Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Funktionel stedstyret fluorometri i indfødte celler til undersøgelse af skeletmuskulaturens excitabilitet

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65311
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Summary

Funktionel stedstyret fluorometri er en metode til at studere proteindomænebevægelser i realtid. Modifikation af denne teknik til dens anvendelse i indfødte celler tillader nu detektion og sporing af enkeltspændingssensorbevægelser fra spændingsstyrede Ca2+ kanaler i murinisolerede skeletmuskelfibre.

Abstract

Funktionel stedstyret fluorometri har været den valgte teknik til at undersøge struktur-funktionsforholdet mellem adskillige membranproteiner, herunder spændingsstyrede ionkanaler. Denne tilgang er primært blevet brugt i heterologe ekspressionssystemer til samtidig måling af membranstrømme, den elektriske manifestation af kanalernes aktivitet og fluorescensmålinger, der rapporterer lokale domæneomlægninger. Funktionel stedrettet fluorometri kombinerer elektrofysiologi, molekylærbiologi, kemi og fluorescens i en enkelt vidtrækkende teknik, der tillader undersøgelse af strukturelle omlejringer i realtid og funktion gennem henholdsvis fluorescens og elektrofysiologi. Typisk kræver denne tilgang en konstrueret spændingsstyret membrankanal, der indeholder en cystein, der kan testes af et thiolreaktivt fluorescerende farvestof. Indtil for nylig blev den thiol-reaktive kemi, der blev anvendt til stedrettet fluorescerende mærkning af proteiner, udelukkende udført i Xenopus-oocytter og cellelinjer, hvilket begrænsede omfanget af tilgangen til primære ikke-excitable celler. Denne rapport beskriver anvendeligheden af funktionel stedrettet fluorometri i voksne skeletmuskelceller til at studere de tidlige trin i excitationskontraktionskobling, den proces, hvorved muskelfiberelektrisk depolarisering er forbundet med aktiveringen af muskelkontraktion. Denne protokol beskriver metoderne til at designe og transfektere cystein-manipulerede spændingsstyrede Ca2+ kanaler (CaV1.1) til muskelfibre i flexor digitorum brevis hos voksne mus ved hjælp af in vivo elektroporation og de efterfølgende trin, der kræves til funktionelle stedrettede fluorometrimålinger. Denne tilgang kan tilpasses til at studere andre ionkanaler og proteiner. Brugen af funktionel stedrettet fluorometri af pattedyrs muskel er særlig relevant for at studere grundlæggende mekanismer for excitabilitet.

Introduction

Evnen til at spore ionkanalkonformationelle omlejringer som reaktion på en kendt elektrisk stimulus i en levende celle er en kilde til værdifuld information til molekylær fysiologi1. Spændingsstyrede ionkanaler er membranproteiner, der registrerer ændringer i transmembranspænding, og deres funktion påvirkes også af spændingsændringer2. Udviklingen af spændingsklemmeteknikker i det sidste århundrede tillod fysiologer at studere ioniske strømme i realtid båret af spændingsstyrede ionkanaler som reaktion på membrandepolarisering3. Brugen af spændingsklemmeteknologi har været afgørende for at forstå de elektriske egenskaber af excitable celler som neuroner og muskler. I 1970'erne tillod spændingsklemmeraffinering detektion af gatingstrømme (eller ladningsbevægelse) i spændingsstyret calcium (Ca V) og natrium (NaV) kanaler 4,5. Gating strømme er ikke-lineære kapacitive strømme, der opstår fra bevægelsen af spændingssensorer som reaktion på ændringer i det elektriske felt over cellemembranen6. Gating strømme betragtes som en elektrisk manifestation af molekylære omlejringer, der går forud for eller ledsager ionkanalåbning7. Mens disse strømmålinger giver værdifuld information om kanalens funktion, er både ioniske strømme og gatingstrømme indirekte aflæsninger af inter- og intramolekylære konformationelle omlejringer af spændingsstyrede kanaler7.

Funktionel stedrettet fluorometri (FSDF; også kaldet spændingsklemmefluorometri, VCF) blev udviklet i begyndelsen af 1990'erne8 og gav for første gang mulighed for direkte at se lokale konformationsændringer og funktionen af et kanalprotein i realtid. Ved hjælp af en kombination af kanalmutagenese, elektrofysiologi og heterologe ekspressionssystemer er det muligt fluorescerende at mærke og spore de bevægelige dele af specifikke kanaler eller receptorer som reaktion på den aktiverende stimulus 9,10. Denne fremgangsmåde er blevet flittigt anvendt til at studere spændingsfølermekanismerne i spændingsstyrede ionkanaler 8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. For autoritative gennemgange, se 10,20,21,22,23.

Ca V- og NaV-kanalerne, der er kritiske for initiering og udbredelse af elektriske signaler, består af en α1-hovedunderenhed, som har en central pore og fire ikke-identiske spændingsfølerdomæner2. Ud over deres særskilte primære struktur udtrykkes Ca V- og NaV-kanaler som multiunderenhedskomplekser med hjælpeunderenheder24. Spændingsafhængige kaliumkanaler (K V) består af fire underenheder, der ligner et enkelt domæne af Na V eller CaV25. Den poredannende og spændingsfølende α1-underenhed af Ca V- og NaV-kanaler dannes af et enkelt polypeptid, der koder for fire individuelle domæner af seks unikke transmembransegmenter (S1-S6; Figur 1A) 24,26. Regionen bestående af S1 til S4 transmembransegmenter danner spændingssensordomænet (VSD), og S5 og S6 transmembransegmenter danner poredomænet26. I hver VSD indeholder S4 α-helixen positivt ladet arginin eller lysin (figur 1A, B), der bevæger sig som reaktion på membrandepolarisering7. Flere årtiers forskning og resultaterne fra meget forskellige eksperimentelle tilgange understøtter forudsætningen om, at S4-segmenter bevæger sig udad og genererer gatingstrømme som reaktion på membrandepolarisering6.

FSDF måler fluorescensændringerne af et thiolreaktivt farvestof konjugeret med en specifik cysteinrest (dvs. S4-α-helixen) på en ionkanal eller andet protein, konstrueret via stedrettet mutagenese, da kanalen fungerer som reaktion på membrandepolarisering eller andre stimuli10. Faktisk blev FSDF oprindeligt udviklet til at undersøge, om S4-segmentet i KV-kanaler, foreslået at være kanalens hovedspændingssensor, bevæger sig, når gatingladningerne bevæger sig som reaktion på ændringer i membranpotentiale 8,10. I tilfælde af spændingsstyrede ionkanaler kan FSDF løse uafhængige konformationelle omlejringer af de fire VSD'er (sporing af en VSD til enhver tid) samtidig med kanalfunktionsmålinger. Ved hjælp af denne tilgang har det faktisk vist sig, at individuelle frekvensomformere synes at være forskelligt involveret i specifikke aspekter af kanalaktivering og inaktivering 12,27,28,29,30. Det er yderst relevant at identificere hver VSD's bidrag til kanalernes funktion og kan bruges til yderligere at belyse kanaldriften og potentielt identificere nye mål for lægemiddeludvikling.

Brugen af FSDF i heterologe ekspressionssystemer har været yderst nyttig til at fremme vores forståelse af kanalfunktion fra et reduktionistisk perspektiv10,23. Som mange reduktionistiske tilgange giver den fordele, men har også begrænsninger. For eksempel er en væsentlig begrænsning den delvise rekonstitution af kanalens nanomiljø i det heterologe system. Ofte interagerer ionkanaler med adskillige tilbehørsunderenheder og adskillige andre proteiner, der ændrer deres funktion31. I princippet kan forskellige kanaler og deres tilbehørsunderenheder udtrykkes i heterologe systemer ved anvendelse af flere proteinkodende konstruktioner eller polycistroniske plasmider, men deres oprindelige miljø kan ikke rekonstitueres fuldt ud30,32.

Vores gruppe offentliggjorde for nylig en variant af FSDF i indfødte dissocierede skeletmuskelfibre til undersøgelse af tidlige trin i excitationskontraktionskobling (ECC)33,34, den proces, hvorved muskelfiberelektrisk depolarisering er forbundet med aktiveringen af muskelkontraktion 35,36. For første gang tillod denne tilgang bevægelsessporing af individuelle S4-spændingssensorer fra den spændingsstyrede L-type Ca2+ kanal (CaV1.1, også kendt som DHPR) i det oprindelige miljø i en voksen differentieret muskelfiber37. Dette blev opnået ved at overveje flere egenskaber ved denne celletype, herunder cellens elektriske aktivitet, der muliggør hurtig stimuleringsinduceret selvformeret depolarisering, evnen til at udtrykke cDNA-plasmid gennem in vivo-elektroporation, den naturlige høje ekspression og rumorganisering af kanalerne i cellen og dens kompatibilitet med højhastighedsbilleddannelse og elektrofysiologiske optageenheder. Tidligere brugte vi et højhastighedslinjescanningskonfokalmikroskop som detekteringsenhed37. Nu præsenteres en variation af teknikken ved hjælp af en fotodiode til signaloptagelse. Dette fotodiodebaserede detektionssystem kan lette implementeringen af denne teknik i andre laboratorier.

Her beskrives en trinvis protokol til udnyttelse af FSDF i native celler til undersøgelse af individuel spændingssensorbevægelse fra CaV1.1. Mens CaV1.1-kanalen er blevet brugt som et eksempel i hele dette manuskript, kunne denne teknik anvendes på ekstracellulært tilgængelige domæner af andre ionkanaler, receptorer eller overfladeproteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af University of Maryland Institutional Animal Care and Use Committee. Følgende protokol er opdelt i flere underafsnit, der består af (1) molekylært konstruktionsdesign og cysteinreagerende farvestofvalg, (2) in vivo-elektroporation, (3) muskeldissektion og fiberisolering, (4) beskrivelse af erhvervelsesopsætning, (5) vurdering af forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) positiv fiberelektrisk aktivitet og cysteinfarvning og (6) signaloptagelse og -behandling. Derudover er der i begyndelsen af hvert afsnit nogle relevante overvejelser detaljeret, når FSDF anvendes i en skeletmuskelfiber. Alle protokolafsnit skal udføres med korrekt personligt beskyttelsesudstyr, herunder laboratoriefrakke og handsker.

1. Molekylært konstruktionsdesign og cysteinreagerende farvestofvalg

  1. Konstruktørdesign er en kritisk del af eksperimentets succes. Først skal du generere en vildtype, fluorescerende mærket CaV1.1 cDNA-konstruktion og evaluere dens ekspression i den relevante celletype. For muskelfibre kan en stærk transfektionseffektivitet opnås ved anvendelse af et plasmid, der bærer en cytomegalovirus (CMV) promotor. I denne protokol blev en allerede karakteriseret kanin EGFP-CaV1.1 plasmid anvendt38.
    BEMÆRK: Når man konstruerer cDNA-konstruktionen til at indføre en cysteinrest i en spændingsstyret ionkanal, er cysteinpositionen kritisk og bør overvejes nøje. Cysteinen skal være tilgængelig fra det ekstracellulære rum for at tillade en thiolkonjugeret farvestofreaktion (figur 1C, D) og skal være proksimal til S4-regionen for præcist at spore dens bevægelse som reaktion på depolarisering. For at tillade dæmpning af farvestoffluorescens som reaktion på proteinbevægelse bør den indførte cysteinkonjugerede fluorofor imidlertid være ved grænsefladen mellem to forskellige miljøer (f.eks. membran og ekstracellulær væske; Figur 1E). Derudover er det afgørende at sikre, at den indsatte cystein ikke forstyrrer proteinfunktionen.
  2. For at få en idé om korrekt cysteinlokalisering skal du indsamle oplysninger om kanalstruktur eller fra andre fluorometrieksperimenter med andre relaterede kanalproteiner. Til design af cystein-manipulerede Ca V 1.1-konstruktioner skal du evaluere den opløste kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) struktur af kanal26 og sammenligne cysteinindsættelsen af tidligere arbejde fra beslægtede kanaler såsom CaV1.2 12 ellerandre kanaler såsom Shaker11 og NaChBac39.
  3. Når den korrekte cysteinposition er valgt, skal du bruge et kommercielt stedrettet mutagenesesæt til at indføre cysteinsubstitutioner. I denne protokol blev følgende cysteinmodifikationer uafhængigt konstrueret på hver cytosolisk ende af S4-spændingsfølersegmentet af CaV1.1: VSD-I (L159C), VSD-II (L522C), VSD-III (V893C), VSD-IV (S1231C) og UniProtKB: P07293 (figur 1B).
  4. Til skeletmuskelfibre skal du bruge 5-carboxytetramethylrhodamin methanethiosulfonat (MTS-5-TAMRA), som udviser korrekt og hurtig diffusion i det tværgående tubulimembransystem, hvilket er en invagination af overflademembranen og den overvejende placering af CaV1.1-kanaler. MTS-5-TAMRA viser et fald i fluorescens ved overgang fra lipidmembranen til et vandigt miljø (figur 1E).
    BEMÆRK: Dylight- eller Alexa-maleimidderivater pletter overflademembranen, men ikke det tværgående tubulisystem.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over thiolcysteinreaktion ved grænsefladen mellem en transmembran α-helix. (A) L-type CaV1.1 membrantopologi. Plustegnene repræsenterer basiske rester i S4-α-helixen, og de orange stjerner angiver det sted, hvor cystein blev indført via stedrettet mutagenese. B) Sekvensjustering af S4I til S4IV af kanin CaV1.1 (UniProtKB: P07293). Positivt ladede arginin- og lysinrester, der er kritiske for spændingsregistrering, fremhæves med rødt, mens konstruerede cysteinsubstitutioner er angivet med orange. Dette panel er tilpasset fra reference37. C) Cystein-thiol fluorescerende molekyle reaktion. D) Diagram, der illustrerer indsættelse af cysteinmutagenese i en transmembran spændingsfølsom α-helix. Cystein bør begraves i membranen i hvile og være tilgængelig ekstracellulært efter depolarisering (ΔV; Cysteinsporing er typisk usandsynligt, hvis målcystein allerede er tilgængelig fra det ekstracellulære rum før depolarisering (II), eller hvis cystein ikke er tilgængelig fra det ekstracellulære rum efter depolarisering (III). (E) Efter reaktionen med thiolfluorescerende molekyle reducerer α-helix-bevægelse som reaktion på depolarisering MTS-5-TAMRA fluorescensemission. Det fluorometriske signal genereres ved bevægelsen af S4-helixen og den efterfølgende farvestofbevægelse i forhold til membranplanet og det vandige miljø. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. In vivo-elektroporation

BEMÆRK: Elektroporationseksperimenter blev udført som tidligere beskrevet38 med modifikationer. I det følgende afsnit er protokollen designet til elektroporation af musens ene fodpude. Volumener skal justeres, hvis begge poter er forberedt.

  1. Alikvote 25-100 μL plasmidopløsning ved 2-5 μg/μL i et 1,5 ml rør anbragt på is.
  2. Forbered en 0,5 ml opløsning af 2 mg/ml hyaluronidase i sterilt saltvand og filtrer opløsningen gennem et 0,2 μm sterilt filter med lavt bindende protein monteret på en 1 ml sprøjte. Opbevares i et 1,5 ml rør ved stuetemperatur.
  3. Ved hjælp af et kalibreret anæstesiapparat bedøves en mus ved hjælp af 3% -4,5% isofluran iO2 (1 L / min) ved at placere musen i anæstesikammeret. Bekræft tilstrækkelig anæstesi af dyret ved at klemme spidsen af halen ved hjælp af et par pincet. Ingen reaktion bør observeres, når optimal anæstesi er nået.
  4. Fjern musen fra anæstesikammeret og læg en anæstesi næsemaske over musen. Placer dyret på ryggen på en isotermisk varmepude dækket med en steril bænkpude. Fortsæt anæstesien med gnavermasken med 3% isofluran iO2 (1 L/min).
  5. For at forhindre øjentørhed under proceduren påføres et fint lag kunstig tårecreme på dyrets øjne med en steril bomuldsspids. Desinficer dyrets pote ved hjælp af en steril aftørring mættet i ethylalkohol.
  6. Brug en 0,5 in lang 29 G steril insulinnål til at aspirere 20 μL hyaluronidaseopløsning. Penetrer huden på hælniveau og skub nålen subkutant mod bunden af tæerne (figur 2A). Injicer langsomt opløsningen, mens nålen gradvist bevæges bagud. En bolus eller bump skal observeres under poten (figur 2B).
    BEMÆRK: Afhængigt af dyrets alder og potens størrelse er det sandsynligt, at den fulde mængde opløsning muligvis ikke injiceres. Ofte kan der forekomme en lille lækage gennem injektionsstedet.
  7. Gentag trin 2.6 med den anden pote, hvis det ønskes, ved hjælp af en anden steril nål efter korrekt pote desinfektion, som i trin 2.5.
  8. Afbryd bedøvelsen ved at fjerne dyret fra næsemasken og returner musen til buret med adgang til mad og vand ad libitum. Fuld genopretning fra anæstesi bør observeres i ~ 5 min. Anbring røret med plasmidopløsningen på bænken, så det kan nå stuetemperatur.
  9. Efter 1 time bedøves dyret en anden gang, placeres på varmepuden og desinficeres poten som beskrevet i trin 2.3-2.5.
  10. 10-20 μL af cDNA-konstruktionen injiceres ved hjælp af samme teknik som beskrevet i trin 2.6. Den samlede mængde injiceret konstruktion er 50-100 μg pr. Pote. Gentag proceduren med den kontralaterale pote, hvis det ønskes ved hjælp af en anden steril sprøjte.
  11. Hold dyret under bedøvelse på den isotermiske varmepude i 5 minutter for at lade cDNA-opløsningen sprede sig jævnt gennem vævet.
  12. Tænd for elektroporationsapparatenheden, og tilslut den til dobbeltelektrodearrayet som anbefalet af producenten.
  13. Desinficer dobbeltelektrodearrayet ved hjælp af en klud mættet i ethylalkohol. Stabiliser poten med den ene hånd og indsæt først en elektrode under huden bag på hælen. Indsæt derefter den anden elektrode i bunden af tæerne, og sørg for, at begge elektroder er vinkelret på fodens akse (figur 2C). Vend sonden i en position, der ikke begrænser foden eller benet i en ekstrem vinkelorientering.
    BEMÆRK: Indføring af elektroder kan lettes ved brug af pincet og ved regelmæssigt at slibe spidserne af elektroderne. Afhængigt af dyrets alder kan potens størrelse variere, og elektrodeafstanden skal tilpasses i overensstemmelse hermed.
  14. Elektroporere musklerne ved at anvende 20 impulser, 20 ms i varighed / hver, ved 1 Hz. For elektrodenåle med en afstand på 1 cm skal du indstille spændingen til ~100 V. Dette bør tilpasses, hvis elektrodeafstanden ændres til at nå ~ 100 V / cm. Der skal observeres let bøjning af cifrene under pulstilførsel, hvis elektroderne er placeret korrekt.
  15. Gentag trin 2.13 og 2.14 med den kontralaterale pote, hvis det ønskes.
  16. Afbryd bedøvelsen og anbring dyret i et bur, isoleret fra dets ikke-elektroporerede modkammerat med mad og vandadgang ad libitum i 2 timer. Fuld genopretning fra anæstesi bør observeres i ~ 10 min. Placer dyret tilbage inde i buret.
    BEMÆRK: Ekspression af cDNA-konstruktion(er) er meget afhængig af det kodede protein. Proteinomsætning, mængde og kvalitet af cDNA, plasmidpromotor og andre variabler kan påvirke konstruktionsekspression. I dette eksperiment kræver optimal ekspression af α1S-underenheden af CaV1.1 med en CMV-promotor 4 til 6 uger, men kan detekteres fra 2 uger i op til 12-15 måneder.

Figure 2
Figur 2: Diagram over cDNA-injektion og elektroporationselektroporationselektrodepositionering i en musefodpude til elektroporation. (A) Nåleposition for hyaluronidase og cDNA-injektion under en musefodpude. Pilen angiver indføringspunktet gennem huden. (B) Let misfarvning af huden og let forøgelse af potestørrelsen skal observeres forbigående efter injektionen. (C) Elektrodearraypositionering til elektroporation. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Muskeldissektion og fiberisolering

BEMÆRK: Dissociation af skeletmuskelfibre blev udført som tidligere beskrevet 37,40,41 med modifikationer. I det følgende afsnit er protokollen velegnet til to fodpuder på musen.

  1. Forud for fiberdissociationen skal du forberede den sylgarddækkede plade ved at tilsætte en del hærdningsmiddel til 10 dele elastomer (% w / w) i en 60 mm plast petriskål for at nå en tykkelse på ~ 5 mm. Lad den elastomerbeklædte plade hærde natten over før brug. Dette kan genbruges flere gange, hvis det opbevares korrekt og desinficeres med 70% ethylalkohol før og efter brug.
  2. Forbered 4 mg collagenase type I i 2 ml spinnerminimum essential eagle's medium (S-MEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; slutkoncentration på 2 mg / ml). Opløsningen overføres til en 35 mm ikke-belagt plastplade og anbringes i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2.
    BEMÆRK: S-MEM er en modificeret MEM-formulering uden glutamin og Ca2+. Fraværet af Ca2+ på dette trin reducerer fiberkontraktur under enzymatisk fordøjelse og trituration.
  3. Der tilsættes 5 ml S-MEM suppleret med 10 % FBS i en 60 mm ikke-coated plastplade og opbevares i inkubatoren ved 37 °C, 5 % CO2.
  4. Aflive dyrene ved kvælning via CO2 efterfulgt af cervikal dislokation. For at reducere forurening under primær celleisolering nedsænkes dyrekroppen i 70% ethylalkohol i ~ 10 s. Fjern og tør slagtekroppen med absorberende papir og skær fødderne med en saks mellem anklen og knæet (figur 3A).
  5. Fastgør den ene fod af dyret, med poten opad, med dissektionsstifter på den elastomerdækkede plade under et dissektionsmikroskop ved 10x forstørrelse.
  6. Fjern huden fra poten med dissektionssaks og fin pincet for at udsætte flexor digitorum brevis (FDB) muskel (figur 3B). For at forhindre vævstørhed tilsættes en dråbe S-MEM 10% FBS til musklen ved hjælp af en 1.000 μL pipette.
  7. På hælniveau skal du skære senen og forsigtigt dissekere FDB-musklen fra hæl til tå (figur 3B). Undgå spændinger på musklen så meget som muligt, mens du udfører dissektionen. For meget kraft på vævene vil resultere i muskelfiberskader. Placer musklen straks i kollagenaseopløsningen.
  8. Gentag trin 3.5-3.7 med den kontralaterale fod. Den dissekerede muskel anbringes i kollagenaseopløsningen i en 5% CO2 inkubator på 37 °C i 2 timer og 45 minutter til 3 timer og 15 minutter. Tilpas inkubationstiden afhængigt af kollagenaseenzymatisk aktivitet og dyrets alder.
  9. Mens muskelvævet inkuberer, tilsættes 300 μL kold MEM uden serum eller antibiotika i midten af en 35 mm glasbundskål. Tilsæt 2 μL kold laminin ved 1,20 mg/ml direkte til MEM. Gentag processen for det ønskede antal retter. Opvasken anbringes i cellekulturinkubatoren ved 37 °C, 5% CO2 i mindst 1 time for at tillade lamininpolymerisation.
  10. Når den enzymatiske fordøjelse er færdig, overføres musklen til 60 mm cellekulturskålen, der indeholder S-MEM 10% FBS, ved hjælp af en stor boring (5 mm) brandpoleret glaspasteurpipette og en latexpære.
  11. Brug en mindre boring (2 mm) brandpoleret glas Pasteur-pipette og en latexpære til forsigtigt at triturere musklen under et dissektionsmikroskop (figur 3C). Dissocierede muskelfibre skal begynde at løsne sig fra vævet og frigives i opløsningen.
    BEMÆRK: Som tommelfingerregel foretrækkes mindre trituration (15-30 pipettepassager) altid, da for meget langvarig trituration kan stresse eller endda beskadige fibrene.
  12. Brug en fin pincet til at fjerne alt ikke-muskelvæv, såsom nerver, sener eller blodkar (figur 3D).
  13. Tilsæt 2 ml varm MEM 2% FBS til hver 35 mm lamininbelagt glasbundskål. Ved hjælp af en 200 μL pipette og en steril plastpipettespids overføres de dissocierede muskelfibre til den 35 mm lamininbelagte glasbundskål (figur 3E).
    BEMÆRK: Det er vigtigt at opnå en lav fibertæthed og lade fibrene være godt adskilt fra hinanden for at forhindre fiberoverlapning.
  14. 35 mm glasbundskålen anbringes i inkubatoren ved 37 °C, 5% CO2. Fibre kan bruges i en tidsramme på 2-20 timer.

Figure 3
Figur 3; Muskel FDB fiber dissektion og dissociation. (A) Efter foddissektion over ankelartikulationen (stiplede linje) fjernes huden under fodpoten efter den stiplede linje for at blotte FDB-musklen (B). Musklen dissekeres og placeres i kollagenaseopløsning. (C) Efter inkubation tritureres musklen for at dissociere og opnå individuelle muskelfibre. (D) Fine pincetter bruges til at fjerne ikke-muskelvæv og snavs, før muskelfibre overføres til den lamininbelagte glasbundskulturskål. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Beskrivelse af anskaffelsesopsætning

BEMÆRK: Anskaffelsesopsætningen er sammenlignelig med den, der er beskrevet før42 med ændringer (figur 4A).

  1. Tænd for alle komponenter: computer, AD / DA-konverter og stiklemmeforstærker, mikroskop, motoriseret trin, manipulator (er), strømforsyning til fotodioden, lyskilde, lyslukker, pulsgenerator og protokoleditor.
  2. Aktivér transistor-transistorlogikken (TTL), der udløser OUT-signal fra AD/DA, for at styre pulsgeneratoren, lyslukkeren og protokoleditoren.
  3. Brug TTL-udgangssignalet fra pulsgeneratoren, og tilslut til en AD-kanal på forstærkeren for at verificere præcis tidsmæssig udløsning. Tilstrækkelig kontrol af den udløsende konsistens bør evalueres omhyggeligt forud for forsøget for at sikre tilstrækkelig apparatsynkronisering.
    BEMÆRK: I tilfælde af CaV1.1 skal du forvente at se maksimalt signal på mindre end 4-10 ms efter stimulering (tid til at udvikle maksimal ladningsbevægelse5). Signalet er hurtigt, og præcis tidsmæssig opløsning er afgørende at sammenligne med andre mål, såsom calciumtransient eller ladningsbevægelse målt via spændingsklemme.
  4. For at fokusere excitationslyset i et bestemt område eller sted på fiberen (figur 4B) skal du bruge en membran placeret i excitationslysbanen. Dette muliggør kun signaloptagelse i et område, hvor EGFP-CaV1.1-signalet er maksimalt (figur 4B).

Figure 4
Figur 4: Beskrivelse af registreringssystemet . (A) Diagram, der illustrerer forbindelsen mellem registreringssystemets forskellige komponenter. Opsætningen består af et omvendt mikroskop med et motoriseret trin, en lysdiode (LED) lyskilde, en lyslukker, et specialfremstillet fotodiodebaseret lysovervågningskredsløb med en track and hold-funktion43, en AD / DA-konverter (fra en patch clamp-forstærker), en analog pulsgenerator, en ekstern feltstimuleringsenhed koblet til feltstimuleringselektroder, Motoriserede manipulatorer og kommerciel software til erhvervelse, synkronisering og generering af protokoller. Elektroden til feltstimulering er lavet af to platintråde svejset til kobberkabler, der er forbundet til pulsgeneratoren via et BMC-stik. Specifikke excitations- og emissionsfiltre bruges til at detektere både EGFP- og MTS-5-TAMRA-signaler. For at excitere EGFP anvendes en xenonlampe med et 488 nm (± 20 nm) excitationsfilter (Ex) og et LP510 nm Em-filter. Til MTS-5-TAMRA anvendes en 530 nm LED-lyskilde og et LP550 nm Em-filter. (B) Billede af en fiber, der udtrykker en EGFP-CaV1.1-cys-konstruktion med tofeltsstimuleringselektroderne (sorte cirkler) orienteret korrekt (venstre) og forkert (højre) i fibrenes hovedakse (stiplede linje). Den sorte ufyldte cirkel repræsenterer erhvervelsesområdet med en diameter, der styres af membranåbningen, placeret foran lyskilden. Klik her for at se en større version af denne figur.

5. Vurdering af EGFP-positiv fiberelektrisk aktivitet og cysteinfarvning

BEMÆRK: Skeletmuskelfiberfeltstimulering udføres som beskrevet før41 med modifikationer. Denne tilgang bruges til at (1) identificere sunde, funktionelle og elektrisk responsive fibre, (2) plette fibrene med cystein-reaktivt fluorescerende farvestof og (3) registrere det fluorescerende signal som reaktion på det formerede handlingspotentiale. Hvert trin i dette afsnit og det følgende skal udføres i et miljø med svagt lys for at reducere blegning af fluorescerende farvestof.

  1. Placer 35 mm glasbundskålen indeholdende dissocierede muskelfibre på mikroskopets stadium. Fjern forsigtigt kulturmediet med en 1.000 μL pipette og erstat med 2 ml stuetemperatur Ringers opløsning (se tabel 1 for sammensætning). Flere runder af medieudskiftning kan være nødvendig for helt at fjerne de originale cellekulturmedier, der indeholder frie cysteiner.
  2. Brug en mekanisk eller motoriseret manipulator til at placere de to platintråde vinkelret på bunden af skålen. Sørg for, at elektrodeterminalerne er justeret i forhold til fiberens længdeakse og et par millimeter væk fra fiberens ender, og at adskillelsen mellem elektroderne er 5 mm (figur 4B). Elektrodepositioneringen justeres yderligere ved enten at dreje skålen eller montere hver elektrode på en uafhængig mikromanipulator (figur 4B).
  3. Tænd for det transmitterede lys og find fibrene i synsfeltet ved hjælp af et 20x mål. Flyt EGFP-filterkuben ind i lysbanen.
    BEMÆRK: Ved hjælp af et mikroskop udstyret med epifluorescens og et mål med lav forstørrelse (2x) er det muligt at vurdere konstruktionstransfektionseffektiviteten i hele musklen før fiberdissociation ved at vurdere EGFP-ekspression (figur 5A).
  4. Brug en fjernstyret lyslukker til at aktivere 488 nm excitationslyset for at identificere de EGFP-positive fibre. Opbevar fiberens x-y-placering på skålen ved hjælp af et motoriseret mikroskoptrin. EGFP-signalet er ofte heterogent i fiberen (figur 4B). Centrer den gemte position til det klareste EGFP-signal.
  5. Efter identifikation af EGFP-positive fibre skal du vende tilbage til den første gemte lokalisering. Brug en manuel udløserkontakt til at levere to sekventielle stimuleringsimpulser med en varighed på 1 ms og 20 V amplitude. Indstil polariteten af impulserne til skiftevis.
  6. Efter stimuleringen observeres to koncentriske homogene fiberkontraktioner som reaktion på de to impulser med modsat polaritet. En lokal sammentrækning eller fraværet af sammentrækning i reaktioner på impulser med alternativ polaritet indikerer lokale ikke-udbredte passive reaktioner eller uexcitabilty41. Ekskluder disse fibre for resten af eksperimentet.
  7. Tilsæt 2 μL 10 mM MTS-5-TAMRA opløsning direkte i skålen og bland forsigtigt med en 1.000 μL pipette (10 μM slutkoncentration). Pas på ikke at flytte skålen, ellers går de lagrede fiberpositioner tabt. Inkuber i 4-5 minutter for at tillade diffusion af det fluorescerende thiolmolekyle i det tværgående tubulisystemlumen.
  8. Anvend bipolære gentagne stimuleringer for at fremkalde successive handlingspotentielle tog med en hastighed på 50 Hz i 300 ms hver 1. sek. i 5 minutter.
    BEMÆRK: Pulstogene giver adgang til cysteinerne indsat i S4 af EGFP-CaV1.1 for at reagere med MTS-5-TAMRA. Fiberens evne til mekanisk at trække sig sammen som reaktion på stimulering er vigtig for, at tværgående tubuli lumenindhold kan cykle med det ekstracellulære miljø.
  9. Fjern farvningsopløsningen fra skålen med en 1.000 μL pipette og erstat med 2 ml stuetemperatur Ringers opløsning. To eller tre runder kan være nødvendige for helt at fjerne ukonjugeret MTS-5-TAMRA. Lad den farvede fiber komme sig efter farvningsprotokollen i mindst 10 minutter.
  10. Som i trin 5.6 skal du revurdere fiberens sundhed og elektriske aktivitet ved at observere symmetrisk fiberkontraktion som reaktion på vekslende polaritet. Ekskluder fibre, der ikke reagerer på begge stimuleringer fra resten af eksperimentet.
  11. Flyt MTS-5-TAMRA filterkuben ind i lysbanen. Brug en fjernstyret lyslukker til at aktivere 533 nm excitationslyset for at bekræfte homogen MTS-5-TAMRA farvning på fibrene.
    BEMÆRK: Ved farvning med MTS-5-TAMRA reagerer både konstruerede og endogene cysteiner med maleimidderivatet (figur 5B). Det er således vanskeligt at evaluere den korrekte reaktion med cystein af interesse. CaV1.1 udtrykkes hovedsageligt i det tværgående rør og danner et skelneligt dobbeltbåndsmønster. Ved hjælp af et konfokal- eller epifluorescensmikroskop kan et x-y-billede bruges til at bekræfte korrekt farvning og tværgående tubulusindgang og diffusion af MTS-5-TAMRA (figur 5C).

6. Signaloptagelse og -behandling

BEMÆRK: Før der udføres fluorometriske målinger, skal signaloptagelsen være omhyggeligt designet for at opnå det optimale signal/støjforhold. Langsommere prøvetagningshastigheder tillader mere lysdetektion, samtidig med at antallet af punkter, der ville blive erhvervet under proteinkonformationel omlejring, reduceres. I tilfælde af EGFP-CaV1.1-cys forekommer ladningsbevægelse induceret af en aktionspotentiel bølgeform i ~ 1-10 ms37. For at opnå flere point til at spore bevægelsens udvikling over tid blev erhvervelsen sat til 50 μs pr. Punkt.

  1. Placer fiberen midt i synsfeltet med et korrekt forstørrelsessystem. Til disse eksperimenter blev der anvendt et 60x olie 1,4 numerisk blænde (NA) omvendt mål. Optimer belysningen og fiberpositionen med det motoriserede trin og membranen for at belyse et cirkulært område med fiberens diameter, hvor EGFP-signalet er maksimalt (figur 4B).
  2. Når fiberen er placeret til erhvervelse, orienteres de to uafhængigt monterede feltstimuleringstlatintråde i hver ende af fiberen. Juster ledningerne på fibrenes hovedakse i en lige linje, og placer dem 5 mm fra hinanden med fiberen i midten (figur 4B).
  3. Indstil erhvervelsens excitations- og emissionsfiltre til de korrekte indstillinger for MTS-5-TAMRA. Start eksperimentet ved at udføre den protokol, der er skrevet i anskaffelsessoftwaren. Dette trin udløser alle downstream-enheder (dvs. protokoleditor, lyslukker, pulsgenerator).
    BEMÆRK: Denne protokol tillader en kort periode (dvs. 10 ms) med baseline-erhvervelse før levering af feltstimulus for at muliggøre efterfølgende målinger af hvilefluorescens.
  4. Start et enkelt eller et tog af handlingspotentialer med en 0,5 eller 1 ms, 20 V kvadratpuls. Minimer den samlede anskaffelsestid så meget som muligt for at undgå signalblegning.
    BEMÆRK: Selvom optagelse i midten af fiberen, kan der forekomme et bevægelsesrelateret fluorescenssignal og kan forveksles med det fluorescerende signal på grund af proteinfluoroforkonformationsændring (figur 5D). Det sammentrækningsinducerede signal bør forsinkes sammenlignet med den forventede tid for ladningsbevægelse efter stimulering37.
  5. For yderligere at skelne signalet fra S4-bevægelser fra signalet på grund af fiberkontraktion tilsættes 1 μL 100 mM N-benzyl-p-toluensulfonamid (BTS; 50 μM slutkoncentration) til optageopløsningen for at minimere kontraktile reaktioner og gentage trin 6.4. Signaler detekteret for anden gang efter fiberfarmakologisk immobilisering svarer til den molekylære bevægelse af den mærkede S4-helix (figur 5D).
    BEMÆRK: Der bør ikke detekteres noget signal i kontrollen EGFP-CaV1.1 uden konstrueret cystein efter bevægelsesundertrykkelse med BTS.
  6. Brug de samme indstillinger til at få et lignende signal på et sted i skålen, hvor der ikke er muskelfibre eller snavs til stede for at opnå en værdi af baggrundsfluorescens.
  7. Importer de filer, der indeholder tidsforløbet for den rå fluorescens [Fr (t)] fra fiber- og baggrundsfluorescensen [Fb (t)] til dataanalysesoftwaren. Gennemsnittet af den kolonne, der indeholder Fb(t), for at opnå en homogen Fb-værdi. Træk Fb fra Fr(t) for at opnå de absolutte fluorescensværdier [F(t)]. Glat det resulterende signal med en udjævningsfunktion, hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Med dette detekteringssystem og hyppigheden af erhvervelse besluttede vi at bruge en tilstødende gennemsnitsfunktion med et vindue på 50 point til udjævning.
  8. Gennemsnit af baseline F(t)-værdierne i et tidsinterval på 10 ms før stimuleringen for at opnå en hvilefluorescensværdi (F0). Træk F0 fra den glatte F(t) for at opnå den absolutte ændring i fluorescens [ΔF(t)]. For at udtrykke fluorescensændring over tid i forhold til hvilefluorescens (ΔF / F0) divideres ΔF (t) med F0.
  9. For at evaluere omfanget af signalblegning skal du definere to punkter fra ΔF / F0 over tidssignalet, før og efter stimuleringen og væk fra det fluorometriske signal. Tilpas en lineær funktion til disse to punkter for at opnå en baseline-sporing. Træk basislinjen til ΔF/F0 over tid for at korrigere for signalblegning.
  10. Træk fra tidskolonnen forsinkelsen mellem erhvervelsesinitiering og feedbacksignalet fra stimuleringen for at have t = 0 svarende til starten af den elektriske stimulus.
    BEMÆRK: For at tillade flere signalsammenligninger er det ofte nødvendigt at normalisere signalets amplitude. Forskellige tilgange kan anvendes afhængigt af formålet med eksperimentet. I det følgende resultatafsnit var vi interesserede i signalkinetik, så vi brugte en simpel metode bestående af normalisering af hvert signal med den minimale nåede værdi (dvs. den negative going peak).

Figure 5
Figur 5: Billeddannelse af muskelfibre, der udtrykker EGFP-CaV1.1-cys uden og med MTS-5-TAMRA farvning og repræsentativ rå fluorometrisk rekord. (A) Eksempler på transmitterede (venstre) og fluorescerende (højre) billeder af den dissekerede, ikke dissocierede muskel, der udtrykker en EGFP-CaV1.1 VSD-III-konstruktion. Skalabjælke: 100 μm. (B) Repræsentativt billede af en muskelfiber, der udtrykker en EGFP-CaV1.1 VSD-III-konstruktion før (venstre) og efter (højre) MTS-5-TAMRA-farvning. Endogene cysteiner af ikke-transfekterede fibre farves også af farvestoffet. Skalabjælke: 30 μm. (C) Konfokalbillede af en EGFP-Ca V 1.1 VSD-III-konstruktion (venstre) og MTS-5-TAMRA-farvning (højre) viser et klassisk dobbeltbåndsmønster, der er karakteristisk for CaV1.1-lokalisering på muskelfiberens tværgående rørsystem (nederst). Skalabjælke: 25 μm. (D) Repræsentativ fluorometrisk registrering som reaktion på to stimuli og målt med en fotodiode før (blåt spor) og efter (rødt spor) fiberimmobilisering med N-benzyl-p-toluensulfonamid (BTS). Den øverste sorte linje angiver protokollen for fiberdepolarisering via ekstern feltstimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Når formeringsaktionspotentialer udløses som reaktion på gentagen feltstimulering, er det muligt at spore specifik spændingssensorbevægelse som reaktion på en bestemt frekvens af depolarisering. Som vist i figur 6A kan bevægelsen af VSD-II-mærkede spiraler spores som reaktion på hver af to på hinanden følgende depolariseringer, der påføres ved 10 Hz (dvs. med en afstand på 100 ms). Signalblegning kan korrigeres ved at trække baseline til sporet (figur 6B). Yderligere tidsforstørrelse på første og andet respons (figur 6C) muliggør præcis observation af disse hurtigt udviklende VSD-II helixbevægelser. Tidsmarkøren fra feltstimuleringsudløseren muliggør relativ tidsmæssig justering af første og andet respons med en præcision på 10 μs. Begge signaler kan normaliseres med deres respektive minimumsværdi (dvs. minimum peak) for at muliggøre en kinetisk sammenligning mellem de to reaktioner (figur 6D). Fra disse optagelser af relativ fluorescens kan det observeres, at tiden til toppen er sammenlignelig mellem successive depolariseringer for denne spændingssensor.

Denne tilgang kan bruges til at spore individuelle spændingssensorers bevægelse med forskellige frekvenser af depolarisering og flere handlingspotentialer for at studere deres aktivering og forhold til ladningsbevægelse, calciumstrøm eller calciumtransienter, som kan studeres parallelt i et andet sæt fibre, som tidligere rapporteret37.

Figure 6
Figur 6: Repræsentativ fluorometrisk optagelse fra EGFP-CaV1.1 VSD-II udløst af to på hinanden følgende depolariseringer ved 10 Hz. A) ΔF/F0 fluorometrisk signal i en fiber, der udtrykker EGFP-Cav1.1 VSD-II stimuleret to gange ved 10 Hz og en basislinjekorrektionskurve (lilla). Den øverste sorte linje angiver induceret depolarisering. B) ΔF/F0 basislinjekorrigeret signal for de to uafhængige reaktioner (C). Værdier på plottet svarer til minimumsrækkevidden på toppen. (D) Signaljustering i forhold til depolarisering og normalisering ved deres respektive minimumstop viser VSD-II-domænebevægelse med sammenlignelig kinetik for begge stimuli. Klik her for at se en større version af denne figur.

Reagenser Endelig koncentration (mM) Molekylvægt g/l
NaCl 150 58.44 8.766
KCl 4 74.55 0.298
CaCl2 Annoncer 2 110.9 0.222
MgCl2 1 95.22 0.095
D-glukose 5 180.2 0.901
HEPES 10 238.3 2.383
pH justeret til 7,4 med 1 M NaOH

Tabel 1: Ændret Ringers opløsningssammensætning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrives en trinvis protokol til udførelse af FSDF i muskelfibre til undersøgelse af individuelle spændingssensorbevægelser fra CaV1.1-kanalen. Selvom antallet af trin og mangfoldigheden af tilgange, der kombineres i denne teknik, kan virke kompleks, anvendes de fleste af disse teknikker ofte rutinemæssigt i biofysiker/cellebiologlaboratorier. Den tilsyneladende kompleksitet ligger således hovedsagelig i kombinationen af alle de forskellige tilgange i en enkelt integreret teknik. Ofte når man udfører en flertrinsmetode, kan virkningen af små ændringer, der udføres i begyndelsen, først påvises senere i de følgende trin. Med strenghed i udviklingen af hvert trin og præcise inklusions- og eksklusionskriterier er det muligt at få flere optagelser fra det samme præparat eller endda den samme fiber.

De her beskrevne tilgange kunne tilpasses andre celletyper, herunder hjerteceller og neuroner. Derudover kan forskellige detektionssystemer, såsom højhastighedskameraer, anvendes. I øjeblikket er brugen af spændingsklemme (patch clamp eller to-elektrode spændingsklemme) begrænset på grund af det ekstra kompleksitetsniveau, der er iboende i disse teknikker44. Forbedringer af den metode, der præsenteres her (såsom lysere og mere fototable sonder) vil lette samtidig brug af FSDF med spændingsklemmemetoder.

Feltstimulering i indfødte dissocierede skeletmuskelfibre har fordelen ved at have en højere gennemstrømning end spændingsklemme og kan anvendes til undersøgelse af andre signaler, såsom udbredelse af handlingspotentiale45 eller handlingspotentialefremkaldte calciumtransienter41.

Den største fordel ved denne native celle FSDF sammenlignet med det heterologe ekspressionssystem er evnen til at detektere proteinkonformationelle ændringer som reaktion på induceret depolarisering i dets fysiologiske miljø og ved dets endogene stimulus. Det er især relevant for undersøgelsen af CaV1.1, der fungerer som spændingssensor for en anden calciumkanal, ryanodinreceptoren type 1 (RyR1), indsat i det særskilte sarkoplasmatiske retikulummembrandomæne 5,33,35. I praksis kunne det være muligt at studere den samtidige måling af fluorescerende signaler fra en spændingssensor med calciumfrigivelse fra det sarkoplasmatiske retikulum ved hjælp af en passende calciumfluorescerende indikator. Da det desuden har vist sig, at mange proteiner fra det triadiske miljø kan påvirke CaV1.1 gating 46,47,48,49,50, er undersøgelsen af spændingssensorbevægelsen i en muskelfiber af høj fysiologisk relevans. To store ulemper ved fremgangsmåden er: 1) lille amplitude af de målte signaler og 2) fotoblegning, hvilket udelukker brugen af gentagne og / eller langvarige stimuli. Forbedringer af denne teknik er nødvendige og vil gøre det muligt at kombinere FSDF med spændingsklemmeeksperimenter i voksne muskelfibre.

Anvendelse af FSDF på andre kanaler (eller receptorer) i muskelfibre er mulig, forudsat at: (1) de udtrykkes på et tilstrækkeligt niveau, (2) de er tilgængelige (fra ekstracellulært eller intracellulært rum), og (3) cysteinmodifikationen via mutagenese ikke forringer kanalfunktionen. Den komplementære anvendelse af FSDF i både heterologe og indfødte muskelfibre er nødvendig og vil være afgørende for at løse ubesvarede spørgsmål vedrørende spændingsafhængige CaV1.1-overgange, der er kritiske for muskelfunktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) for at dele EGFP-CaV1.1 (kanin) vildtypeplasmid. Vi takker Yale Department of Physiology Electronics Laboratory og især Henrik Abildgaard for design og konstruktion af fotodioden med track and hold kredsløb. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud R01-AR075726 og R01-NS103777

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hyaluronidase SIGMA ALDRICH H3884-50mg
0.5 mL Eppendorf tube Millipore Sigma EP022363719-500EA
1 mL syringe Millipore Sigma Z683531-100EA tuberculine slip tip
1/2” long 29-gauge sterile insulin needle and syringe Becton Dikinson 324702
35 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 353001
60 mm non coated plastic plate Falcon, Corning 351007
Alcoholic whip PDI B60307
Alexa-533 cube LP Chroma 49907 Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp
Arc lamp Sutter Instrumets LB-LS 672
Artificial tears cream Akorn NDC 59399-162-35
Borosilicate glass Pasteur pipet 5 3/4" VWR 14672-200
BTS (N-benzyl-p-toluene sulphonamide) SIGMA ALDRICH 203895
collagenase type I SIGMA ALDRICH C0130-1g
Cotton tip VWR VWR-76048-960-BG
Double electrode array  (for electroporation) BTX harvard apparatus 45-0120 10mm 2 needle array tips
EGFP cube Chroma 39002AT Ex: 480/30x; BS 505; Em: 535/40m
Electroporation apparatus device BTX harvard apparatus ECM 830
EPC10 HEKA Elektronik GmbH  (Harvard Bioscience) 895000
FBS Biotechne,  R&D Systems RND-S11150H Fetal Bovine Serum - Premium, Heat Inactivated
glass coverslip 35 mm dish MatTek Life Science P35G-1.5-14-C
Isoflurane Fluriso (Isoflurane) Liquid for Inhalation 502017-250ml
Isothermal heating pad Braintree scientific inc 39DP
Laminin Thermo Fisher INV-23017015 Laminin Mouse Protein, Natural
Latex bulb VWR 82024-554
LED 530 nm Sutter Instrumets 5A-530
Low binding protein 0.2 μm sterile filter Pall FG4579 acrodisk  syringe filter 0.2um supor membrane low protein binding non pyrogenic
MEM Invitrogen INV-11380037
MTS-5-TAMRA Biotium 89410-784 MTS-5-TAMRA
OriginPro Analysis Software OriginLab Corporation OriginPro 2022 (64-bit) SR1
Photodiode Custom Made NA
PlanApo 60x oil  1.4 N.A/∞/0.17 Olympus BFPC2
Platinum wire 0.5 mm, 99.9 % metals basis SIGMA 267228-1G To manufacture field stimulation electrode
Pulse Generator WPI Pulsemaster A300
Shutter drive controller Uniblitz 100-2B
Shuttter Uniblitz VS2582T0-100
S-MEM Invitrogen INV-11380037
Sterile bench pad VWR DSI-B1623
Sterile saline SIGMA ALDRICH S8776
Sylgard 184 Silicone Elastomer kit Dow Corning 1419447-1198
Vaporizer for Anesthesia Parkland Scientific V3000PK
Voltage generator Custom Made NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Catterall, W. A., Wisedchaisri, G., Zheng, N. The chemical basis for electrical signaling. Nature Chemical Biology. 13 (5), 455-463 (2017).
  2. Armstrong, C. M., Hille, B. Voltage-gated ion channels and electrical excitability. Neuron. 20 (3), 371-380 (1998).
  3. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  4. Armstrong, C. M., Bezanilla, F. Currents related to movement of the gating particles of the sodium channels. Nature. 242 (5398), 459-461 (1973).
  5. Schneider, M. F., Chandler, W. K. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature. 242 (5395), 244-246 (1973).
  6. Bezanilla, F. Gating currents. The Journal of General Physiology. 150 (7), 911-932 (2018).
  7. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiological Reviews. 80 (2), 555-592 (2000).
  8. Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
  9. Akabas, M. H. Cysteine modification: probing channel structure, function and conformational change. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 25-54 (2015).
  10. Priest, M., Bezanilla, F. Functional site-directed fluorometry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 869, 55-76 (2015).
  11. Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).
  12. Pantazis, A., Savalli, N., Sigg, D., Neely, A., Olcese, R. Functional heterogeneity of the four voltage sensors of a human L-type calcium channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 18381-18386 (2014).
  13. Savalli, N., Kondratiev, A., Toro, L., Olcese, R. Voltage-dependent conformational changes in human Ca(2+)- and voltage-activated K(+) channel, revealed by voltage-clamp fluorometry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (33), 12619-12624 (2006).
  14. Zheng, J., Zagotta, W. N. Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry. Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).
  15. Bannister, J. P. A., Chanda, B., Bezanilla, F., Papazian, D. M. Optical detection of rate-determining ion-modulated conformational changes of the ether-à-go-go K+ channel voltage sensor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (51), 18718-18723 (2005).
  16. Bruening-Wright, A., Elinder, F., Larsson, H. P. Kinetic relationship between the voltage sensor and the activation gate in spHCN channels. The Journal of General Physiology. 130 (1), 71-81 (2007).
  17. Osteen, J. D., et al. KCNE1 alters the voltage sensor movements necessary to open the KCNQ1 channel gate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22710-22715 (2010).
  18. Smith, P. L., Yellen, G. Fast and slow voltage sensor movements in HERG potassium channels. The Journal of General Physiology. 119 (3), 275-293 (2002).
  19. Gonzalez, C., Koch, H. P., Drum, B. M., Larsson, H. P. Strong cooperativity between subunits in voltage-gated proton channels. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 51-56 (2010).
  20. Gandhi, C. S., Olcese, R. The voltage-clamp fluorometry technique. Methods in Molecular Biology. 491, 213-231 (2008).
  21. Horne, A. J., Fedida, D. Use of voltage clamp fluorimetry in understanding potassium channel gating: a review of Shaker fluorescence data. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 87 (6), 411-418 (2009).
  22. Zhu, W., Varga, Z., Silva, J. R. Molecular motions that shape the cardiac action potential: Insights from voltage clamp fluorometry. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 120 (1-3), 3-17 (2016).
  23. Cowgill, J., Chanda, B. The contribution of voltage clamp fluorometry to the understanding of channel and transporter mechanisms. The Journal of General Physiology. 151 (10), 1163-1172 (2019).
  24. Catterall, W. A., Lenaeus, M. J., Gamal El-Din, T. M. Structure and pharmacology of voltage-gated sodium and calcium channels. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 60, 133-154 (2020).
  25. MacKinnon, R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature. 350 (6315), 232-235 (1991).
  26. Wu, J., et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 Å resolution. Nature. 537 (7619), 191-196 (2016).
  27. Capes, D. L., Goldschen-Ohm, M. P., Arcisio-Miranda, M., Bezanilla, F., Chanda, B. Domain IV voltage-sensor movement is both sufficient and rate limiting for fast inactivation in sodium channels. The Journal of General Physiology. 142 (2), 101-112 (2013).
  28. Cha, A., Ruben, P. C., George, A. L., Fujimoto, E., Bezanilla, F. Voltage sensors in domains III and IV, but not I and II, are immobilized by Na+ channel fast inactivation. Neuron. 22 (1), 73-87 (1999).
  29. Muroi, Y., Arcisio-Miranda, M., Chowdhury, S., Chanda, B. Molecular determinants of coupling between the domain III voltage sensor and pore of a sodium channel. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (2), 230-237 (2010).
  30. Savalli, N., et al. The distinct role of the four voltage sensors of the skeletal CaV1.1 channel in voltage-dependent activation. The Journal of General Physiology. 153 (11), e202112915 (2021).
  31. Muller, C. S., et al. Quantitative proteomics of the Cav2 channel nano-environments in the mammalian brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (34), 14950-14957 (2010).
  32. Perni, S., Lavorato, M., Beam, K. G. De novo reconstitution reveals the proteins required for skeletal muscle voltage-induced Ca2+ release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (52), 13822-13827 (2017).
  33. Beam, K. G., Horowicz, P. Excitation-Contraction Coupling in Skeletal Muscle. , McGraw-Hill. New York. (2004).
  34. Schneider, M. F., Hernandez-Ochoa, E. O. Muscle: Fundamental Biology and Mechanisms of Disease. , Academic Press, Elsevier. 811-822 (2012).
  35. Rios, E., Pizarro, G. Voltage sensor of excitation-contraction coupling in skeletal muscle. Physiological Reviews. 71 (3), 849-908 (1991).
  36. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage sensing mechanism in skeletal muscle excitation-contraction coupling: coming of age or midlife crisis. Skeletal Muscle. 8 (1), 22 (2018).
  37. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of CaV1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (40), e2026116118 (2021).
  38. DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1520 (2009).
  39. Blunck, R., Starace, D. M., Correa, A. M., Bezanilla, F. Detecting rearrangements of shaker and NaChBac in real-time with fluorescence spectroscopy in patch-clamped mammalian cells. Biophysical Journal. 86 (6), 3966-3980 (2004).
  40. Liu, Y., Carroll, S. L., Klein, M. G., Schneider, M. F. Calcium transients and calcium homeostasis in adult mouse fast-twitch skeletal muscle fibers in culture. The American Journal of Physiology. 272 (6), C1919-C1927 (1997).
  41. Hernandez-Ochoa, E. O., Vanegas, C., Iyer, S. R., Lovering, R. M., Schneider, M. F. Alternating bipolar field stimulation identifies muscle fibers with defective excitability but maintained local Ca(2+) signals and contraction. Skeletal Muscle. 6, 6 (2016).
  42. Klein, M. G., Simon, B. J., Szucs, G., Schneider, M. F. Simultaneous recording of calcium transients in skeletal muscle using high- and low-affinity calcium indicators. Biophysical Journal. 53 (6), 971-988 (1988).
  43. Irving, M., Maylie, J., Sizto, N. L., Chandler, W. K. Intrinsic optical and passive electrical properties of cut frog twitch fibers. The Journal of General Physiology. 89 (1), 1-40 (1987).
  44. Hernandez-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca(2+) release in adult skeletal muscle fibres. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 108 (3), 98-118 (2012).
  45. Banks, Q., et al. Optical recording of action potential initiation and propagation in mouse skeletal muscle fibers. Biophysical Journal. 115 (11), 2127-2140 (2018).
  46. Bannister, R. A. Bridging the myoplasmic gap II: more recent advances in skeletal muscle excitation-contraction coupling. The Journal of Experimental Biology. 219, 175-182 (2016).
  47. Bannister, R. A., Beam, K. G. Ca(V)1.1: The atypical prototypical voltage-gated Ca2+ channel. Biochimica et Biophysica Acta. 1828 (7), 1587-1597 (2013).
  48. Beard, N. A., Wei, L., Dulhunty, A. F. Ca(2+) signaling in striated muscle: the elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. European Biophysics Journal. 39 (1), 27-36 (2009).
  49. Polster, A., Perni, S., Bichraoui, H., Beam, K. G. Stac adaptor proteins regulate trafficking and function of muscle and neuronal L-type Ca2+ channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (2), 602-606 (2015).
  50. Perni, S. The builders of the junction: roles of Junctophilin1 and Junctophilin2 in the assembly of the sarcoplasmic reticulum-plasma membrane junctions in striated muscle. Biomolecules. 12 (1), 109 (2022).

Tags

Biologi nr. 196
Funktionel stedstyret fluorometri i indfødte celler til undersøgelse af skeletmuskulaturens excitabilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bibollet, H., Bennett, D. F.,… More

Bibollet, H., Bennett, D. F., Schneider, M. F., Hernández-Ochoa, E. O. Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability. J. Vis. Exp. (196), e65311, doi:10.3791/65311 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter