Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65329
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

Summary

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

Abstract

נויטרופילים ידועים כאחד מקווי ההגנה הראשונים בתגובה החיסונית המולדת ויכולים לבצע תפקודים תאיים מסוימים רבים, כגון כימוטקסיס, הגירה הפוכה, פגוציטוזה, פירוק אנזימים ציטוטוקסיים ומטבוליטים, ושחרור דנ"א כמלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). נויטרופילים לא רק יש איתות מוסדר היטב עצמם, אלא גם להשתתף ברגולציה של רכיבים אחרים של המערכת החיסונית. מכיוון שנויטרופילים טריים נבדלים זה מזה, קצרי חיים ומשתנים מאוד בין אנשים, חשוב להפיק את המרב מהדגימות שנאספו. חוקרים לעתים קרובות צריכים לבצע בדיקות סקר כדי להעריך סקירה כללית של פונקציות נויטרופילים רבים שעשויים להיות מושפעים מתנאים ספציפיים תחת הערכה. סדרה של בדיקות בעקבות תהליך בידוד יחיד של נויטרופילים בצפיפות נורמלית פותחה כדי לענות על צורך זה, בחיפוש אחר איזון בין מהירות, מקיף, עלות ודיוק. התוצאות יכולות לשמש כדי לנמק ולהנחות מחקרי מעקב מעמיקים. הליך זה יכול להתבצע בזמן ממוצע של 4 שעות וכולל הערכה של כדאיות התא, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), נדידה בזמן אמת ופאגוציטוזה של שמרים על שקופיות זכוכית, מה שמשאיר מספיק תאים לגישות מפורטות יותר כמו מחקרי אומיקס. יתר על כן, ההליך כולל דרך לצפות בקלות בהצעה ראשונית של NETs לאחר צביעה פנאופטית מהירה שנצפתה במיקרוסקופ אור, עם היעדר סמנים ספציפיים, אם כי מספיק כדי לציין אם מאמצים נוספים בדרך זו יהיו כדאיים. מגוון הפונקציות שנבדקו משלב נקודות משותפות בין הבדיקות, ומקטין את זמן הניתוח וההוצאות. ההליך נקרא NeutroFun Screen, ולמרות שיש לו מגבלות, הוא מאזן את הגורמים הנ"ל. יתר על כן, מטרת עבודה זו אינה סט בדיקות מוגדר, אלא קו מנחה שניתן להתאים בקלות למשאבים ולדרישות של כל מעבדה.

Introduction

נויטרופילים הם תאי החיסון המולדים הנפוצים ביותר בדם האנושי וידועים כממלאים תפקיד מרכזי בזיהום ובדלקת, בהיותם המגיבים הראשונים שהגיעו לאתר של נזק לרקמות1. בשנים האחרונות גוברת ההכרה בתפקיד המכריע שממלאים נויטרופילים במגוון מחלות ובתמיכה בהומאוסטזיס2. נויטרופילים לא רק יש איתות מוסדר היטב עצמם, אלא גם להשתתף ברגולציה של רכיבים אחרים של המערכת החיסונית 3,4,5. לכן, חקירת נויטרופילים ותפקודיהם התאיים יוצאי הדופן הרבים, כגון כימוטקסיס, נדידה הפוכה6, פגוציטוזה7, התפרצות נשימתית8 ושחרור מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs)7, היא הכרחית בהקשרים מחקריים רבים שבהם יש צורך להעריך את השינויים הפונקציונליים, המורפולוגיים או המולקולריים הפוטנציאליים של נויטרופילים המופעלים על ידי תנאים ספציפיים הנבדקים.

נויטרופילים מבודדים טריים הם בעלי התמיינות סופנית, קצרי מועד, דינמיים מאוד ומופעלים בקלות9. עם זאת, שיטת אחסון יעילה שאינה משפיעה על תגובות הנויטרופילים טרם הושגה, מה שהופך את ביצוע בדיקות מרובות למאתגרות שחייבות להיות רצופות. יתר על כן, ניתוחים פונקציונליים10,11 שתוארו קודם לכן, המבוססים על בדיקות הדורשות ציטומטריה ו / או צביעה פלואורסצנטית, עשויים שלא להיות בחירה מעשית כאשר יש צורך בהערכה רחבה וראשונית של הנויטרופיל.

כדי לטפל בבעיות אלה, פרוטוקול זה מתאר סדרה של בדיקות שניתן לבצע לאחר תהליך בידוד יחיד, כולל הערכת כדאיות התא, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), נדידה בזמן אמת ופאגוציטוזה של שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae), שתוצאותיהם יכולות לשמש להנמקת מחקרי מעקב מעמיקים. הליך זה, שנקרא NeutroFun Screen, תוכנן להקיף את פעילויות האפקט המובילות, למעט degranulation, וניתן להשלים בזמן ממוצע של 4 שעות, כולל 1 שעה של הפעלה. בנוסף, התאים הנותרים יכולים לשמש לגישות מפורטות יותר כמו מחקרי אומיקס. יתרונה של שיטה זו טמון באיזון בין מהירות, מקיף, עלות ודיוק.

יתר על כן, יש דרך להתבונן בקלות בהצעה ראשונית של NETs, ללא סמנים ספציפיים, אך מספיק כדי לציין אם מאמצים נוספים בכיוון זה יהיו כדאיים. מגוון הפונקציות שנבדקו נועד לשלב נקודות משותפות בין המבחנים, ולצמצם את זמן הניתוח וההוצאות. המטרה העיקרית של שיטה זו היא לספק ניתוח מאוזן ופונקציונלי לגבי מהירות, מקיף, עלות ודיוק המאפשר סקירה כללית של תגובת הנויטרופילים, מה שהופך אותה לצעד ראשוני שימושי בחקירת ההשפעות של גירויים חדשים על נויטרופילים בצפיפות נורמלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים עקבו בקפדנות אחר ההנחיות האתיות שנקבעו על ידי ועדת הביקורת המוסדית באוניברסיטת ברזיליה (תהליך 13364819.0.0000.5558), והדגימות זוהו על ידי קודים כדי להבטיח את אנונימיות התורם. התאים נלקחו מתורמים זכרים בריאים רגילים בגילאי 18-35 שנים, שחתמו על ההסכמה מדעת ועמדו בתנאי הזכאות הבאים: לא מעשנים/מאדים, ללא מחלות כרוניות וללא היסטוריה של מצבים דלקתיים ב-14 הימים האחרונים.

1. איסוף דם

  1. יש להניח 0.3 מ"ל של 5,000 IU/mL הפרין (ראה טבלת חומרים) במזרק סטרילי של 20 מ"ל כדי להפריד אותו.
  2. יש למרוח חוסם עורקים ורידי כ-12 ס"מ מעל אתר הניקוב ולזהות את הווריד הקוביטלי החציוני או הווריד הצפלי לניקוב.
    הערה: יש לוודא שזמן חוסם העורקים הכולל אינו עולה על דקה.
  3. נקו את אתר הניקוב עם 70% אלכוהול ובצעו את הניקוב.
  4. הפוך בעדינות את המזרק שלוש או ארבע פעמים לאחר איסוף הדם כדי לערבב את הדם ואת הפרין כראוי.

2. בידוד נויטרופילים

הערה: לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים (PMNs) מבודדים באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ואחריה ליזה היפוטונית של תאי הדם האדומים הנותרים (RBC), כפי שתואר קודם לכן11 עם כמה שינויים. שיטה זו אינה חובה לביצוע בדיקות המיון, וניתן להחליפה כל עוד השיטה שנבחרה מביאה לכדאיות של >97%, פרימה או הפעלה של <3% מה- PMNs, ומניבה מספיק תאים לכל הבדיקות, ההעתקים והתנאים. ביצוע שלבים אלה בתנאים אספטיים ושימוש בתמיסות נטולות אנדוטוקסין הם חובה כדי למנוע הפעלת תאים.

  1. בצע דילול של 12 מ"ל של חומרי הפרדה של 60% ו-70% (זמין מסחרית; ראה טבלת חומרים) בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל.
  2. מכינים את השיפוע מלמטה למעלה על ידי הוספת 4 מ"ל בכל פעם של דילול של 60% מעל דילול של 70%, באמצעות פיפטה של 5 מ"ל. עשה זאת בעדינות כדי למנוע ערבוב הממשק.
  3. בזהירות שכבה 12 מ"ל של דם heparinized על גבי שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: משלב זה ואילך, עד להפעלת PMN, יש לשמור את כל הריאגנטים והצינורות המשמשים בצידנית מלאה בקרח.
  4. השליכו את שכבת הפלזמה/תא חד-גרעיני, ולאחר מכן העבירו בעדינות את השכבה שמעל גלולת כדורית כדורית הדם לשני צינורות חרוטיים של 15 מ"ל עם כ-7.5 מ"ל בכל אחד. הרכיבו את נפח הצינור עם תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS; ראו טבלת חומרים).
  5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 19 ° C.
  6. שטפו את גלולת התא עם HBSS.
    1. השליכו את הסופרנאטנט על ידי מזיגת הצינור והשהו מחדש בעדינות את הגלולה ב-7 מ"ל HBSS.
    2. צנטריפוגה במהירות 300 x גרם למשך 5 דקות ב-19°C להסרת כל אמצעי ההפרדה.
  7. בצע ליזה היפוטונית של RBCs הנותרים.
    1. יש להשליך את הסופרנאטנט ולערבב את הכדוריות בצינור אחד.
    2. השהה מחדש את גלולת RBC/PMN ב-3 מ"ל של H2O סטרילי והוסף 3 מ"ל HBSS (2x) תוך 25 שניות כדי לשחזר את האוסמולריות. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 19 ° C.
    3. חזור על שלבים 2.8.1 ו- 2.8.2 לקבלת גלולה לבנה ללא אריתרוציטים.
      הערה: יש להסיר את הסופרנאטנט בהקדם האפשרי כדי למזער את המגע של נויטרופילים עם תוצרי פירוק RBC. לחלופין, ניתן להחליף את הליזה ההיפוטונית השנייה על ידי השעיה עדינה מחדש של שכבת RBC השיורית והסרת כל הסופרנטנט, מכיוון שהמשקעים הנותרים של RBC ישקעו מעל גלולת PMN.
  8. השליכו את הסופרנאטנט על ידי מזיגת הצינור, השהו מחדש בעדינות את ה-PMN במאגר הנותר, והעבירו אותם למיקרו-צינור קר כקרח.
    הערה: הקפד להוסיף ביאורים לעוצמת הקול בעת העברת התאים המרחפים מחדש באמצעות מיקרופיפטה.
  9. מעבירים 3 x 1 μL של תרחיף התא למגלשת זכוכית נקייה (שלוש בארות של 1 μL כל אחת) וכתם עם פנאופטיקה מהירה (ראה טבלת חומרים) להערכת מורפולוגיה וטוהר12.
    1. כדי להכתים בפנאופטי מהיר, יש לטבול את המגלשה חמש פעמים ב-panoptic fixative n° 1, שש פעמים ב-eosin n° 2 ופעמיים ב-hematoxylin n° 3, כאשר כל טבילה נמשכת שנייה אחת.
    2. שטפו בעדינות את מגלשת הזכוכית במים מזוקקים.
    3. יש לנקז ולייבש באוויר.
  10. התבוננו תחת מיקרוסקופ וספרו 300 תאים אקראיים בכל באר, ובכך הבדילו את הנויטרופילים מגרנולוציטים אחרים.
  11. מעבירים 1 μL של תרחיף התא ל-49 μL של 0.2% צבע כחול טריפאן13 וסופרים את התאים באמצעות תא נויבאואר, תוך הבחנה בין תאים מתים לתאים בני קיימא.
  12. התאימו את ריכוז התאים ל-6,667 תאים/מיקרוליטר באמצעות תמיסה של 50% פלזמה אוטולוגית ו-50% HBSS בתוספת סידן ומגנזיום. חלק את התרחיף של 6,667 תאים/μL באופן שווה בין המיקרו-צינורות המתאימים לתנאים שיש לבדוק, כולל הבקרה השלילית.
    הערה: ניתן להשתמש בכל ריכוז תאים הדומה לנויטרופילים המסתובבים באורגניזם המודל, אך חשוב להשתמש באותו ריכוז תאים בכל הניסויים לצורך שחזור.

Figure 1
איור 1: פרוטוקול בידוד הנויטרופילים. שני ריכוזים של מצע ההפרדה (פרקול) (A) מוערמים (B), ואז הדם מונח בשכבות על גבי שיפוע ההפרדה (C). לאחר הצנטריפוגה, PMN נמצא בשכבה המרכזית (D), המחולקת לשני צינורות 15 מ"ל (E). תרחיף התא נשטף פעמיים ב- HBSS ובצנטריפוגה (G-I) כדי להסיר את המדיה, ואז התאים מושהים מחדש, ושאריות RBCs נשלחות לשני סבבים של ליזה היפוטונית (J-M). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. הכנה להפעלת נויטרופילים

  1. במיקרו-צינוריות של 1.5 מ"ל, הכינו מערכת הפעלה לכל מצב כך שריכוז התא הסופי יהיה 6,600 תאים/μL. לדוגמה, כדי לבדוק את ההשפעות של 100 nM fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine; ראה טבלה של חומרים), להוסיף 5 μL של 10 μM fMLP ל 495 μL של 6,667 תאים / μL תרחיף. עבור הבקרה השלילית (ללא גירוי), הוסף HBSS המכיל Ca2+ ו- Mg2+.
    הערה: כדי להדגים מתודולוגיה זו, נעשה שימוש בריכוזים הסופיים הבאים של הגירויים: 100 nM fMLP, 16 μM של fallaxin, פפטיד אנטי-מיקרוביאלי טבעי14, ו-100 nM PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) (ראה טבלת חומרים).
  2. לדגור ב 37 ° C ללא סיבוב.
    הערה: כל ה- aliquots עבור בדיקות פונקציונליות נלקחים מהשעיית תא זו, המכונה להלן מערכת ההפעלה.

4. בדיקת Nitrotetrazolium Blue Chloride (NBT) להערכת ייצור ROS

  1. הכנת פתרון עבודה NBT: עבור כל תנאי ניסוי, הכינו פתרון עבודה NBT (ראה טבלת חומרים) של 6 מילימטר באמצעות השלבים הבאים:
    1. יש להמיס 0.0005 גרם של NBT ב-10 מיקרוליטר של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ומערבולת למשך 15 דקות לפחות.
    2. מוסיפים 90 μL של HBSS Ca2+Mg2+ ומערבלים עד 2 דקות.
      הערה: יש לבצע את כל השלבים הקשורים ל-NBT בחושך.
  2. בצע בדיקת שקופיות NBT.
    1. לאחר 20 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את מתלה התא והעבירו בזהירות 2 μL של PMN למגלשת זכוכית נקייה. יש לדגור במשך 20 דקות בתא לח בטמפרטורה של 37°C.
      הערה: אין לפזר את מתלה התא יותר מדי על המגלשה; אחרת הוא עלול להתייבש לפני הדגירה.
    2. הוסף 1 μL של תמיסת העבודה NBT מעל התאים ודגרה נוספת במשך 20 דקות מוגן מפני אור.
    3. יבש את המגלשה עם אוויר חם לתקן אותו עם טיפה מתנול בכל באר במשך 1 דקה. מכתים עם 0.03% ספרנין (ראו טבלת חומרים) למשך דקה.
    4. שטפו בעדינות את מגלשת הזכוכית במים מזוקקים.
    5. הניחו למגלשה להתייבש באוויר והתבוננו תחת מיקרוסקופ.
    6. ספרו 100 תאים אקראיים בכל באר, והבינו נויטרופילים עם וללא משקעי פורמזן.
  3. בצע בדיקת ספקטרופוטומטריה של NBT.
    1. לאחר 40 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את תרחיף התא והעבירו 90 מיקרוליטר של PMN ממערכת ההפעלה למיקרו-צינורית נקייה. לאחר מכן, הוסף בזהירות 20 μL של תמיסת NBT 6 mM. לדגור בחושך במשך 20 דקות ב 37 ° C.
    2. הוסף 100 μL של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS; ראה טבלה של חומרים) ומערבולת.
    3. סוניק באמצעות קצה סוניקטור באמפליטודה של 60%, חמישה מחזורים של 15 שניות כל אחד עם מרווחים של 15 שניות. צנטריפוגה ב 12,000 x גרם במשך 5 דקות.
    4. מעבירים 60 מיקרוליטר של הסופרנאטנט לצלחת בעלת תחתית שקופה של 96 בארות ומודדים את ספיגת תוצר הפורמזן ב-570 ננומטר.

5. בדיקת פגוציטוזה

  1. הכינו תרחיף של 33,000 שמרים/מיקרוליטר לכל מצב, כמתואר להלן:
    1. הוסיפו כ-0.75 מ"ג שמרים יבשים (Saccharomyces cerevisiae; ראו טבלת חומרים) ל-200 מיקרוליטר של HBSS Ca2+Mg2+ ודגרו בתרמומיקסר בטמפרטורה של 100°C עם 500 סל"ד למשך 15 דקות לפחות.
    2. הומוגניזציה של התערובת על ידי ערבול והעברת 5 μL של תרחיף שמרים ל 45 μL של 0.2% צבע כחול טריפאן. ספרו את השמרים באמצעות תא נויבאואר.
    3. התאימו את ריכוז התרחיף הראשוני ל-33,000 תאי שמרים/μL באמצעות HBSS Ca2+Mg2+. יש לשמור את המתלים על קרח עד לשימוש.
  2. לאחר 20 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את תרחיף התא והעבירו 5 μL של מערכת ההפעלה ל-5 μL מתוך 33,000 השמרים/μL Saccharomyces cerevisiae suspension במיקרו-צינורית סטרילית חדשה.
    הערה: יחס הנויטרופילים לשמרים הוא 1:5 (PMN:שמרים).
  3. העבירו מיד 6 μL של תרחיף PMN/שמרים לשלוש בארות של מגלשת זכוכית נקייה (2 μL כל אחת) ודגרו על המגלשה בתא לח למשך 40 דקות.
    הערה: אין לפזר את מתלה התא יותר מדי על המגלשה; אחרת, הוא עלול להתייבש לפני הדגירה.
  4. יבש את המגלשה תחת אוויר חם והכתים עם פנאופטיקה מהירה, כמתואר בשלב 2.9 לעיל.
    הערה: השלב השלישי של הצביעה הפנופטית המהירה הוא קריטי לניתוח המיקרוסקופ של השקופית. צביעת השקופית במשך ≥3 שניות בשלב זה עלולה להפוך אותה ללא ראויה לניתוח, מכיוון שיהיה קשה להבדיל בין שמרים לאונות גרעיניות של נויטרופילים.
  5. התבוננו בשקופיות מתחת למיקרוסקופ, ספרו 100 נויטרופילים אקראיים מכל באר והבחינו בין PMN חיובי ושלילי לפאגוציטוזה.
    הערה: לפחות חלקיק שמרים אחד בתוך או במגע ישיר עם קרום תא PMN מצביע על PMN חיובי לפאגוציטוזה. אם אתם מעוניינים ביחס שמרים/נויטרופילים, ספרו גם את מספר חלקיקי השמרים שנבלעו.

6. בדיקת כימוטקסיס PMN בזמן אמת

הערה: בדיקת ההעברה מבוצעת באופן דומה לפרוטוקול המתואר previoulsy15, עם ההתאמות הבאות:

  1. הכינו את השיפוע הכימוטקטי על ידי הוספת 160 מיקרוליטר של כימואטרקנט (למשל, fMLP, IL-8, C5 או LTB4; ראו טבלת חומרים) לתא התחתון של צלחת מנתח תאים בזמן אמת (RTCA) מבוסס עכבה. עבור בקרות שליליות וחסרים, הוסף 160 μL של HBSS Ca2+Mg2+.
  2. חבר את החדר העליון והוסף 25 μL של HBSS Ca2+Mg2+. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות כדי ליצור את השיפוע הכימוטקטי.
  3. לאחר 60 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את מתלה התא והניחו 60 מיקרוליטר של תרחיף התא בתא העליון. הוסף 60 μL של HBSS Ca2+Mg2+ לריק.
  4. הניחו את צלחת RTCA ותכנתו את תוכנת RTCA למדוד את אינדקס התא (CI) כל 60 שניות למשך שעתיים.
    הערה: ניתן לשטוף את לוחות RTCA לשימוש חוזר כמתואר16. לסיכום, שטפו את תאי RTCA והאלקטרודות עם מי מלח פוספט-בופר (PBS) שלוש פעמים, ולאחר מכן עם מים אולטרה-טהורים מסוג I פעמיים. יש לדגור על החדר התחתון והעליון עם 0.25% טריפסין 0.53 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) למשך 40 דקות. יש לשטוף במים טהורים במיוחד שלוש פעמים.

7. בדיקה סוגסטיבית נטו

  1. לאחר 10 דקות של הפעלת התא, ערבבו בעדינות את תרחיף התא והעבירו 4 μL של PMN מכל מערכת הפעלה תחת הערכה, המחולקים לשתי בארות של מגלשת זכוכית נקייה. יש לדגור בתא לח בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
  2. הוסף 1 μL של DNAse I לאחת הבארות ודגר במשך 20 דקות ב 37 ° C (בתא רטוב).
  3. יבש את המגלשה ואת הכתם עם panoptic מהיר, כפי שתואר קודם בשלב 2.9 של סעיף "בידוד נויטרופילים".
  4. הערך את השקופיות תחת מיקרוסקופ.
    הערה: חפש כל אינדיקציה לשחרור נטו, המאופיינת בנוכחות של מבנים דמויי אינטרנט. לאחר הזיהוי, ודא אם הטיפול ב- DNAse I היה מסוגל להסיר מבנים כאלה. בדיקה זו מרמזת על היווצרות NET, שכן נדרשות בדיקות נוספות כדי לאשר את נוכחותם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטת הבידוד מבוססת הצפיפות ששימשה במחקר זה (איור 1) עמדה בקריטריונים של הניסויים המוצעים. פרמטרים נויטרופילים שהתקבלו משיטה זו כללו כדאיות ≥98%, טוהר ≥94%, ותפוקת תאים ≥1.5 x 107, ללא הפעלה שניתן לזהות על ידי בדיקות הסינון. שני שלבים רלוונטיים בבידוד PMN הם נוגדי קרישה והסרת RBC. שמירה על צינור הדם או המזרק נוגדי הקרישה בנדנוד עדין לפני שכבות מעל שיפוע הצפיפות ובחירת שיטת הסרת RBC למניעת הפעלה וזיהום יכולה להשפיע על תפוקת הניסוי ויכולת השחזור.

כדי להעריך את הסקירה הפונקציונלית של תפקוד נויטרופילים, פותחה זרימת עבודה שאפשרה לבצע את בדיקות הסינון המוצעות עם לפחות שני חוקרים בזמן ממוצע של 4 שעות, עם שעה אחת של הפעלה ושעתיים של ניטור נדידה בזמן אמת, כפי שמוצג באיור 2.

Figure 2
איור 2: זרימת העבודה של NeutroFun Screen. כדי להעריך את פאנל התגובות הפונקציונליות המופעלות על ידי תנאים ספציפיים תחת הערכה, זרימת העבודה של NeutroFun Screen כוללת השתתפות של לפחות שני חוקרים. חוקר 1 (R1) מתחיל את תהליך בידוד PMN, ואחריו התאמת ריכוז התאים והדגירה של מערכת ההפעלה, ואילו במקביל, חוקר 2 (R2) מכין את החומרים לביצוע הבדיקות הבאות, המתחלקות בין השניים: R1 מבצע בדיקות פגוציטוזיס, NET ו-NBT ספקטרופוטומטריות; R2 מבצע העברה בזמן אמת ובדיקות שקופיות של NBT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

בדיקת NBT17 הקלאסית הותאמה הן לשקופיות והן להערכה ספקטרופוטומטרית של היווצרות הפורמזן כתוצאה מהתגובה של NBT עם ה-ROS שנוצר על ידי PMNs. הבדיקה הספקטרופוטומטרית אפשרה כימות יחסי בין תנאים, בעוד שבדיקת המיקרוסקופ הייתה שימושית לניתוח תיאורי וכמותי למחצה, להערכת סדירות התפלגות הגבישים, המורפולוגיה ומספר התאים המכילים פורמזן. תוצאות הבדיקה הספקטרופוטומטרית מוצגות באיור 3A, המצביעות על כך ש-PMA של 100 ננומטר גרם לייצור ROS מוגבר (ביחס ממוצע של 3:2:1) בהשוואה ל-fMLP ולקבוצות ביקורת. תוצאות בדיקת השקופיות של NBT (איור 3B) אישרו את התוצאות הספקטרופוטומטריות, והראו גם PMA כגירוי האינטנסיבי ביותר ליצירת ROS בהשוואה ל-fMLP (איור 3C), כפי שהודגם בעבר על ידי מדידה ישירה של ROS באמצעות ציטומטריה18. בנוגע לספירת תאים, מספר הנויטרופילים המכילים גבישי פורמזן הראה יחס של 7:4:1 בתנאי הבקרה PMA:fMLP, וחשף גם דפוסי התפלגות פורמזן שונים בין PMN המופעלים על ידי fMLP ו-PMA; טיפול fMLP הביא להפעלה אינטנסיבית של תאים בודדים, בעוד PMA גרם להיווצרות גבישי פורמזן המפוזרים ברחבי הציטופלסמה ברוב PMNs. יתר על כן, נצפו כמה מאפיינים מורפולוגיים שהבדילו את התנאים, כגון צבירת תאים אקספרסיבית לאחר טיפול PMA. היעדר מאפייני הפעלה אופייניים כאלה ורמות נמוכות של פורמזן בקבוצת הביקורת הצביעו על כך שמצב המנוחה לא הופרע באופן משמעותי. לכן, בדיקת NBT התגלתה כבדיקה פשוטה, זולה ואמינה לייצור ROS נויטרופילים שניתן להשתמש בה כדי לסקור את היכולת והעוצמה של גירוי נתון כדי לגרום לייצור ROS.

Figure 3
איור 3: מבחן NBT. (A) הערכה ספקטרופוטומטרית של התפרצות נשימתית של נויטרופילים לתנאים שונים (בקרה שלילית: 100 ננומטר fMLP ו-100 ננומטר PMA) על ידי ספיגת פורמזן (490-630 ננומטר). נתונים מארבעה תורמים מוצגים כסטיית תקן ממוצעת ± (SD). * = כל הקבוצות שונות זו מזו (עמ≤ 0.05); £ = ההשוואות CTRL לעומת PMA ו- fMLP לעומת PMA מראות הבדלים משמעותיים (עמ '≤ 0.05). (B) ניתן לנתח את מבחן השקופיות באופן איכותי, תוך אפיון עוצמת משקעי הפורמזן, מיקומו בתוך התא וצבירת התא. חיצים שחורים מצביעים על גבישי פורמזן. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (C) מספר PMN המכיל פורמזן, נספר במיקרוסקופ אופטי. נתונים משמונה תורמים שהוצגו כממוצע ± SD. *** p < 0.0001, מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שקופיות הפאגוציטוזה שימשו כדי לקבוע את שיעור הפאגוציטוזה כאחוז מהנויטרופילים המבצעים פאגוציטוזה, כפי שמוצג באיור 4. אף על פי שגם fMLP של 100 ננומטר וגם פפטיד אנטי-מיקרוביאלי של 16 מיקרוביאלית גרמו ככל הנראה לבליעת שמרים מוגברת, ההבדל לא היה מובהק סטטיסטית עד לגירוי הכפול, אשר שיפר באופן משמעותי את הפאגוציטוזה בהשוואה לקבוצת הביקורת ועשוי להציע תגובה בגירוי כפול.

Figure 4
איור 4: בדיקת פגוציטוזיס. נויטרופילים הוערכו על ידי יכולת הפאגוציטוזה שלהם (ספירת נויטרופילים המכילים שמרים). אף על פי שהחשיפה ל-fMLP של 100 ננומטר או לפפטיד אנטי-מיקרוביאלי של 16 מיקרומטר לפני דגירה של שמרים שיפרה את הפאגוציטוזה בהשוואה לקבוצת הביקורת, (A) העלייה לא הייתה מובהקת סטטיסטית. באופן מעניין, דגירה ראשונית עם fMLP, ואחריה הוספת הפפטיד האנטי-בקטריאלי, הביאה לשיפור משמעותי בפאגוציטוזה בנויטרופילים אנושיים (כוכבית בין CTRL לפפטיד האנטי-מיקרוביאלי fMLP+). (B) חצים שחורים מראים תאי שמרים, חיצים ירוקים מראים נויטרופילים בלבד, וחצים אדומים מצביעים על נויטרופילים פאגוציטוזיטים. נתונים מחמישה תורמים שהוצגו כממוצע ± SD. פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

דוגמה לתוצאות נדידת תאים בזמן אמת מוצגת באיור 5, המציג את ההשפעה הכימוטקטית הידועה של fMLP של 100 ננומטר על נויטרופילים. קינטיקה של נדידת תאים הותאמה למודל גומפרץ ואפשרה השוואה בין הפרמטרים שלו.

Figure 5
איור 5: נדידת תאים בזמן אמת. אינדקס התא משקף את העכבה החשמלית הנובעת מנדידת תאים. בניסוי זה, fMLP שימש כבקרה חיובית של נדידת נויטרופילים על ידי הוספת fMLP של 100 ננומטר לתא התחתון. בקרה שלילית (CTRL) הכילה רק HBSS בחדר התחתון. העקומות המונחות על גבי מייצגות את העקומה המתאימה למודל גומפרץ, ששונתה כך שתתאים בצורה הטובה ביותר למדרונות עולים ויורדים בצורה הטובה ביותר. נתונים משלושה תורמים, מוצגים כממוצע ± SD.* p < 0.05, מבחן t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לבסוף, מוצגת בדיקת מיקרוסקופ אופטי פשוטה המרמזת על נוכחות של NET, שבה PMN מוכתמים בפנאופטיקה מהירה. אפשר לראות שעבור גירויים מסוימים שגורמים ל-NET, כמו PMA או כמה פפטידים אנטי-מיקרוביאליים, אפילו אחרי זמן הפעלה קצר (שעה אחת) אפשר לצפות במבנים דמויי רשת נימה ליד התאים, בעוד שזה לא אפשרי בתנאים אחרים כמו הבקרה השלילית וה-fMLP (איור 6). כדי לתמוך טוב יותר בטענה זו, DNase I נוסף לאחר 40 דקות של הפעלת תאים עם PMA של 100 ננומטר או פפטיד אנטי-מיקרוביאלי, והסיר את המבנים דמויי ה-NET (איור 6). למרות ששיטה זו אינה מתאימה לאפיון NET ויכולה להיות מושפעת מתוצרים, זוהי נקודת מוצא זולה, פשוטה ומעניינת להצדיק השקעות נוספות בניתוח NETs, במיוחד בהקשרים בהם השפעות הגירויים אינן ידועות או מתוארות בצורה גרועה.

Figure 6
איור 6: בדיקה סוגסטיבית של היווצרות נטו. ניתוח איכותי של נויטרופילים מוכתמים פנאופטיים לאחר שעה של הפעלה מעל שקופית זכוכית עשוי להצביע על שחרור נטו. קבוצות CTRL (A,B) ו-fMLP (C,D) לא הראו כל אינדיקציה לשחרור NET, בעוד שהפעלה עם PMA (E-H) גרמה להיווצרות מבנים דמויי NET שנפגעו על ידי טיפול DNase I (I-L). חקירת ההשפעות של פפטיד אנטי-מיקרוביאלי על הנויטרופילים הראתה כי גירוי כזה עשוי להיות מסוגל לעורר שחרור NET, מאחר שהשקופיות הציגו את המבנים דמויי ה-NET (M-P) שהתפרקו על ידי DNase I (Q-T). חיצים אדומים מצביעים על מבנים דמויי NET. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נויטרופילים הם תאים דינמיים ומגיבים מאוד, קצרי חיים שעדיין לא ניתן לשמר אותםבהקפאה 19, מה שהופך את חקירת הביולוגיה שלהם למאתגרת. לכן, חיוני לעקוב אחר צעדים זהירים כדי להשיג נויטרופילים קיימא, מועשר ומנוחה11,20. במחקר זה נעשה שימוש בטכניקת בידוד מבוססת צפיפות המדגישה מניפולציה עדינה ומינימלית, כמו גם שימוש בטמפרטורות נמוכות עד לשלב ההפעלה. בנוסף, עיבוד הדם חייב להתרחש תוך 30 דקות לאחר הניקור ולהיות מאוחסן בטמפרטורת החדר. העבודה הנוכחית מציגה אפשרות להפחית את מתח המניפולציה ואת זמן הניסוי. כדי לפשט עוד יותר את התהליך, הצגנו שלב חדש (כאופציה) בפרוטוקול, הכולל הסרת RBCs על ידי השעיה עדינה ושאיפה של שכבת RBC לאחר הליך המוליזה יחיד. שלב זה מפחית את מתח המניפולציה ואת זמן הניסוי, מכיוון שהוא מסיר את רוב RBCs עם צעד המוליזה היפוטוני אחד בלבד. עם זאת, יש לציין כי מיומנויות המפעיל משפיעות מאוד על האפקטיביות של צעד זה, וזה לא תמיד יכול להסיר לחלוטין RBCs. יתר על כן, שאיפת RBC יכולה להוביל לאובדן נויטרופילים, אך זה אינו משפיע על התפוקה, מכיוון שיותר נויטרופילים נמצאו בתחילה מהשיפוע כאשר נאספו קרוב יותר לשכבת RBC. לכן, שאיפת RBC מומלצת אם הבדיקות אינן דורשות את הטוהר הגבוה ביותר האפשרי, או אם למפעיל היו תוצאות טובות באופן עקבי. עבור בדיקות הסקר המוצגות כאן, כמות קטנה של RBCs מזהמים (<3%) לא תפריע לתוצאות.

כדי להבטיח שכל ההליכים מבוצעים בזמן, כולל הכנת ריאגנטים, מוצגת זרימת עבודה (איור 2) שמפרטת את ציר הזמן וחלוקת המשימות בין שני חוקרים. לאחר שכל הבדיקות הפונקציונליות הסתיימו, התאים הנותרים יכולים להיות מוכנים לחקירות מולקולריות נוספות, כמו מחקרי אומיקס על ידי ליזה של התא עם חיץ ליזה מתאים ואחסון.

ייצור ROS
התפרצות נשימתית היא סימן ההיכר של פרימה והפעלה של נויטרופילים18,21, והערכת ייצור ROS היא שיטה נפוצה המשמשת להערכת מצב ההפעלה של נויטרופילים. מחקר זה העריך את ייצור ROS באמצעות שתי גישות: מיקרוסקופיה אופטית וספקטרופוטומטריה.

בדיקת NBT היא גישה ידועה להערכת פרץ הנשימה בנויטרופילים22,23. שתי שיטות נפוצות הן בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה אופטית (או בדיקת שקופיות) ובדיקות מבוססות ספקטרופוטומטריה 24,25,26. למרות שמיקרוסקופ אופטי מאפשר הדמיה של פרטים ברמת התא, הוא נוטה להטיית המשתמש. לכן, מבחן השקופיות NBT משמש כהשלמה איכותית לבדיקה הספקטרופוטומטרית לגבי תכונות פנוטיפיות, כגון תבניות היווצרות פורמזן, עוצמה וצבירת תאים.

השלבים הקריטיים הן עבור שקופית NBT והן עבור בדיקות ספקטרופוטומטריות הם NBT ומסיסות מלאה של פורמזן. בניגוד להמלצות היצרן, NBT אינו מתמוסס היטב במים. עם זאת, הומוגניזציה של NBT ב- DMSO למשך 15 דקות לפחות ולאחר מכן הוספת מים/HBSS וערבול למשך 2 דקות מספקת מסיסות מלאה. בנוסף, כדי לנתח את ספיגת הפורמזן יש לבצע שני שלבים קריטיים: (1) שחרור גבישי פורמזן מתאים על ידי ליזה PMN ו-(2) מסיסות מלאה של גבישי פורמזן. שני השלבים הושגו על ידי טיפול בכדורית התא עם 10% SDS, כפי שהוצע לאחרונה27, ואחריו ניתוח סוניקציה וספיגה של הסופרנאטנט ב 570 ננומטר.

יתר על כן, תוצאות NBT של קבוצות הביקורת השליליות והחיוביות הן הצעד הראשון של הסינון שיש להעריך. שלב זה חייב להראות הבדל מדהים, שכן הערכת ייצור ROS באמצעות פורמזן מצביעה אם תהליך הבידוד עשוי היה להיות אחראי לשינויים לא רצויים במצב המנוחה של התאים על ידי גירוי או עיכוב.

שיטות אחרות, כגון cytochrome c reduction28 או flow cytometry29 analysis, משמשות לעתים קרובות לזיהוי ROS; עם זאת, בהתחשב בגישת הסינון, היישום שלהם דורש זמן ניסוי ארוך יותר, שימוש בסמנים ספציפיים ומכשירים יקרים. כימילומינסנציה של לומינול/איזולומינול היא שיטה מהירה וחסכונית לזיהוי ROS תוך שהיא מאפשרת גם התמיינות של ROS תוך-תאי וחוץ-תאי. עם זאת, לומינומטר נדרש עבור שיטה זו30,31. למרות שניתן לעקוף את עלות המכשיר על ידי שימוש במתקן, הוא עדיין לא יהיה מתאים לניתוח סינון המבוצע בו זמנית עם בדיקות אחרות.

פגוציטוזה
דגירה PMN/שמרים מספקת סקירה כללית של קיבולת ויעילות פגוציטוזה של נויטרופילים על ידי ספירת מספר הנויטרופילים המבצעים פאגוציטוזה ומספר השמרים הנבלעים לכל נויטרופיל. אולם מאחר שחלקיק השמרים עצמו הוא אות שפעול, השוואת קבוצת הביקורת עם PMN שטופל מראש מהווה מערכת גירוי כפולה, שעשויה שלא להציג שינויים משמעותיים, כפי שמוצג ב-CTRL לעומת PMN שטופל ב-fMLP (איור 4). עם זאת, בדיקה זו שימושית כדי לציין אם אפנן פוטנציאלי ייצור השפעה כלשהי על phagocytosis. פפטיד אנטי-מיקרוביאלי חדשני נבדק באמצעות בדיקה זו, והתוצאות מצביעות על תגובה פוטנציאלית מעניינת לשילוב גירויים זה, שנדון לאחרונה כנדרש להפעלה יעילה32.

השלב הקריטי עבור בדיקה זו הוא הצביעה, כמו הניתוח הופך אמין אם השקופית נשמרת על panoptic מס '3 (hematoxylin) במשך ≥3 שניות. הסיבה לכך היא שלא ניתן להבדיל בין תאי השמרים והאונות הגרעיניות של הנויטרופילים. יתר על כן, גישה זו מאפשרת ניתוח מורפולוגי של נויטרופילים לאחר חשיפה למודולטורים. ציטומטריית זרימה היא טכניקה יעילה נוספת לניתוח פגוציטוזה33, אם כי יש לה מגבלות באמצעות הקושי להבחין בין חלקיקים הקשורים לקרום לבין חלקיקים שנבלעו וגורמים אחרים הקשורים לערכת הסינון המוצעת, כפי שנדון בנושא הקודם. אותה מגבלה נצפית בשיטה המתוארת כאן, אם כי יש לראות בכך סינון ראשוני כדי להנחות מחקרי המשך.

העברה בזמן אמת
פרוטוקול הסינון בזמן אמת עבר אופטימיזציה כדי להעריך את יכולת ההעברה של PMN. למרות שמחקר קודם הציע כי ציפוי החלק התחתון של צלחת RTCA היה נחוץ לבדיקת הנדידה כדי להראות הבדל בין הבקרה השלילית לבין טיפול IL-815, מחקר זה הראה ערכי רווח בר-סמך (CI) גבוהים עבור תאים שטופלו ב- fMLP ללא תוספת של חומרי ציפוי. התוצאות הציגו יכולת שחזור גבוהה עם הגירה משמעותית מ -12 דקות ואילך. יתר על כן, ניתוח התאמת עקומה של נתוני ההגירה המתקבלים יכול לחשוף פרמטרים, כגון אינדקס התא המרבי, כמו גם עלייה וירידה בשיפוע, השימושיים להבנת הדינמיקה של ההגירה, ועשויים להיות תלויים בריכוז או שונים בין תנאים. ההתאמה הטובה ביותר לעקומות נדידת נויטרופילים (איור 5) הייתה פונקציית גומפרץ34 המותאמת, שהראתה כי fMLP מגדיל את אינדקס התאים המרבי ואת השיפוע המוגבר.

תשומת לב מיוחדת נדרשת כדי למנוע בועות במערכת RTCA מכיוון שהן יכולות לחסום את התאים העוברים דרך האלקטרודות, ולסכן את הניסוי. גורם מגביל הוא העלות הגבוהה של הצלחות. למרות שטכניקות זולות יותר מנתחות נדידת תאים, הן חסרות יכולת שחזור טובה או שהן קשות וגוזלות זמן, כמו תא בוידן35. לכן, RTCA הוא ניתוח הגירה אמין התואם את בדיקות הסינון האחרות המוצגות כאן.

רשתות
לבסוף, בדיקה מבטיחה, קלה וזולה להערכה ראשונית של היווצרות NET פותחה באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. הוא נגזר מתצפית של שקופיות פאגוציטוזיס, שבהן PMA, גירוי ספציפי המשרה NET שנבדק על השפעתו על יכולת הפאגוציטוזה, גרם גם להיווצרות מבנה דמוי רשת בהשוואה לקבוצות CTRL ו-fMLP. עבודה זו שיערה כי מבנים אלה יכולים להצביע על שחרור נטו. השערה כזו נבדקה על ידי טיפול בדגימות עם DNase I לאחר ההפעלה, שם לא נמצאו מבנים נימיים בנויטרופילים המופעלים על ידי PMA. ההנחה כי מבנים כאלה עשויים להיות NETs מבוססת על העובדה כי PMA מצוטט כגורם ידוע של היווצרות NET36,37, מציאת מבנים דומים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות סמנים ספציפיים עבור NETs38,39 ואת השפלה של NETs זרז על ידי DNase I40,41. חשוב להדגיש כי לא מדובר בשיטה לאישור היווצרות NET, אלא רק בסינון ראשוני המצביע על הימצאות NETs. למרות שלבדיקה זו יש מגבלות, מכיוון שניתן לבלבל בין NETs לבין ממצאים מכתימים, היא משרתת מטרה רלוונטית בהצעת היווצרות נטו בסינון מהיר וזול שניתן לבצע יחד עם בדיקות פונקציונליות אחרות. לאחר שזוהו כרלוונטיים למחקר המוקרנ, ניתן להעריך NETs על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי או אלקטרונים42, כפי שיפורט בהמשך.

במעבדה שלנו, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים חדשים, שגם סביר להניח שיש להם פעילות אימונומודולטורית, מוערכים לעתים קרובות על ידי קבוצה זו של בדיקות סקר כדי להנחות טוב יותר ניתוח נוסף של ההשפעות של פפטידים מסוימים על נויטרופילים אנושיים, שכן חלקם מראים תכונות ROS43 מעניינות, פגוציטוזה, הגירה ו / או אפנון רשת.

לסיכום, מסך NeutroFun מציע כלי רב ערך לזיהוי מודולטורים פוטנציאליים של פעילות נויטרופילים בצפיפות נורמלית ממספר רב של תרכובות שלא נבדקו. עם זאת, חשוב לציין כי שיטה זו משמשת רק כסינון ראשוני. לאחר סינון ראשוני זה, ניתן להפנות מתודולוגיות יקרות, מתקדמות וגוזלות זמן לפונקציות או מסלולים ספציפיים המוצעים על ידי תוצאות ראשונות אלה לצורך אימות נתונים. עבור ייצור ROS, phagocytosis והיווצרות NET, ישנן שיטות חלופיות לאימות נתונים ולהשגת תוצאות כמותיות נוספות. הדמיה וכימות NET ניתן לבצע באמצעות ניתוח מיקרוסקופ immunofluorescence, אשר קובע את נוכחותם וחפיפה של DNA חוץ תאי חלבונים גרגירים, כגון myeloperoxidase ו neutrophil elastase, כפי שתואר בפירוט לאחרונה42. ROS ממלאים תפקידים מכריעים שונים בתהליכים ביולוגיים רבים, ולכן המחקר שלהם נפוץ ומגוון מאוד. בין המתודולוגיות המבוססות ביותר הן אלה שעושות שימוש בנוגדנים, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) ואימונובלוטינג של לומינסנציה, או זיהוי פלואורסצנטי - כגון ציטומטריית זרימה של תאים תחת תיוג שונה - באמצעות DCFDA, ספקטרוסקופיית EPR ומדידות פעילות אנזימטית44. באופן דומה, הערכת פגוציטוזה חזקה נעשית גם במספר דרכים; השיטות החלופיות כוללות ציטומטריית זרימה בלבד45,46 או בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי47. נדידת התאים בזמן אמת המתוארת היא בדיקה חזקה ומספקת שאינה דורשת אימות נוסף ומציגה פרמטרים שמתודולוגיות אחרות אינן יכולות לחשוב עליהם. שילובים אחרים של שיטות כאלה עשויים להתאים טוב יותר לתרחישים ספציפיים, אך לסיכום, מדובר בשילוב מהיר ובמחיר סביר המקיף פעילויות נויטרופילים רבות.

לסיכום, מחקר זה נועד לספק סדרה של בדיקות המורכבות ממתודולוגיות פשוטות, מהירות ובעלות נמוכה להערכת תגובות נויטרופילים מרובות למולקולות ותנאים חדשים כדרך לכוון טוב יותר מאמצים לעבר מתודולוגיות מתקדמות. כמגבלות עיקריות, התוצאות של מבחני ROS, NET ופאגוציטוזה צריכות להיחשב ראשוניות וזקוקות לאימות נוסף על ידי בדיקות ספציפיות ומפורטות יותר, ואלה המסתמכות על ספירת תאי מיקרוסקופיה לא אוטומטית נוטות להטיה לא מודעת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

המחברים מודים לסוכנויות המימון הבאות: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP ו-FINATEC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma - Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma - Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma - Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma - Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma - Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma - Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma - Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma - Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 204
סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga… More

Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter