Summary
En este artículo se describe el uso de una aplicación de software, mAbScale, para el cálculo de masas para terapias con proteínas basadas en anticuerpos monoclonales.
Abstract
Las masas bioterapéuticas son un medio para verificar la identidad y la integridad estructural. La espectrometría de masas (MS) de proteínas intactas o subunidades proteicas proporciona una herramienta analítica sencilla para las diferentes etapas del desarrollo biofarmacéutico. La identidad de la proteína se confirma cuando la masa experimental de la EM está dentro de un rango de error de masa predefinido de la masa teórica. Si bien existen varias herramientas computacionales para el cálculo de los pesos moleculares de proteínas y péptidos, no fueron diseñadas para su aplicación directa a entidades bioterapéuticas, tienen limitaciones de acceso debido a licencias pagas o requieren cargar secuencias de proteínas en servidores host.
Hemos desarrollado una rutina modular de cálculo de masas que permite determinar fácilmente las masas medias o monoisotópicas y las composiciones elementales de las glicoproteínas terapéuticas, incluidos los anticuerpos monoclonales (mAb), los anticuerpos biespecíficos (bsAb) y los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). La naturaleza modular de este marco de cálculo basado en Python permitirá la extensión de esta plataforma a otras modalidades como vacunas, proteínas de fusión y oligonucleótidos en el futuro, y este marco también podría ser útil para la interrogación de datos de espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Al crear una aplicación de escritorio independiente de código abierto con una interfaz gráfica de usuario (GUI), esperamos superar las restricciones de uso en entornos donde la información propietaria no se puede cargar en herramientas basadas en la web. En este artículo se describen los algoritmos y la aplicación de esta herramienta, mAbScale, a diferentes modalidades terapéuticas basadas en anticuerpos.
Introduction
En las últimas dos décadas, la bioterapéutica ha evolucionado hasta convertirse en un pilar de la industria farmacéutica moderna. La pandemia de SARS-CoV2 y otras afecciones potencialmente mortales han aumentado aún más la necesidad de un desarrollo más rápido y amplio de moléculas biofarmacéuticas 1,2,3.
El peso molecular bioterapéutico es crítico para la identificación de la molécula, en combinación con otros ensayos analíticos. Las masas de subunidades intactas y reducidas se utilizan a lo largo de los ciclos de vida de descubrimiento y desarrollo como parte de las estrategias de control destinadas a mantener la calidad, como se describe en el QTPP (Quality Target Product Profile)4.
El desarrollo analítico en la industria biofarmacéutica se basa en gran medida en las mediciones de masa para el análisis de masa intacta y la caracterización profunda mediante el mapeo de péptidos o el monitoreo del método multiatributo (MAM). En el centro de estas técnicas que utilizan plataformas modernas de espectrometría de masas (MS) se encuentra la capacidad de proporcionar mediciones de masa precisas de alta resolución (HR/AM). La mayoría de los instrumentos HR/AM producen precisiones de masa en el rango de 0,5-5 ppm, que se escalan con el rango de masa. La capacidad de medir masas con precisión para moléculas grandes intactas permite la identificación rápida y confiable de terapias de moléculas grandes. Dado que la resolución isotópica no puede alcanzarse utilizando las condiciones experimentales típicas para moléculas grandes (>10 kDa), se deben calcular las masas medias para su comparación e identificación 5,6.
Un espectro típico de masa de proteína intacta o subunidad representa el perfil proteoforme general, que contiene información compuesta sobre las diversas formas moleculares resultantes de las modificaciones postraduccionales (PTM) y cualquier diferencia de estructura primaria, como clips o variantes de secuencia. La naturaleza relativamente fácil y de alto rendimiento de estas mediciones las hace atractivas para la caracterización y como controles de monitoreo durante el proceso 7,8. El análisis de datos para estos experimentos generalmente requiere que el usuario defina el espacio de búsqueda de formas moleculares (rango de PTM u otras formas moleculares). En el caso de las proteínas glicosiladas, este espacio de búsqueda está impulsado en gran medida por la heterogeneidad de los glicoformes. Las combinaciones de múltiples PTM, las configuraciones de enlaces disulfuro y otras variaciones a lo largo de la estructura primaria hacen que el cálculo de todas las formas moleculares posibles sea una tarea tediosa. Por lo tanto, el cálculo manual de las posibles formas moleculares es un proceso que consume tiempo y recursos con un alto potencial de error humano.
Aquí, presentamos una herramienta de cálculo de masa que fue desarrollada considerando las características más importantes de las moléculas bioterapéuticas, tales como mAbs, bsAbs, ADCs, etc. La herramienta permite la fácil incorporación de variables de espacio de búsqueda para el cálculo consistente de masas y composiciones elementales. El carácter modular de esta herramienta permitirá seguir desarrollándola y aplicándola al cálculo de masas y a la adaptación de masas para otras modalidades.
El módulo GUI permite al usuario especificar la entrada para el cálculo de masa, como se muestra en la Figura 1; En concreto, el usuario introduce secuencias de aminoácidos de una sola letra para cadenas de anticuerpos ligeros y pesados. Las modificaciones comunes para la ciclación de N-terminal de cadena pesada y el recorte de lisina C-terminal se incluyen como casillas de verificación. Además, la fórmula química/composición elemental se puede agregar/restar de estas cadenas de proteínas a través del cuadro de texto Chem Mod respectivo. Esto permite al usuario la flexibilidad de agregar una composición elemental que incluye múltiples modificaciones postraduccionales o una carga útil de molécula pequeña en el caso de un ADC. Como la mayoría de los anticuerpos monoclonales terapéuticos están diseñados para eliminar los sitios de glicosilación en la cadena ligera, la glicosilación en la cadena ligera se deja opcional y se puede especificar mediante una casilla de verificación en la interfaz gráfica de usuario.
Una variación típica del análisis de masa intacta para anticuerpos es un análisis de masa de subunidades reducidas, en el que la cadena ligera se separa de la cadena pesada mediante la reducción de los enlaces disulfuro entre cadenas. Dependiendo de la fuerza del agente reductor utilizado, los enlaces disulfuro intracadena pueden o no escindirse. Los usuarios tienen la flexibilidad de introducir el número total de enlaces disulfuro en función del subtipo de IgG o en el caso de unADC 9 conjugado con cisteína.
La aplicación calcula las masas de forma ascendente, en la que las composiciones elementales se calculan primero para las cadenas pesadas y ligeras individuales. A continuación, se tiene en cuenta la ciclación N-terminal de cadena pesada (HC) Lys-clipping ajustando las composiciones elementales calculadas. A continuación, se aplican las modificaciones químicas especificadas a las cadenas pesadas y/o ligeras. Dependiendo del tipo de análisis y de los patrones de enlace disulfuro especificados por el usuario, el número de hidrógenos se ajusta para las dos cadenas polipeptídicas. Las masas de HC glicosilado y de cadena ligera (LC) (opcional) se calculan en función de la entrada del usuario. Finalmente, se combinan múltiples masas HC y LC, y los números de enlace disulfuro se actualizan automáticamente para el cálculo de masa intacta.
Con moléculas más grandes, como proteínas intactas, las masas monoisotópicas no se pueden medir debido al defecto de masa aditivo cuando se utilizan espectrómetros de masas con un poder de resolución típico. En cambio, se miden o informan masas nominales o promedio 5,10,11,12,13. Las masas elementales medias pueden variar en función de la fuente utilizada para las masas seleccionadas14,15. Si bien las diferencias en las masas elementales pueden ser pequeñas, pueden sumar valores significativos para los cálculos de peso molecular de moléculas grandes. Las masas elementales medias utilizadas por defecto en la aplicación de software se muestran en la Tabla Suplementaria 1. Para entornos regulados como el campo de la investigación y el desarrollo (I&D) biofarmacéutico, es importante mantener masas moleculares consistentes porque los cambios en las masas pueden implicar cambios en la entidad molecular durante las presentaciones regulatorias. Para permitir la coherencia en el uso de masas elementales, se incluye un diccionario de masas elementales con la herramienta de software como un archivo de texto de valores separados por comas (csv): Element_Mass.csv (Archivo de codificación suplementario 1). Del mismo modo, se incluye una lista curada de composiciones de glicanos que se ven típicamente en mAbs: Glycan.csv (Supplemental Coding File 2). Ambos archivos se guardan en la misma ubicación de carpeta que una aplicación ejecutable y pueden ser modificados por el usuario para usar una lista de masa elemental específica o una biblioteca de glicanos.
Figura 1: Interfaz gráfica de usuario para la aplicación mAbScale. El módulo GUI permite al usuario especificar la entrada para el cálculo de masa. El usuario introduce secuencias de aminoácidos de una sola letra para las cadenas de anticuerpos ligeros y pesados. Las modificaciones comunes para la ciclación del terminal N de cadena pesada y el recorte de lisina del terminal C se incluyen como casillas de verificación. Las fórmulas químicas/composiciones elementales se pueden sumar/restar a través del cuadro de texto respectivo de Chem Mod . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
El flujo de trabajo de alto nivel para mAbScale se muestra en la figura 2. Cada paso tiene ramas de decisión internas, bucles y combinatoria más sofisticados. En la Figura complementaria 1 se presenta un flujo de trabajo algorítmico detallado que describe el proceso de cálculo. La salida de la aplicación se guarda en formato de hoja de cálculo en la carpeta seleccionada por el usuario. El archivo de salida consta de varias hojas de cálculo independientes, que se pueden clasificar como la entrada del usuario, los cálculos de peso molecular y las referencias para las derivaciones de masa isotópica promedio (se proporciona un ejemplo de salida en tablas complementarias). Las hojas de trabajo de entrada del usuario incluyen las secuencias de aminoácidos de proteínas y otra información ingresada por el usuario, masas elementales promediadas y masas de glicanos, que se utilizan para calcular la composición elemental y los diferentes pesos moleculares. Las hojas de cálculo de peso molecular incluyen la composición química de varias formas, la masa reducida con y sin glicosilación y modificación química, y la masa intacta con y sin glicosilación y modificación química. Las hojas que contienen masas de medios anticuerpos se generarán automáticamente si el usuario ingresa dos HC diferentes y/o dos LC diferentes en la página de entrada del usuario, ya que los medios anticuerpos son impurezas primarias que deben identificarse y cuantificarse en relación con el heterodímero deseado. Se puede acceder al código fuente de mAbScale a través del siguiente repositorio: https://github.com/kkhatri99/mAbScale.
Figura 2: Resumen de los pasos involucrados en el cálculo de composiciones elementales y masas utilizando la aplicación. El código de colores se puede utilizar para vincular el flujo de proceso descrito en la Figura complementaria 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1. Abrir la aplicación mAbscale
- Abra la aplicación de software haciendo doble clic en el icono del archivo ejecutable.
2. Entrada de secuencia
- Introduzca las secuencias de cadenas pesadas y ligeras en los respectivos cuadros de texto marcados con 1 sin espacios.
- Para bsAbs, agregue cadenas pesadas o ligeras adicionales en el segundo conjunto de cuadros de texto marcados con 2. Deje 2 en blanco para los mAbs con cadenas pesadas y cadenas ligeras idénticas.
- Marque las casillas de verificación Ciclación de N-terminal y/o Recorte de terminal C , si estas variantes de terminales de cadena pesada son aplicables.
- Agregue cualquier modificación química, incluido el enlazador y la carga útil para las moléculas ADC, a los cuadros de texto Heavy Chain Chem Mod y/o Light Chain Chem Mod .
- Especifique las modificaciones como composiciones elementales, como CaCl2. La modificación se agregará a la subunidad o cadena de proteína respectiva.
NOTA: También se puede restar una composición química de una subunidad o cadena prefijando la composición elemental con un signo -. Por ejemplo, -H2O restará una molécula de agua de la composición y masa de la subunidad.
- Especifique las modificaciones como composiciones elementales, como CaCl2. La modificación se agregará a la subunidad o cadena de proteína respectiva.
3. Especificación del número de enlaces disulfuro
- Especifique el número de enlaces disulfuro en las moléculas de proteína en el cuadro de texto marcado Número total de disulfuros.
- Introduzca el número de disulfuros de HC no reducidos en el cuadro de texto Disulfuros de HC no reducidos y el número de disulfuros de HC no reducidos en el cuadro de texto Disulfuros de HC no reducidos , en función del grado de reducción (completa o parcial).
NOTA: El análisis de masa reducida de las subunidades de mAb implica la reducción/separación de las cadenas pesadas y ligeras ligadas al disulfuro. - Si la glicosilación está presente en la cadena ligera de anticuerpos monoclonales, marque la casilla de verificación La cadena ligera está glicosilada .
4. Configuración de la carpeta de salida y ejecución de la aplicación
- Haga clic en el botón Examinar para seleccionar una carpeta de salida para el cuadro de texto Carpeta de salida .
- Introduzca el nombre del archivo de salida sin una extensión de archivo (se guarda automáticamente como .xlsx) en el cuadro de texto Archivo de Excel (sin ext).
- Haga clic en el botón Enviar para iniciar la solicitud. El archivo de salida se puede encontrar en la carpeta designada.
NOTA: Las masas elementales y la lista de glicanos se pueden personalizar editando los archivos de texto delimitados Element_Mass.csv (Archivo de codificación suplementaria 1) y Glicano.csv (Archivo de codificación suplementaria 2), respectivamente. Estos archivos deben colocarse en la misma carpeta que el archivo ejecutable mAbScale.exe (archivo de codificación suplementario 3) para que se ejecute la aplicación. La aplicación se cerrará automáticamente después de una ejecución. El usuario tendrá que volver a iniciar la aplicación si necesita un segundo cálculo.
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Representative Results
Se seleccionó una variedad de anticuerpos monoclonales para representar diferentes tipos de anticuerpos monoclonales. Se seleccionó un estándar de AcM disponible comercialmente para representar un AcM convencional con cadenas pesadas idénticas, cadenas ligeras idénticas y un sitio de glicosilación ligado a N en la región Fc. También se eligió un AcM con una glicosilación Nligada a N de cadena ligera adicional, un AcM biespecífico y un AcM conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) para ampliar el uso de la aplicación. La composición química, la masa calculada, la masa medida y el error de masa de estos mAbs de ejemplo se resumen en la Tabla 1. Las composiciones químicas de las proteínas y las masas calculadas informadas por mAbScale fueron confirmadas por GPMAW16, un programa para el análisis de la estructura primaria de proteínas y péptidos.
Para el análisis de masa intacta, las muestras de anticuerpos monoclonales se diluyeron a 1 mg/ml utilizando agua de grado LC-MS y se inyectaron para su análisis. Para el análisis reducido, las muestras se trataron primero con dititreitol y se incubaron a 37 °C durante 15 min para romper los enlaces disulfuro entre cadenas. Todas las muestras se analizaron utilizando un sistema Acquity UPLC acoplado a un espectrómetro de masas. Se empleó una columna BEH 200 SEC para la desalinización en línea y la separación de las cadenas pesadas y ligeras utilizando un método isocrático con agua/acetonitrilo (65:35) y AGT al 0,1% como fase móvil. El espectrómetro de masas funcionó en modo de iones positivos y los datos se adquirieron con un rango de barrido de 700-5.000 m/z.
Los flujos de trabajo intactos y reducidos de Protien Metrics, Inc. (PMi) Byos se utilizaron para procesar los espectros sin procesar intactos y reducidos, respectivamente. El rango de masa de proteína se estableció en 143.000-163.000 Da para la deconvolución de masa intacta, 47.000-53.000 Da para la deconvolución de masa HC y 20.000-27.000 Da para la deconvolución de masa LC. Para la selección automatizada de masa/pico, la diferencia mínima entre los picos de masa se estableció en 15 Da, y el número máximo de picos de masa se limitó a 10. Se introdujo/seleccionó una lista de glicanos esperados para la pestaña de coincidencia de masa, y el límite superior para la tolerancia de coincidencia de masa se estableció en 10 Da.
Los pequeños errores de masa entre las masas calculadas y las masas medidas estaban dentro de los criterios normales de aceptación de errores de masa (≤10 Da para mAbs intactos, ≤5 Da para cadenas pesadas reducidas y cadenas ligeras, respectivamente), lo que sugiere que las masas calculadas eran precisas17.
Para el cálculo de las masas teóricas del ADC, se puede añadir una modificación química con la composición elemental del enlazador/carga útil a subunidades específicas de mAb. Sin embargo, solo se incluirá en la salida el peso molecular de una masa de relación de carga de fármaco. La masa molecular compuesta de anticuerpos con diferentes ratios de carga de fármacos debe ser añadida manualmente por el usuario. Estas capacidades podrían agregarse en una versión posterior de mAbScale o modificarse con el apoyo de la comunidad, dada la naturaleza de código abierto de este proyecto.
Tabla 1: Comparación de las masas calculadas y medidas para varias subunidades de mAb y formas moleculares. En esta tabla se resumen las composiciones químicas, las masas calculadas, las masas medidas y los errores de masa de los anticuerpos monoclonales de ejemplo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Figura complementaria 1: Flujo de trabajo algorítmico detallado para mAbScale. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla complementaria 1: Masas elementales medias calculadas utilizadas en la escala de AbM14,15. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Fichero de codificación suplementario 1: Lista de masas elementales. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Fichero de codificación suplementario 2: Lista de glicanos. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo de codificación suplementario 3: Aplicación empaquetada: ejecutable de mAbScale. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
mAbScale proporciona una interfaz de usuario intuitiva con la flexibilidad de alterar los componentes básicos para los cálculos de masa y elementales. Se espera que los usuarios tengan un conocimiento básico de la molécula objetivo para usar la aplicación, derivar masas correctas e interpretar los resultados. Por ejemplo, la hoja de salida de masa intacta o reducida puede ser abrumadora debido a las numerosas filas de masas intactas o reducidas, ya que la base de datos de glicanos predeterminada contiene 88 glicanos ligados a N que se encuentran comúnmente en la porción Fc de los anticuerpos terapéuticos, y la aplicación calcula todas las masas glicoformes posibles que se incluyen en la base de datos18, Artículo 19. Si bien la mayoría de los anticuerpos monoclonales terapéuticos están diseñados para eliminar la glicosilación en la región Fab, algunos anticuerpos monoclonales podrían retener este sitio de glicosilación, y esto podría aumentar aún más el número total de proteoformas glicosiladas. Se recomienda a los usuarios que conserven una base de datos de glicanos que se centre en las glicoformas más apropiadas para una molécula determinada para reducir la complejidad de la salida y alinear mejor los resultados con las masas medidas para la identificación de picos de masa.
El nivel de complejidad aumenta aún más con los bsAbs debido a la heterogeneidad de las cadenas ligeras y pesadas. Esta aplicación de software genera todas las permutaciones y combinaciones posibles con las secuencias y glicoformas LC y HC proporcionadas para permitir la generación de todos los subproductos potenciales del apareamiento incorrecto o incompleto de las subunidades de anticuerpos, como los semianticuerpos. Esto deja en manos del usuario la tarea de filtrar las proteoformas más apropiadas para su uso. La salida del software divide las salidas glicosiladas y no glicosiladas en hojas de trabajo separadas, lo que facilita la revisión por parte del usuario. Las masas moleculares intactas y reducidas también se segregan, y todas las combinaciones posibles de semianticuerpos para los bsAbs se enumeran en una hoja de trabajo específica para simplificar aún más la absorción de los resultados procesados.
Una limitación de la versión actual del software es que la aplicación calcula las masas de ADC con una sola relación fármaco-anticuerpo a la vez, ya que la estructura química de la carga útil se introduce en los cuadros de texto Heavy Chain Chem Mod y Light Chain Chem Mod . Para cada relación fármaco-anticuerpo (DAR), el usuario debe introducir la composición elemental para volver a calcularla.
La capacidad de calcular masas para proteínas intactas es proporcionada por varias aplicaciones, pero requieren una licencia comercial para ser compradas o son herramientas basadas en la web que requieren que las secuencias de proteínas sean cargadas 16,20,21. Estas aplicaciones ofrecen una flexibilidad muy limitada al usuario para agregar modificaciones químicas personalizadas o incorporar fácilmente enlaces intramoleculares, como disulfuros. Además, el valor de las aplicaciones basadas en la web es limitado cuando se trata de información confidencial y de propiedad, como en el desarrollo farmacéutico u otros entornos controlados, porque la información de la secuencia bioterapéutica no puede cargarse en servidores externos. En consecuencia, los investigadores deben confiar en cálculos manuales o rutinas programáticas que son menos flexibles, difíciles de difundir y podrían dar lugar a inconsistencias.
Hemos desarrollado un marco de código abierto para el cálculo de la masa molecular y la composición elemental con un enfoque en aliviar las restricciones asociadas con las aplicaciones existentes. La aplicación de escritorio independiente con una interfaz gráfica de usuario superará las restricciones asociadas con la carga de información propietaria a servidores externos y permitirá un fácil acceso para los usuarios. Esta herramienta se puede utilizar para las modalidades bioterapéuticas más comunes, incluidos mAbs, bsAbs y ADC. Además, la gama de modificaciones y las masas elementales de origen se pueden personalizar fácilmente para adaptarse a las necesidades del usuario. La naturaleza flexible de este flujo de trabajo permitirá que el desarrollo futuro incluya aplicaciones a otras modalidades terapéuticas, como terapias con proteínas no AcM, vacunas de subunidades múltiples y oligonucleótidos o ARNm. Al hacer que este marco sea de código abierto, esperamos involucrar a la comunidad en un mayor desarrollo y adaptación a otras modalidades, así como en la adición de más funciones, como el cálculo de fragmentos teóricos para la interrogación de datos de MS de arriba hacia abajo.
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Disclosures
Este software se publica bajo la licencia Apache 2.0. Derechos de autor (2022) de GlaxoSmithKline Research & Development Limited. Todos los derechos reservados. Licenciado bajo la Licencia Apache, Versión 2.0 (la "Licencia"); no puede utilizar este archivo excepto en cumplimiento de la Licencia. Puede obtener una copia de la Licencia en http://www.apache.org/licenses/LICENSE-2.0. A menos que lo exija la ley aplicable o se acuerde por escrito, el software distribuido bajo la Licencia se distribuye "tal cual", sin garantías ni condiciones de ningún tipo, ya sean expresas o implícitas. Consulte la Licencia para conocer el idioma específico que rige los permisos y las limitaciones de la Licencia. L.C. es un empleado de GlaxoSmithKline (GSK). T.H. y K.K. desarrollaron este software como empleados de GSK y ahora son asociados de Merck y Moderna, respectivamente.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Robert Schuster por su ayuda con la verificación de datos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
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