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Bioengineering

Rilevamento elettrico cellula-substrato per la valutazione in tempo reale dei profili tossicologici della struttura metallo-organica

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65313
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

Summary

Il seguente studio valuta il profilo tossicologico di una struttura metallo-organica selezionata utilizzando il rilevamento dell'impedenza della cellula-substrato elettrico (ECIS), una tecnica di screening in tempo reale e ad alto rendimento.

Abstract

Le strutture metallo-organiche (MOF) sono ibridi formati attraverso la coordinazione di ioni metallici e leganti organici in solventi organici. L'implementazione dei MOF in applicazioni biomediche e industriali ha sollevato preoccupazioni per quanto riguarda la loro sicurezza. In questo caso, il profilo di un MOF selezionato, una struttura zeolitica imidazolica, è stato valutato dopo l'esposizione a cellule epiteliali polmonari umane. La piattaforma per la valutazione era una tecnica in tempo reale (ad esempio, il rilevamento dell'impedenza della cella elettrica-substrato [ECIS]). Questo studio identifica e discute alcuni degli effetti deleteri del MOF selezionato sulle cellule esposte. Inoltre, questo studio dimostra i vantaggi dell'utilizzo del metodo in tempo reale rispetto ad altri saggi biochimici per valutazioni cellulari complete. Lo studio conclude che i cambiamenti osservati nel comportamento cellulare potrebbero suggerire una possibile tossicità indotta dall'esposizione a MOF di diverse caratteristiche fisico-chimiche e dal dosaggio di tali strutture utilizzate. Comprendendo i cambiamenti nel comportamento cellulare, si prevede la capacità di migliorare le strategie di sicurezza fin dalla progettazione dei MOF da utilizzare per applicazioni biomediche, adattando in modo specifico le loro caratteristiche fisico-chimiche.

Introduction

Le strutture metallo-organiche (MOF) sono ibridi formati attraverso la combinazione di ioni metallici e linker organici 1,2 in solventi organici. A causa della varietà di tali combinazioni, i MOF possiedono diversità strutturale3, porosità regolabile, elevata stabilità termica ed elevate aree superficiali 4,5. Tali caratteristiche li rendono candidati interessanti in una varietà di applicazioni, dallo stoccaggio di gas 6,7 alla catalisi8,9, e dai mezzi di contrasto 10,11 alle unità di somministrazione di farmaci 12,13. Tuttavia, l'implementazione dei MOF in tali applicazioni ha sollevato preoccupazioni relative alla loro sicurezza sia per gli utenti che per l'ambiente. Studi preliminari hanno dimostrato, ad esempio, che la funzione cellulare e la crescita cambiano in seguito all'esposizione delle cellule a ioni metallici o linker utilizzati per la sintesi di MOF 1,14,15. Ad esempio, Tamames-Tabar et al. hanno dimostrato che ZIF-8 MOF, un MOF a base di Zn, stava portando a più cambiamenti cellulari in una linea cellulare di cancro cervicale umano (HeLa) e in una linea cellulare di macrofagi di topo (J774) rispetto ai MOF a base di Zr e Fe. Tali effetti erano presumibilmente dovuti alla componente metallica di ZIF-8 (cioè Zn), che potrebbe potenzialmente indurre l'apoptosi cellulare dopo la disintegrazione della struttura e il rilascio di ioni Zn1. Allo stesso modo, Gandara-Loe et al. hanno dimostrato che HKUST-1, un MOF a base di Cu, ha causato la più alta riduzione della vitalità delle cellule di retinoblastoma di topo quando usato a concentrazioni di 10 μg/mL o superiori. Ciò era presumibilmente dovuto allo ione metallico Cu incorporato durante la sintesi di questa struttura, che, una volta rilasciato, poteva indurre stress ossidativo nelle cellule esposte15.

Inoltre, l'analisi ha dimostrato che l'esposizione a MOF con diverse caratteristiche fisico-chimiche potrebbe portare a risposte diverse delle cellule esposte. Ad esempio, Wagner et al. hanno dimostrato che ZIF-8 e MIL-160 (una struttura a base di Al), utilizzati nell'esposizione di una cellula epiteliale bronchiale umana immortalizzata, hanno portato a risposte cellulari dipendenti dalle proprietà fisico-chimiche delle strutture, vale a dire idrofobicità, dimensioni e caratteristiche strutturali16. Parallelamente, Chen et al. hanno dimostrato che una concentrazione di 160 μg/mL MIL-100(Fe) esposta a cellule epatiche umane normali (HL-7702) ha causato la maggiore perdita di vitalità cellulare, presumibilmente a causa della componente metallica di questa specifica struttura (cioè Fe17).

Mentre questi studi classificano gli effetti deleteri dei MOF sui sistemi cellulari in base alle loro caratteristiche fisico-chimiche e alle concentrazioni di esposizione, sollevando così potenziali preoccupazioni con l'implementazione del quadro, specialmente in campo biomedico, la maggior parte di queste valutazioni si basa su saggi colorimetrici a singolo punto temporale. Ad esempio, è stato dimostrato che quando sono stati utilizzati saggi di tetrazolio (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) e sale di tetrazolio solubile in acqua (WST-1), questi reagenti biochimici potrebbero portare a falsi positivi nelle loro interazioni con le particelle a cui le cellule sono state esposte18. È stato dimostrato che il sale di tetrazolio e i reagenti rossi neutri possiedono un'elevata affinità di adsorbimento o legame sulle superfici delle particelle, con conseguente interferenza del segnale dell'agente19. Inoltre, per altri tipi di saggi, come la citometria a flusso, che in precedenza si era dimostrata utilizzata per valutare i cambiamenti nelle cellule esposte ai MOF20,21, è stato dimostrato che i principali problemi devono essere aggirati se si vuole prendere in considerazione un'analisi praticabile degli effetti deleteri delle particelle. In particolare, devono essere affrontati gli intervalli di rivelazione delle dimensioni delle particelle, specialmente in popolazioni miste come quelle offerte dai MOF o i riferimenti delle particelle utilizzate per la calibrazione prima dei cambiamenti cellulari22. È stato anche dimostrato che il colorante utilizzato durante la marcatura cellulare per tali saggi citometrici potrebbe anche interferire con le nanoparticelle a cui le cellule sono state esposte23.

L'obiettivo di questo studio era quello di utilizzare un saggio di valutazione in tempo reale e ad alto rendimento per valutare i cambiamenti nel comportamento cellulare in seguito all'esposizione a un MOF selezionato. Le valutazioni in tempo reale possono aiutare a fornire informazioni sugli effetti dipendenti dal tempo, in relazione alle finestre di esposizione16. Inoltre, forniscono informazioni sui cambiamenti nelle interazioni cellula-substrato, sulla morfologia cellulare e sulle interazioni cellula-cellula, nonché su come tali cambiamenti dipendano rispettivamente dalle proprietà fisico-chimiche dei materiali di interesse e dai tempi di esposizione24,25.

Per dimostrare la validità e l'applicabilità dell'approccio proposto, sono state utilizzate cellule epiteliali bronchiali umane (BEAS-2B), ZIF-8 (una struttura idrofobica di imidazolatozeolitico 16) e rilevamento dell'impedenza cellula-substrato elettrico (ECIS). Le cellule BEAS-2B rappresentano un modello per l'esposizione polmonare 26 e sono state precedentemente utilizzate per valutare i cambiamenti in seguito all'esposizione delle cellule alle nanoargille e ai loro sottoprodotti degradati termicamente26,27,28, nonché per valutare la tossicità dei nanomateriali, come i nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT)18. Inoltre, tali cellule sono state utilizzate per più di 30 anni come modello per la funzione epiteliale polmonare29. ZIF-8 è stato scelto per la sua ampia implementazione nella catalisi30 e come mezzo di contrasto31 per il bioimaging e la somministrazione di farmaci32, e quindi per l'esteso potenziale di esposizione polmonare durante tali applicazioni. Infine, ECIS, la tecnica non invasiva in tempo reale, è stata precedentemente utilizzata per valutare i cambiamenti nell'aderenza, nella proliferazione, nella motilità e nella morfologia cellulare 16,26 come risultato di una varietà di interazioni tra analiti (sia materiali che farmaci) e cellule esposte in tempo reale 16,18,28. ECIS utilizza una corrente alternata (AC) per misurare l'impedenza delle celle immobilizzate sugli elettrodi d'oro, con le variazioni di impedenza che forniscono informazioni sui cambiamenti di resistenza e capacità all'interfaccia del substrato cellula-oro, sulla funzione di barriera indotta dalle interazioni cellula-cellula e sulla copertura dello strato sovracellulare di tali elettrodi d'oro33,34. L'utilizzo di ECIS consente misurazioni quantitative con una risoluzione su scala nanometrica in modo non invasivo e in tempo reale26,34.

Questo studio valuta e confronta la semplicità e la facilità di valutazione dei cambiamenti indotti da MOF nel comportamento cellulare in tempo reale con le valutazioni dei saggi a punto singolo. Tale studio potrebbe essere ulteriormente estrapolato per valutare i profili cellulari in risposta all'esposizione ad altre particelle di interesse, consentendo così test delle particelle sicuri fin dalla progettazione e il successivo aiuto per l'implementazione. Inoltre, questo studio potrebbe integrare i saggi genetici e cellulari che sono valutazioni a punto singolo. Ciò potrebbe portare a un'analisi più informata degli effetti deleteri delle particelle sulla popolazione cellulare e potrebbe essere utilizzato per lo screening della tossicità di tali particelle in modo ad alto rendimento16,35,36.

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Protocol

1. Sintesi di ZIF-8

  1. Ai fini di questo esempio, utilizzare un rapporto di massa 1:10:100 (metallo:linker:solvente) per sintetizzare lo ZIF-8. Per questo, misurare il nitrato di zinco esaidrato e registrare la misurazione. Utilizzare il rapporto di massa di esempio per calcolare la quantità necessaria per il linker, il 2-metilimidazolo e il solvente (cioè il metanolo).
  2. Mettere l'esaidrato di nitrato di zinco e il linker in due diverse fiale di vetro. Aggiungere metà della quantità calcolata di metanolo al nitrato di zinco esaidrato e l'altra metà al linker. Lasciare che ogni soluzione si sciolga.
  3. Combinare le due soluzioni (ad esempio, soluzioni contenenti rispettivamente il metallo e il linker). Posizionare il contenitore con la soluzione combinata per la reazione su una piastra di agitazione e agitare a 700 giri/min per 24 ore a temperatura ambiente (RT).

2. Collezione ZIF-8

  1. Una volta conclusa la reazione di cui sopra (cioè dopo 24 ore), mettere la soluzione in provette da centrifuga da 50 mL e centrifugare a 3.075 x g per 5 minuti (utilizzare quantità uguali e bilanciare il rotore). Rimuovere i surnatanti dalle provette centrifugate.
  2. Aggiungere metanolo (5-15 ml) alle provette da centrifuga e ridisperdere le particelle.
  3. Ripetere le fasi di centrifugazione e lavaggio almeno altre due o quattro volte. Dopo l'ultimo lavaggio, scaricare il surnatante.
    NOTA: Le fasi di lavaggio rimuovono tutte le specie non precipitate.
  4. Rimuovere i coperchi dei tubi e posizionare sopra il nastro parafilm; Successivamente, fai dei buchi nel parafilm. Porre la/e provetta/e contenente il campione in una camera a vuoto a RT ad asciugare per 24 ore.

3. Morfologia superficiale ZIF-8 (microscopia elettronica a scansione [SEM])

  1. Montare le polveri secche di ZIF-8 su nastro di carbonio e farfugliare per 120 s con oro-palladio per evitare qualsiasi carica che potrebbe verificarsi durante l'analisi SEM.
  2. Impostare la tensione di accelerazione del microscopio a 15 kV. Mettere a fuoco le particelle e regolare l'ingrandimento (sono stati utilizzati ingrandimenti di 500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x e 40.000x).
  3. Visualizzare le particelle sotto l'ingrandimento che consente sia una chiara valutazione della dimensione delle particelle che della morfologia (si consiglia di considerare gli intervalli per particelle di 5 μm, 10 μm e 20 μm).
  4. Raccogli i dati da almeno tre diversi campi visivi e, per ciascuno, considera diversi ingrandimenti.

4. Composizione elementare ZIF-8

  1. Segui i passaggi per l'imaging SEM.
  2. Utilizzando l'unità di spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX) del microscopio SEM, analizzare la composizione elementare del campione.
  3. Assicurarsi che la tensione di accelerazione e l'ingrandimento SEM corrispondano al monitor EDX. Spegnere la telecamera a infrarossi sul microscopio SEM.
  4. Sul monitor EDX, vai su Collect Spectrum e inserisci un tempo di raccolta di 200 s. Questo è raccomandato per evitare la carica e la disintegrazione delle particelle che potrebbero portare a false valutazioni.
  5. Raccogli dati da almeno tre diversi campi visivi. Una volta terminata la raccolta, analizza i dati e identifica gli elementi di interesse.

5. Colture cellulari

  1. La coltura ha immortalato le cellule BEAS-2B in terreni integrati con il 5% di siero fetale bovino (FBS) e lo 0,2% di penicillina/streptomicina.
    NOTA: I passaggi compresi tra 5 e 10 devono essere utilizzati per garantire che non si siano verificati cambiamenti fenotipici nel lotto di cellule utilizzato37 (tutti i reagenti sono elencati nella tabella dei materiali).
  2. Prelevare una piastra di coltura cellulare da 100 mm e posizionare 10 mL di terreno sulla piastra. Aggiungere 1 mL della soluzione cellulare BEAS-2B alla piastra.
  3. Mettere la piastra in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2 ) e lasciare crescere le cellule.
  4. Controllare la piastra dopo 24 ore per determinare se le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza. In questo caso, la confluenza dell'80% si riferisce alla percentuale della superficie coperta da cellule aderenti. In caso contrario, cambiare il terreno e lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere il livello di confluenza dell'80%.

6. Conteggio delle cellule

  1. Una volta che le cellule sulla piastra hanno raggiunto una confluenza dell'80%, rimuovere il terreno dalla piastra. Lavare la piastra con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
  2. Rimuovere il PBS dalla piastra. Aggiungere 2 mL di tripsina alla piastra e metterla nell'incubatrice (37 °C, 5% CO 2 ) per2 min.
  3. Aggiungere 2 mL di terreno alla piastra e pipettare il terreno verso l'alto e verso il basso per rimuovere le cellule dalla piastra. Trasferire la soluzione in una provetta da 15 mL e centrifugare a 123 x g per 5 min.
  4. Rimuovere il surnatante dalla provetta e aggiungere 2 mL di terreno. Pipettare il terreno su e giù per disperdere nuovamente le cellule.
  5. Utilizzando una provetta da 1,5 mL, aggiungere 20 μL di blu di tripano e poi 20 μL di soluzione cellulare (rapporto 1:1 di blu di tripano:soluzione cellulare).
  6. Posizionare 10 μL della miscela cellulare su un vetrino e posizionarlo su un contatore automatico di cellule. Attendi che lo schermo sia a fuoco, quindi seleziona Acquisisci.
  7. Lo schermo visualizza il numero di cellule vive e la vitalità delle cellule. L'intervallo di misurazione si estende da 1 x 10a 4-1 x 107 celle.
  8. In alternativa, contare le cellule manualmente utilizzando un emocitometro.
    1. A tale scopo, aggiungere 15-20 μL della soluzione cellulare trattata con tripano blu all'emocitometro.
    2. Utilizzare un microscopio verticale con una messa a fuoco dell'obiettivo 10x sulle linee della griglia dell'emocitometro.
    3. Conta il numero di celle nei quattro quadrati esterni e dividi il numero per quattro. Quindi, moltiplica per 10.000 per ottenere il numero di cellule vive.
    4. Per calcolare la vitalità cellulare, sommare il conteggio delle cellule vive e morte per ottenere il conteggio totale delle cellule e successivamente dividere il conteggio delle cellule vive per il conteggio totale delle cellule.

7. Preparazione della dose di ZIF-8

  1. Preparare una soluzione madre di ZIF-8 da 1 mg/mL. Per questo, misurare la quantità di ZIF-8 e aggiungere acqua deionizzata (DI) alle particelle per raggiungere una concentrazione di 1 mg/mL.
  2. Sonicare (impostare il sonicatore su sonics) la soluzione madre ZIF-8 per 2 minuti a intervalli di 30 s a bagnomaria.
  3. Effettuare diverse dosi di ZIF-8 per le esposizioni cellulari calcolando la quantità di soluzione madre e il mezzo modificato di aquila di Dulbecco (DMEM) necessari per raggiungere le dosi desiderate utilizzando l'equazione C 1V1 = C 2 V2. Le dosi variano da 0 a 950 μg/mL.
    NOTA: In questo esperimento, sono state selezionate dosi di 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL e 950 μg/mL.

8. Concentrazione inibitoria semimassima (IC 50)

  1. Dopo il conteggio delle cellule, seminare le cellule BEAS-2B a una densità di 4 x 104 cellule/mL in una piastra da 96 pozzetti, con un volume di 100 μL/pozzetto.
    1. Per raggiungere una densità di 4 x 104 cellule/mL, utilizzare C 1 V1= C 2 V2per calcolare la quantità di soluzione cellulare da combinare con il terreno.
    2. Assicurarsi di mantenere i pozzetti vuoti per ogni dose; lasciare questi pozzetti vuoti fino all'esposizione a ZIF-8.
  2. Posizionare la piastra a 96 pozzetti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 e lasciare crescere le cellule fino a diventare un monostrato confluente per 24 ore.
  3. Rimuovere il terreno dai pozzetti ed esporre le cellule BEAS-2B a dosi di ZIF-8 comprese tra 0 e 950 μg/mL. Aggiungere 100 μL di ZIF-8 ai rispettivi pozzetti bianchi e cellulari.
  4. Riposizionare le piastre a 96 pozzetti nell'incubatore per un tempo di esposizione di 48 ore.
  5. Dopo l'esposizione, aggiungere 10 μL di 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disolfonato (WST-1) a ciascun pozzetto (bianco e pozzetto cellulare) e incubare per 2 ore. I media rimangono nei pozzi; Il rapporto è 1:10 (reagente:media).
  6. Leggere le variazioni dell'assorbanza su un lettore di piastre utilizzando un'assorbanza di 485 nm.
  7. Calcolare la vitalità della cella tramite il software per determinare il valore IC50 (vedere la sezione 10).

9. Rilevamento dell'impedenza elettrica della cella-substrato (ECIS)

  1. Utilizzare una piastra a 96 pozzetti (96W10idf) per eseguire l'analisi ECIS. La piastra28 contiene elettrodi di connessione a dito interdigitati che coprono un'area di circa 4 mm2.
  2. Innanzitutto, verificare che tutti i pozzetti vengano letti dai sensori. Per questo, posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla stazione del pozzetto e fare clic sul pulsante Setup .
  3. Se i pozzetti sono collegati correttamente, apparirà il verde; Tutti i pozzi non collegati saranno identificati come rossi. In tal caso, rimuovere e reinserire la piastra del pozzetto e fare nuovamente clic sul pulsante Setup , fino a quando tutti i pozzetti non offrono letture verdi praticabili.
  4. Stabilizzare gli elettrodi per 40 minuti con 200 μL di terreno per pozzetto per evitare la deriva del potenziale. Aggiungere 200 μL di terreno a ciascun pozzetto utilizzato, quindi posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla stazione ECIS. Fare clic su Setup/Check (Imposta/Verifica) per assicurarsi che la piastra sia collegata correttamente. Fare clic su Stabilizza.
  5. Una volta completata la stabilizzazione, rimuovere la piastra dalla stazione e rimuovere il terreno da ciascun pozzetto.
  6. Seminare le cellule BEAS-2B a una densità di 4 x 104 cellule/mL, con un volume di 100 μL per pozzetto, nei pozzetti contenenti le cellule e posizionare la piastra sulla stazione ECIS nell'incubatore.
  7. Sul monitor, fare clic su Verifica per determinare che tutti gli elettrodi vengono letti dai sensori sulla stazione.
  8. Impostare la misurazione dell'andamento del tempo selezionando MFT (Multiple Freq/Time). Il programma misurerà ogni pozzetto a sette diverse frequenze.
  9. Fare clic su Start e lasciarlo funzionare per 24 ore in modo che le celle possano formare un monostrato confluente.
  10. Dopo 24 ore, i pozzetti contenenti le cellule mostreranno una maggiore resistenza sul monitor. Questo è un indicatore che le cellule si sono attaccate agli elettrodi.
  11. Premere Pausa sul monitor per interrompere la raccolta dei dati.
  12. Effettuare le dosi di ZIF-8 al di sopra e al di sotto del valore IC50 calcolato seguendo i passaggi descritti nella sezione 7 di cui sopra.
  13. Esporre le nanoparticelle ZIF-8 ai rispettivi pozzetti vuoti e cellulari a un volume di 100 μL per pozzetto e riposizionare la piastra a 96 pozzetti sulla stazione.
  14. Fare nuovamente clic su Controlla sul monitor per assicurarsi che i sensori leggano tutti gli elettrodi. Fare clic su Riprendi e consentire al sistema di funzionare per 72 ore per monitorare il comportamento cellulare e l'allegato.
  15. Una volta terminata la raccolta dei dati, fare clic su Fine sul monitor. Per salvare il file, fare clic su File > Salva con nome. Salvare i dati come file di foglio di calcolo.
  16. Per ottenere i parametri alfa, fare clic su Modello. Nella finestra pop-up dello schermo, fai clic su Contenitore solo media, quindi seleziona il contenitore che contiene solo contenuti multimediali.
  17. Fate clic su Imposta rif. Sul monitor, fare clic su Trova.
  18. Se il pozzetto mostrato nel sistema non è lo stesso di quello scelto, ripetere il passaggio 9.16.
  19. Fare clic su Imposta. Fare clic su Adatta intervallo T per determinare l'intervallo di tempo desiderato per la raccolta dei dati.
  20. Durante l'elaborazione, fare clic su Alpha. Quando il sistema termina l'analisi, fare clic su Salva RbA e salvarlo come file di foglio di calcolo.
    NOTA: Fare riferimento al manuale ECIS, disponibile sul sito Web del produttore38.

10. Analisi dei dati

  1. SEM
    1. Aprire il software di imaging per analizzare le immagini SEM. Fare clic su File > Apri, quindi selezionare l'immagine da analizzare.
    2. Fare clic su Immagine > Digitare > 8 bit per convertire l'immagine in scala di grigi per eseguire l'operazione di soglia.
    3. Calibrare la misurazione della distanza dei pixel in micron. Fare clic sullo strumento Linea retta e tracciare la lunghezza di ogni particella da misurare.
    4. Fare clic su Analizza e quindi su Imposta scala. La distanza nota verrà impostata sulla lunghezza della dimensione della barra della scala sull'immagine SEM. L'unità di lunghezza nota sarà impostata su micron. Selezionare Globale e premere Ok.
    5. Fare clic sullo strumento Linea retta e tracciare il diametro della particella, quindi selezionare Analizza e misura. Registrare il risultato della lunghezza.
    6. Ripetere l'operazione per tutte le immagini raccolte. Calcolare la media di tutti i diametri di almeno 60 particelle per un'adeguata valutazione statistica.
  2. EDX
    1. Calcola la media di tutte le percentuali di peso di ciascun elemento insieme da tutte le immagini raccolte (vedi la sezione EDX sopra).
    2. Utilizzando un foglio di calcolo, traccia un grafico a barre di ciascun elemento sull'asse x e la percentuale media del peso elementare sull'asse y.
  3. IC50
    1. Calcolare la media dei pozzetti vuoti e calcolare la media dei pozzetti di dose per ogni replica.
    2. Calcolare il bianco regolato sottraendo la media del bianco di controllo dalla media del bianco della dose. Calcolare il valore reale delle cellule per ciascuna dose sottraendo il bianco aggiustato dal valore medio della dose.
    3. Sottrarre il valore del bianco aggiustato per ciascuna dose dal valore medio di controllo. Calcolare la vitalità cellulare di ciascuna dose utilizzando l'equazione: vitalità cellulare = (valore reale della cellula/(valore di controllo - valore del bianco aggiustato)) x 100.
    4. Ripetere l'operazione per tutte le altre repliche.
    5. Calcolare la media della vitalità cellulare per ciascuna replica insieme per ottenere la vitalità cellulare finale per ciascuna dose.
    6. Nel software, scegli la scheda XY sullo schermo.
    7. Inserire i valori di concentrazione (dose) nella colonna X e la vitalità cellulare (%) di ciascuna dose nella colonna Y.
    8. Trasformare i valori X facendo clic su Analizza > Trasforma > Ok, quindi su Trasforma X = Log(X).
    9. Normalizzare i valori Y selezionando il foglio Dati trasformati , facendo clic su Analizza e quindi selezionando Normalizza.
    10. Selezionare il foglio dati Normalizza trasformazione , fare clic su Analizza e selezionare Regressione non lineare (adattamento curva). Selezionare Dose-Risposta-Inibizione e fare clic su Log(Inibitore) Vs. Pendenza variabile di risposta (quattro parametri). Fare clic su OK per visualizzare i risultati.
  4. ECIS
    1. Dal foglio di calcolo, prendi le colonne di resistenza (ohm) per ogni replica (pozzetti vuoti e pozzetti di dose) e calcola la media insieme dalla frequenza di 4.000 Hz. Questa frequenza consente la valutazione del contatto cellula-cellula38.
    2. Calcolare la resistenza corretta sottraendo la media del bianco dalla dose media per ogni replica. Calcolare la media della resistenza corretta per le repliche per ciascuna dose.
    3. Ripetere gli stessi passaggi per i valori alfa per calcolare il parametro alfa medio. Rappresentare graficamente l'asse x come tempo (h) e l'asse y come valori medi di resistenza/alfa per ciascun valore di dose.

11. Analisi statistica

  1. SEM
    1. Eseguire una deviazione standard nel file del foglio di calcolo in cui sono stati calcolati i diametri medi delle particelle ZIF-8.
    2. Utilizzando la funzione STDEV nel foglio di calcolo, evidenziare i dati delle 60 particelle e fare clic su Invio. Rappresentare graficamente la deviazione standard per ogni diametro medio calcolato.
  2. EDX
    1. Analogamente a SEM (passaggi 11.1.1-11.1.2), calcola la deviazione standard per ogni composizione elementare media utilizzando la funzione STDEV nel foglio di calcolo. Rappresentare graficamente le deviazioni standard per ogni composizione elementare media.
  3. IC50
    1. Aprire il software utilizzato per il calcolo dell'IC50 e fare clic su Scheda tecnica raggruppata.
    2. Inserire le dosi ZIF-8 nelle righe etichettate Gruppo A, Gruppo B, ecc. Inserire la vitalità cellulare media per ciascuna dose e replicarla nella colonna corrispondente alla dose ZIF-8.
    3. Fare clic su Analizza e, in Analisi colonne, selezionare ANOVA unidirezionale (e non parametrica o mista).
    4. Nella scheda Progettazione sperimentale , selezionare Nessuna corrispondenza o abbinamento. In Distribuzione gaussiana dei residui, selezionare Sì usa ANOVA. Infine, seleziona Sì Usa test ANOVA ordinario in Presumi SD uguali.
    5. Nella scheda Confronti multipli selezionare Confronta la media di ogni colonna con la media di una colonna di controllo. Fare clic su OK per visualizzare i risultati.

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Representative Results

Utilizzando una comune linea cellulare modello in vitro 39 (BEAS-2B), questo studio mirava a dimostrare la fattibilità e l'applicabilità dell'ECIS per valutare i cambiamenti nel comportamento cellulare in seguito all'esposizione a un MOF sintetizzato in laboratorio. La valutazione di questi cambiamenti è stata integrata dall'analisi mediante saggi colorimetrici convenzionali.

Le caratteristiche fisico-chimiche del quadro sono state prima valutate per garantire la riproducibilità dei metodi impiegati, la validità dei risultati ottenuti e le relative discussioni di tali risultati. L'analisi della morfologia superficiale di ZIF-8, ad esempio, è stata eseguita tramite SEM; le immagini hanno mostrato che le strutture mostravano una morfologia rombica del dodecaedro40 e avevano una dimensione media di 62,87 nm ± 9,61 nm (Figura 1A). La composizione elementare dei MOF è stata determinata tramitespettroscopia EDX. I risultati hanno mostrato che la composizione principale di ZIF-8 consisteva in C, N e Zn (cioè la composizione del linker dell'imidazolato e dello ione metallico, Zn16) (Figura 1B). Precedenti diffrazioni di raggi X hanno mostrato che le fasi cristalline di ZIF-8 hanno identificato picchi specifici a 10,33°, 12,8°, 14,7°, 16,5° e 18°, con tali picchi attribuiti ai piani (002), (112), (022), (013) e (222), rispettivamente, 16,41.

Per lo screening del comportamento cellulare proposto, è stato determinato l'IC 50 (concentrazione in cui ZIF-8 inibisce la crescita cellulare del50 %)29. Per questo, le cellule sono state esposte a ZIF-8 per 48 ore a dosi comprese tra 0 e 950 μg/mL (Figura 2A). Il grafico dose-risposta delle cellule esposte è mostrato nella Figura 2B, con il successivo IC50 registrato di 35,7 μg/mL. Inoltre, l'analisi ha rivelato una tendenza dose-dipendente nella vitalità delle cellule dopo l'esposizione allo ZIF-8.

Dopo aver determinato l'IC50, è stata eseguita l'analisi ECIS. In breve, ECIS è stata utilizzata come strategia di screening in tempo reale di BEAS-2B esposti a MOF ZIF-8 a IC50, nonché al di sotto e al di sopra di questa concentrazione, vale a dire 15,7 μg/mL (C1), 35,7 μg/mL (C2), 55,7 μg/mL (C3) e 75,7 μg/mL (C4) rispettivamente, con le cellule esposte per un periodo totale di 72 ore. L'inclusione di ECIS è stata concepita per consentire di determinare i cambiamenti nella copertura cellulare, nella morfologia e nella vitalità, il tutto in tempo reale. I risultati dell'ECIS sono stati registrati come cambiamenti nella resistenza e cambiamenti nelle interazioni cellula-substrato, in particolare il parametro alfa42.

Gli andamenti di resistenza sono visualizzati nella Figura 3A come cambiamenti nei profili delle cellule trattate con ZIF-8 rispetto al controllo (linea nera) (cioè celle non esposte). In particolare, l'analisi ha mostrato che i pozzetti contenenti cellule sugli elettrodi d'oro esposti a dosi di C2-C4 hanno mostrato un leggero aumento iniziale della resistenza immediatamente dopo l'esposizione delle cellule alle strutture (tutte relative al controllo [cioè cellule non esposte]). Questi cambiamenti iniziali sono stati successivamente seguiti da forti diminuzioni delle resistenze registrate, con tali diminuzioni prevalenti tra 6-8 ore dall'esposizione (Figura 3A). È stata osservata una completa perdita di resistenza dopo 14-18 ore dal tempo di esposizione. Le cellule esposte a dosi inferiori al valore IC50 hanno mostrato resistenze, come i pozzetti con le celle di controllo, fino a circa 16-18 ore dall'esposizione, quando compaiono perdite di resistenza. Inoltre, durante l'esposizione cellulare, è stata osservata una continua perturbazione del segnale dei pozzetti utilizzati negli esperimenti. Queste perturbazioni sono persistite durante l'analisi del parametro alfa (Figura 3B), con questa analisi che mostra ulteriormente che le cellule esposte cambiano le loro interazioni cellula-substrato con profili simili a quelli di resistenza. Inoltre, tali cambiamenti dipendevano dal tempo trascorso dall'esposizione e dalla dose utilizzata in tale esposizione.

Figure 1
Figura 1: Immagine SEM e composizione elementare media delle particelle ZIF-8. (A) Immagine SEM rappresentativa delle particelle ZIF-8. (B) Composizione elementare media delle particelle ZIF-8 (± barre di deviazione standard [SD]). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Vitalità cellulare. (A) Schema di trattamento cellulare (creato con Biorender.com). (B) Vitalità delle cellule BEAS-2B esposte a particelle ZIF-8 a dosi comprese tra 0 e 950 μg/mL; questa analisi è stata utilizzata per determinare l'IC50 (± barre SD; ***p = 0,0001 e **** p < 0,0001 rispetto al controllo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Resistenza cellulare rappresentativa e cambiamenti nell'attacco cellulare. (A) Resistenza cellulare rappresentativa delle cellule BEAS-2B esposte a particelle ZIF-8 al di sotto, al di sopra e al di sopra della concentrazione di IC50. (B) Cambiamenti nell'attacco cellulare (cioè cambiamenti nel parametro alfa) delle cellule BEAS-2B quando esposte a particelle ZIF-8 al di sotto e al di sopra della concentrazione di IC50. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Analisi precedenti hanno mostrato che l'ECIS potrebbe essere utilizzato per valutare il comportamento delle cellule esposte agli analiti (ad esempio, nanotubi di carbonio35, farmaci43 o nanoargille16). Inoltre, Stueckle et al. hanno utilizzato ECIS per valutare la tossicità delle cellule BEAS-2B esposte alle nanoargille e ai loro sottoprodotti e hanno scoperto che il comportamento cellulare e l'attaccamento dipendevano dalle caratteristiche fisico-chimiche di tali materiali42. In questo articolo, ci siamo proposti di determinare i possibili cambiamenti delle cellule BEAS-2B in risposta all'esposizione ai MOF, per contribuire così al corpo di conoscenze volte a differenziare eventuali effetti deleteri di ZIF-8 sui sistemi cellulari in vitro, il tutto in modo ad alto rendimento e in tempo reale.

L'analisi ha permesso in primo luogo di valutare le proprietà della struttura per aiutare a correlare i cambiamenti nel comportamento cellulare alle proprietà fisico-chimiche dei MOF testati44. In particolare, dopo l'esposizione cellulare a MOF con geometrie regolari di composizione elementare simile (vedi risultati sopra), l'analisi ha mostrato cambiamenti nel comportamento cellulare, presumibilmente derivanti dall'assorbimento delle strutture e dalla degradazione cellulare del loro profilo. In particolare, in termini di assorbimento, precedenti analisi della tossicità su materiali idrofobici, come questo quadro, hanno mostrato che quando tali materiali sono esposti alle cellule, il loro assorbimento è più dannoso per una membrana cellulare rispetto all'assorbimento delle loro controparti idrofile, presumibilmente a causa della loro capacità di rimuovere i lipidi dal doppio strato strutturale della membrana16. 45 durante la loro traslocazione cellulare, portando così a disfunzioni di membrana o perturbazioni della membrana plasmatica46,47. In particolare, è stato dimostrato che la rimozione dei lipidi porta a cambiamenti nell'integrità della membrana, nella segnalazione cellulare48 e in un aumento dell'assorbimento cellulare49, con un aspetto negativo degli effetti sulla funzione cellulare. Ad esempio, Farcal et al. hanno dimostrato che un nanomateriale idrofobico di TiO2 ha un maggiore effetto citotossico rispetto alla sua controparte idrofila nei macrofagi alveolari esposti50. Inoltre, Wagner et al., hanno dimostrato che ZIF-8 idrofobico ha causato una maggiore interruzione delle cellule BEAS-2B rispetto a MIL-160 idrofilo16.

I cambiamenti registrati nel comportamento cellulare sono presumibilmente dovuti a disturbi nelle interazioni cellula-substrato26 e/o alla vitalità e proliferazione cellulare16 sugli elettrodi a seguito dell'esposizione della cellula alla struttura selezionata. Ad esempio, Wagner et al. hanno valutato parametri simili in cellule esposte a nanoargille. Gli autori hanno scoperto che nel corso degli esperimenti di 72 ore è stata osservata una perdita completa dell'interazione cellula-substrato. Inoltre, gli autori hanno dimostrato un effetto dipendente dal tempo sulla vitalità e sulla proliferazione cellulare quando i BEAS-2B sono stati esposti alle loro nanoargille selezionate26. Mentre le particelle qui testate sono MOF, la possibile associazione estesa con gli effetti osservati per le nanoargille è fattibile, poiché alcune delle caratteristiche fisico-chimiche di queste particelle (vale a dire dimensioni, idrofobicità e composizione) sono simili a quelle dei MOF. Inoltre, Stueckle et al. hanno anche dimostrato un comportamento cellulare dipendente dal tempo e dal trattamento quando le nanoargille sono state esposte a cellule BEAS-2B immortalizzate. Altri hanno dimostrato che ZIF-8, alla dose di 100 μg/mL, fa sì che le cellule BEAS-2B abbiano una perdita completa del monostrato cellulare e della vitalità cellulare, presumibilmente a causa di cambiamenti nelle interazioni cellula-substrato16. Si nota, tuttavia, che in tali studi, le particelle ZIF-8 sono state ottenute in diverse condizioni di sintesi (ad esempio, 10 min contro 24 ore utilizzate in questo studio), con tali condizioni di sintesi che hanno successivamente portato a diverse forme/morfologie delle strutture per supportare così le conclusioni precedenti. Ciò dimostra che il tempo di reazione6, la temperatura2 e il solvente44 utilizzati durante la sintesi delle particelle influenzano la loro forma, dimensione e profili di composizione e, di conseguenza, portano a effetti e comportamenti differenziali nelle cellule esposte.

L'analisi ha anche mostrato che le cellule esposte a dosi di ZIF-8 al di sotto del valore IC50 mostravano resistenze simili a quelle dei controlli, presumibilmente perché tali dosi non erano abbastanza significative da indurre una trasformazione cellulare osservabile da ECIS nelle condizioni e nel periodo di tempo in cui sono stati intrapresi questi esperimenti. Tuttavia, a dosi superiori a IC50, è stata osservata una completa perdita della resistenza cellulare e solo entro poche ore dall'esposizione, molto probabilmente a causa di cambiamenti nella vitalità cellulare e di possibili cambiamenti indotti nelle interazioni cellula-substrato16 (Figura 3A). Queste affermazioni sono supportate da studi precedenti che hanno dimostrato che le cellule non vitali cambiano la loro forma e si staccano dai substrati. Ad esempio, Verma et al. hanno utilizzato una tecnica di rilevamento dell'impedenza in tempo reale per valutare la citotossicità delle nanoargille in una linea cellulare epiteliale alveolare umana (A549). È stato dimostrato che le nanoargille di tipo piastrinico hanno causato un aumento del numero di cellule distaccate e deformate rispetto alle nanoargille di tipo tubolare51. Inoltre, Xiao et al. hanno dimostrato che il citoscheletro delle cellule fibroblastiche V79 era compromesso quando esposto al cloruro di cadmio, a causa di un afflusso di acqua, ioni extracellulari e sostanze chimiche citotossiche dal terreno di coltura. I cambiamenti nel citoscheletro cellulare hanno portato alla perdita delle interazioni cellula-substrato. Inoltre, quando il cloruro di benzalconio è stato esposto alle cellule V79, c'è stata una significativa diminuzione della resistenza cellulare, a causa del danno alla membrana cellulare che l'esposizione ha causato52.

Inoltre, i cambiamenti nella resistenza possono essere dovuti alle reazioni cellulari alle caratteristiche fisico-chimiche di ZIF-8. In particolare, ZIF-8 è una struttura idrofobica; Precedenti analisi hanno dimostrato che l'idrofobicità può causare un aumento della tossicità16. Gli ioni metallici, come lo Zn, hanno anche dimostrato in precedenza di indurre un grado più elevato di tossicità rispetto ad altri metalli come Zr e Fe1 , vale a dire, contribuendo probabilmente a una maggiore morte cellulare.

È stato inoltre dimostrato che tutte le cellule hanno registrato una diminuzione iniziale della resistenza subito dopo l'esposizione, seguita da un successivo aumento. Eldawud et al. hanno dimostrato effetti simili quando gli SWCNT sono stati esposti alle cellule BEAS-2B. Gli autori hanno interpretato l'aumento della resistenza cellulare come dovuto al fatto che le cellule BEAS-2B hanno superato i disturbi causati dall'esposizione dei materiali e successivamente hanno riacquistato la loro integrità18 , il tutto eliminando la deriva degli elettrodi28, per garantire così la riproducibilità dell'analisi dei dati (vedi manuale ECIS).

Anche se questo studio ha dimostrato che l'ECIS potrebbe essere uno strumento prezioso da utilizzare nello screening del comportamento cellulare, soprattutto grazie alla caratteristica ad alto rendimento, si raccomanda che la tecnica non sostituisca i saggi a singolo punto temporale quando si desidera un quadro completo della valutazione deleteria di un materiale. In particolare, il saggio single point potrebbe consentire ulteriormente la valutazione della trasformazione cellulare a livello genetico 45,53, come mostrato da Eldawud et al., ad esempio per le cellule BEAS-2B esposte a nanodiamanti e attraverso il cell sorting attivato dalla fluorescenza (FACS)45.   Yu et al., hanno anche utilizzato FACS per valutare le cellule tumorali del colon umano (HCT0116) esposte a nanoparticelle di silice mesoporosa modificata con acido ialuronico (HA-MSNs)54.

I risultati presentati suggeriscono che la via del cambiamento dipende dalle caratteristiche fisico-chimiche dei MOF, nonché dal tempo e dal dosaggio di tali strutture utilizzate nelle esposizioni. I risultati e i metodi qui descritti sottolineano ulteriormente l'importanza delle misurazioni in tempo reale e i loro vantaggi nella comprensione dei cambiamenti nei profili cellulari. Questi possono potenzialmente essere integrati con ulteriori saggi biochimici per valutare il meccanismo di tossicità, portando così a strategie sicure fin dalla progettazione di MOF che non hanno effetti deleteri sul comportamento cellulare, registrati come attacco cellulare, interazioni cellula-cellula o interazioni cellula-substrato.

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Disclosures

Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato in parte dal programma T32 del National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (T32 GM133369) e dalla National Science Foundation (NSF 1454230). Inoltre, vengono riconosciute le strutture di ricerca condivise della WVU e l'assistenza e il supporto di biofisica applicata.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)  Roche 5015944001
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25255-056
100 mm plates Corning 430167
1300 Series A2 biofume hood Thermo Scientific 323TS
2510 Branson bath sonicator Process Equipment & Supply, Inc.  251OR-DTH
2-methylimidazole, 97% Alfa Aesar 693-98-1
5 mL sterile microtube Argos Technologies T2076S-CA
50 mL  tubes  Falcon 352098
96W10idf well plates Applied Biophysics  96W10idf PET
96-well plates Fisherbrand FB012931
Biorender Biorender N/A
Countess cell counting chamber slides Invitrogen C10283
Countess II FL automated cell counter Life Technologies C0916-186A-0303
Denton Desk V sputter and carbon coater Denton Vacuum N/A
Dimethly sulfoxide  Corning 25-950-CQC
DPBS/Modified Cytiva SH30028.02
Dulbecco's modified Eagle medium Corning 10-014-CV
ECIS-ZΘ Applied Biophysics  ABP 1129
Excel Microsoft Version 2301
Falcon tubes (15 mL) Corning 352196
Fetal bovine serum Gibco 16140-071
FLUOstar OPTIMA plate reader BMG LABTECH 413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0) GraphPad Software, LLC Version 9.0.0
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Scientific 50116047
Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray  Hitachi High-Technologies Corporation S4700 and EDAX TEAM analysis software
ImageJ software National Institutes of Health N/A
Immortalized human bronchial epithelial cells American Type Culture Collection CRL-9609
Isotemp freezer Fisher Scientific 
Methanol, 99% Fisher Chemical 67-56-1
Parafilm sealing film The Lab Depot HS234526A
Penicillin/Steptomycin Gibco 15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge  Thermo Scientific 75004220
Sorvall T 6000B DU PONT  T6000B
Trypan blue, 0.4% solution in PBS MP Biomedicals, LLC 1691049
Vacuum Chamber Belart 999320237
Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure Acros Organic 101-96-18-9

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