Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Svinemodell av biofilminfeksjon og usynlige sår

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/65301
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Indiana Center for Regenerative Medicine & Engineering, Indiana University Health Comprehensive Wound Center, Department of Surgery, Indiana University School of Medicine

Summary

Kroniske sår som er resistente mot antibiotika er en stor trussel mot helsevesenet. Biofilminfeksjoner er gjenstridige og fiendtlige og kan forårsake mangelfull funksjonell sårlukking. Vi rapporterer en klinisk relevant svinemodell av biofilminfiserte kroniske sår i full tykkelse. Denne modellen er kraftig for mekanistiske studier så vel som for testing av intervensjoner.

Abstract

Biofilminfeksjon er en stor bidragsyter til sårkronisitet. Etablering av klinisk relevant eksperimentell sårbiofilminfeksjon krever involvering av vertsimmunsystemet. Iterative endringer i verten og patogenet under dannelsen av slik klinisk relevant biofilm kan bare forekomme in vivo. Svinesårmodellen er anerkjent for sine fordeler som en kraftig preklinisk modell. Det er flere rapporterte tilnærminger for å studere sårbiofilm. In vitro og ex vivo systemer er mangelfulle når det gjelder vertens immunrespons. Kortvarige in vivo studier involverer akutte responser og tillater derfor ikke modning av biofilm, som er kjent for å forekomme klinisk. Den første langsiktige biofilmstudien av svin ble rapportert i 2014. Studien anerkjente at biofilminfiserte sår kan lukke som bestemt av planimetri, men hudbarrierefunksjonen til det berørte stedet kan ikke gjenopprettes. Senere ble denne observasjonen validert klinisk. Begrepet funksjonell sårlukking ble dermed født. Lukkede sår, men mangelfull hudbarrierefunksjon, kan betraktes som usynlige sår. I dette arbeidet søker vi å rapportere de metodiske detaljene som er nødvendige for å reprodusere den langsiktige svinemodellen for biofilminfisert alvorlig brannskade, som er klinisk relevant og har translasjonsverdi. Denne protokollen gir detaljert veiledning om å etablere en 8 ukers sårbiofilminfeksjon ved bruk av P. aeruginosa (PA01). Åtte brannsår i full tykkelse ble skapt symmetrisk på dorsum av hvite griser, som ble inokulert med (PA01) på dag 3 etter forbrenning; Deretter ble ikke-invasive vurderinger av sårhelingen utført på forskjellige tidspunkter ved bruk av laserspeckle imaging (LSI), høyoppløselig ultralyd (HUSD) og transepidermalt vanntap (TEWL). De inokulerte brannsårene ble dekket med en firelags bandasje. Biofilm, som etablert og bekreftet strukturelt av SEM på dag 7 etter inokulering, kompromitterte funksjonell sårlukking. Et slikt uheldig utfall er gjenstand for reversering som svar på passende tiltak.

Introduction

Biofilminfeksjon kompliserer brannsår og kroniske sår og forårsaker kronisitet 1,2,3,4,5. I mikrobiologi studeres biofilmmekanismer primært, med fokus på mikrobene 1,6. Erfaringene fra disse studiene er av avgjørende betydning fra et biologisk vitenskapelig synspunkt, men kan ikke nødvendigvis gjelde for klinisk relevante patogene biofilmer 6,7,8. Klinisk relevante strukturelle biofilmaggregater bør inkludere mikrobielle så vel som vertsfaktorer 8,9,10. Et slikt mikromiljø muliggjør inkludering av vert-mikrobe iterative interaksjoner, som er avgjørende for å utvikle en klinisk relevant biofilm 7,8. I en slik prosess er deltakelsen av immunceller og blodbårne faktorer kritisk11,12. Vertsmikrobeinteraksjonene som ligger til grunn for kliniske patogene biofilmer, som sett i kroniske sår, forekommer over lang tid. Enhver eksperimentell tilnærming som tar sikte på å utvikle en translasjonelt relevant modell for biofilminfeksjon, må derfor ta hensyn til disse faktorene. Så vi søkte å utvikle en klinisk reproduserbar svinekronisk biofilminfeksjonsmodell.

Mens menneskelige studier klart representerer den beste tilnærmingen til å studere helbredende utfall, er de ofte ikke best egnet til å takle de underliggende mekanismene og nye mekanistiske paradigmer. Etiske hensyn begrenser bruken av studiedesign som krever innsamling av flere biopsier fra et kronisk sår på forskjellige tidspunkter. Det er derfor avgjørende å ha en veletablert og reproduserbar dyremodell for å muliggjøre invasive studier for grundig undersøkelse av biofilmskjebne 7,13. Valget av en dyremodell avhenger av flere faktorer, inkludert vitenskapelig/translasjonell relevans og logistikk. Svinesystemet er allment anerkjent for å være den mest translasjonelt verdifulle eksperimentelle modellen for å studere menneskelige hudsår7. Dermed rapporterer dette arbeidet en etablert svinemodell av biofilminfisert brannskade i full tykkelse. Dette arbeidet er basert på flere originale publikasjoner rapportert i litteraturen 2,7,13,14,15,16,17. I denne studien ble et klinisk isolat av multiresistente Pseudomonas aeruginosa (PA01) valgt for å infisere såret. P. aeruginosa er en vanlig årsak til sårinfeksjoner 2,18,19,20. Det er en gramnegativ bakterie som kan være vanskelig å behandle på grunn av dens motstand mot noen antibiotika11,19,21. Ingen av de rapporterte svinebiofilmmodellene så langt involverte 8 ukers langtidsstudier 22,23,24,25,26. Kroniske sår er de som forblir åpne i 4 uker eller mer 14,27,28. Det er ingen andre kroniske sårbiofilmmodeller rapportert i litteraturen. Dette arbeidet tar for seg begrepet funksjonell sårlukking 2,7,13,15,17,29.

Protocol

Alle dyreforsøkene ble utført i samsvar med protokoller godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) #21147. Studien ble utført ved Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University. Vi brukte en kvinnelig hvit gris (70-80 lb) i denne protokollen.

1. Dyr akklimatisering

  1. Ved ankomst av grisene til anlegget, hus dyrene individuelt i samme rom i minst 3 dager for akklimatisering og sosial interaksjon.
  2. Gi grisene et godt balansert kosthold. Bestem mengden matet basert på vekt, og følg anbefalingene fra produsenten.
  3. Sørg for at dyret er fastet i 6-12 timer før prosedyren for å forhindre kvalme, oppkast og aspirasjon av magevæsker under anestesi.

2. Oppsett av operasjonsrom

  1. Forbered anestesimaskinen, og sørg for at den er klar med rebreathing-kretsen.
  2. Ordne rommet for kirurgi, som beskrevet nedenfor (figur 1A).
    1. Dekk prosedyrebordet med en steril drapering, og legg et sirkulerende vannteppe under for å hjelpe til med termoregulering.
    2. Sett opp et bord med induksjonsutstyr og kirurgiske forberedelsesmaterialer. Sett opp et bord med brennerenhetene og kontrollboksene. Sett opp bildeutstyret, og kontroller at det er slått på.

3. Sedasjon av grisen

  1. Bedøv grisen med en intramuskulær injeksjon av TKX (Telazol 4,4 mg/kg; ketamin 2,2 mg/kg; xylazin 2,2 mg/kg) i en dose på 1 ml/50 lb. Grisen skal vedlikeholdes i prosedyrerommet på 1-3 % isofluran gitt via maske.
  2. Administrer (preoperativ) analgetika til grisene i henhold til IACUC-protokollen; noen eksempler er som følger: buprenorfin 0,3 mg / ml, 0,01-0,05 mg / kg IM; karprofen 50 mg/ml, 4 mg/kg i.m. eller SQ; fentanyl transdermal 100 mcg / t plassert på pinna av øret; gabapentin 300 mg kapsler, 3-10 mg/kg oralt.
    MERK: For alle brann- og biopsiprosedyrer vil 1 dose gabapentin bli gitt dagen før operasjonen og 1 dose karprofen vil bli gitt på dagen for prosedyren. For hovedforbrenningsprosedyren vil et fentanylplaster bli plassert, og 1 full dose buprenorfin vil bli gitt under kirurgisk forberedelse.

4. Induksjon av anestesi

  1. Steriliser øret med vekslende 2% klorhexidinskrubb og alkohol minst tre ganger. Sett inn A 22-18 G 1 i intravenøst kateter i den marginale ørevenen, og bekreft blodstrømmen. Skyll kateteret med saltvann, og fest kateteret med kirurgisk tape (figur 1B).
  2. Intuber grisen med en endotrakealslange av passende størrelse (7-9 mm) når muskelrelaksasjon er oppnådd ved innånding av anestesi via masken. Kontroller muskelavslappingen ved tap av kjevetone og en palpebral refleks som observeres.
    1. Åpne røret, og test mansjettlekkasjen ved hjelp av en sprøyte med luft. Sett inn røret ved hjelp av et laryngoskop30.
    2. Blås opp mansjetten, og fest røret når riktig plassering er bekreftet. Koble grisen til rebreathing-kretsen.
      MERK: Røret er bundet på plass over snuten, og rullegasbind brukes til å feste den. Auskultasjon av brystet utføres med et stetoskop for å bekrefte riktig plassering av røret.
      MERK: Under anestesi tilføres luft hvert 5-10 minutt ved å lukke pop-off-ventilen og trykke ned pusteposen til trykkmanometeret når 20 mm / Hg for å forhindre posisjonell atelektase.
  3. Overvåk dyret og dybden av anestesi.
    1. Koble grisen til en multiparametermonitor. Monitoren vil kontinuerlig lese oksygenmetningen (SpO 2), pulsfrekvens, endetidalt karbondioksid (EtCO2), respirasjonsfrekvens og temperatur. Registrer vitalitetene hvert 10. minutt gjennom hele prosedyren.
    2. Vurder dybden av anestesi ved å teste smerterefleksene med en bakbentåklemme før du begynner såret.
      MERK: Når det er nødvendig, juster bedøvelsesfordamperen for å administrere ytterligere anestesi, eller vent noen minutter. Sjekk smertereflekser og palpebrale reflekser regelmessig gjennom hele operasjonen.

5. Dyrs forberedelse for brennsår

  1. Koble grisen fra anestesimaskinen, og flytt den til prosedyrebordet. Plasser grisen i akterliggende stilling, og sørg for å sikre alle tilkoblede linjer og rør (figur 1C).
  2. Koble grisen til anestesimaskinen igjen, og holdØ2 på 0,8-1,5 l/min og isofluran på 1%-3% til prosedyrens slutt.
  3. Gi intravenøs væske (LRS) til grisen med en drypphastighet på 8-10 ml / kg / t. Overvåk anestesien som i trinn 4.3.

6. Antiseptisk forberedelse og merking av hudbrennstedet

  1. Forbered sårområdet ved å barbere og påføre hårfjerningskremen, som beskrevet nedenfor (figur 2).
    1. Barber grisedorsum i et område på ca. 25 cm bredde fra virvelsøylen helt til armhulen på begge sider ved hjelp av elektriske klippemaskiner.
    2. Påfør hårfjerningskremen på det klippede området, og la den sitte i 3-7 min. Fjern kremen sammen med håret ved hjelp av rene absorberende håndklær.
  2. Forberedelse av brennstedet
    1. Skrubb området som skal såres med vekslende 2% klorhexidinskrubb og 70% isopropylalkohol minst tre ganger i ca. 5 minutter. Forsikre deg om at skrubben påføres i et bullseye-mønster (starter i midten og beveger seg utover i en spiral) av personell som bruker sterile hansker.
    2. Merk sårstedene med en steril brannskademal og en kirurgisk hudmarkør (figur 2B). Merk seks til åtte sår (2 i x 2 tommer) symmetrisk på dorsum.
    3. Dekk områdene rundt de merkede stedene med en steril gardin for å redusere forurensning (figur 2C).

7. Brenn sår prosedyre

  1. Bruk en brenneanordning, for eksempel en egenprodusert tilpasset brenner som består av en blokk i rustfritt stål på 2 x 2 tommer (vekt: 352 g) koblet til en metallpenn, en elektronisk mikrostat og en elektronisk vekt (totalvekt: 1,714 g; Figur 3).
    1. Sett brenneren på ønsket temperatur. Juster måltemperaturen for sår i full tykkelse ved 150 °C (figur 3A). For å gjøre dette, juster settpunktet (SP) på kontrollenheten til 150 °C. Sett det lave settpunktet til 145 °C og det høye settpunktet til 155 °C (figur 1D).
  2. Lag et brennsår i full tykkelse på 2 x 2 tommer ved å bruke oppvarmede rustfrie stålblokker koblet til brenneenheten og plassere dem på huden i 60 s (figur 3B, C). Under påføring av brenningen, bruk den elektroniske skalaen for å sikre at jevnt trykk påføres av brenneren.

8. Vurdering av brannsår og avbildning

  1. Digital fotografering
    1. Avbilde sårene med et DSLR-kamera og en elektrofokus, kort bakfokus (EFS), 17-55 mm ultralyd vidvinkelobjektiv og lommelykt.
    2. Ta et digitalt bilde av hele grisen tilbake, inkludert en plakat med grisidentifikasjon, tidspunkt og dato. Ta deretter bilder for hvert sår separat som viser en plakat med grise-ID, sår-ID og tidspunkt, og en linjal.
    3. Beregn sårområdet som prosentandel av opprinnelig sårstørrelse ved hvert tidspunkt for innsamling frem til dag 56.
      MERK: I dette arbeidet ble sårområdet beregnet ved hvert tidspunkt (d0, d7, d14, d28 og d56) som en prosentandel av det opprinnelige sårområdet på d0.
  2. Laser speckle imaging (LSI)
    1. For laser speckle imaging, bruk en blodperfusjonsavbildning basert på laser speckle contrast analysis (LASCA) teknologi for å vurdere såret mikrovaskulær perfusjon i sanntid.
    2. Ta bildene av alle sårene i ett enkelt opptak. Juster den målte verdien av arbeidsavstanden fra laserkameraet til såret slik at det er konsistent for avbildning av hvert sår (figur 4A).
    3. Ta opp perfusjonen med en serie bilder tatt over et spenn på 10-15 s. Etter at et sår er avbildet, stopper opptaket automatisk, og opptaket gjenopptas når kameraet er justert for det påfølgende såret. Hver gang opptaket pauser, legges det til en markør for å identifisere såret.
  3. Transepidermalt vanntap (TEWL)
    1. Mål TEWL for hvert sår ved hjelp av en standardenhet, en TEWL-sonde og programvare (figur 4B). For hvert sår, plasser et rent sondedeksel over sondespissen, som vil være i kontakt med sårvevet.
    2. Plasser sonden forsiktig og jevnt på huden, og start avlesningen ved å trykke på Start-knappen på apparatet.
    3. Mål hvert sår fem ganger, først i midten og deretter på hvert hjørne. Deretter eksporterer du alle avlesningene til et regneark (figur 4B).
  4. Harmonisk ultralyd (HUSD)
    1. Utfør HUSD-kartlegging ved å skanne såret med ultralydsonde (US) fra midtlinjen (virvelsøylen) fra normal hud mot sidesiden av grisen der det er normal hud igjen. Følg dette skannemønsteret for hvert sår i både B-modus og vevselastografimodus ved hjelp av ultralydmaskinen (figur 4C).
      1. For B-modusskanning, bruk steril ultralydgel på sårområdet, og påfør noen på ML-615 høyoppløselig sonde. Kommenter hvert opptak med såridentifikasjonsetiketten. Start opptaket, og beveg sonden sakte fra midtlinjen nedover såret til normal hud på den andre siden er nådd.
        MERK: Etter at skanningen er fullført, lagres opptaket og eksporteres fra maskinen for analyse.
      2. For elastografi, bytt ultralydmaskinen til elasto-modus ved å trykke på Elasto-knappen . Skann såret på nytt på samme måte som ved skanning i B-modus, og sørg for at sondens jevne trykk opprettholdes slik at fargeindikatoren for elastografi (grønne søyler) forblir synlig gjennom hele opptaket.
        MERK: Passende trykk kan bestemmes av skalalinjen på opptaket, som vises grønt når riktig kontakt utføres (figur 4D).
      3. Endre merknaden etter at hvert sår er avbildet i både B-modus og elasto-modus (to opptak per sår). Endre kommentaren i programvaren for å inkludere informasjonen for neste sår, og gjenta prosessen for de påfølgende sårene.

9. Bandasjering og påkledning

  1. Dekk brannsårene individuelt med gjennomsiktige filmbandasjer eller testbandasjen (figur 5A, B). Plasser en større gjennomsiktig filmbandasje over hele sårområdet (figur 5C).
  2. Påfør et andre lag med rullegasbind løst rundt hele stammen av grisen for å absorbere væskeekssudat som kommer fra sårene. Rull grisen frem og tilbake fra siden til litt på ryggen for å vikle bandasjematerialet rundt grisen.
  3. Dekk gasbindet løst med et lag fleksibel elastisk bandasje (figur 5D). Sørg for at bandasjen ikke er for stram, da påføring av den for tett kan begrense pusten og legge press på magen, noe som kan føre til rektal prolaps eller forskjellige komplikasjoner.
    MERK: Den elastiske bandasjen er elastisk og kan lett strammes for mye under påføring. Å trekke den av rullen og la den ligge over kanten av forrige innpakning kan bidra til å forhindre overstramming.
  4. Dekk den elastiske bandasjen med et siste lag på 4 i elastisk tape (figur 4E). Igjen, sørg for at applikasjonen ikke er for stram, men sørg for at bandasjen er festet i øvre og nedre kant for å forhindre at den glir ned når grisen beveger seg rundt etter prosedyren.

10. Dyrs utvinning og postoperativ omsorg

  1. Bedring
    1. Avbryt bedøvelsesgassen når såret er fullført, bildebehandling og bandasjering. La grisen forbli på oksygen i minst 5 minutter.
    2. Flytt grisen, etter retur til primærinnhegningen, fra transport-/løftebordet til en skumgjenvinningsmatte i buret. Løft den automatiske vanneren, og fjern j-materen for å forhindre skade på grisen under gjenoppretting.
    3. Dekk grisen med tepper (inkludert et varmt luftteppe) hvis hypotermi er tilstede. Overvåk og registrer vitalitetene, inkludert temperatur, puls, respirasjonsfrekvens og SpO2 hvert 10.-15. minutt.
    4. Overvåk grisen kontinuerlig til den er i stand til å opprettholde sternal recumbency uavhengig. Når grisen er fullstendig gjenopprettet, senk brystvorten vanneren, og så kan grisen også mates.
  2. Smertevurdering
    1. Utfør en postoperativ smertevurdering ved hjelp av en modifisert Glasgow smerte scoring form. Sørg for at smertevurderingene fullføres av enten laboratorie- eller LARC-ansatte minst hver 12. time de første 3-4 dagene postoperativt. Frekvensen av smerteskåring bestemmes av den behandlende veterinæren. Hvis dyret scorer over 5, administrer redningsanalgesi (buprenorfin eller hydromorfon).
    2. Gi analgesi ved å administrere en dose buprenorfin 0,01-0,05 mg / kg i.m. før prosedyren, med en andre dose gitt 8-12 timer senere.
    3. Plasser et fentanylplaster (100 mcg/t) på ørepinnaen før brannskaden.
    4. Injiser karprofen 4 mg / kg IM eller SQ pre-prosedyre, og deretter en gang daglig IM, SQ eller PO i 2 dager eller som anvist av LARC veterinær.
    5. Gi gabapentin 3-10 mg / kg oralt, med en dose gitt dagen før prosedyren, morgenen av prosedyren, kvelden etter prosedyren, og deretter hver 12 timer i 3-5 dager.
  3. Diett
    1. Sørg for at grisene blir gjenvunnet, og la deretter fri tilgang til vann og mat i henhold til deres vektbaserte rasjon to ganger daglig.
    2. Gi matberikelse (frisk frukt og grønnsaker, frossen frukt, marshmallows, yoghurt, pudding, etc.), og bruk disse til å lokke til å spise hvis en redusert appetitt blir observert.
  4. Dressing endring
    1. Bytt bandasjer minst en gang i uken eller oftere hvis bandasjene blir skitne eller for å imøtekomme behandlingsstrategier.
    2. Bytt bandasjer etter avbildning mens du fortsatt er i narkose, eller bedøv grisen med bare TKX for bandasjeskift.
    3. For å erstatte bandasjen, start med å fjerne forsiktig den skitne bandasjen ved hjelp av Lister bandasje saks eller traumesaks, vær oppmerksom på å ikke la utsiden av bandasjen komme i kontakt med sårene.
    4. Rengjør området rundt sårene om nødvendig med 0,9 % NaCl på rent gasbind, og tørk området forsiktig. Følg fremgangsmåten for bandasjering som er beskrevet i avsnitt 9.
      MERK: Hvis eksperimentelle bandasjer påføres, kan disse påføres før sårene dekkes med den gjennomsiktige filmbandasjen.
  5. Bildefrekvens
    1. Få bildebehandling (digitale bilder, LSI, TEWL og HUSD) på ulike tidspunkter gjennom hele studien. Samle bildedata på dag −3 (brannskade), dag 0 (inokulering) og dag 7, dag 14, dag 28, dag 35 og dag 56 etter inokulering.

11. Fremstilling og inokulering av biofilm

  1. Inokulum forberedelse
    1. Forbered en startplate fra et glyserolfryselager av Pseudomonas aeruginosa (PA01) for en ren kultur av bakterien. Dyrk en P. aeruginosa-kultur i lavsalt Luria-Bertani agar (LBA), og rug ved 37 °C over natten.
    2. Inokuler 5 ml Luria-Bertani buljong (LBB) med en enkelt P. aeruginosa-koloni neste dag, og inkuber over natten ved 37 °C med risting ved 200 o / min.
    3. For å oppnå logfaseceller, inokuler 200 μL av nattenkulturen i 5 ml LBB, og inkuber i shakeren ved 200 o / min ved 37 ° C i 2,5 timer.
    4. Mål den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) ved hjelp av et spektrofotometer. Forbered serielle fortynninger opp til 1 x 10-9 ved bruk av 100 μL fra kulturen i 900 mikrol steril LBB.
      MERK: Vi startet med ufortynnede prøver og endte med 1 x 10 7 CFU / ml.Vi oppnådde tellbare kolonier i 1 x 107 fortynning, så vi betraktet denne fortynningen som sluttfortynning.
    5. Spre 100 mikrol av hver fortynning på LBA, og inkuber over natten ved 37 °C. I henhold til standard mikrobiologiske protokoller, bruk fortynninger som viser tellbare kolonier (30-300) for kolonitellingen, og oppnå kolonidannende enheter (CFU).
  2. Inokulering av såret
    1. Inokuler 200 μL fra nattens kultur til 5 ml LB-buljong, og inkuber i shakeren ved 37 °C i 2,5 timer.
    2. Mål den optiske tettheten til dagkulturen ved 600 nm (OD600). For PA01-inokulering, bruk 3 x 10 8 CFU / ml (250 μL av 1 x 108 CFU / ml PA01 inokuleres per sår). Transporter inokulumet til dyreavdelingen i en biohazard-beholder.
    3. Spre inokulumet over overflaten av de eksponerte sårene på dag 3 etter forbrenning med pipette, og fordel jevnt med en engangsspreder (figur 6). Hold sårene åpne i ca. 15 min før bandasjering.
      MERK: Alle kirurgiske prosedyrer, inokulasjon, vevsbiopsier, avbildning og bandasjering gjøres i narkose som i avsnitt 3 og 4.
  3. Bekrefter etablering av infeksjon
    MERK: For å bekrefte at sårene har blitt vellykket infisert etter inokuleringen, brukes flere tilnærminger, og sårprøver sammenlignes med prøver samlet fra normal hud; Nedenfor er noen eksempler.
    1. For patologibasert analyse av prøver samlet på forskjellige tidspunkter, bruk antall kolonidannende enheter for å estimere en infeksjon (CFU; Figur 7E, F).
      1. Samle 6 mm sårvev ved stansebiopsi. Merk og vei tomme 5 ml rundbunnsrør. Overfør prøvene til rørene, og vei rørene med prøvene.
      2. Terning vevet med en skalpell på en steril overflate. Utfør alle trinnene i en BSL2-hette.
        MERK: For å sikre at vevet lett homogeniseres, bør størrelsen være svært liten (men ikke mindre enn 0,5 mm)
      3. Sett prøven i røret, og tilsett 1 ml PBS. Bland og slip vevet ved hjelp av en hardvevsslipingssonde.
      4. Serielt fortynnet (ufortynnet til 1 x 10-5) homogenatet, og plate 50 μL av hver fortynning i selektive (Pseudomonas Isolation Agar, PIA) og ikke-selektive (LBA) medier.
      5. Inkuber alle fortynninger under aerobe forhold ved 37 °C i 18–24 timer. Se for deg platene med riktige lysforhold.
      6. Velg plater med 30-300 kolonier, hvis ingen av platene har nådd den konsentrasjonen, bruk den ufortynnede platen. Bruk ImageJ til å telle kolonitallene, og beregn CFU per plate ved å multiplisere gjennomsnittsverdien med den endelige fortynningsfaktoren.
    2. Hent bildene fra prøver samlet inn fra dag 7 etter inokulering og andre tidspunkter ved hjelp av skanning elektronmikroskopi (SEM) for å bekrefte tilstedeværelsen av bakterielle biofilmer (figur 7G).
      MERK: Dag 7 etter inokulering ble valgt fordi det er dagen for etablering av biofilminfeksjon og begynnelsen av brennende eschar mykning, noe som tillater penetrasjon av de amerikanske bølgene og dermed visualisering av dypere vev. I figur 4, sjekk dag 3 US burn wound image, som viser den tykke læraktige eschar som hindrer de amerikanske bølgene i å passere gjennom til dypere vev.
    3. Flekk seksjonene av sårbiopsiene med spesifikke antistoffer mot P. aeruginosa for å bekrefte tilstedeværelsen av de spesifikke bakteriene, som vist i en tidligere publikasjon13 (figur 7H).
    4. Utfør neste generasjons sekvensering (NGS), som publisert i Sinha et al.31. Kvantikater bakteriene 16srRNA fra de infiserte sårene og de normale uinfiserte hudprøvene samlet på forskjellige tidspunkter fra dag 7 etter inokulering til slutten av studien.

12. Biopsi samling

  1. Samle vevsbiopsiene for analyse etter avbildning på dag 7, dag 14, dag 28 og dag 56 etter inokulering. Samle biopsier fra hvert sår bare en gang for å minimere forstyrrelsen av helingsprosessen.
    MERK: Alle kirurgiske prosedyrer, inokulasjon, vevsbiopsier, avbildning og bandasjering gjøres i narkose som i avsnitt 3 og 4.
    1. Infiltrer området rundt såret med 0,5% bupivakain. Klipp en 3-4 mm bred stripe fra den ene kanten av såret til den andre, og hold små marginer av normal hud på begge sider, ved hjelp av en engangs skalpell med et blad i størrelse 10. Plasser stripen i et merket konisk rør fylt med 4% bufret formalin for fiksering.
      MERK: For tidlig avbildning og biopsiprosedyrer, vil en full dose buprenorfin bli gitt under kirurgisk forberedelse. Ved sen biopsiprosedyre vil det bli gitt en halv dose buprenorfin under kirurgisk forberedelse. Etter alle brann- og biopsiprosedyrer vil gabapentin bli gitt BID i opptil 7 dager som anbefalt av den behandlende veterinæren. Carprofen vil bli gitt i flere dager etter operasjonen eller som anbefalt av behandlende veterinær.
    2. Klipp en 6 mm stansebiopsi fra såret (enten fra sårsengen eller sårkanten). Samle fra sårkanten, inkludert en del av normal hud og sårbunnen, for ulike typer analyser.
    3. Fjern prøven ved hjelp av sterilisert tang og dissekere saks. Plasser biopsiprøven i riktig rør eller kassett for behandling og analyse.
    4. For CFU, SEM, RNA og FPPE, bevar prøvene i rør med en passende buffer. For eksempel kan prøver plasseres i OCT i kassetter for laserfangstmikroskopi (LCM) og immunhistokjemi (IHC).
    5. Oppnå hemostase etter at prøvene er samlet ved forsiktig å trykke på såret med en steril gasbind. Dekk såret med bandasje som ikke klebes, og bandasje som i avsnitt 9.

13. Eutanasi og vevsinnsamling

  1. Sedere grisen på dagen for eutanasi med TKX, og bedøve med isofluran . Plasser et intravenøst kateter i den marginale ørevenen ved å følge trinnene beskrevet i avsnitt 3. Intuber grisen ved å følge trinnene i avsnitt 4.
  2. Fjern bandasjen når grisen er bedøvet, og rengjør området rundt sårene.
  3. Komplett digital fotografering, LSI, TEWL og HUSD bildebehandling. Samle prøvene fra sårene og normal hud ved å følge trinnene som er beskrevet i avsnitt 12.
  4. Når alle nødvendige prøver er samlet, avlives grisen humant mens den fortsatt er under anestesi via en intravenøs injeksjon av kommersielt tilgjengelig eutanasiløsning (natriumpentobarbital). Bruk et stetoskop for å auskultere for å bekrefte opphør av hjerteslag og spontan respirasjon.
  5. Utfør en sekundær metode for eutanasi, som kreves av SOM IACUC, ved å bruke en skalpell for å indusere pneumothorax. Overfør grisekroppen i en tønne, og transporter til fryseren for å bli hentet for forbrenning.

Representative Results

Et standardisert brannskadeapparat ble brukt til å lage brannsår i full tykkelse ved 150 °C i 1 min, noe som resulterte i en homogen dyp forbrenning med jevn erytemmargin og inflammasjon (figur 3 og figur 7). Hver gris fikk åtte brannsår i full tykkelse på ryggen, som vist i figur 3C.

Den ikke-invasive sanntidsvurderingen av brannsårene med B-modus høyoppløselig ultralyd for å bekrefte sårdybde og progrediering av sårtilheling over tid, viste destruksjon av alle hudlag opp til underhudsfettet (figur 4). Laser speckle imaging (LSI) ble brukt for videre karakterisering av sårperfusjonen (figur 4A).

Brannsårene viste tykk pyogen hinne på såroverflaten dag 7 etter inokulering, noe som bekreftet infeksjonen og etablering av brannsårbiofilm (figur 7A). Digital planimetri viste økt sårområde ved dag 3 etter inokulasjon med PAO1 på grunn av inflammatorisk respons på sårsted og marginer (figur 7A,B). Selv om sårområdet begynte å krympe etter inokulering dag 14, ble det observert ufullstendig tilheling til ca. 25 % av den opprinnelige sårstørrelsen på dag 56, noe som indikerer sårets kronisitet (figur 7B). Sårkronisitet og svekket sårtilheling ble ytterligere bekreftet av TEWL, som viste høyt transepidermalt vanntap. TEWL-resultatene reflekterte tap av hudbarrierefunksjon sammenlignet med normal hud ved alle målte tidspunkter, og indikerte dermed funksjonsnedsettelse av brannsårhelingen (figur 7B). Dette ble også bekreftet av suppresjon av de stramme koblingsproteinene ZO-1 og 213 og svekkelsen av restaureringen av hudbarrierefunksjonen, noe som gjenspeiles i de høye TEWL-verdiene sett på dag 35 (midt) og dag 56 (sent) til tross for synssårlukking (figur 7I).

Brenndybden ble videre validert ved H&E-farging, som viste forvrengning og nekrose av alle histologiske hudlag, som vist i figur 7C. Den etablerte biofilmen av PA01 ble videre validert ved dag 7 etter inokulering av CFU (figur 7E,F), SEM-avbildning (figur 7G) og immunfluorescensfarging (figur 7H).

Figure 1
Figur 1: Oppsett for prosedyren . (A) Kirurgisk bordforberedelse. (B) Ørevenekanylering for IV-væsker og legemiddeladministrasjon. (C) Termisk teppebelegg for å beskytte grisen mot hypotermi under prosedyren. (D) Brenner og timeroppsett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Sterilisering og merking på operasjonsstedet . (A) Hårklipping og sterilisering. (B) Merking av brannskadestedet ved hjelp av en steril standardmal med åtte sår (hvert sår er 2 x 2 tommer). (C) Endelig merking ved bruk av en steril hudmarkør. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Brennsårinduksjon. (A,B) Standardisert brenner med trykkmåler og automatisert styreenhet (2 x 2 tommer) påført det forhåndsmerkede sårstedet. (C) Hele ryggen viser de åtte brannsårene i full tykkelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Ikke-invasiv avbildning og vurdering av brannsår. (A) Laser speckle imaging (LSI) med riktig orientering av laserstråleindikatoren til midten av såret er vist i venstre bilde; bildet til høyre viser LSI-enheten og sanntids hudvaskulær perfusjonskart. (B) Transepidermalt vanntap (TEWL) sondepåføring på sårstedet på fem forskjellige steder (fire sårhjørner og midten demonstrert i nedre høyre hjørnebilde) vises på bildet til venstre; bildet til høyre er en representativ sanntidsfanget skjerm av TEWL-målingen. (C) Harmonisk ultralydskanning av brannsåret ved hjelp av en høyoppløselig 16 MHz ultralydsonde er vist på venstre side; Bildet til høyre viser ultralydsenheten og skjermopptaket i sanntid. (D) Strukturelle (B-modus bilder, gråtoner ultralyd) og biomekaniske (elastografi, farge ultralyd) bilder av brannsåret på inokulasjonsdagen og dag 7 etter inokulering. Sårdybden indikeres av den gule stiplede linjen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Sårbandasje og bandasjering . (A) Påføring av gjennomsiktig filmbandasje for hvert sår separat. (B) Alle dorsale inokulerte brannsår er dekket med det første laget av bandasje. (C) En større gjennomsiktig filmbandasje plasseres over hele sårområdet. (D) Påføring av det andre laget av gasbind og et løst lag av elastisk elastisk bandasje rundt hele stammen av grisen for å absorbere væskeekssudat som kommer fra sårene. (E) Tildekking av hele sårområdet med et siste lag på 4 i klebende bandasje. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Bakteriell inokulasjon . (A) Oppsett for inokulering av Pseudomonas aeruginosa (PA01) ved dag 3 etter forbrenning. (B) Topikal påføring av inokulum med en pipette ved bruk av et volum på 500 mikrol for hvert sår. (C) Inokulumet spres jevnt over såroverflaten ved hjelp av en steril engangsspreder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Sårhelingsprogresjon og biofilmbekreftelse . (A) Representative bilder av sårlukking over tidslinjen for studien. Skalastang = 1 cm. (B) Kvantifisering av sårområdet og TEWL-målinger over tidslinjen for studien (n = 6). Dataene er representert som gjennomsnittlige ± SD. N.S. refererer til TEWL-verdien av normal hud. (C) Skjematisk diagram som viser forskjellige sårbiopsisteder. D. H&E-farging med tilhørende Massons trikrome farging som viser forvrengning og nekrose av alle hudlagene på dag 3 etter forbrenning og dag 7 etter inokulering. Skala bar = 500 μm. (E) Representative digitale bilder av ikke-selektiv agar (Luria-Bertani agar) og selektiv agar (Pseudomonas Isolation Agar) med bakteriekolonier dyrket fra svinesårevev. Det selektive mediet muliggjør kun nøyaktig telling av PA01-koloniene. (F) En prøve kolonidannende enhet (CFU) beregning fra kolonitellingene tatt fra behandlet dag 7 etter inokulasjon sårbiopsier er vist. (G) Representative scanning elektronmikroskopi (SEM) bilder av de inokulerte brannsårene på dag 7 etter inokulasjon som viser den etablerte PA01 biofilmen, med et zoomet inn bilde på høyre side. Skala bar = 1 μm. De røde pilspissene peker på ekstracellulære polymere stoffer (EPS). (H) P. aeruginosa på brannsårene ble visualisert ved bruk av anti-Pseudomonas (grønt) antistoff; immunfluorescensbildene fra dag 7 etter inokulasjonssårbiopsier viser tung kolonisering av sårvevet av P. aeruginosa. Skalalinje = 100 μm. (I) Representativ mosaikk (skalalinje = 200 μm) og tilsvarende innzoomede (skalalinje = 50 μm) bilder av ZO-1- og ZO-2-fargede seksjoner på dag 35 og dag 56 etter inokulering, som viser redusert ekspresjon av proteinene etter den induserte infeksjonen. De OCT-innebygde frosne seksjonene (10 μm) ble farget med anti-ZO-1 (grønn) eller anti-ZO-2 (grønn). Seksjonene ble motfarget med DAPI. Søylediagrammene presenterer kvantifiseringen av signalintensiteten ZO-1 og ZO-2. Dataene er presentert som gjennomsnitt ± SD (n = 3); * p < 0,05 sammenlignet med spontane. Mann-Whitney eller Kruskal-Wallis enveisanalyse av varianstester ble utført for å teste signifikansen. Figur 7H, I er modifisert fra Roy et al.13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Denne rapporten gir en detaljert protokoll for å sette opp en svinemodell av kronisk sårbiofilminfeksjon for eksperimentelle studier. Flere svinebiofilmmodeller har tidligere blitt rapportert 22,23,24,25,26, men ingen av dem er svinemodeller som involverer 8 ukers langtidsstudier. Kroniske sår er de som forblir åpne i 4 uker eller mer 14,27,28. Det er ingen andre kroniske sårbiofilmmodeller rapportert i litteraturen. Dette arbeidet tar for seg begrepet funksjonell sårlukking 2,7,13,15,17,29. En studie utført i 2014 var den første som rapporterte at biofilminfiserte sår kan lukke seg uten at barrierefunksjon7 gjenopprettes. Måling av hudbarrierefunksjonen i helbredelsessåret ved bruk av transepidermalt vanntap (TEWL) er rapportert i dette arbeidet.

Anatomisk og fysiologisk er svineskinnet, sammenlignet med huden til andre små dyr, en nærmere match med den menneskelige huden32,33,34. Både gris og menneskelig hud har en tykk epidermis 33, og det dermal-epidermale tykkelsesforholdet varierer fra 10: 1 til13: 1 hos gris, som kan sammenlignes med mennesker34,35. Histologisk og biomekanisk viser huden til mennesker og griser likheter i reteryggene, subdermalt fett, dermalt kollagen, hårfordeling, adnexale strukturer og blodkarstørrelse og distribusjon36,37,38. Funksjonelt deler både griser og mennesker likheter i sammensetningen av lipid-, protein- og keratinkomponentene i epidermale laget, samt sammenlignbare immunohistologiske mønstre37,38. Svinens immunsystem, sammenlignet med andre små dyr, deler høyere likheter med det menneskelige immunsystemet, noe som betyr at griser er en passende modell for studier på vertsinteraksjonene som er integrert i kompleksiteten til den patologiske biofilmen i sårinfeksjoner39. Den kritiske vurderingen av fordeler og ulemper ved ulike dyremodeller har ført til enighet om at griser representerer en effektiv modell for å studere sårheling34,38. I tillegg utvikler husdyr spontant kroniske bakterielle infeksjoner, som observert hos mennesker10. Brannskadeanordningen som brukes til å lage sårene er en avansert og automatisert brannskadeanordning som leverer varmeenergi basert på en temperatur avlest fra det målrettede hudstedet22,40. En slik tilnærming forbedrer strengheten og reproduserbarheten av brennskaden. Bruk av humane kliniske isolater av bakterier for å infisere grisesårene tilfører verdi som en preklinisk modell.

Brannskader er komplekse og forårsaker flere systemiske forstyrrelser20,41. Det er derfor viktig å gjenopplive grisen med tilstrekkelige væsker og forhindre hypotermi under anestesi og gjenoppretting. Flere faktorer kan forstyrre sårheling, inkludert ernæring etter brenning, væsker og smerte42. Tett oppfølging av ernærings- og smertevurderingene er derfor av betydning. Post-burn smerte kan være alvorlig og påvirke dyrets oppførsel og kosthold. Intervensjoner for å løse atferdsmessige bekymringer må aktivt vurderes. Regelmessig og kontinuerlig smerteskåring og ledelse er avgjørende. Et grundig smertevurderingsark med en svært detaljert smertebehandlingsplan er inkludert i denne protokollen. For å unngå krysskontaminering mellom sårene, bør det tas særlig hensyn til å påføre det første laget av bandasjen på hvert sår separat. Kritisk forsiktighet bør utvises ved håndtering av alle biofarlige materialer og når du utfører grundig desinfeksjon av utstyr, verktøy og hele operasjonsrommet. Påføringen av flere lag av bandasjen forhindrer grisen i å utsette sårene under arbeidet med å gni eller skrape kløen tilbake.

Grisen i den nåværende modellen ble ikke kompromittert av underliggende metabolske forstyrrelser (f.eks. diabetes), og derfor var effekten som ble studert rent virkningen av bakteriell biofilminfeksjon på sårheling. Modellen egner seg imidlertid til induksjon av diabetes (for eksempel ved bruk av streptozotocin) og kan brukes til å studere biofilminfeksjon i forhold til en underliggende metabolsk lidelse. Den andre begrensningen i modellen er den kontrollerte infeksjonsinnstillingen ved hjelp av P. aeruginosa, en bakterie. Det forventes at grisens normale hudmikroflora også kan vokse i såret og kan påvirke tilhelingen. Videre analyse ved hjelp av NGS eller andre avanserte teknikker for å avgrense det mikrobielle innholdet i såret er nødvendig. Den nåværende modellen kan også brukes på blandede infeksjoner med forskjellige mikrobielle arter (f.eks. Sopp, viral, etc.). Dette er et viktig element, da klinisk relevante sår sannsynligvis vil være befolket av blandede mikrober, noe som kan påvirke sårheling forskjellig.

Det er mange potensielle fordeler i denne modellen, inkludert likheten med kompleksiteten og langsiktige følgetilstander av humane kroniske sår, den automatiserte og reproduserbare brenneprosessen og bruken av klinisk isolerte bakteriearter. Bruken av flere ikke-invasive bildebehandlingsmodaliteter representerer en kraftig tilnærming for å samle nyttige fysiologiske data som karakteriserer såret. Til slutt er vurderingen av funksjonell sårheling via restaurering av hudbarrierefunksjon basert på TEWL kritisk. Avslutningsvis er en robust, enkel, detaljert og brukervennlig protokoll for å utvikle en biofilminfisert alvorlig brannskade ved hjelp av et svinemodellsystem vist i dette arbeidet.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University, for deres støtte og veterinærpleie av dyrene under studien. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health tilskudd NR015676, NR013898 og DK125835 og forsvarsdepartementets tilskudd W81XWH-11-2-0142. I tillegg dro dette arbeidet nytte av følgende National Institutes of Health-priser: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 og NS42617.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sedation
Ketamine Zoetis 10004027 100mg/ml
Telazol Zoetis 106-111 100mg/ml
Xylazine Pivetal 04606-6750-02 100mg/ml Anased
3ml syringe w/ 20g needle Covidien-Monoject 8881513033
Winged infusion set 21g Jorgensen Labs J0454B
Anesthetic
Isoflurane Pivetal 21295097
Surgery
Hair clippers Wahl 8787-450A
Nair Church and Dwight Co. Inc 70506572
Chlorhexidine Solution First Priority Inc. 179925722
70% Isopropyl Alcohol Uline S-17474
0.9% Saline Solution ICU Medical  RL-7282
Non-woven gauze Pivetal 21295051
Paper tape McKesson 455531
2" Elastic tape Pivetal 21300869
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Spay hook Jorgensen Labs J0112A
Sterile lube McKesson 16-8942
Laryngoscope Jorgensen Labs J0449S
Roll gauze Pivetal 21295032
Endotracheal tube (7-9mm) Covidien 86112 Shiley Hi-Lo Oral Nasal Tracheal Tube Cuffed
15gtt/ml IV administration set ICU Medical 12672-28
LRS 1000ml bag ICU Medical 07953-09
Three Quarter Drape Sheet McKesson 16-i80-12110G
Analgesia
Buprenorphine RX Generics 42023-0179-05 0.3mg/ml
Fentanyl Transdermal
Carprofen 21294548 Pivetal 50mg/ml Levafen
Bandaging
Transparent film dressing 26x30 Genadyne Biotechnologies A4-S00F5
Film dressing 4 x 4-3/4 Frame Style McKesson 886408
Vetrap 3M 1410BK BULK
Elastic tape 4" Pivetal 21300931
Kerlix Roll Gauze Cardinal Health 3324
Imaging
Canon EOS 80D Canon 1263C004
Speedlight 600EX II-RT Canon 1177C002
EFS 17-55mm Ultrasonic Canon 1242B002
GE Logiq E9 GE 5197104-2
ML6-15 Probe GE 5199103
PeriCamPSI Perimed 90-00070
DermaLab Cortex Technologies Inc 4608D78
Biopsy/Tissue Collection
6mm punch biopsy Integra Lifesciences 33-36
bupivicaine 0.5% Auromedics Pharma 55150017030
Size 10 Disposable Scalpel McKesson 16-63810
Dissection scissors Pivetal 21294806
Rat tooth thumb tissue forceps Aesculap BD512R
Non-adherent Dressing Covidien 2132 Telfa
50ml Conical tube Falcon 352070
Eppendorf/microcentrifuge tube Fisherbrand 02-681-320
OCT Cassette
Non Woven Gauze 4x4 Pivetal 21295051
Inoculum
Low salt LB agar Invitrogen 22700-025
Low salt LB broth Fisher scientific BP1427-500
Petri plate Falcon REF-351029
Polyprophyline round bottom tubes (14 ml) Falcon REF-352059
Pseudomonas Agar Base (Dehydrated) Thermo Scientific OXCM0559B
LB Agar, powder (Lennox L agar) Thermo Fisher Scientific (Life Technologies) 22700025
Gibco™ DPBS, calcium, magnesium Gibco 14040133
Euthanasia
18-22g Intravenous Angiocath SurVet (01)14806017512306
Fatal Plus Vortech Pharmaceuticals 9373

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodwine, J., et al. Pyruvate-depleting conditions induce biofilm dispersion and enhance the efficacy of antibiotics in killing biofilms in vitro and in vivo. Scientific Reports. 9 (1), 3763 (2019).
  2. Sen, C. K., Roy, S., Mathew-Steiner, S. S., Gordillo, G. M. Biofilm management in wound care. Plastic and Reconstructive Surgery. 148 (2), 275-288 (2021).
  3. Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. Burn wound infections. Clinical Microbiology Reviews. 19 (2), 403-434 (2006).
  4. Nguyen, T. T., Gilpin, D. A., Meyer, N. A., Herndon, D. N. Current treatment of severely burned patients. Annals of Surgery. 223 (1), 14-25 (1996).
  5. Eriksson, E., et al. Chronic wounds: Treatment consensus. Wound Repair and Regeneration. 30 (2), 156-171 (2022).
  6. Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C. From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections. Pathogens. 2 (2), 288-356 (2013).
  7. Ganesh, K., et al. Chronic wound biofilm model. Advances in Wound Care. 4 (7), 382-388 (2015).
  8. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  9. Stewart, P. S. Biophysics of biofilm infection. Pathogens and Disease. 70 (3), 212-218 (2014).
  10. Jensen, L. K., Johansen, A. S. B., Jensen, H. E. Porcine models of biofilm infections with focus on pathomorphology. Frontiers in Microbiology. 8, 1961 (2017).
  11. Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends in Microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).
  12. Gonzalez, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
  13. Roy, S., et al. Mixed-species biofilm compromises wound healing by disrupting epidermal barrier function. Journal of Pathology. 233 (4), 331-343 (2014).
  14. Sen, C. K. Human wound and its burden: Updated 2020. Compendium of Estimates. Advances in Wound Care. 10 (5), 281-292 (2021).
  15. Barki, K. G., et al. Electric field based dressing disrupts mixed-species bacterial biofilm infection and restores functional wound healing. Annals of Surgery. 269 (4), 756-766 (2019).
  16. Dusane, D. H., et al. Electroceutical treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 9 (1), 2008 (2019).
  17. Roy, S., et al. Staphylococcus aureus biofilm infection compromises wound healing by causing deficiencies in granulation tissue collagen. Annals of Surgery. 271 (6), 1174-1185 (2020).
  18. Ghanbari, A., et al. Inoculation density and nutrient level determine the formation of mushroom-shaped structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Scientific Reports. 6, 32097 (2016).
  19. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Frontiers in Microbiology. 13, 955286 (2022).
  20. Norbury, W., Herndon, D. N., Tanksley, J., Jeschke, M. G., Finnerty, C. Infection in burns. Surgical Infections. 17 (2), 250-255 (2016).
  21. Nitz, F., et al. Molecular detection of drug-resistance genes of bla(OXA-23)-bla(OXA-51) and mcr-1 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Microorganisms. 9 (4), 786 (2021).
  22. Davis, S. C., et al. Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 23-29 (2008).
  23. Breuing, K., Kaplan, S., Liu, P., Onderdonk, A. B., Eriksson, E. Wound fluid bacterial levels exceed tissue bacterial counts in controlled porcine partial-thickness burn infections. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (2), 781-788 (2003).
  24. Nusbaum, A. G., et al. Effective method to remove wound bacteria: Comparison of various debridement modalities in an in vivo porcine model. Journal of Surgical Research. 176 (2), 701-707 (2012).
  25. Hirsch, T., et al. Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model. BMC Surgery. 8, 5 (2008).
  26. Roche, E. D., et al. Increasing the presence of biofilm and healing delay in a porcine model of MRSA-infected wounds. Wound Repair and Regeneration. 20 (4), 537-543 (2012).
  27. Hartoch, R. S., McManus, J. G., Knapp, S., Buettner, M. F. Emergency management of chronic wounds. Emergency Medical Clinics of North America. 25 (1), 203-221 (2007).
  28. Mustoe, T. Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy. American Journal of Surgery. 187 (5), 65-70 (2004).
  29. Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
  30. Chum, H., Pacharinsak, C. Endotracheal intubation in swine. Lab Animal. 41 (11), 309-311 (2012).
  31. Sinha, M., et al. Pseudomonas aeruginosa theft biofilm require host lipids of cutaneous wound. Annals of Surgery. 277 (3), e634-e647 (2023).
  32. Fan, G. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
  33. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  34. Meyer, W., Schwarz, R., Neurand, K. The skin of domestic mammals as a model for the human skin, with special reference to the domestic pig. Current Problems in Dermatology. 7, 39-52 (1978).
  35. Vardaxis, N. J., Brans, T. A., Boon, M. E., Kreis, R. W., Marres, L. M. Confocal laser scanning microscopy of porcine skin: implications for human wound healing studies. Journal of Anatomy. 190, 601-611 (1997).
  36. Heinrich, W., Lange, P. M., Stirtz, T., Iancu, C., Heidemann, E. Isolation and characterization of the large cyanogen bromide peptides from the alpha1- and alpha2-chains of pig skin collagen. FEBS Letters. 16 (1), 63-67 (1971).
  37. Marcarian, H. Q., Calhoun, M. L. Microscopic anatomy of the integument of adult swine. American Journal of Veterinary Research. 27 (118), 765-772 (1966).
  38. Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).
  39. Dawson, H. D., et al. Structural and functional annotation of the porcine immunome. BMC Genomics. 14, 332 (2013).
  40. Kim, J. Y., Dunham, D. M., Supp, D. M., Sen, C. K., Powell, H. M. Novel burn device for rapid, reproducible burn wound generation. Burns. 42 (2), 384-391 (2016).
  41. Nielson, C. B., Duethman, N. C., Howard, J. M., Moncure, M., Wood, J. G. Burns: Pathophysiology of systemic complications and current management. Journal of Burn Care and Research. 38 (1), e469-e481 (2017).
  42. Rowan, M. P., et al. Burn wound healing and treatment: Review and advancements. Critical Care. 19 (1), 243 (2015).

Tags

Svinemodell biofilminfeksjon sårkronisitet vertsimmunsystem klinisk relevant preklinisk modell in vivo in vitro ex vivo korttidsstudie langtidsstudie hudbarrierefunksjon funksjonell sårlukking usynlige sår metodologiske detaljer alvorlig brannskade translasjonsverdi P. aeruginosa (PA01) 8 ukers infeksjon
Svinemodell av biofilminfeksjon og usynlige sår
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

El Masry, M., Bhasme, P.,… More

El Masry, M., Bhasme, P., Mathew-Steiner, S. S., Smith, J., Smeenge, T., Roy, S., Sen, C. K. Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds. J. Vis. Exp. (196), e65301, doi:10.3791/65301 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter