकन पर डबल-क्लिक करके सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन खोलें।
2. अनुक्रम प्रविष्टि
- बिना किसी रिक्त स्थान के 1 के साथ चिह्नित संबंधित टेक्स्ट बॉक्स में भारी-श्रृंखला और प्रकाश-श्रृंखला अनुक्रम दर्ज करें।
- bsAbs के लिए, 2 चिह्नित पाठ बक्से के दूसरे सेट में अतिरिक्त भारी या हल्की चेन जोड़ें. समान भारी चेन और हल्की चेन वाले एमएबी के लिए 2 खाली छोड़ दें।
- एन-टर्मिनल साइक्लाइजेशन और/या सी-टर्मिनल क्लिपिंग चेक बॉक्स की जांच करें, यदि ये भारी श्रृंखला टर्मिनल वेरिएंट लागू होते हैं।
- हेवी चेन केम मॉड और / या लाइट चेन केम मॉड टेक्स्ट बॉक्स में एडीसी अणुओं के लिए लिंकर और पेलोड सहित कोई भी रासायनिक संशोधन जोड़ें।
- संशोधनों को मौलिक रचनाओं के रूप में निर्दिष्ट करें, जैसे CaCl2. संशोधन को संबंधित प्रोटीन सबयूनिट या श्रृंखला में जोड़ा जाएगा।
नोट: एक रासायनिक संरचना को एक सबयूनिट या श्रृंखला से एक - चिह्न के साथ मौलिक संरचना को उपसर्ग करके भी घटाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, -एच2ओ सबयूनिट संरचना और द्रव्यमान से पानी के अणु को घटा देगा।
- संशोधनों को मौलिक रचनाओं के रूप में निर्दिष्ट करें, जैसे CaCl2. संशोधन को संबंधित प्रोटीन सबयूनिट या श्रृंखला में जोड़ा जाएगा।
3. डाइसल्फ़ाइड बांड की संख्या निर्दिष्ट करना
- डाइसल्फ़ाइड की कुल संख्या चिह्नित पाठ बॉक्स में प्रोटीन अणुओं में डाइसल्फ़ाइड बांड की संख्या निर्दिष्ट करें।
- कमी की सीमा (पूर्ण बनाम आंशिक) के आधार पर, अपरिवर्तित एचसी डाइसल्फ़ाइड टेक्स्ट बॉक्स में अपरिवर्तित एचसी डाइसल्फ़ाइड की संख्या और अपरिवर्तित एलसी डाइसल्फ़ाइड की संख्या दर्ज करें।
नोट: एमएबी सबयूनिट्स के कम द्रव्यमान विश्लेषण में डाइसल्फ़ाइड-लिंक्ड भारी और हल्की श्रृंखलाओं की कमी / पृथक्करण शामिल है। - यदि एमएबी प्रकाश श्रृंखला पर ग्लाइकोसिलेशन मौजूद है, तो जांचें कि लाइट चेन ग्लाइकोसिलेटेड चेक बॉक्स है।
4. आउटपुट फ़ोल्डर सेट करना और एप्लिकेशन चलाना
- आउटपुट फ़ोल्डर पाठ बॉक्स के लिए आउटपुट फ़ोल्डर का चयन करने के लिए ब्राउज़ करें बटन पर क्लिक करें।
- Excel फ़ाइल ( कोई ext नहीं) पाठ बॉक्स में फ़ाइल एक्सटेंशन के बिना आउटपुट फ़ाइल नाम दर्ज करें (स्वचालित रूप से .xlsx के रूप में सहेजता है)।
- आवेदन शुरू करने के लिए सबमिट बटन पर क्लिक करें। आउटपुट फ़ाइल निर्दिष्ट फ़ोल्डर में पाया जा सकता है।
नोट: मौलिक द्रव्यमान और ग्लाइकेन की सूची को क्रमशः सीमांकित पाठ फ़ाइलों Element_Mass.csv (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) और ग्लाइकन.csv (पूरक कोडिंग फ़ाइल 2) को संपादित करके अनुकूलित किया जा सकता है। इन फ़ाइलों को अनुप्रयोग को निष्पादित करने के लिए mAbScale.exe (पूरक कोडिंग फ़ाइल 3) निष्पादन योग्य फ़ाइल के समान फ़ोल्डर में रखा जाना चाहिए। एक निष्पादन के बाद आवेदन स्वचालित रूप से बंद हो जाएगा। दूसरी गणना की आवश्यकता होने पर उपयोगकर्ता को ऐप को फिर से शुरू करना होगा।
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Representative Results
विभिन्न प्रकार के एमएबी का प्रतिनिधित्व करने के लिए विभिन्न प्रकार के एमएबी का चयन किया गया था। एफसी क्षेत्र में समान भारी श्रृंखलाओं, समान प्रकाश श्रृंखलाओं और एक एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन साइट के साथ एक पारंपरिक एमएबी का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एमएबी मानक का चयन किया गया था। एक अतिरिक्त प्रकाश श्रृंखला एन-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन, एक द्विविशिष्ट एमएबी और एक एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट (एडीसी) एमएबी के साथ एक एमएबी को भी आवेदन उपयोग को चौड़ा करने के लिए चुना गया था। इन उदाहरण एमएबी की रासायनिक संरचना, गणना द्रव्यमान, मापा द्रव्यमान और द्रव्यमान त्रुटि को तालिका 1 में संक्षेपित किया गया है। एमएबीस्केल द्वारा रिपोर्ट किए गए प्रोटीन रासायनिक रचनाओं और गणना किए गए द्रव्यमान की पुष्टि जीपीएमएडब्ल्यू16 द्वारा की गई थी, जो प्रोटीन और पेप्टाइड प्राथमिक संरचना विश्लेषण के लिए एक कार्यक्रम है।
बरकरार द्रव्यमान विश्लेषण के लिए, एमएबी नमूनों को एलसी-एमएस ग्रेड पानी का उपयोग करके 1 मिलीग्राम / एमएल तक पतला किया गया था और विश्लेषण के लिए इंजेक्ट किया गया था। कम विश्लेषण के लिए, नमूनों को पहले डिथिथ्रेइटोल के साथ इलाज किया गया था और इंटर-चेन डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को छोड़ने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। सभी नमूनों का विश्लेषण एक मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ युग्मित एक एक्विटी यूपीएलसी प्रणाली का उपयोग करके किया गया था। मोबाइल चरण के रूप में पानी/एसिटोनिट्राइल (65:35) और 0.1% टीएफए के साथ एक आइसोक्रेटिक विधि का उपयोग करके ऑनलाइन डीसाल्टिंग और भारी और हल्की श्रृंखलाओं को अलग करने के लिए एक बीईएच 200 एसईसी कॉलम का उपयोग किया गया था। मास स्पेक्ट्रोमीटर को सकारात्मक आयन मोड में संचालित किया गया था, और डेटा को 700-5,000 मीटर / जेड की स्कैन रेंज के साथ प्राप्त किया गया था।
प्रोटीन मेट्रिक्स, इंक (पीएमआई) बायोस के बरकरार और कम वर्कफ़्लो का उपयोग क्रमशः बरकरार और कम कच्चे स्पेक्ट्रा को संसाधित करने के लिए किया गया था। प्रोटीन मास रेंज को बरकरार मास डीकन्वोल्यूशन के लिए 143,000-163,000 डीए, एचसी मास डीकन्वोल्यूशन के लिए 47,000-53,000 डीए और एलसी मास डीकन्वोल्यूशन के लिए 20,000-27,000 डीए तक सेट किया गया था। स्वचालित द्रव्यमान / पीक-पिकिंग के लिए, द्रव्यमान चोटियों के बीच न्यूनतम अंतर 15 डीए पर सेट किया गया था, और द्रव्यमान चोटियों की अधिकतम संख्या 10 तक सीमित थी। द्रव्यमान मिलान टैब के लिए अपेक्षित ग्लाइकेन की एक सूची दर्ज / चयनित की गई थी, और द्रव्यमान मिलान सहिष्णुता के लिए ऊपरी सीमा 10 डीए पर सेट की गई थी।
गणना किए गए द्रव्यमान और मापा द्रव्यमान के बीच छोटी द्रव्यमान त्रुटियां सामान्य द्रव्यमान त्रुटि स्वीकृति मानदंड (≤बरकरार एमएबी के लिए 10 डीए, कम भारी श्रृंखलाओं और हल्की श्रृंखलाओं के लिए क्रमशः ≤5 डीए) के भीतर थीं, यह सुझाव देते हुए कि गणना किए गए द्रव्यमान सटीक17 थे।
एडीसी सैद्धांतिक द्रव्यमान की गणना के लिए, विशिष्ट एमएबी सबयूनिट्स में लिंकर / पेलोड तात्विक संरचना के साथ एक रासायनिक संशोधन जोड़ा जा सकता है। हालांकि, केवल एक दवा लोड अनुपात द्रव्यमान का आणविक भार आउटपुट में शामिल किया जाएगा। विभिन्न दवा भार अनुपात के साथ एंटीबॉडी के समग्र आणविक द्रव्यमान को उपयोगकर्ता द्वारा मैन्युअल रूप से जोड़ा जाना चाहिए। इन क्षमताओं को एमएबीस्केल के बाद के संस्करण में जोड़ा जा सकता है या इस परियोजना की ओपन-सोर्स प्रकृति को देखते हुए सामुदायिक समर्थन के साथ संशोधित किया जा सकता है।
तालिका 1: विभिन्न एमएबी सबयूनिट्स और आणविक रूपों के लिए गणना और मापा द्रव्यमान की तुलना। रासायनिक रचनाओं, गणना किए गए द्रव्यमान, मापा द्रव्यमान और उदाहरण एमएबी के द्रव्यमान त्रुटियों को इस तालिका में सारांशित किया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
पूरक चित्र 1: mAbScale के लिए विस्तृत एल्गोरिथम वर्कफ़्लो। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक तालिका 1: एमएबीस्केल14,15 में उपयोग किए जाने वाले गणना औसत मौलिक द्रव्यमान। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: मौलिक द्रव्यमान की सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक कोडिंग फ़ाइल 2: ग्लाइकेन की सूची। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक कोडिंग फ़ाइल 3: बंडल अनुप्रयोग- mAbScale निष्पादन योग्य। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
एमएबीस्केल द्रव्यमान और मौलिक गणना के लिए बिल्डिंग ब्लॉक को बदलने के लचीलेपन के साथ एक सहज उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस प्रदान करता है। उपयोगकर्ताओं को एप्लिकेशन का उपयोग करने, सही द्रव्यमान प्राप्त करने और परिणामों की व्याख्या करने के लिए लक्ष्य अणु की बुनियादी समझ होने की उम्मीद है। उदाहरण के लिए, बरकरार या कम द्रव्यमान आउटपुट शीट बरकरार या कम द्रव्यमान की कई पंक्तियों के कारण भारी हो सकती है, क्योंकि डिफ़ॉल्ट ग्लाइकन डेटाबेस में 88 एन-लिंक्ड ग्लाइकेन होते हैं जो आमतौर पर चिकित्सीय एंटीबॉडी के एफसी भाग में पाए जाते हैं, और एप्लिकेशन डेटाबेस18 में शामिल सभी संभावित ग्लाइकोफॉर्म द्रव्यमान की गणना करता है। 19. जबकि अधिकांश चिकित्सीय एमएबी को फैब क्षेत्र में ग्लाइकोसिलेशन को हटाने के लिए इंजीनियर किया जाता है, कुछ एमएबी इस ग्लाइकोसिलेशन साइट को बनाए रख सकते हैं, और इससे ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटियोफॉर्म की कुल संख्या में वृद्धि हो सकती है। उपयोगकर्ताओं को एक ग्लाइकन डेटाबेस क्यूरेट करने की सिफारिश की जाती है जो आउटपुट की जटिलता को कम करने और मास पीक पहचान के लिए मापा द्रव्यमान के साथ परिणामों को बेहतर ढंग से संरेखित करने के लिए किसी दिए गए अणु के लिए सबसे उपयुक्त ग्लाइकोफॉर्म पर केंद्रित है।
हल्के और भारी जंजीरों की विविधता के कारण बीएसएबीएस के साथ जटिलता का स्तर और बढ़ जाता है। यह सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन प्रदान किए गए एलसी और एचसी अनुक्रमों और ग्लाइकोफॉर्म के साथ सभी संभावित क्रमपरिवर्तन और संयोजन उत्पन्न करता है ताकि एंटीबॉडी सबयूनिट्स की मिसपेयरिंग या अपूर्ण जोड़ी से सभी संभावित उप-उत्पादों की पीढ़ी की अनुमति मिल सके, जैसे कि अर्ध-एंटीबॉडी। यह उपयोगकर्ता को उनके उपयोग के लिए सबसे उपयुक्त प्रोटियोफॉर्म को फ़िल्टर करने के लिए छोड़ देता है। सॉफ्टवेयर आउटपुट ग्लाइकोसिलेटेड और गैर-ग्लाइकोसिलेटेड आउटपुट को अलग-अलग वर्कशीट में विभाजित करता है, जिससे उपयोगकर्ता के लिए समीक्षा करना आसान हो जाता है। बरकरार और कम आणविक द्रव्यमान को भी अलग किया जाता है, और बीएसएबी के लिए सभी संभावित अर्ध-एंटीबॉडी संयोजनों को संसाधित परिणामों के उत्थान को और सरल बनाने के लिए एक समर्पित वर्कशीट में सूचीबद्ध किया जाता है।
वर्तमान सॉफ्टवेयर संस्करण की एक सीमा यह है कि एप्लिकेशन एक समय में केवल एक दवा-से-एंटीबॉडी अनुपात के साथ एडीसी द्रव्यमान की गणना करता है, क्योंकि पेलोड रासायनिक संरचना को हेवी चेन केम मॉड और लाइट चेन केम मॉड टेक्स्ट बॉक्स में दर्ज किया जाता है। प्रत्येक दवा-से-एंटीबॉडी अनुपात (डीएआर) के लिए, मौलिक संरचना को उपयोगकर्ता द्वारा पुनर्गणना के लिए दर्ज करने की आवश्यकता होती है।
बरकरार प्रोटीन के लिए द्रव्यमान की गणना करने की क्षमता कई अनुप्रयोगों द्वारा प्रदान की जाती है, लेकिन उन्हें या तो खरीदने के लिए वाणिज्यिक लाइसेंस की आवश्यकता होती है या वेब-आधारित उपकरण होते हैं जिनके लिए प्रोटीन अनुक्रमों को 16,20,21 अपलोड करने की आवश्यकता होती है। ये एप्लिकेशन कस्टम रासायनिक संशोधनों को जोड़ने या आसानी से इंट्रामोलेक्यूलर बॉन्ड, जैसे डाइसल्फ़ाइड को शामिल करने के लिए उपयोगकर्ता को बहुत सीमित लचीलापन प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वेब-आधारित अनुप्रयोगों का मूल्य सीमित होता है जब मालिकाना और गोपनीय जानकारी शामिल होती है, जैसे कि दवा विकास या अन्य नियंत्रित वातावरण में, क्योंकि बायोथेराप्यूटिक अनुक्रम जानकारी बाहरी सर्वरों पर अपलोड नहीं की जा सकती है। नतीजतन, शोधकर्ताओं को या तो मैनुअल गणना या प्रोग्रामेटिक दिनचर्या पर भरोसा करना चाहिए जो कम लचीले हैं, प्रसारित करना मुश्किल है, और विसंगतियों को जन्म दे सकता है।
हमने मौजूदा अनुप्रयोगों से जुड़े प्रतिबंधों को कम करने पर ध्यान देने के साथ आणविक द्रव्यमान और मौलिक संरचना की गणना के लिए एक ओपन-सोर्स फ्रेमवर्क विकसित किया है। जीयूआई के साथ स्टैंडअलोन डेस्कटॉप एप्लिकेशन बाहरी सर्वरों पर मालिकाना जानकारी अपलोड करने से जुड़े प्रतिबंधों को दूर करेगा और उपयोगकर्ताओं के लिए आसान पहुंच सक्षम करेगा। इस उपकरण का उपयोग सबसे आम बायोथेराप्यूटिक तौर-तरीकों के लिए किया जा सकता है, जिसमें एमएबी, बीएसएबीएस और एडीसी शामिल हैं। इसके अलावा, उपयोगकर्ता की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए संशोधनों और स्रोत मौलिक द्रव्यमान की सीमा को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। इस वर्कफ़्लो की लचीली प्रकृति भविष्य के विकास को अन्य चिकित्सीय तौर-तरीकों, जैसे गैर-एमएबी प्रोटीन चिकित्सीय, मल्टी-सबयूनिट टीके, और ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स या एमआरएनए के अनुप्रयोगों को शामिल करने की अनुमति देगी। इस ढांचे को ओपन-सोर्स बनाकर, हम समुदाय को आगे के विकास और अन्य तौर-तरीकों के अनुकूलन में संलग्न करने की उम्मीद करते हैं, साथ ही साथ अधिक सुविधाओं को जोड़ने में, जैसे कि टॉप-डाउन एमएस डेटा पूछताछ के लिए सैद्धांतिक टुकड़ों की गणना।
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Disclosures
यह सॉफ्टवेयर अपाचे 2.0 लाइसेंस के तहत जारी किया जा रहा है। ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन रिसर्च एंड डेवलपमेंट लिमिटेड का कॉपीराइट (2022)। सभी अधिकार सुरक्षित. अपाचे लाइसेंस, संस्करण 2.0 ("लाइसेंस") के तहत लाइसेंस प्राप्त); आप लाइसेंस के अनुपालन के अलावा इस फ़ाइल का उपयोग नहीं कर सकते हैं। आप http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0 पर लाइसेंस की एक प्रति प्राप्त कर सकते हैं। जब तक लागू कानून द्वारा आवश्यक नहीं है या लिखित रूप में सहमति नहीं दी जाती है, लाइसेंस के तहत वितरित सॉफ्टवेयर को "जैसा है" आधार पर वितरित किया जाता है, बिना किसी प्रकार की वारंटी या शर्तों के, या तो व्यक्त या निहित। लाइसेंस के अंतर्गत अनुमतियों और सीमाओं को नियंत्रित करने वाली विशिष्ट भाषा के लिए लायसेंस देखें. एल.सी. एक ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन (जीएसके) कर्मचारी है। टीएच और केके ने जीएसके के कर्मचारियों के रूप में इस सॉफ्टवेयर को विकसित किया और अब क्रमशः मर्क और मॉडर्ना के सहयोगी हैं।
Acknowledgments
लेखक डेटा सत्यापन के साथ सहायता के लिए रॉबर्ट शूस्टर को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
References
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