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Neuroscience

Système d’enregistrement électroencéphalographique à faible coût combiné à une bobine de taille millimétrique pour stimuler transcrânalement le cerveau de la souris in vivo

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65302
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2
1Bioengineering and Bioinformatics, Graduate School of Information Science and Technology, Hokkaido University, 2Bioengineering and Bioinformatics, Division of Information Science and Technology, Hokkaido University
* These authors contributed equally

Summary

Un système d’enregistrement électroencéphalographique à faible coût combiné à une bobine de taille millimétrique est proposé pour stimuler la stimulation magnétique transcrânienne du cerveau de la souris in vivo. En utilisant des électrodes à vis conventionnelles avec un substrat multi-électrodes flexible sur mesure, l’enregistrement multisite peut être effectué à partir du cerveau de la souris en réponse à la stimulation magnétique transcrânienne.

Abstract

Un système d’enregistrement électroencéphalographique (EEG) à faible coût est proposé ici pour piloter la stimulation magnétique transcrânienne (TMS) du cerveau de la souris in vivo, en utilisant une bobine de taille millimétrique. À l’aide d’électrodes à vis conventionnelles combinées à un substrat multi-électrodes flexible sur mesure, l’enregistrement multisite peut être effectué à partir du cerveau de la souris. De plus, nous expliquons comment une bobine de taille millimétrique est produite à l’aide d’équipements à faible coût que l’on trouve généralement dans les laboratoires. Les procédures pratiques pour la fabrication du substrat flexible multiélectrodes et la technique d’implantation chirurgicale pour les électrodes à vis sont également présentées, qui sont nécessaires pour produire des signaux EEG à faible bruit. Bien que la méthodologie soit utile pour enregistrer à partir du cerveau de tout petit animal, le présent rapport se concentre sur la mise en œuvre d’électrodes dans un crâne de souris anesthésié. De plus, cette méthode peut être facilement étendue à un petit animal éveillé qui est connecté avec des câbles attachés via un adaptateur commun et fixé avec un dispositif TMS à la tête pendant l’enregistrement. La version actuelle du système EEG-TMS, qui peut inclure un maximum de 32 canaux EEG (un dispositif avec 16 canaux est présenté comme un exemple avec moins de canaux) et un dispositif TMS canal, est décrite. De plus, les résultats typiques obtenus par l’application du système EEG-TMS à des souris anesthésiées sont brièvement rapportés.

Introduction

La stimulation magnétique transcrânienne (SMT) est un outil prometteur pour la science du cerveau humain, l’application clinique et la recherche sur les modèles animaux en raison de son caractère non / peu invasif. Au début des applications de la SMT, la mesure de l’effet cortical en réponse à la SMT à impulsion unique et par paires chez les humains et les animaux était limitée au cortex moteur; La production facilement mesurable était limitée aux potentiels évoqués moteurs et aux potentiels myoélectriques induits impliquant le cortex moteur 1,2. Pour élargir les régions du cerveau qui peuvent être mesurées par modulation de la SMT, l’enregistrement électroencéphalographique (EEG) a été intégré à la SMT à impulsion unique et appariée comme méthode utile pour examiner directement l’excitabilité, la connectivité et la dynamique spatio-temporelle des zones du cerveauentier 3,4,5. Ainsi, l’application simultanée de la SMT et de l’enregistrement EEG (SM-EEG) au cerveau a été utilisée pour sonder diverses zones cérébrales corticales superficielles des humains et des animaux afin d’étudier les circuits neuronaux intracorticaux (voir Tremblay et coll.6). De plus, les systèmes TMS-EEG peuvent être utilisés pour examiner d’autres caractéristiques spatio-temporelles corticales, y compris la propagation de signaux vers d’autres zones corticales et la génération d’une activité oscillatoire 7,8.

Cependant, le mécanisme d’action de la SMT dans le cerveau reste spéculatif en raison du caractère non invasif de la SMT, ce qui limite notre connaissance du fonctionnement du cerveau pendant les applications de la SMT. Par conséquent, les études translationnelles invasives chez des animaux allant des rongeurs aux humains sont d’une importance cruciale pour comprendre le mécanisme des effets de la SMT sur les circuits neuronaux et leur activité. En particulier, pour les expériences combinées TMS-EEG chez l’animal, un système de stimulation et de mesure simultanées n’a pas été développé de manière intensive pour les petits animaux. Par conséquent, les expérimentateurs sont tenus de construire un tel système par essais et erreurs en fonction de leurs besoins expérimentaux spécifiques. En outre, les modèles murins sont utiles parmi d’autres modèles d’espèces animales in vivo , car de nombreuses souches de souris transgéniques et isolées par souche sont disponibles en tant que ressources biologiques. Ainsi, une méthode pratique pour construire un système de mesure combiné TMS-EEG pour les souris serait souhaitable pour de nombreux chercheurs en neurosciences.

Cette étude propose une méthode combinée TMS-EEG qui peut être appliquée pour la stimulation et l’enregistrement simultanés du cerveau de souris, qui est le principal type d’animal transgénique utilisé dans la recherche, et qui peut facilement être construit dans des laboratoires de neurosciences typiques. Tout d’abord, un système d’enregistrement EEG à faible coût est décrit à l’aide d’électrodes à vis conventionnelles et d’un substrat flexible pour attribuer de manière reproductible une position de réseau d’électrodes dans chaque expérience. Deuxièmement, un système de stimulation magnétique est construit à l’aide d’une bobine de taille millimétrique, qui peut facilement être fabriquée sur mesure dans des laboratoires typiques. Troisièmement, le système combiné TMS-EEG enregistre l’activité neuronale en réponse à la stimulation sonore et magnétique. La méthode présentée dans cette étude peut révéler les mécanismes qui génèrent des troubles spécifiques chez les petits animaux, et les résultats obtenus dans les modèles animaux peuvent être traduits pour comprendre les troubles humains correspondants.

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Protocol

Dans la présente étude, toutes les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et avec l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’Hokkaido. Des souris C57BL/6J, deux mâles et trois femelles, âgées de 8 à 10 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Il s’agit d’une procédure terminale. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Conception et construction flexibles de réseaux bidimensionnels

  1. Préparer le nombre requis d’électrodes à vis miniatures (inoxydables, SUS XM7; voir le tableau des matériaux) avec les propriétés structurelles suivantes pour une utilisation comme électrodes d’enregistrement EEG et de référence : diamètre nominal, longueur du col et diamètre de la tête de 0,6 mm, 1,5 mm et 1,1 mm, respectivement (Figure 1A).
    NOTE: Dans la présente étude, 16 électrodes à vis miniatures ont été utilisées.
  2. Préparez un plan d’un schéma de circuit imprimé sur un substrat flexible en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Créez un motif de tampon d’électrode bidimensionnel (2D) sur un substrat flexible (taille entière, 41,2 mm × 19,9 mm; voir Tableau des matériaux) pour que les électrodes à vis soient lues. Concevez la disposition des électrodes 2D. La figure 1B montre les dispositions spécifiques utilisées dans cette étude et les coordonnées relatives à partir d’un point de référence (croix à l’origine [0, 0]).
      REMARQUE : Dans la présente étude, pour enregistrer l’activité neuronale dans le cortex auditif dans les lobes temporaux, le placement des électrodes dans la direction latérale à médiale (horizontale) était plus long que dans le sens rostral-caudal (vertical) (Figure 1B).
    2. Assurez-vous que pour les électrodes d’enregistrement EEG, chaque tampon de cuivre (voir le tableau des matériaux) sur le substrat flexible a une forme d’anneau avec un diamètre extérieur de 1,3 mm et un diamètre intérieur de 0,8 mm (Figure 1C, à gauche). Faites un petit trou (0,8 mm de diamètre) au centre pour que chaque électrode à vis traverse le substrat. Pour les électrodes de référence, chaque tampon de cuivre doit avoir une forme carrée avec une longueur latérale de 1,4 mm; de même, faites un petit trou (0,8 mm de diamètre) au centre pour que chaque vis passe à travers le tampon carré sur le substrat (Figure 1C, à droite).
    3. Ensuite, pour souder un connecteur à montage en surface (Figure 1D, à gauche), concevez des tampons de lecture (matrice 2D) menant au connecteur (Figure 1D, à droite). Par exemple, utilisez un connecteur avec 2 × 10 broches et un pas de 1,27 mm entre les broches adjacentes (Figure 1D, à droite).
    4. Câblez les plaquettes d’électrode à vis et les plaquettes de connecteur en utilisant à la fois la couche de surface et la couche arrière avec une largeur de ligne de 0,03 mm et un intervalle de ligne de 0,03 mm (lignes fines sur la figure 1E).
    5. De plus, pour connecter les canaux de référence et de masse à l’amplificateur, connectez les électrodes des électrodes de référence et de masse à la partie isolée à l’extérieur du réseau 2D flexible (deux rectangles verticaux indiqués par « G » et « HR » au bas de la figure 1E). Après avoir déterminé les canaux de référence et de masse, n’oubliez pas de souder les électrodes aux connecteurs correspondants (voir étape 2.1).
    6. Concevoir correctement une zone exposée qui n’est pas recouverte d’une couche de protection (couche de polyimide). Exposez les connecteurs de la couche de surface tout en exposant les plaquettes d’électrode à vis dans les couches de surface et arrière. La conception complète de l’électrode, les tailles et le réseau 2D flexible fabriqué sont illustrés à la figure 1E, et l’image d’un substrat fabriqué est illustrée à la figure 1F.
    7. Dans la partie supérieure de l’électrode (partie tête) du réseau 2D flexible, assurez-vous que la structure à trois couches de haut en bas est composée des éléments suivants (épaisseur totale de 49,0 μm) : une couche supérieure de cuivre (épaisseur de 12,0 μm), une couche intermédiaire de polyimide de noyau (25,0 μm) et une couche de cuivre inférieure (12,0 μm) (Figure 1G, en haut).
    8. Gret les couches de cuivre sur les surfaces supérieure et inférieure du substrat, par exemple, en utilisant la gravure humide et la technique de fabrication standard9.
    9. Dans la partie inférieure du tampon carré (partie connecteur) du réseau 2D flexible, assurez-vous que la structure à six couches est composée de trois couches, dont une couche supérieure de cuivre (épaisseur 12,0 μm), une couche de polyimide à noyau intermédiaire (25,0 μm) et une couche de cuivre inférieure (12,0 μm), qui sont prises en sandwich par des couches de polyimide protectrices, y compris les couches supérieure et inférieure (toutes deux de 12,5 μm). Fixer un panneau de polyimide de 2 mm à partir du bas comme matériau de renforcement (figure 1G, en bas).
      REMARQUE: Pour maintenir la flexibilité, le panneau de polyimide de renforcement n’est pas monté sur la partie col du réseau 2D flexible entre la tête et la partie connecteur.
    10. De même, dans la partie connecteur, gravez les couches de cuivre et de polyimide protecteur sur le dessus en utilisant la gravure humide et la technique de fabrication standard.
      REMARQUE: Le poids total du périphérique matrice 2D flexible fabriqué, y compris le connecteur, est de 0,84 g. Après avoir conçu une mise en page pour un tableau 2D flexible, les substrats d’un fabricant commercial (voir Tableau des matériaux) sont parfois recommandés pour plus de commodité.

Figure 1
Figure 1 : Composants du réseau bidimensionnel flexible (2D) pour l’enregistrement électroencéphalographique (EEG) et du dispositif fabriqué, y compris le réseau. (A) L’électrode à vis miniature qui est intégrée dans le crâne de souris. (B) Les électrodes conçues pour mesurer l’activité cérébrale (cercles verts) et le canal de référence (carré en bas à droite). Les coordonnées relatives des électrodes à partir d’un point de référence (croix) à l’origine (0, 0) sont indiquées; La taille en millimètres est illustrée entre parenthèses. Les coordonnées centrales des électrodes sont symétriques par rapport à l’axe vertical passant par la croix. (C) Les plaquettes d’électrode et les trous de forage pour une électrode d’enregistrement (à gauche) et une électrode de référence (à droite) sont illustrés. (D) Un connecteur à montage en surface (2 × 10 broches) utilisé pour le réseau 2D flexible (à gauche) et le motif et la taille des tampons conçus sur le substrat (à droite). (E) Plan conçu avec la taille de chaque partie en millimètres. F) Image d’un substrat fabriqué indiquée par le plan figurant dans E. (G) La structure en couches du réseau 2D flexible (pièces de tête et de connecteur). Les vues de dessus et de côté des électrodes à vis (en haut) et des plaquettes de lecture (en bas) sont illustrées. La tête et les parties du connecteur sont composées d’une structure à trois couches (en haut) et d’une structure à six couches (en bas), respectivement. De plus, la partie du cou est composée d’une structure à cinq couches; Une couche de polyimide protectrice est montée sur la surface supérieure et arrière, et le panneau de polyimide de renforcement n’est pas monté sur la partie du cou. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Construction de l’adaptateur et mappage des canaux

  1. Effectuez la construction de l’adaptateur en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Étaler le flux de soudure sur le connecteur à montage en surface à 2 × 10 broches (Figure 1D, à gauche) et les connecteurs du réseau 2D (Figure 1D, à droite) (voir Tableau des matériaux) sur le substrat flexible.
    2. Soudez le connecteur à montage en surface à 2 × 10 broches aux connecteurs pads. En particulier, confirmez la connexion entre les deux pads de la partie inférieure de la matrice 2D et les deux broches de connecteur utilisées comme canaux de référence et de masse (Figure 2A).
    3. Connecter chacun des deux tampons à des fils conducteurs individuels pour transmettre les signaux de base à un point externe (p. ex., un point de masse connecté au canal de masse du système de mesure; Figure 2A).
      REMARQUE: Dans cette étude, cependant, l’un des tampons d’électrodes circulaires avec électrodes à vis a été utilisé comme électrode de référence au lieu d’une électrode carrée dans la partie connecteur.
    4. Après le brasage, couvrir les points de soudure avec de la résine époxy (voir le tableau des matériaux) pour protéger les points exposés et éviter les courts-circuits.
  2. Épinglez le câble du connecteur et l’amplificateur de tête en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Préparez un connecteur d’isolation-déplacement (IDC) avec 2 × 10 broches et un pas de 1,27 mm (Figure 2B, en haut à gauche) et un câble ruban plat de 20 broches (voir Tableau des matériaux) avec un pas de 0,635 mm (Figure 2B, en bas à gauche). Coupez le câble plat à la longueur requise (par exemple, 40 cm).
    2. Sertir l’IDC et une extrémité du câble à ruban plat à l’aide d’un outil de sertissage IDC (Figure 2B, en haut à droite) (voir le tableau des matériaux).
    3. Séparez chaque ligne de l’autre extrémité du câble jusqu’à environ 15 mm de l’extrémité de l’extrémité à l’aide d’un coupe-tête. Décaper l’isolant à 3 mm de l’extrémité de la pointe.
    4. Connectez l’IDC serti au câble à ruban plat et le connecteur 2 × 10 broches soudé au substrat flexible (Figure 2C).
    5. Confirmez la correspondance entre l’électrode d’enregistrement et la ligne séparée du câble. Assurez-vous que chaque ligne utilisée ne produit pas une erreur de connexion incorrecte.
    6. Souder les fils de cuivre exposés des lignes individuelles correspondant à la sortie de chaque électrode au connecteur à 20 broches (pas de 1,25 mm) du système de mesure, y compris l’amplificateur principal (Figure 2B, en bas à droite).
    7. Après soudure, confirmer la conduction entre les plaquettes d’électrode à vis et les broches du connecteur à l’aide d’un équipement d’essai (p. ex., un compteur LCR; voir le tableau des matériaux).
    8. Couvrez les points de soudure à l’aide de résine époxy et de ruban de blindage pour les protéger des dommages et éviter tout contact avec d’autres lignes de signal.
    9. À l’aide de résine époxy, collez une fine tige en acier inoxydable (diamètre: 1,1-1,2 mm; longueur: 100 mm) à l’arrière de la partie connecteur du réseau 2D sur le substrat flexible.
      NOTE: Cette tige en acier inoxydable peut être saisie par un support de micromanipulateur pendant les expériences (Figure 2C).
    10. Enfin, confirmez la correspondance entre les électrodes à vis et les canaux de sortie du signal (Figure 2D).

Figure 2
Figure 2 : Construction de l’adaptateur pour un réseau d’électrodes bidimensionnel (2D) sur le substrat flexible et mappage du canal d’enregistrement. (A) Dans la partie connecteur, les canaux de référence et de terre sont connectés aux électrodes inférieures par des fils conducteurs. Si les canaux de référence et de masse sont déterminés à l’avance, les canaux doivent être connectés aux électrodes inférieures correspondantes pendant la phase de conception. Dans de tels cas, il n’est pas nécessaire de souder les fils conducteurs aux canaux et aux électrodes. (B) Les connecteurs d’isolation et de déplacement (en haut à gauche) sont serties à une extrémité du câble plat (en bas à gauche) pour relier le connecteur de l’amplificateur de mesure (en haut à droite). Toutes les lignes qui correspondent aux canaux à utiliser sont soudées aux connecteurs verts (en bas à droite). Dans ce cas, étant donné que chaque connecteur vert connecté à l’amplificateur de tête est affecté à une mesure à huit canaux, au moins deux connecteurs sont nécessaires pour enregistrer des signaux d’activité cérébrale à 16 canaux. Les points soudés sont recouverts de résine époxy et de ruban de blindage pour éviter tout contact avec d’autres lignes de signal. (C) Le connecteur et le câble fabriqué sont placés à la surface du substrat flexible de la matrice 2D. La fine tige en acier inoxydable est fixée à l’arrière du substrat flexible. (D) Les emplacements spatiaux des canaux d’enregistrement sur la surface du cerveau de la souris et les cartes des canaux pour chaque point du système de mesure sont indiqués. Dans ce cas, il existe 16 canaux d’enregistrement avec des électrodes à vis (cercles rouges), bien que le nombre total de sites d’enregistrement possibles soit de 32. Les 16 autres canaux non enregistreurs sont également représentés par des cercles verts à la surface du cerveau. Dans le diagramme cartographique, « G » et « R » indiquent les canaux conçus pour les électrodes de masse et de référence, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Chirurgie animale

  1. Préparez l’environnement chirurgical stérile.
    1. Portez un équipement de protection, tel que des gants en latex, pendant toute la procédure expérimentale impliquant des animaux.
    2. Stériliser l’appareil stéréotaxique et les instruments chirurgicaux (voir le tableau des matériaux).
    3. Après avoir stérilisé les instruments chirurgicaux, lavez-les avec une solution saline stérile.
  2. Anesthésiez les animaux.
    1. Mesurez le poids de la souris avant la chirurgie. Administrer du sulfate d’atropine (0,04 mg/kg; voir le tableau des matières) par injection intrapéritonéale.
    2. Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale d’un mélange de médétomidine (0,3 mg/kg), de midazolam (4,0 mg/kg) et de butorphanol (5,0 mg/kg).
    3. Confirmez la profondeur anesthésique par le niveau de réponse en pinçant l’orteil.
      REMARQUE: L’anesthésie se dissipera après environ 40 minutes. Si la souris répond à un pincement d’orteil, administrer la même dose du mélange anesthésique par injection intrapéritonéale.
  3. Pré-préparez-vous pour la chirurgie d’implantation d’électrodes.
    1. Coupez les moustaches de la souris pour éviter toute sensation haptique.
    2. Lubrifiez les deux yeux avec une pommade ophtalmique pour éviter le dessèchement. Fermez les paupières pour obstruer la vue et maintenir la fermeture en adhérant aux paupières supérieures et inférieures avec du ruban de réparation.
    3. Rasez les poils sur la tête de la souris avec des tondeuses électriques. Insérez un thermomètre dans le rectum et maintenez la température corporelle à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant.
    4. Administrer le chlorhydrate de lidocaïne comme anesthésique local topique à la partie du cuir chevelu de souris qui sera incisée.
    5. Inciser le cuir chevelu de souris à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux chirurgicaux dans le sens rostral-caudale (taille de la zone: 7 × 10 mm2).
    6. Pincez le cuir chevelu près de la partie incisée avec une pince à épiler et soulevez. Enlevez la membrane visible sur le crâne à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux chirurgicaux. Ne cassez pas les vaisseaux sanguins autour des yeux pendant l’opération.
    7. Saisissez la peau près des deux centres de la ligne d’incision du cuir chevelu avec une pince et élargissez la partie incisée pour exposer largement le haut du crâne.
    8. Confirmer l’enlèvement complet de toutes les membranes à la surface du crâne et du tissu autour du lambda avec des ciseaux chirurgicaux.
    9. Mouillez la surface du crâne avec une solution saline physiologique pour améliorer la visibilité de la surface du cerveau sous le crâne et localiser le sinus transversal.
      REMARQUE: Lorsque vous implantez des électrodes à vis dans le crâne, n’oubliez pas de ne pas les encastrer au-dessus et dans le sinus transversal.

4. Implantation d’électrodes

  1. Fixez la tige en acier inoxydable montée sur le réseau d’électrodes 2D à l’arrière du substrat flexible à un micromanipulateur. Placez le substrat flexible sur le crâne.
  2. Ajustez l’emplacement des canaux (Chs) 3 et 14 (Figure 2D) sur le réseau pour qu’il s’adapte au colliculus inférieur.
    REMARQUE: Le colliculus inférieur est situé le long du sinus transversal. Nous vous recommandons de confirmer à l’avance l’emplacement du colliculus inférieur à l’aide d’un atlas du cerveau de souris.
  3. Dessinez de petits cercles aux emplacements des chapitres 3, 8, 9 et 14 (figure 2D) sur le crâne avec un marqueur permanent à utiliser comme repères de ciblage.
  4. Sécher la surface du crâne pour améliorer l’adhérence au ciment dentaire et isoler électriquement le réseau d’électrodes 2D sur le substrat flexible du crâne de souris.
  5. Appliquez du ciment dentaire (épaisseur d’environ 1 mm; voir le tableau des matériaux) sur la surface du crâne. Après avoir appliqué le ciment dentaire, attendez environ 30 minutes pour qu’il durcisse.
  6. Aligner le substrat flexible selon les petites marques circulaires sur la surface du crâne.
  7. Alignez la pointe d’une perceuse dentaire sur chaque trou de tampon d’électrode sur le substrat flexible. Percez soigneusement dans le crâne à travers chacun des trous du tampon d’électrode.
  8. Vissez chacune des électrodes de vis miniatures à travers les trous percés dans le crâne à l’aide d’un tournevis dédié pour les vis miniatures.
  9. Sertir fermement la tête de l’électrode à vis et le tampon d’électrode. Enfin, mesurez la conductance entre chaque électrode à vis et le connecteur à l’aide d’un équipement de test (par exemple, un compteur LCR) pour confirmer la conductivité électrique.

5. Conception et construction de petites bobines

  1. Concevoir un disque en forme de beignet (voir le fichier de codage supplémentaire 1) avec un trou au centre (diamètre intérieur: 2 mm; diamètre extérieur: 7 mm; épaisseur: 1 mm) à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) (voir le tableau des matériaux).
  2. À l’aide d’une imprimante 3D, imprimer deux disques (figure 3A, à gauche) faits d’un matériau non résistant à la chaleur (p. ex., filament d’acide polylactique); Un matériau non résistant à la chaleur n’est pas toujours nécessaire (voir ci-dessous).
  3. Couper une tige de permalloy-45 (diamètre: 2 mm; voir le tableau des matériaux) pour former un arbre court (longueur: 60 mm).
  4. Insérez l’arbre dans chaque trou des deux disques imprimés en 3D (Figure 3A, à droite). Placez un disque à l’extrémité de l’arbre et l’autre à 11 mm de l’extrémité, ce qui donne une distance de 10 mm entre les deux disques. Faites adhérer les disques avec de la colle instantanée (voir le tableau des matériaux).
  5. Fixez l’extrémité de l’arbre sans disque à un pilote d’impact (Figure 3B). Fixez un petit aimant à l’arbre en permalloy-45. Placez un capteur à effet Hall près de l’aimant à 5 mm de l’arbre. Connectez le capteur à effet Hall à un système d’acquisition de données (DAQ ; voir Tableau des matériaux).
  6. Pour compter le nombre de tours, préparez un programme informatique (voir Tableau des matériaux) qui analyse les signaux de sortie du capteur à effet Hall via le système DAQ.
  7. Connectez un fil de cuivre mince (diamètre: 0,16 mm) à l’arbre et adhérez à l’extrémité supérieure du fil avec de la colle instantanée.
  8. À l’aide du pilote d’impact, enroulez le fil de cuivre pendant 1 000 tours entre les deux disques. Bien que la vitesse de rotation soit arbitraire, environ 5 rotations par seconde sont généralement utilisées. Ensuite, adhérez au fil enroulé avec de la colle instantanée.
  9. Détachez les deux disques de l’arbre. Si les disques adhèrent fortement à l’arbre, faites-les fondre à l’aide d’un pistolet thermique.
  10. Couvrir la bobine de résine époxy pour isoler et fixer la surface. Ensuite, coupez la partie de l’arbre déroulé en excès.
  11. Assurez-vous que la bobine obtenue a une hauteur de 10 mm et un diamètre de 6 mm (figure 3B, à gauche). Pour la manipulation de bobines, construisez un support de bobine (Figure 3C, à droite) ou collez une tige en acier inoxydable à la bobine (non illustrée ici).
  12. Mesurez la résistance et l’inductance de la bobine à l’aide d’un compteur LCR (voir le tableau des matériaux). Par exemple, la bobine utilisée ici avait une résistance en courant continu (CC) de 18,3 Ω et une inductance de 7,9 mH à une entrée de courant alternatif (CA) de 1 kHz. Les propriétés AC (résistance et inductance) sont montrées à la figure 3D.
  13. Utilisez un générateur de fonctions pour appliquer une onde carrée bipolaire à la bobine. L’amplitude typique de la tension d’entrée est de 20 V via une alimentation bipolaire avec un gain de 10x, suivant une sortie de générateur de 2 V. La forme d’onde résultante est une onde carrée bipolaire d’une amplitude approximative de 20 V (c.-à-d. une tension de crête à crête de 40 V) (Figure 3E).
  14. Mesurez la densité de flux magnétique à l’aide du capteur à effet Hall et du système DAQ. Dans ce cas, par exemple, la densité de flux magnétique (B) de la bobine était de 113,6 ±2,5 mT (moyenne ± MEB) lorsque le fond de la bobine était en contact avec le capteur à effet Hall (Figure 3F).

Figure 3
Figure 3: Petite bobine pour la stimulation magnétique. (A) Disque tridimensionnel (imprimé en 3D) (à gauche). Deux disques identiques sont collés à l’arbre permalloy-45; L’un est à l’extrémité de l’arbre et l’autre à 10 mm (à droite). (B) Configuration pour enrouler la bobine. L’arbre de 60 mm avec les deux disques est fixé à un pilote d’impact. Un capteur à effet Hall est placé près du petit aimant fixé à l’arbre. Le fil de cuivre est enroulé entre les deux disques. (C) Bobine construite. La bobine mesure 10 mm de hauteur, 6 mm de diamètre et comporte 1 000 tours de fil de cuivre. Le côté droit de la figure montre la bobine manipulée par un support de bobine imprimé en 3D. (D) Propriétés AC de la bobine enregistrées par un compteur LCR: résistance (supérieure) par rapport à la fréquence d’entrée sinusoïdale; (en bas) inductance par rapport à la fréquence d’entrée. Une bobine typique a une résistance et une inductance de 21,6 et 7,9 mH, respectivement, à 1 kHz d’entrée CA. (E) Forme d’onde rectangulaire biphasique utilisée comme entrée de bobine enregistrée par un oscilloscope. (F) Relation entre la densité de flux magnétique et la distance entre une bobine construite et le capteur à effet Hall. La densité de flux magnétique a été enregistrée par cinq capteurs à effet Hall différents, une fois pour chaque capteur. La moyenne de cinq mesures est tracée et les barres d’erreur représentent les erreurs-types de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Système et procédure d’enregistrement des signaux

  1. Connectez la matrice 2D flexible au système d’enregistrement (voir Tableau des matériaux) à l’aide du câble à ruban plat.
  2. Fixez la tige d’acier inoxydable montée sur la bobine à un micromanipulateur (voir le tableau des matériaux).
  3. Placez la bobine au-dessus du bregma et ajustez la position dans la direction caudale pour localiser le point focal au-dessus du colliculus inférieur. Le point focal du champ électrique émetteur est la ligne médiane de la zone enroulée sur la surface inférieure de la bobine (c.-à-d. 1 mm du bord au centre).
  4. Préparez un système de stimulation composé d’une alimentation bipolaire et d’un générateur de fonctions (voir le tableau des matériaux) et connectez la bobine au système.
  5. Connectez un câble entre la borne d’entrée du générateur de fonctions et la borne de sortie du système DAQ pour appliquer des signaux de déclenchement au générateur de fonctions à partir du système DAQ. Préparez un programme informatique approprié pour les signaux déclencheurs afin d’initier des stimuli. De plus, connectez le système DAQ au système d’enregistrement pour enregistrer les temps de stimulation sous forme d’horodatages.
  6. Démarrez le processus d’acquisition du système d’enregistrement.
    REMARQUE: Si le système d’enregistrement capte du bruit, trouvez la source du bruit et réduisez-la.
  7. Testez la stimulation magnétique en déclenchant le système de stimulation.
    REMARQUE: Si le bruit produit par la stimulation magnétique sature la plage de mesure, ajustez la plage correctement. De plus, vérifiez que le système d’enregistrement enregistre correctement les horodatages de stimulation.
  8. Commencez à enregistrer les données de réponse et commencez les séances de stimulation. Arrêtez l’enregistrement lorsque chaque séance de stimulation est terminée. Enregistrez toutes les données enregistrées pour une analyse ultérieure.
    NOTE: Pour effectuer toutes les conditions expérimentales avec cinq intensités magnétiques différentes, par exemple, le temps total requis pour toutes les sessions était d’environ 75 minutes. Le critère d’évaluation était généralement déterminé après la fin de toutes les sessions d’enregistrement. Cependant, lorsque les animaux ont montré des signes cliniques, notamment de la toux, une respiration laborieuse et un halètement, la session expérimentale a été immédiatement interrompue. Pour l’euthanasie, la décapitation a été réalisée à l’aide de ciseaux tranchants et propres pendant que les animaux étaient sous anesthésie.

7. Analyse des données

  1. Filtrez le signal large bande (brut) à l’aide d’un filtre passe-bas avec une fréquence de coupure de 200 Hz.
  2. Collectez les formes d’onde filtrées pendant une fenêtre temporelle autour de chaque horodatage de stimulation. Faire la moyenne des formes d’onde pour obtenir les formes d’onde potentielles liées aux événements (ERP ) (Figure 4 et Figure 5).

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Representative Results

Des exemples de données EEG enregistrées chez des souris C57BL/6J anesthésiées avec le substrat flexible combiné aux électrodes à vis sont présentées ci-dessous.

À titre d’exemple typique, les formes d’onde EEG moyennes générées en réponse à la stimulation sonore (éclatement de tonalité de 8 kHz, niveau de pression acoustique [SPL] de 80 dB) sont présentées pour 60 essais avec des stimuli identiques (Figure 4A). Un schéma de la cartographie des canaux d’enregistrement est également présenté au milieu de la figure 4A. Les réponses des chapitres 5, 7, 10 et 12 sont enregistrées à partir de zones proches du cortex auditif dans les deux lobes temporaux. Dans les formes d’onde EEG individuelles des canaux situés autour des zones auditives (le colliculus inférieur et le cortex auditif), les réponses excluant les artefacts de stimulation étaient d’abord négatives immédiatement après le début de la stimulation sonore (p. ex. Chs 3 et 10); les amplitudes de crête étaient respectivement de 45,6 ± 4,0 μV et de 25,6 ± 1,5 μV. Par la suite, les réponses ont été positives dans une certaine mesure au-dessus de la ligne de base (figure 4B, C) et ont oscillé tout en amortissant. En revanche, les réponses d’autres canaux étaient presque indépendantes du début de la stimulation, bien que certaines formes d’onde de canaux aient montré des réponses similaires.

Figure 4
Figure 4 : Formes d’onde du potentiel lié aux événements sonores (ERP) à 16 sites dans le cerveau de la souris. (A) En réponse à la stimulation sonore (éclatement de tonalité de 8 kHz, SPL de 80 dB) appliquée à une souris anesthésiée, des formes d’onde ERP à 16 canaux sont illustrées. Le schéma d’un cerveau de souris est montré au centre, et les 16 sites d’enregistrement (cercles rouges) sur la surface du cerveau de la souris sont indiqués par des numéros de canaux. Dans ce cas, 16 canaux d’enregistrement sont utilisés; Les 16 autres canaux non enregistrés sont représentés par des cercles verts. (B) Vues élargies des formes d’onde du PGI pour le Ch 3. (C) Vues élargies des formes d’onde ERP pour le Ch 10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

De même, les formes d’onde moyennes des enregistrements EEG en réponse à une stimulation magnétique courte (V in = 60 Vpp) de la zone proche du colliculus inférieur droit sont montrées pour 60 essais avec des stimuli identiques à la figure 5A. Un schéma de la cartographie des canaux d’enregistrement est également présenté au milieu de la figure 5A. Étant donné que la bobine de stimulation était située près de la zone du Ch 14, l’artefact de stimulation était le plus grand à ce canal. Cependant, des artefacts de stimulation relativement importants ont été observés pour la plupart des canaux immédiatement après le début de la stimulation, ce qui indique que la stimulation magnétique a influencé tous les sites d’enregistrement. Étant donné que les réponses des chapitres 5, 7, 10 et 12 ont été enregistrées à partir de zones proches du cortex auditif dans les deux lobes temporaux, les formes d’onde EEG individuelles excluant les artefacts de stimulation étaient d’abord négatives, puis positives dans une certaine mesure, selon la position des canaux (Figure 5A-C). Près des zones auditives, les temps de réponse induits par la stimulation magnétique étaient différents de ceux induits par la stimulation sonore. Pour les Chs 3 et 10, par exemple, les réponses étaient négatives immédiatement après le début de la stimulation sonore, bien que les amplitudes maximales aient été de 58,8 ± 4,0 μV et 28,2 ± 2,0 μV, respectivement. De plus, avec l’augmentation des intensités de stimulation magnétique, les amplitudes maximales des réponses entraînées pour Ch 10 ont été augmentées (Figure 5D), ce qui suggère que la stimulation magnétique a affecté les réponses neuronales évoquées.

Figure 5
Figure 5 : Formes d’ondes de potentiel lié aux événements (ERP) induites par la stimulation magnétique transcrânienne (TMS) à 16 sites dans le cerveau de la souris. (A) Les formes d’onde ERP à 16 canaux en réponse à TMS (V in = 60 Vpp) appliquées à une souris anesthésiée sont illustrées. Un schéma d’un cerveau de souris est montré au centre, et les 16 sites d’enregistrement (cercles rouges) à la surface du cerveau de la souris sont indiqués par les numéros de canaux. (B) Vues élargies des formes d’onde du PGI pour le Ch 3. (C) Vues élargies des formes d’onde ERP pour le Ch 10. (D) Résumé des amplitudes du Ch. 10 ERP évoquées par différentes intensités magnétiques (tension d’entrée). Pour l’analyse statistique, une ANOVA pour les comparaisons multiples suivie d’un test de Tukey-Kramer post-hoc est utilisée. * et *** représentent p < 0,05 et p < 0,001, respectivement. Le numéro d’essai pour une séance est de 60 fois pour chaque condition d’animaux individuels. Les statistiques sont calculées pour les échantillons prélevés sur deux animaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cette méthode peut également être facilement étendue à un petit animal éveillé qui est connecté avec des câbles attachés via un adaptateur commun et fixé avec un dispositif TMS à la tête pendant l’enregistrement (Figure supplémentaire 1 et Figure supplémentaire 2).

Figure supplémentaire 1 : Fixation de la bobine de stimulation attachée à un crâne de souris. (A) Pour une souris éveillée, une bobine de stimulation fixée avec le dispositif attaché au crâne de souris est montrée. (B) Les potentiels liés aux événements (ERP) de la souris éveillée ont été enregistrés dans une boîte en acryl, où la souris pouvait se déplacer à l’intérieur de la boîte. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Formes d’onde des ERP pilotées par le son et la stimulation magnétique transcrânienne (TMS) à 16 sites du cerveau d’une souris éveillée. (A) En réponse à une stimulation sonore (éclatement de tonalité de 8 kHz, SPL de 80 dB) appliquée à une souris éveillée dans un boîtier en acryle (figure supplémentaire 1B), les formes d’onde ERP à 16 canaux sont illustrées. Le schéma d’un cerveau de souris est représenté au centre, et les 16 sites d’enregistrement (cercles rouges) à la surface du cerveau de la souris sont indiqués par des numéros de canaux. Dans ce cas, 16 canaux d’enregistrement sont utilisés; Les 16 autres canaux non enregistrés sont représentés par des cercles verts. (B) De même, les formes d’onde ERP à 16 canaux en réponse à TMS (Vin = 60 Vpp) appliquées à la même souris éveillée sont illustrées. Un schéma d’un cerveau de souris est montré au centre, et les 16 sites d’enregistrement (cercles rouges) à la surface du cerveau de la souris sont indiqués par les numéros de canaux. La bobine de stimulation est située près de la zone du Ch 14. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 1 : fichier de données CAO pour le disque en forme de beignet requis pour la construction de la bobine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Cette étude porte sur un système d’enregistrement EEG multisite combiné à un système de stimulation magnétique conçu pour les petits animaux, y compris les souris. Le système construit est peu coûteux et facile à construire dans les laboratoires physiologiques, et peut étendre leurs installations de mesure existantes. La procédure chirurgicale nécessaire pour obtenir des données du système d’enregistrement de la souris est profondément simple si ces laboratoires ont une expérience préalable des expériences électrophysiologiques standard.

L’un des avantages de cette approche est la bonne reproductibilité du placement des électrodes sur la tête et le cuir chevelu d’un animal individuel. Le substrat flexible utilisé pour assigner des électrodes à vis aux sites cibles du cerveau est facilement reproduit à l’aide de techniques de microfabrication standard, et les mêmes substrats sont également pratiques pour déterminer les sites d’enregistrement du cuir chevelu de chaque animal. De plus, la forme du réseau d’électrodes peut être facilement modifiée pour optimiser divers besoins expérimentaux; Des arrangements d’électrodes personnalisés peuvent être créés de manière optimale à des fins expérimentales spécifiques. Si la méthode indiquée dans le protocole est suivie, les électrodes à vis, les connecteurs, les câbles et les interventions chirurgicales peuvent être facilement modifiés et étendus à un système de mesure avec un plus grand nombre de sites d’enregistrement. Un deuxième avantage de ce système d’enregistrement est son faible coût lorsque les laboratoires sont équipés d’un amplificateur multicanal. Le système d’enregistrement actuel peut obtenir des signaux neuronaux à partir de 32 canaux d’entrée et jusqu’à quatre câbles distincts. Par conséquent, un système d’enregistrement étendu à 32 canaux nécessiterait des câbles supplémentaires, des électrodes à vis et des substrats flexibles modifiés, et ce système étendu aurait un coût très faible.

Cependant, un inconvénient de cette méthodologie est le contrôle précis de la profondeur des électrodes à vis pendant l’implantation. Cependant, cet inconvénient est toujours présent pour les électrodes EEG à vis typiques, et la profondeur précise des vis prémortem par rapport à la surface corticale est inconnue. En outre, dans ce système, un autre point critique pour la qualité d’enregistrement des signaux EEG et la réduction du niveau de bruit est le contact approprié de l’électrode avec la couche épidurale. Nous confirmons toujours le contact approprié de toutes les électrodes à vis par mesure d’impédance. En règle générale, une impédance de 5 à 10 kΩ à 1 kHz suggère un placement épidural approprié, et les valeurs d’impédance doivent être confirmées avant la mesure du signal neuronal.

De plus, dans le protocole actuel, le ciment dentaire est appliqué sur le crâne avant l’implantation de l’électrode. La quantité appropriée de ciment dentaire peut affecter le succès des enregistrements de signaux EEG. C’est-à-dire qu’une fine couche de ciment dentaire sur le crâne ne supporte pas les électrodes implantées et ne fixe pas la position des électrodes, tandis qu’une couche plus épaisse empêche le positionnement correct de l’électrode ou des électrodes pour entrer en contact avec la matière de dure-mère. Pour déterminer l’épaisseur appropriée de la couche, nous avons mesuré l’épaisseur du ciment dentaire à l’aide d’un pied à coulisse numérique après des enregistrements EEG réussis. L’épaisseur moyenne d’une couche de ciment appropriée était de 0,7 mm, ce qui suggère que la couche de ciment dentaire pourrait être remplacée par un « capuchon crânien » d’une épaisseur de 0,7 mm et de petits trous pour les électrodes à vis.

La stimulation magnétique est un outil utile dans les études humaines et animales pour la neurostimulation mini-invasive ou non invasive du cerveau. La modification rapide des courants dans une bobine crée un champ magnétique autour de la bobine et provoque une hyperpolarisation ou une dépolarisation des membranes neuronales lorsque les courants traversent les crânes d’animaux et d’humains. Pour les modèles animaux, les réponses au potentiel d’action sont directement déclenchées par l’amplitude supraseuil du changement de champ électrique, tandis que les changements sous-seuil dans les membranes neurales sont produits pour ajuster l’activité du réseau des populations neuronales10. Cette bobine est simulée pour produire un champ électrique de plus de 10 V/m, jusqu’à une profondeur de 1,8 mm de la surface du cerveau (2,4 mm du crâne), correspondant à la couche corticale 5/6 ou aux régions plus profondes d’une souris typique (par exemple, C57BL/6J)10. Ces bobines millimétriques sont capables d’induire une activité neuronale supraseuil et peuvent même générer un champ électrique plus localisé à la surface du cerveau par rapport à celles induites par les bobines précédemment rapportées11. Bien que les effets supplémentaires consistant en plusieurs facteurs, y compris le son perçu, la vibration du crâne et l’effet thermique, ne puissent pas être complètement exclus, ces effets individuels ont eu peu d’influence sur l’activité neuronale. De plus, en tant que noyau magnétique, nous utilisons du permalloy, dont les propriétés magnétiques dépendent généralement des conditions du processus de recuit, y compris la vitesse de refroidissement, la température de recuit et le temps de maintien12. Cependant, ses conditions de recuit ne pouvaient pas être contrôlées car il s’agissait d’un permalloy commercial.

Récemment, des systèmes de mesure combinés comprenant l’enregistrement EEG multi-sites et la TMS ont été utilisés dans des études médicales, et leurs applications cliniques ont augmenté 4,6. L’approche que nous proposons améliorera les modèles de petits animaux (en particulier les modèles murins) de neurophysiologie humaine, ce qui peut faciliter la traduction des résultats des modèles expérimentaux de rongeurs à leurs homologues cliniques humains en offrant des modèles animaux qui correspondent mieux aux systèmes humains. Enfin, en utilisant des techniques d’enregistrement multi-sites chez des souris génétiquement modifiées, des interventions magnétiques et pharmacologiques combinées chez des animaux atteints de perte auditive sensorielle pourraient aider à révéler les mécanismes générant des troubles auditifs spécifiques et des acouphènes, qui sont nos futures cibles de recherche.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Murata Science Foundation, la Suzuken Memorial Foundation, la Nakatani Foundation for Advancement of Measuring Technologies in Biomedical Engineering, et une subvention pour la recherche exploratoire (numéro de subvention 21K19755, Japon) et pour la recherche scientifique (B) (numéro de subvention 23H03416, Japon) à T.T.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D printer Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd FFD-101 The printer used for 3D-printing the donut-shaped disks
ATROPINE SULFATE  0.5 mg NIPRO ES PHARMA CO., LTD. - Atropine sulfate
Bipolar amplifier NF Corp. KIT61380 For amplifying waveforms for coil input
Butorphanol Meiji Seika Pharma
Co., Ltd., Tokyo, Japan		 - For anathesis of animals
Commercial manufacturer of flexible 2D array p-ban.com Corp. - URL: https://www.p-ban.com/
Computer prograom to analyze output signals Natinal Instruments NI-DAQ and  NI-DAQmx Python To analyze output signals from the hall-effect sensor
Connector Harwin Inc. G125-FV12005L0P For connector to conect to the measuring system
Copper pad p-ban.com Corp. copper Copper pad on each substrate
Copper wire Kyowa Harmonet Ltd. P644432 The windings of the coil
DAQ board National Instruments Corp. USB-6343 For measuring the magnitic flux density of the coil
Dental cement SHOFU INC. Quick Resin Self-Curing Orthodontic Resin
ECoG electrode NeuroNexus Inc. HC32 For reference to design of the flexible 2D array
Epoxy resin Konishi Co. Ltd. #16123 For coil construction
Ethyl Carbamate FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp. 050-05821 For urethan anesthesia
Flat ribbon cable Oki Electric Cable Co., Ltd. FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5m For cable to connect between surface-mount connector and measuring sysytem
flexible substrate p-ban.com Corp. polyimide Baseplate of flexible substrate
Function generator NF Corp. WF1947 For generating waveforms for coil input
Hall-effect sensor Honeywell International Inc. SS94A2D For measuring the magnitic flux density of the coil
IDC crimping tool Pro'sKit Industries Co. 6PK-214 To crimp the IDC and one end of the flat ribbon cable; Flat cable connector crimping tool
Instant glue Konishi Co. Ltd. #04612 For coil construction
Insulation-displacement connector (IDC ) Uxcell Japan B07GDDG3XG 2 × 10 pins and a 1.27 mm pitch 
LCR meter NF Corp. ZM2376 For measuring the AC properties of the coil
Manipulator NARISHIGE Group. SM-15L For manipulating the coil
Medetomidine Kobayashi Kako, Fukui, Japan - For anathesis of animals
Midazolam Astellas Pharma, Tokyo, Japan - For anathesis of animals
Miniature screw KOFUSEIBYO Co., Ltd. S0.6*1.5 For EEG-senseing and reference electrode
Mouse Japan SLC, Inc. C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc) Experimental animal
Permalloy-45 rod The Nilaco Corp. 780544 The core of the coil
Recording system Plexon Inc. OmniPlex For EEG data acquisition
Stainless wire Wakisangyo Co., Ltd. HW-136 For grasp by manipulator
Stereotaxic apparatus NARISHIGE Group. SR-5M-HT To fix a mouse head
Surface-mount connector Useconn Electronics Ltd. PH127-2x10MG For connector to mount on the flexible 2D array
Testing equipment (LCR meter) NF Corp. ZM2372 Contact check and impedance measurements
White PLA filament Zhejiang Flashforge 3D Technology Co., Ltd PLA-F13 The material used for 3D-printing the donut-shaped disks
Xylocaine Jelly 2% Sandoz Pharma Co., Ltd. - lidocaine hydrochloride

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References

  1. Ilmoniemi, R. J., et al. Neuronal responses to magnetic stimulation reveal cortical reactivity and connectivity. Neuroreport. 8 (16), 3537-3540 (1997).
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Neurosciences numéro 195
Système d’enregistrement électroencéphalographique à faible coût combiné à une bobine de taille millimétrique pour stimuler transcrânalement le cerveau de la souris <em>in vivo</em>
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Yoshikawa, T., Sato, H., Kawakatsu,… More

Yoshikawa, T., Sato, H., Kawakatsu, K., Tateno, T. Low-Cost Electroencephalographic Recording System Combined with a Millimeter-Sized Coil to Transcranially Stimulate the Mouse Brain In Vivo. J. Vis. Exp. (195), e65302, doi:10.3791/65302 (2023).

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