Summary
פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.
Abstract
מודלים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) חייבים לשחזר את הרשת המורכבת של תאים מחוברים הנמצאים in vivo. מערכת העצבים המרכזית מורכבת בעיקר מנוירונים, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ותאי מיקרוגליה. בשל המאמצים הגוברים להחליף ולהפחית את השימוש בבעלי חיים, פותחו מגוון מערכות תרבית תאים במבחנה כדי לחקור תכונות תאים מולדות, המאפשרות פיתוח טיפולים לזיהומים ופתולוגיות במערכת העצבים המרכזית. בעוד ששאלות מחקר מסוימות יכולות להיות מטופלות על ידי מערכות תרבית תאים מבוססות אדם, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים (מושרים), לעבודה עם תאים אנושיים יש מגבלות משלה לגבי זמינות, עלויות ואתיקה. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול ייחודי לבידוד וטיפוח תאים ממוחות עכברים עובריים. תרביות התאים העצביות המעורבות המתקבלות מחקות מספר אוכלוסיות תאים ואינטראקציות הנמצאות במוח in vivo. בהשוואה לשיטות המקבילות כיום, פרוטוקול זה מחקה באופן הדוק יותר את מאפייני המוח וגם מגייס יותר תאים, ובכך מאפשר לחקור יותר תנאי ניסוי מעכבר הרה אחת. יתר על כן, הפרוטוקול קל יחסית וניתן לשחזור מאוד. תרביות אלה עברו אופטימיזציה לשימוש בקני מידה שונים, כולל מסכי תפוקה גבוהה מבוססי 96 בארות, ניתוח מיקרוסקופיה של 24 בארות ותרביות 6 בארות לניתוח ציטומטריית זרימה ותגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק לאחור (RT-qPCR). שיטת תרבית זו היא כלי רב עוצמה לחקור זיהום וחסינות בהקשר של חלק מהמורכבות של מערכת העצבים המרכזית עם הנוחות של שיטות חוץ גופיות .
Introduction
שיפור ההבנה שלנו של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי לשיפור האפשרויות הטיפוליות עבור מחלות נוירו-דלקתיות וניווניות רבות. מערכת העצבים המרכזית, רשת מורכבת של תאים המחוברים זה לזה במוח, בעמוד השדרה ובעצבי הראייה, כוללת נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ותאי מערכת החיסון המולדת שלהם, מיקרוגליה1. גישה חוץ-גופית יכולה לעתים קרובות להפחית באופן דרסטי את מספר העכברים הדרושים לביצוע מחקר משמעותי; עם זאת, האופי המורכב של מערכת העצבים המרכזית אינו מאפשר לשחזר את המצב in vivo באמצעות קווי תאים. תרביות תאים עצביים מעורבים מספקות כלי מחקר בעל ערך רב לחקר שאלות נוירו(אימונו)לוגיות במודל רלוונטי, בהתאם לעקרונות החלפה, הפחתה ועידון (3Rs) 2,3.
תומסון ועמיתיו תיארו שיטת תרבית תאים המשתמשת בתאי חוט שדרה טרום לידתי המתמיינים לכל סוגי תאי CNS העיקריים שהוזכרו לעיל4. למערכת זו יש גם היווצרות סינפסות, אקסונים מיאלינטים וצמתים של Ranvier. המגבלה העיקרית של שיטת תרבית זו היא שבהיותו חוט השדרה, הוא אינו מודל שימושי של המוח, והתא מניב מיום עוברי 13 (E13) חוטי השדרה מתכווצים. לפיכך, זה מגביל את מספר תנאי הניסוי שניתן לחקור. לכן, מחקר זה נועד לפתח מערכת תרבית תאים חדשה המשחזרת את מאפייני המוח עם תפוקת תאים מוגברת כדי להפחית את הדרישות לבעלי חיים.
באמצעות תומסון ועמיתיו כנקודת מוצא, פיתחנו מודל של תרבית תאים שנגזר אך ורק ממוחות של עכברים לפני הלידה. לתרביות אלה יש את אותן אוכלוסיות תאים, קישוריות ואפשרויות טיפול כמו תרביות חוט השדרה, אלא שיש פחות מיאלינציה בהשוואה. עם זאת, מודל CNS in vitro עם תפוקת תאים גבוהה פי שלושה בקירוב הוא יעיל יותר, דורש פחות עכברים ופחות זמן עיבוד עוברים. ביצענו אופטימיזציה של מערכת תרביות ייחודית זו עבור יישומים ומאזניים מרובים במורד הזרם, כולל שימוש בכיסויי זכוכית לניתוח מיקרוסקופיה ובגדלים שונים של לוחות בארות פלסטיק, כולל לוחות 96 בארות למחקר בתפוקה גבוהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים עמדו בחוקים ובהנחיות המקומיים לשימוש בבעלי חיים, ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המקומית באוניברסיטת גלזגו. בעלי החיים שוכנו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים בהתאם לחוק הנהלים המדעיים של בעלי החיים בבריטניה 1986, בחסות רישיון פרויקט משרד הפנים הבריטי. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J בוגרים שגודלו בבית. מומלץ להשתמש בנשים צעירות (8-12 שבועות) בשל שיעור ההצלחה הגבוה יותר של ההריון; ניתן לעשות שימוש חוזר בזכרים למספר סבבי רבייה. איור 1 מייצג סקירה סכמטית של השיטה המתוארת ליצירת תרביות נוירונים וגליה מעורבות.
1. הכנת חומרים מתכלים של תרבות הרקמה
- הכינו את הצלחות ו/או הכלים המכילים כיסויי מיקרוסקופיה בתוך ארון בטיחות דרגה 2. לעקר את כל הריאגנטים או autoclave כדי להבטיח סטריליות במהלך תקופת התרבות.
- הוסף את הנפח המתאים של BA-PLL (13.2 מיקרוגרם/מ"ל פולי-L-ליזין-הידרוברומיד [PLL] במאגר חומצה בורית [BA] [50 מ"מ חומצה בורית, 12.5 מ"מ נתרן טטרבורט, pH 8.5]; ראה טבלת חומרים) לכל באר (1,000 מיקרוליטר/באר בצלחת בת 6 בארות, 100 מיקרוליטר/באר בצלחת של 96 בארות; הכרכים מסוכמים בטבלה 1). לכיסויי מיקרוסקופיה יש להוסיף 20 מ"ל BA-PLL לצלחת תרבית רקמה בקוטר 9 ס"מ המכילה 200 כיסויים סטריליים, ולהסתחרר לפיזור אחיד.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 1-2 שעות.
- הסר את תמיסת BA-PLL מכל באר או צלחת המכילה כיסויי מיקרוסקופיה, ושטוף על ידי הוספת 20 מ"ל מים סטריליים, ערבול החלקות הכיסוי, ולאחר מכן הסרת המים. חזור על שלב השטיפה שלוש פעמים. עבור צלחת המכילה כיסויים, השאירו מים סטריליים בצלחת תרבית הרקמה בשטיפה הסופית כדי להסיר בקלות את הכיסויים.
- מוציאים כמה שיותר נוזלים עם פיפטה סטרילית ומניחים להתייבש לפחות שעתיים עד לילה.
- אחסנו את הצלחות המצופות בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודשיים.
הערה: חומצה בורית מוכנה עם תמיסת פולי-ל-ליזין (BA-PLL) ניתנת לשימוש חוזר עד שלוש פעמים, הוספת PLL חדש בכל פעם. אחסן את BA-PLL ב 4 ° C. מנות מטופלות עם BA-PLL, כמו PLL מאפשר לתאים להישאר למטה ולגדול. ללא טיפול זה, התאים יתרוממו לאחר כשבוע של תרבית ולא יוכלו עוד להתמיין.
2. דיסקציה של המוח העוברי E17
- בית משותף של עכבר נקבה אחת או יותר עם עכבר זכר. בדוק את הנקבות מדי יום עבור פקק ריר, המציין הזדווגות התרחשה.
הערה: כל נקבת עכברה "מחוברת" צריכה להיות מופרדת מהזכר כדי להבטיח את תאריך ההתחלה הנכון של ההריון. ניתן לשקול עכברים כדי לאשר הריון או לפקח חזותית. - יש לכלוא את העכבר ההרה ב-E17 בשיטות מתאימות בהתאם להנחיות ולחוקים המקומיים לרווחת בעלי חיים, לדוגמה, על ידי העלאת ריכוז הפחמן הדו-חמצני (CO2), מנת יתר קטלנית של חומר הרדמה או נקע של הצוואר.
הערה: אסור שהשיטה שנבחרה תשבש את העוברים. במחקר זה, חשיפה לריכוז עולה של גז פחמן דו חמצני ואחריו אישור מוות על ידי קטיעת עורק הירך שימשה כדי לרפות סכרים בהריון. - הניחו את העכבר ההרה על גבו על לוח נתיחה; אמנם אין צורך להצמיד אותו, אך הוא עשוי להקל על חוקרים חסרי ניסיון. צבטו את קו האמצע של הבטן באמצעות מלקחיים. באמצעות מספריים חדים, לחתוך לפתוח את הבטן דרך העור ואת הצפק מעל קו האמצע מן איבר המין לכלוב הצלעות, נזהר לא לנקב את הרחם.
- לרחם העכבר יש שתי קרניים, שכל אחת מהן מכילה בדרך כלל עובר אחד עד חמישה עוברים. הסר את הרחם המכיל את העוברים מן האם ומיד להניח אותו על קרח.
- חותכים דרך שק החלמון בצד השליה, נזהרים שלא לפגוע בעוברים, ומוציאים את העוברים משק החלמון שלהם.
- ערפו מיד את ראשיהם של העוברים. הוסיפו את הראשים הערופים לצלחת עם תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) ללא סידן (Ca 2+) ומגנזיום (Mg2+) (HBSS-/-) על קרח.
הערה: אם נדרש גנוטיפ, ניתן להסיר את הזנב בשלב זה לצורך ניתוח גנטי. כאשר צפויים גנוטיפים מרובים, יש לשמור את הראשים של כל עובר בנפרד לצורך תרבית. - בעזרת מלקחיים זוויתיים מקמו את הראש על צדו כשהוא פונה שמאלה.
- חורר את העין עם קצה אחד של המלקחיים, מחזיק בחוזקה את הסנטר עם השני.
- מתחילים מהעורף, קורעים בעדינות את עור הקרקפת לאורך קו האמצע לכיוון קצה החוטם.
- נכנסים דרך חוט השדרה, בולט כמו אליפסה לבנה, להשתמש מלקחיים זוויתיים כדי לפצח את הגולגולת לאורך קו האמצע, לחשוף את המוח.
- מקלפים בעדינות את הגולגולת בצד הפונה כלפי מעלה, וחושפים את המוח.
- הרימו את המוח אל מחוץ לגולגולת, והשליכו את הגולגולת לאחר שהמוח הוסר לחלוטין.
- באמצעות מלקחיים, להסיר את קרומי המוח, אשר בולטים כמו קרום דק עם כלי דם צפופים.
- הכניסו את המוח לביז'ו (ראו טבלת חומרים) המכיל 2 מ"ל HBSS-/- על קרח.
- חזרו על שלבים 2.6 עד 2.13 עם המוחות הנותרים, והוסיפו עד ארבעה מוחות לכל ביז'ו.
- הוסף 250 μL של טריפסין 10x bijou ו triturate המוח על ידי ניעור bijou. יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C.
הערה: כל השלבים מנקודה זו ואילך צריכים להתבצע בתרבית רקמה סטרילית. - הפשרה 2 מ"ל של מעכב טריפסין סויה (SD) (Leibovitz L-15, 0.52 מ"ג/מ"ל מעכב טריפסין מפולי סויה, 40 מיקרוגרם/מ"ל DNase I, 3 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר [BSA] חלק V; ראו טבלת חומרים) מ-20°C - על ידי הצבתו בטמפרטורה של 37°C.
- הוסיפו 2 מ"ל של מעכב SD לכל ביז'ו המכיל מוח (לכל ביז'ו המכיל עד ארבעה מוחות), ונענעו שוב את הביז'ו כדי לפזר אותו באופן שווה.
הערה: מעכב SD מפחית את פעילות הטריפסין כדי למנוע עיכול מיותר של הדגימות ולשמר את יכולת הקיום של התא. - ללא צנטריפוגה, מוציאים 2 מ"ל של הסופרנאטנט מכל ביז'ו ומעבירים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, נזהרים שלא להעביר גושי תאים.
- Triturate את התאים הנותרים bijou עם מחט 19 G מחובר מזרק 5 מ"ל על ידי שאיפה את המתלה פעמיים. זה ייצור תערובת סמיכה דמוית ריר.
- חזור על הפעולה פעמיים נוספות באמצעות מחט 21 גרם. אם נותרו גושים, יש לשלש שוב עם מחט 21 גרם.
- העבר את התאים מהביז'ו לאותה צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל (משלב 2.18) באמצעות מחט 23 גרם.
- צנטריפוגה במהירות 200 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות.
- מוציאים את כל הסופרנאטנט באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ"ל ומעבירים אותו לצינור צנטריפוגה נוסף של 15 מ"ל, נזהרים שלא להפריע לגלולה הרופפת בתחתית המכילה את התאים הדרושים.
- צנטריפוגה את הסופרנאטנט שוב ב 200 x גרם ב RT במשך 5 דקות.
הערה: שלב זה אינו חיוני, אך אם אדם זקוק לתאים רבים או שיש לו מעט עוברים, ניתן לבצע שלב זה כדי לשחזר תאים רבים ככל האפשר מהסופרנטנט. - שימוש ב-10 מ"ל של חומרי ציפוי (PM) (49% מדיום עיט מעובד של Dulbecco [DMEM], 1% פניצילין/סטרפטומיצין [Pen/Strep], 25% סרום סוס, 25% HBSS עם Ca 2+ ו-Mg2 + [HBSS+ /+]; ראו טבלת חומרים), שלבו והשעו מחדש את שתי הכדוריות יחד ליצירת תרחיף תא שלם.
- ספרו את התאים באמצעות טריפאן כחול והמוציטומטר או מונה תאים דיגיטלי, ודללו את תרחיף התא עם PM לריכוז של 1.8 x 106 תאים / מ"ל.
3. ציפוי התאים
- הוסף את הנפח הנדרש של מתלה התא לתבנית הנדרשת כמפורט בטבלה 1: 1,000 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 50 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 100 μL לכל כיסוי.
- יש לדגור במשך 2-4 שעות בטמפרטורה של 37°C עם 5%-7% CO2. בדקו שהתאים נצמדו באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
- הסר את המדיה וטען באמצעי בידול חדש (DM+: DM- כולל אינסולין של 10 מיקרוגרם/מ"ל. DM-: DMEM, 1% עט/Strep, הידרוקורטיזון 50 ננומטר, ביוטין 10 נ"ג/מ"ל, תוסף מדיה 2.5 מ"ל 100x N1; ראו טבלת חומרים). הכרכים מפורטים בטבלה 1. לחצו כלפי מטה על כל הכיסויים הצפים בעזרת קצה פיפטה סטרילי.
4. שמירה על התרבויות
הערה: תרבויות אלה דורשות האכלה שלוש פעמים בשבוע כדי לתמוך בגדילה ובהתמיינות אופטימליות. התרביות יגיעו לבריאות ובשלות אופטימליות לניסויים ב-DIV (ימים במבחנה) 21. תאים יכולים להישמר בתרבית עד 28 ימים, ולאחר מכן התרביות מתנוונות במהירות.
- שלוש פעמים בשבוע עד DIV12, להחליף חלק של supernatant עם DM+ טרי על ידי הסרת 500 μL לכל באר בפורמט 6 באר, 50 μL לכל באר בפורמט 96 באר, או 500 μL לכל צלחת המכילה שלושה כיסויים, והוספת 600 μL לכל באר בפורמט 6 באר, 60 μL לכל באר בפורמט 96 באר, או 600 מיקרוליטר לכל צלחת כיסוי (טבלה 1).
- שלוש פעמים בשבוע מ-DIV13 ואילך, החליפו חלק מהסופרנאטנט ב-DM טרי על ידי הסרת 500 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 50 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 500 μL לצלחת המכילה שלוש כיסויים, והוספת 600 μL לבאר בפורמט 6 בארות, 60 μL לבאר בפורמט 96 באר, או 600 מיקרוליטר לכל צלחת כיסוי (טבלה 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופ
תרביות הגדלות על כיסויי זכוכית אידיאליות לניתוח במיקרוסקופיה. כדי להמחיש את התפתחות התרביות, הכיסויים נקבעו ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) במספר נקודות זמן מ-DIV0 (לאחר חיבור התאים) ועד DIV28. התרביות הוכתמו לצורך דימות אימונופלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן5 באמצעות שלושה שילובי צביעה שונים: NG2 (אוליגודנדרוציטים לא בוגרים) ונסטין (תאי גזע/תאי אב) כסמנים התפתחותיים, SMI31 (אקסונים), MBP (מיאלין) ו-NeuN (גוף תא עצב) כסמנים עצביים, או CNP (אוליגודנדרוציטים), GFAP (אסטרוציטים) ו-Iba1 (מיקרוגליה) כסמני גלייה (איור 2).
סוגי התאים השונים כומתו באמצעות צינורות CellProfiler (בהתבסס על ′,6-diamidino-2-phenylindole-positive (https://github.com/muecs/cp/tree/v1.1). כל נקודת נתונים בודדת נוצרה מממוצע של 10 תמונות שצולמו משלושה כיסויים בכל נקודת זמן. עבור מיקרוגליה, נוירונים ואוליגודנדרוציטים, חושב אחוז סוג התא לתא 4′,6-diamidino-2-phenylindole-positive (DAPI+). שדה הראייה באחוזים שימש במקום מספר התאים לכימות מספר האסטרוציטים. זה נבע מקשיים בהתמיינות בין תאים בודדים כאשר הם חפפו לעתים קרובות (איור 2M,N). התרביות הגיעו לשיא הבשלות וצפיפות התאים ב-DIV21, ולאחר מכן התרביות החלו להתפרק (איור 2N).
חשוב לציין, תרבויות אלה יכולות בקלות להיות מטופלות באמצעות תרופות, כגון טיפולים פוטנציאליים, או להשתמש בהן כדי לעקוב אחר זיהומים במבחנה . בדוגמה זו, תרביות על גבי כיסויים הועברו לצלחת בת 24 בארות והודבקו בנגיף הנוירוטרופי ביותר Semliki Forest virus (SFV) (זן SFV6)6, המבטא zsGreen בתאים נגועים. מכפלה של זיהום (MOI - מספר חלקיקי הנגיף שנוספו לכל תא) של 0.05, כמו טיטרציה על תאי כליות אוגר התינוק (BHK), שימש כדי להבטיח זיהום ברמה נמוכה. לאחר 0-72 שעות לאחר ההדבקה (hpi), התרביות תוקנו ב-4% PFA ונצבעו לניתוח על ידי הדמיה אימונופלואורסצנטית. איור 3 ממחיש כי, בהתאם לזיהום in vivo , SFV מדביק בעיקר אוליגודנדרוציטים ותאי עצב6.
qRT-PCR
בנוסף למיקרוסקופיה, תרביות CNS אלה יכולות לשמש לניתוח בשיטות מולקולריות, כגון RT-qPCR של תגובות mRNA לטיפול. כדי להמשיך לחקור את התגובה האנטי-ויראלית המולדת, תרביות צלחת 6 בארות טופלו במגוון מינונים של ציטוקין אנטי-ויראלי אינטרפרון בטא (IFN-β) במשך 24 שעות. תרביות עברו ליזה עם גואנידיום-תיוציאנט/פנול, והרנ"א בודד, הומר ל-cDNA ונותח על ידי qPCR כפי שתואר קודם לכן7. בשיטה זו ניתן למדוד ביטוי דיפרנציאלי של גנים רבים. כאן, הרגולציה של Ccl5 כומתה כנגד גן משק הבית 18s. CCL5 הוא ציטוקין כימוטקטי (כימוקין) המעורב בתגובה הדלקתית. טיפול IFN-β הביא לעלייה בוויסות של Ccl5 mRNA בתרביות (איור 4A).
בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA)
פורמט 96 בארות של תרבויות הוא כלי מצוין להקרנות בתפוקה גבוהה של טיפולים. כדי לחקור אם הרגולציה של Ccl5 mRNA גורמת לביטוי של חלבון CCL5, CCL5 נמדד בסופרנאטנט של התרביות על ידי ELISA, על פי הוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). בדוגמה זו, תרביות של 96 בארות טופלו בכפילות עם 27 מנות מצטברות של IFN-β כדי ליצור עקומת מנה-תגובה (איור 4B). בהתאם לביטוי המוגבר של mRNA (איור 4A), הייתה עלייה ב-CCL5 ששוחרר בסופר-נטנט. כצפוי, איור 4C מדגים מתאם ברור בין mRNA לבין ביטוי חלבונים.
ציטומטריית זרימה
ציטומטריית זרימה היא כלי רב עוצמה לחקירה בו זמנית של ביטוי של סמנים תוך-תאיים ו/או חוץ-תאיים רבים. עם זאת, ניתוח תרביות מורכבות ואינטראקטיביות מאוד על ידי ציטומטריית זרימה יכול להיות מאתגר עקב נזק לתאים ומוות בעת העברת תאים מתרבית לתרחיף של תא יחיד לצורך עיבוד וניתוח. בהשוואה בין מגוון פרוטוקולים המשתמשים בחומצה טריפסין-אתילאנדיאמין-טראאצטית (EDTA) של 0.05%-0.5%, טריפסין 1x-10x ללא EDTA ומגיב דיסוציאציה עדין, נמצא כי לאחר טיפול בתרביות צלחת 6 בארות עם 0.05% טריפסין-EDTA במשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה, התאים הורמו בטריטורציה עדינה כדי ליצור תרחיף חד-תאי. במיוחד עבור ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי CNS, זה קריטי להיות עדין במהלך הכנת התא, למזער את שלבי השטיפה, ולהקפיד מאוד לשמור על התאים ב 4 ° C או על קרח בכל עת.
כדי להעריך את הכדאיות ואת סוגי התאים בתרחיף החד-תאי הזה, התאים הוכתמו בצבע כדאיות ותויגו באופן פלואורסצנטי נוגדנים נגד CD45, CD11b, O4, ACSA-2 ו-CD24 כדי לאפשר הדמיה של כל אוכלוסיית תאים בודדת בתרביות8 (איור 5). כ-70% כדאיות תאים התקבלה משיטה זו, בממוצע בערך 2 x 10 6 תאים בודדים בני קיימא לכל צלחת של6 בארות (איור 5C). בהתאם לתוצאות המיקרוסקופ (איור 2N), היו מספר גדול של מיקרוגליה, תאי עצב ואסטרוציטים, בעוד שאוליגודנדרוציטים היו הכי פחות נפוצים.
איור 1: סקירה סכמטית של השיטה המתוארת ליצירת תרביות נוירונים וגליה מעורבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תרביות מערכת העצבים המרכזית E17 מוכתמות עבור סמנים של תאי הדמיה אימונופלואורסצנטיים לאורך זמן. התאים תוקנו עם 4% PFA לפני שחדרו והוכתמו כדי לדמיין אוכלוסיות שונות. תמונות מייצגות של (A,D,G,J,M) סמנים התפתחותיים NG2 (תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים) ונסטין (תאים מבשרי נוירונים וגלייה), (B,E,H,K,N) סמנים עצביים SMI31 (אקסונים), MBP (מיאלין) ו-NeuN (גוף תא עצב), ו-(C,F,I,L,O) סמני גליה CNP (אוליגודנדרוציטים), GFAP (אסטרוציטים) ו-Iba1 (מיקרוגליה). פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (P) ספירות DAPI למ"מ2, n = 3, כל n מטריפליקטים טכניים של 10 תמונות למשולש. (Q) תאים נספרים כאחוז מתאי DAPI+ (מיקרוגליה, אוליגודנדרוציטים ונוירונים) וכאחוז משדה הראייה (אסטרוציטים), n = 3, כל n מטריפליקטים טכניים של 10 תמונות למשולש. קווי שגיאה הם ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהום בנגיף יער סמליקי (SFV) של תרביות מערכת העצבים המרכזית E17 לאורך זמן. תמונות מייצגות של תרביות בקרה לא נגועות (A,C,E,G) ותרבויות נגועות ב-0.05 MOI SFV (B,D,F,H). התאים היו נגועים במשך 0-48 שעות ומוכתמים ב-CNP (סמן אוליגודנדרוציטים) וב-NeuN (סמן נוירונים) (A-D) או GFAP (סמן אסטרוציטים) וב-Iba1 (סמן מיקרוגליאלי) (E-H). חיצים לבנים מציינים תא נגוע. זן זה של SFV מבטא את החלבון הפלואורסצנטי הירוק zsGreen כדי לאפשר מעקב אחר זיהום נגיפי. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: CCL5 mRNA וביטוי חלבונים של תרביות E17 CNS לאחר טיפול IFN-β. התאים טופלו בפורמט צלחת 6 בארות (mRNA) או בפורמט צלחת 96 בארות (חלבון) במשך 24 שעות עם מגוון מינונים של IFN-β. (A) ביטוי של Ccl5 mRNA לאחר טיפול עם 0-100 ng/mL IFN-β, ביולוגי n = 2, כל אחד נלקח מטריפליקטים טכניים. (B) ריכוז CCL5 בסופרנאטנט לאחר טיפול IFNβ של 0-100 ננוגרם/מ"ל, ביולוגי n = 1, נלקח מטריפליקטים טכניים. (C) mRNA תאי Ccl5 upregulation לעומת ריכוז חלבון CCL5 בסופרנאטנט עם קו מגמה לוג. קווי שגיאה הם ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: אסטרטגיית גאטומטריית זרימה ליצירת אוכלוסיות חד-תאיות מתרביות מערכת העצבים המרכזית E17. התאים נותקו באמצעות 0.05% טריפסין-EDTA, הוכתמו בנוגדנים מתאימים ומוינו לאוכלוסיות תאים בודדות. (א-ג) אסטרטגיית Gating למיון תאים בודדים חיים. (D) אסטרטגיה לבחירת מיקרוגליה (CD45+ CD11b+). (E) אסטרטגיה לבחירת אוליגודנדרוציטים (CD45- CD11b- O4+). (F) אסטרטגיה למיון אסטרוציטים (CD45- CD11b- O4- ACSA-2+ CD24+) ונוירונים (CD45- CD11b- O4- ACSA-2- CD24+). (G) אוכלוסיות תאים בודדות מונחות זו על זו, ומראות אוכלוסיות בדידות. (H) סוגי תאים בודדים כאחוז מסך התאים הממוינים, n = 4. קווי שגיאה הם ± SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| פורמט נדרש | BA-PLL/באר | מים לשטיפה | תאי נפח במדיית ציפוי (PM) ללוחית החוצה | טעינת מדיה | להסיר/להוסיף בעת האכלת תרביות (3 פעמים בשבוע) |
| 6 פורמט טוב (9.6cm2) | 1000 מיקרוליטר | 1000 מיקרוליטר | 1000 מיקרוליטר | -400 מיקרוליטר | -500 μL מדיה |
| +600 מיקרוליטר DM+ | +600 μL DM+/- | ||||
| 96 פורמט טוב (0.32 ס"מ2) | 100μL | 100 מיקרוליטר | 50 מיקרוליטר | +60 מיקרוליטר DM+ | -50 μL מדיה |
| +60 μL DM+/- | |||||
| כיסויים בפורמט צלחת | 20 מ"ל לכל 200 כיסויים | 20 מ"ל | 100 מיקרוליטר לכל כיסוי | +600 מיקרוליטר DM+ | -500 μL מדיה |
| +300 μL PM | +600 μL DM+/- |
טבלה 1: נפחים נדרשים להכנת פלסטיק לתרבית רקמה מצופה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מערכת העצבים המרכזית היא רשת מורכבת המשתרעת מהמוח ועד חוט השדרה ומורכבת מסוגי תאים רבים, בעיקר נוירונים, אוליגודנדרוציטים, אסטרוציטים ומיקרוגליה1. מכיוון שלכל תא יש תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס וביצירת תגובות מתאימות לאתגרים במערכת העצבים המרכזית 9,10,11, מערכת תרבית המכילה את כל סוגי התאים הללו היא כלי שימושי ורב-תכליתי לחקור כיצד המוח עשוי להגיב לגירוי. היכולת לחקור תאים אלה, ואת יחסי הגומלין ביניהם, בהקשר של מבחנה פירושה שניתן להשתמש במגוון רחב של טכניקות כדי לחקור שאלות ניסוי שונות בקלות. תיארנו שיטה מהירה ויעילה להשיג ולתרבת את סוגי תאי מערכת העצבים המרכזית העיקריים מהמוח שלפני הלידה, אשר יכולים לחקות אוכלוסיות תאים בודדים במוח העכבר הבוגר12.
פרוטוקולים שנקבעו בעבר ליצירת תרביות CNS משתמשים בחוט השדרה E13.5 4,5. בנוסף לכך שיש מודל מתאים לחוט השדרה, זה מאוד רלוונטי יש מודל כי reapitulates את המוח. לכן, מוחות מעכברי E13.5 אלה שימשו במקור ליצירת תרביות מערכת העצבים המרכזית המתוארות כאן באמצעות אותו פרוטוקול. עם זאת, לאחר DIV14, התאים החלו ליצור אגרגטים גדולים עם גופי תאים עצביים צפופים. בזמן שהאסטרוציטים היו נוכחים, לא ברור אם הם התפזרו באופן שווה. לא ברור אם התאים במרכז גופי התא האלה יקבלו מספיק חומרי מזון וחמצן ממדיום התרבית כמו התאים בחוץ. כאשר חווים מחסור בחמצן ובחומרים מזינים, תאי עצב עלולים לעבור אפופטוזיס ולשחרר אותות עקה לתאי גליה13, מה שעלול להוביל לפנוטיפ פרו-דלקתי14. נוירוגנזה נחשבה כגורם סביר לצברים צפופים אלה, ושלב זה שוכך עד E1715. כאשר נעשה שימוש במוחות מעוברי עכברים E17, התאים עדיין יצרו רשתות, אך לא התקבצו לצברים הגדולים שנצפו ב-E13.5, ולכן נחשבו לגיל מתאים יותר להיווצרות תרביות המוח.
השיטה הנוכחית מביאה גם למספר גדול יותר של תאים המתקבלים מהריון אחד (בממוצע 1 x 10 7 תאים / מוח לעומת 3-4 x 106 תאים / חוט השדרה)7. עבור עכברה בהריון ממוצעת עם 8-10 עוברים, זה מתואם עם עד 54 תנאים ניסיוניים שונים בפורמט צלחת 6 בארות, או 150 תנאים ניסיוניים עבור מיקרוסקופיה (לעומת 19 ו 64, בהתאמה, מחוט השדרה). ככאלה, תרביות CNS אלה הן כלי נהדר כדי להפחית את המספר הנדרש של עכברים16. בפרט, פורמט 96 בארות יכול לשמש בקלות עבור בדיקות תפוקה גבוהה, כגון לאפשר סינון של מועמדים לתרופות לפני ניסויים בבעלי חיים, להפחית באופן משמעותי את מספר בעלי החיים הדרושים למחקרים כאלה. יש לקוות שזה ישפר את שיעור ההצלחה הנמוך של בדיקת תרופות למערכת העצבים המרכזית בבעלי חיים וישפר את התרגום לניסויים קליניים בבני אדם17,18.
התרבויות מגיעות לשיא הבשלות על ידי DIV21. ספירת התאים גדלה עד לנקודת זמן זו, ולאחר מכן התאים מתחילים להתנוון עם מספרים הולכים ופוחתים של כל סוג תא. זה נמדד גם על-ידי התבוננות במספרי התאים המכומתים (איור 2N) וגם במספר הגרעינים הפיקנוטיים (כתמי DAPI צפופים) (איור 2M). בעוד שהסמנים ההתפתחותיים nestin ו-NG2 עדיין מבוטאים ב-DIV14 (איור 2G) וב-DIV21 (איור 2J), הסיבה לכך היא שחלק מהאסטרוציטים עוברים אסטרוגליוזיס, אשר מעלה את רמת הוויסות של Nestin19, בעוד שחלק מהאוליגודנדרוציטים אינם בשלים לחלוטין ולכן עדיין מבטאים חלק מ-NG220. בהתבסס על אימות במיקרוסקופיה, רק חלק קטן מהתאים עדיין מבטאים סמנים התפתחותיים בהשוואה לתאים הבשלים לחלוטין על-ידי DIV21 (איור 2I,L); לכן, התרבויות בוגרות במידה רבה בשלב זה. יש לציין, in vivo, צפיפות מיקרוגליה משתנה מאוד על פני CNS murine. רמת המיקרוגליה, כפי שהיא מוגדרת על ידי ביטוי Iba1 באמצעות מיקרוסקופיה, נמצאת בקצה הגבוה של צפיפות זו בתרבויות שלנו12. האחוז הגבוה של מיקרוגליה ששורדים את הליך ציטומטריית הזרימה נובע ככל הנראה מכך שתאי מיקרוגליה חזקים יותר מתאי CNS אחרים, שבדרך כלל יש להם שלוחות עדינות, ולכן נוטים יותר להיפגע במהלך הכנת ציטומטריית זרימה.
זה לוקח רק 3 שבועות לאחר הדיסקציה עד שהתאים מוכנים לניסויים, שהוא קצר יותר מרוב שיטות המבחנה המבוססות על בני אדם, כגון אורגנואידים או מודלים מופקים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים21. כל עוד נדרש מחקר in vivo כדי להבטיח את בטיחותם של טיפולים חדשים, שימוש בשיטות גידול תאי מבחנה כמו שלנו יסייע בבדיקת רעילות ויעילות ביעילות לפני ניסויים בבעלי חיים, הפחתת הדרישה לבעלי חיים ושיפור תרגום המחקר מ- in vitro ל- in vivo. יש לקוות שזה יוביל בסופו של דבר לתרגום יעיל יותר גם לניסויים קליניים מבוססי אדם. בסופו של דבר, תרבויות אלה נוצרו כדי לאפשר את המחקר של CNS. בעוד שמערכות במבחנה אינן יכולות לבטא באופן מלא את המורכבות של מערכת העצבים המרכזית, תרביות ראשוניות שמקורן בתאים מייצגות בצורה מדויקת יותר את תכונות מערכת העצבים המרכזית in vivo 22,23. גישות במבחנה יכולות לאפשר גישה רדוקטיבית יותר לחקור את מערכת העצבים המרכזית בהיעדר תאי חיסון חודרים24 ואת שלמות מחסום הדם-מוח25. הסרת שכבת מורכבות זו יכולה להקל על חשיפת מנגנונים. ככזו, מערכת הטיפוח הנוכחית היא כלי שימושי לענות על שאלות מחקר המשלימות את המחקר בבעלי חיים in vivo.
היכולת לקצור, לבודד ולגדל תאי CNS כבר קידמה מאוד את הבנתנו את מערכת העצבים המרכזית המולדת16. מאמר זה מדגים את הדיסקציה של מוחות עכברי E17 ואת הטריטורציה והטיפוח של התאים כתוצאה מכך כדי ליצור מערכת תרבית תאים המכילה את כל סוגי התאים העיקריים של מערכת העצבים המרכזית. טכניקות מולקולריות רבות הופעלו על תרבויות אלה, המראות את היעילות שיש לתרבויות אלה לחקר מערכת העצבים המרכזית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי מעבדות אדגר ולינינגטון, במיוחד לפרופ' כריס לינינגטון, ד"ר דיאנה ארסני וד"ר קטיה מוקליש, על עצותיהם, הערותיהם המועילות ועזרתם בהזנת התרבויות בזמן שהקמנו תרבויות אלה. תודה מיוחדת לד"ר Muecklisch על מתן נקודות ההתחלה עבור צינורות Cell Profiler. עבודה זו נתמכה על ידי האגודה לטרשת נפוצה (מענק 122) וקרן יורי ולורנה צ'רניובסקי לפרלמנט; מימון אוניברסיטת גלזגו ל-JC ול-MP; ו-Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) ו-Medical Research Council (MRV0109721) ל-GJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | To digest tissue |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Put 8 35 mm dishes per 1 140 mm dish |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | To collect cells into pellet for resuspension in plating media |
| 18 G needle | Henke Sass Wolf | 4710012040 | For trituration of sample |
| 21 G needle | BD | 304432 | For trituration of sample |
| 23 G needle | Henke Sass Wolf | 4710006030 | For trituration of sample |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plate out 3 PLL coated coverslips per 1 35 mm dish |
| 5 mL syringe | Fisher | 15869152 | For trituration of sample |
| 6 well plate | Corning | 3516 | To plate out cells for RT-qPCR, and flow cytometry |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | To put brains intp |
| 96 well plate | Corning | 3596 | To plate out cells for high-throughput testing |
| ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE | Miltenyi | 130-123-284 | For flow cytometry staining of astrocytes |
| Angled forceps | Dumont | 0108-5/45-PO | For dissection |
| Biotin | Sigma | B4501 | For DM+/- |
| Boric Acid | Sigma | B6768-500G | For boric acid buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-mouse CD24 Antibody, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | For flow cytometry staining of neurons and astrocytes |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD45 Antibody, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | For flow cytometry staining of microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-mouse/human CD11b Antibody, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | For flow cytometry staining of microglia |
| BSA Fraction V | Sigma | A3059-10G | For SD Inhibitor |
| CNP | Abcam | AB6319 | Mature oligodendrocytes |
| Coverslip | VWR | 631-0149 | To plate out cells for microscopy |
| Dissection Scissors | Sigma | S3146-1EA | For dissection |
| DMEM High glucose, sodium pyruvate, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | For DM+/-, and for plating media |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from sigma |
| DNase I | Sigma | D4263 | For SD Inhibitor, can use this or the other Dnase from thermofisher |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead stain |
| Fine forceps | Dumont | 0102-SS135-PO | For dissection |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocytes |
| HBSS w Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | For plating media |
| HBSS w/o Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | For brains to be added to |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | For plating media |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | For DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | For DM+ |
| Leibovitz L-15 | GIbco | 11415-049 | For SD Inhibitor |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myelin |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit for quantifying concentration of CCL5 in supernatants of 96 well plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | For DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neuronal stem/progenitor cells |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronal cell body |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Immature oligodendrocytes |
| O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | For flow cytometry staining of oligodendrocytes |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | For DM+/-, and for plating media |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | For Boric acid / poly-L-lysine solution to coat coverslips |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axons |
| Sodium Tetraborate | Sigma | 221732-100G | For boric acid buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | For lysing cells for RT-qPCR |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T9003-100MG | For SD Inhibitor |
References
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754 (2019).
- Thomson, C. E., et al. synapsing cultures of murine spinal cord-validation as an in vitro model of the central nervous system. The European Journal of Neuroscience. 28 (8), 1518-1535 (2008).
- Bijland, S., et al. An in vitro model for studying CNS white matter: Functional properties and experimental approaches. F1000Research. 8, 117 (2019).
- Fragkoudis, R., et al. Neurons and oligodendrocytes in the mouse brain differ in their ability to replicate Semliki Forest virus. Journal of Neurovirology. 15 (1), 57-70 (2009).
- Hayden, L., et al. Lipid-specific IgMs induce antiviral responses in the CNS: Implications for progressive multifocal leukoencephalopathy in multiple sclerosis. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 135 (2020).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. Journal of Immunology Research. 2017, (2017).
- Gee, J. R., Keller, J. N. Astrocytes: Regulation of brain homeostasis via apolipoprotein E. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 37 (6), 1145-1150 (2005).
- Madeira, M. M., Hage, Z., Tsirka, S. E. Beyond myelination: possible roles of the immune proteasome in oligodendroglial homeostasis and dysfunction. Frontiers in Neuroscience. 16, 867357 (2022).
- Keller, D., Erö, C., Markram, H. Cell densities in the mouse brain: A systematic review. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 83 (2018).
- Wang, Y. X., et al. Oxygenglucose deprivation enhancement of cell death/apoptosis in PC12 cells and hippocampal neurons correlates with changes in neuronal excitatory amino acid neurotransmitter signaling and potassium currents. Neuroreport. 27 (8), 617-626 (2016).
- Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 3, 99-126 (2008).
- Chen, V. S., et al. Histology atlas of the developing prenatal and postnatal mouse central nervous system, with emphasis on prenatal days E7.5 to E18.5. Toxicologic Pathology. 45 (6), 705-744 (2017).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Kesselheim, A. S., Hwang, T. J., Franklin, J. M. Two decades of new drug development for central nervous system disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (12), 815-816 (2015).
- Gribkoff, V. K., Kaczmarek, L. K. The need for new approaches in CNS drug discovery: Why drugs have failed, and what can be done to improve outcomes. Neuropharmacology. 120, 11-19 (2017).
- Zamanian, J. L., et al.
- Nishiyama, A., Suzuki, R., Zhu, X. NG2 cells (polydendrocytes) in brain physiology and repair. Frontiers in Neuroscience. 8, 133 (2014).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain organoids derived from pluripotent stem cells: Promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 59 (2017).
- Asch, B. B., Medina, D., Brinkley, B. R. Microtubules and actin-containing filaments of normal, preneoplastic, and neoplastic mouse mammary epithelial cells. Cancer Research. 39 (3), 893-907 (1979).
- Koch, K. S., Leffertt, H. L. Growth control of differentiated adult rat hepatocytes in primary culture. Annals of the New York Academy of Sciences. 349, 111-127 (1980).
- Nevalainen, T., Autio, A., Hurme, M. Composition of the infiltrating immune cells in the brain of healthy individuals: effect of aging. Immunity and Ageing. 19 (1), 45 (2022).
- Daneman, R., Prat, A.
