Summary
这里展示的是新版本的扩增显微镜(ExM),放大,经过修改可扩展高达11倍,保留全面的生物分子类别,并与多种组织类型兼容。它能够使用传统的衍射极限显微镜询问生物分子的纳米级构型。
Abstract
生物标本的纳米级成像可以提高对疾病发病机制的认识。近年来,扩展显微镜(ExM)已被证明是光学超分辨率显微镜的有效且低成本的替代方案。然而,由于需要特定的且通常是定制的锚定剂来保留凝胶内不同的生物分子类别,以及难以扩展标准临床样品形式(例如福尔马林固定石蜡包埋的组织),特别是如果需要更大的扩增因子或保留的蛋白质表位,它受到了限制。在这里,我们描述了Magnify,这是一种新的ExM方法,可在各种组织类型中实现高达11倍的稳健扩增。通过使用甲基丙烯醛作为组织和凝胶之间的化学锚,Magnify在凝胶中保留了多种生物分子,例如蛋白质,脂质和核酸,从而允许在传统光学显微镜上对组织进行广泛的纳米级成像。该协议描述了确保稳定和无裂纹组织扩增的最佳实践,以及处理和成像高度扩增凝胶的技巧。
Introduction
生物系统表现出结构异质性,从四肢和器官到纳米级的蛋白质水平。因此,要全面了解这些系统的运行情况,需要对这些尺寸尺度进行目视检查。然而,光的衍射极限给在传统荧光显微镜上可视化小于~200-300nm的结构带来了挑战。此外,光学超分辨率方法1,2,3,如受激发射损耗(STED),光激活定位显微镜(PALM),随机光学重建显微镜(STORM)和结构照明显微镜(SIM),虽然功能强大,但也带来了自己的挑战,因为它们需要昂贵的硬件和试剂,并且通常采集时间慢,并且在3D中成像大体积的能力差。
膨胀显微镜4(ExM)提供了一种规避光衍射极限的替代方法,方法是将生物分子共价锚定到可水溶胀的聚合物凝胶中并将它们物理拉开,从而使它们在传统光学显微镜上可分辨。自不到十年前ExM首次发表以来,已经开发了多种ExM方案变体,这些方案允许直接掺入蛋白质5,6,7,RNA 8,9,10或脂质11,12,13通过在单个步骤14或多个迭代步骤15,16中改变化学锚或进一步扩展样品(从而提高有效分辨率)进入凝胶网络。直到最近,还没有一个单一的ExM协议可以用单一的市售化学锚保留这三种生物分子类别,同时提供机械坚固的凝胶,可以在单轮扩增中扩增~10倍。
在这里,我们介绍了Magnify17,这是ExM武器库中的最新成员,它使用甲基丙烯醛作为生物分子锚。甲基丙烯醛与多聚甲醛等组织形成共价键,确保多类生物分子可以保留在凝胶网络中,而无需各种特异性或定制的锚定剂。此外,该技术可以将广谱组织扩展多达 11 倍,包括众所周知具有挑战性的样品,例如福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 临床样品。以前扩增这种机械刚性样品的方法需要严格的蛋白酶消化,使得在样品扩增后无法对感兴趣的蛋白质进行抗体标记。相比之下,该技术使用热变性溶液实现FFPE临床样品的扩增,从而保留凝胶内的整个蛋白质表位,可以靶向扩增后成像(图1)。
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Protocol
所有涉及动物的实验程序均按照美国国立卫生研究院(NIH)指南进行,并得到卡内基梅隆大学机构动物护理和使用委员会的批准。人体组织样本是商业获得的。
1. 储备试剂和溶液的制备
注意:有关所用试剂的列表,请参阅 材料表 。
- 准备胶凝储备液。这些将在胶凝步骤之前立即组合。
- 制备单体储备溶液(4 g/100 mL N,N-二甲基丙烯酰胺酸 [DMAA]、50 g/100 mL 丙烯酸钠 [SA]、66.7 g/100 mL 丙烯酰胺 [AA]、0.10 g/100 mL N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 [Bis]、33 g/100 mL 氯化钠 [NaCl]、1x 磷酸盐缓冲盐水;PBS),使用 表 1 中列出的组件。将所有储备溶液溶解或稀释在水中。单体储备溶液可在4°C下储存至少3个月。
- 在水中分别制备以下储备溶液:0.5%(w / w)4-羟基-TEMPO (4HT),在单体扩散到组织中期间抑制凝胶化,以及10%(w / w)四甲基乙二胺(TEMED),其加速过硫酸铵(APS)引发的自由基生成,并以10%(w / w)制备。
注意:储备溶液可以分成1-2mL等分试样,并在4°C下储存长达3个月;但是,APS是在制备胶凝溶液之前立即进行的。
- 通过在室温 [R.T.]下混合 1 g SDS、48.048 g 尿素、5 mL EDTA(0.5M,pH 8)、20 mL 10x PBS、25 mL Tris (2 M) 和 0.75 g 甘氨酸,制备匀浆缓冲液(1% w/v S.D.S.、8 M 尿素、25 mM EDTA、2x PBS、pH 8)。加水,总体积为 100 mL。该解决方案可以根据需要放大或缩小,并可以存储在 R.T.
2. 用于存档和新鲜制备的临床组织载玻片的组织制备
注意:组织预处理步骤因标本的制备方式而异。
- 对于甲醛固定石蜡包埋 (FFPE) 临床样品,请按照以下步骤操作。
- 将样品依次放入一系列溶液中(可以使用载玻片染色罐或50mL锥形管):二甲苯,95%乙醇,70%乙醇和50%乙醇,然后是双倍去离子水。每次使用每种溶液两次,每次至少3分钟。使用镊子将载玻片放入容器中,并加入 15 mL 相应的溶液(足以覆盖样品)。在室温下将带盖的锥形管水平放置在摇床上。
- 对于染色并安装在永久性载玻片上的样品,请按照以下步骤操作。
- 将载玻片短暂地放入二甲苯中,并使用适当的工具(例如剃须刀片)小心地取出盖玻片。如果盖玻片仍然卡住,请将二甲苯载玻片放回室温,直到盖玻片松动。
- 然后,将样品作为FFPE样品进行处理(步骤2.1.1)。
注意:对于苏木精和伊红(H&E)染色的载玻片,苏木精和伊红染色剂在扩增过程中会丢失。
- 对于最佳切割温度(OCT)溶液中未固定的冷冻组织载玻片,将组织固定在-20°C的丙酮中10分钟,然后在室温下用1x PBS溶液洗涤样品三次,每次10分钟。
- 对于先前固定的冷冻临床组织载玻片,通过在室温下孵育载玻片2分钟来融化OCT,然后在室温下用1x PBS溶液洗涤三次,每次5分钟。
3.多聚甲醛固定小鼠脑的组织制备
- 对于30-50μm厚的小鼠脑切片,请遵循此协议。
注意:较大的切片可能会取得成功,但单体溶液扩散和均质可能需要更长的时间。 - 如果切片当前未储存在 1x PBS 溶液中(例如,在 30% [v/v] 甘油和 30% [v/v] 乙二醇溶液中的 1x PBS 溶液中,在 6 至 24 孔板中,在室温下洗涤三次,每次至少 10 分钟。
- 获得未镀膜的玻璃显微镜载玻片。如果载玻片的一面有涂层,请使用湿画笔检查未涂层的一面(通常,涂层面的标签将由毛玻璃制成,并且在潮湿时会变得不那么不透明)。
- 使用画笔弄湿未涂覆的幻灯片。用画笔从孔板上取出小鼠脑组织,然后小心地将其放在载玻片上,使用滚动运动确保组织平整。让多余的PBS保留在组织上,直到所有切片都安装完毕。
注意:虽然单个载玻片可用于多个组织切片,但当一次凝胶化更多组织切片时(即使在单独的载玻片上),必须更加小心以确保它们不会完全变干。 - 使用实验室纸布,从载玻片上去除大部分多余的PBS。在每个组织部分周围留一个小液环,但让载玻片的其余部分大部分干燥。在制备凝胶单体溶液时,剩余的液体将覆盖组织。
4. 胶凝
注意:本协议适用于制备用于该技术的所有组织类型。
- 在组织切片的两侧应用垫片(图2A)以防止组织压迫。为此,使用金刚石笔将盖玻片薄薄地切割成垫片,然后用少量水或 1x PBS 将它们固定在载玻片上,或使用少量强力胶固定它们。接下来,轻轻地将垫片放在组织的两侧。
- 准备最终的胶凝溶液。通常,每个组织切片~200 μL就足够了,但每张载玻片的体积不应超过800 μL。任何更多的胶凝溶液都会导致溢出。
注意:甲基丙烯醛用于将生物分子锚定到凝胶中。但是,不需要单独的锚固步骤,并且可以将甲基丙烯醛直接添加到最终的胶凝溶液中。- 每个切片按顺序组合以下内容:200 μL 单体溶液、0.5 μL 0.5% 4HT 储备溶液(1:400 稀释)、0.2-0.5 μL 甲基丙烯醛(1:400-1:1,000 稀释度,具体取决于组织类型;通常,对多聚甲醛 [PFA] 固定样品使用 1:1,000 稀释度,对 FFPE 临床标本使用 1:400 稀释度), 2 μL 10% TEMED储备溶液(1:100稀释), 和 5 μL 10% APS 储备溶液(1:40 稀释)。
注意:使用前立即准备最终胶凝溶液。为防止过早胶凝,请最后添加APS溶液。
- 每个切片按顺序组合以下内容:200 μL 单体溶液、0.5 μL 0.5% 4HT 储备溶液(1:400 稀释)、0.2-0.5 μL 甲基丙烯醛(1:400-1:1,000 稀释度,具体取决于组织类型;通常,对多聚甲醛 [PFA] 固定样品使用 1:1,000 稀释度,对 FFPE 临床标本使用 1:400 稀释度), 2 μL 10% TEMED储备溶液(1:100稀释), 和 5 μL 10% APS 储备溶液(1:40 稀释)。
- 从组织切片中取出多余的溶液,并将载玻片放入培养皿中。将所有新鲜制备的冷凝胶溶液加入样品中,并将混合物在4°C下在纸巾上孵育30分钟,以使其扩散到组织中。
- 将第二张未涂覆的载玻片小心地放在组织和凝胶溶液上。应避免气泡(图2B)。
注意:如果气泡被困在纸巾上,可以小心地提起玻璃盖并放回原处。此外,任何溢出的单体溶液都可以在聚合后被修剪掉,并且不会对组织造成任何问题。 - 确保聚合完成。这种聚合可以通过两种方式完成,每种方式产生相似的结果。首先,将样品在37°C的潮湿环境(例如带有湿纸巾的封闭培养皿)中孵育过夜。或者,为了更快速聚合,将样品在37°C的潮湿气氛中孵育2小时,然后在60°C下孵育1小时。
5. 样品消解和组织扩增
注意:此协议适用于所有组织类型。
- 戴上护目镜,将剃须刀片滑到胶凝室的两个载玻片之间以将它们分开。
注意:载玻片应非常容易分离。如果凝胶的不同部分粘在两个载玻片上,则可以使用画笔将凝胶引导到一个或另一个。如果凝胶在聚合过程中变得特别干燥,则可以将1x PBS施加到凝胶室的外部,但不要完全浸没凝胶,因为这会导致其在组织均质化之前膨胀,从而导致开裂。 - 修剪组织周围的空白凝胶以尽量减少体积。不对称地切割凝胶可以在均质化后跟踪凝胶的方向,因为样品将是完全透明的。
- 用剃须刀片轻轻地从载玻片中取出含组织的凝胶,然后用画笔轻轻地将其转移到2 mL离心管中。
- 用预热至80°C的均质缓冲液(表2)将管填充到顶部。
- 将样品在80°C下振荡孵育8小时(对于PFA固定的小鼠脑)或60小时(大多数FFPE临床样品;见 表3)。
注意:均质时间取决于组织类型和固定方法。其中许多条件已经得到验证,但对于其他条件,可能需要优化。 - 将离心管的内容物倒入6孔塑料细胞培养板的单孔中。
- 用移液管取出变性缓冲液。
- 为了从水凝胶中完全去除剩余的SDS,请在1%非离子表面活性剂(C12E 10)溶液中洗涤样品,如下所示:室温下至少三次,每次10分钟;在60°C下60分钟;然后在室温下再洗涤三次,每次10分钟。
- 将样品储存在4°C的1x PBS + 0.02%叠氮化钠中,直到需要进行扩增后染色和成像。
注意:此时,样品在每个维度上应大~3-4.5倍,具体取决于组织类型。
6. 扩增后生物分子分析
- 抗体染色
注意:这遵循典型的免疫荧光(IF)/免疫组织化学(IHC)染色方案。一抗和二抗的使用量取决于制造商建议的浓度或针对特定实验的优化。用户可以自行决定替换单个缓冲区。- 将样品置于6孔细胞培养板的单孔中,在R.T.的1x PBS中洗涤扩增的样品三次,每次10分钟,用移液管转移液体。
- 在室温下或在4°C下过夜,执行可选的封闭步骤(例如,3%牛血清白蛋白/ 0.1%Triton-X100在1x PBS中)至少1小时。
- 在染色缓冲液(例如,0.1% Triton-X100 1x PBS 或 9x PBS/10 mg/L 肝素)中与一抗在 37 °C 下孵育过夜。 根据样品大小,0.5-2 mL应充分覆盖凝胶。
- 在室温下在1x PBS中洗涤样品三次,每次至少10分钟。
- 在所选的染色缓冲液中于37°C在相应的二抗中孵育3小时。
- 在室温下在1x PBS中洗涤样品三次,每次至少10分钟。
- NHS-酯泛蛋白染色
- 将样品放入 6 孔板中,将 1-2 mL 聚乙二醇 (PEG 200) 倒入样品上(足以完全覆盖它)。
注意:组织应收缩并恢复到其原始膨胀前的大小(或接近它)。 - 用荧光团偶联的NHS-酯在1-2 mL染色缓冲液(例如,1x PBS,2x S.S.C.或100 mM碳酸氢钠溶液)中稀释至13.3-80μg/ mL3小时。
- 在室温下在1x PBS中洗涤样品三次,每次至少10分钟。
- 将样品放入 6 孔板中,将 1-2 mL 聚乙二醇 (PEG 200) 倒入样品上(足以完全覆盖它)。
- 脂质染色
注意:扩增后脂质染色对FFPE临床样品无效,因为在固定过程中脂质会丢失。- 在室温下在1x PBS中洗涤样品三次,每次至少10分钟。
- 在室温下应用在 2 mL 的 0.1% TritonX-100/1x PBS 中稀释 200 倍的传统亲脂性染料(DiO、DiI 或 DiD)72-96 小时。
- 用 1x PBS 至少清洗三次
- 荧光 原位 杂交
- 将匀浆凝胶样品置于预热至60°C的杂交缓冲液中30分钟。
- 制备 FISH 杂交缓冲液:混合 2x S.S.C.(300 mM NaCl,30 mM 柠檬酸钠,pH 7.0)、10% (v/v) 葡聚糖硫酸盐、20% (v/v) 碳酸乙烯酯和 0.1% (v/v) 吐温20。
- 将凝胶样品与含有10pM(每寡核苷酸)针对靶基因的FISH探针(每10kb至少20个探针)的杂交缓冲液在45°C孵育过夜。
- 用严格的洗涤缓冲液(2x S.S.C.和0.1%吐温20)洗涤两次,每次在45°C下洗涤15分钟。
- 用严格的洗涤缓冲液再洗涤两次,每次在37°C下洗涤10分钟。
- 最后,在室温下用1x PBS洗涤至少三次,每次10分钟。
- 样品准备在4°C下在1x PBS + 0.02%叠氮化钠中成像或储存。
- 全组织扩增和荧光成像
注意:放大倍放大可获得的膨胀因子因组织类型和扩增方法而异(完整摘要可在 表3中找到)。然而,作为一般估计,放大样本在 1x PBS 中将膨胀 3-4.5 倍,在 ddH2O 中稀释至 1:50 的 PBS 中将膨胀 5-7 倍,在 ddH2O 中将膨胀 8-11 倍。成像的最佳膨胀系数取决于每个实验的需求。膨胀因子是高度可调的,因此单个样品可以多次膨胀和收缩,以便在各种尺度上成像。- 使用画笔将PBS中膨胀4倍的样品移动到玻璃底6孔成像板上。通过将任何样品切成小块或轻轻放入带有薄柔性塑料的大玻璃底成像板中,进一步移动任何扩展的样品。
- 使用传统的宽视场显微镜、共聚焦显微镜或其他选择的成像系统进行荧光成像。用实验室纸布去除凝胶周围的多余液体可能会阻止凝胶在成像过程中移动。凝胶也可以通过在成像前将0.1%聚-L-赖氨酸施加到玻璃表面上来固定。
注意:聚-L-赖氨酸的应用将使凝胶在接触时完全不动。因此,必须注意将凝胶涂在玻璃上时不要折叠或拉伸。此外,不应让凝胶在聚-L-赖氨酸涂层玻璃上完全干燥,因为这会使去除变得困难,并且当凝胶仍然与聚-L-赖氨酸附着在玻璃上时,不应在PBS中收缩,因为这可能导致凝胶或组织损伤。 - 成像后,将样品收缩在1x PBS中,每次至少洗涤三次10分钟,因为由于荧光信号的降解,不建议将样品长期储存在ddH2O中。特别是,用亲脂性染料染色的完全膨胀样品应尽可能接近扩增时间成像,以防止染料在水中解离。
- 将样品储存在4°C的1x PBS + 0.02%叠氮化钠中。
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Representative Results
如果方案已成功完成(图1),则热变性后样品将呈现清澈平坦;任何折叠或起皱都表明不完全均质化。在 1x PBS 中成功扩增的样品将比扩增前大 3-4.5 倍,在 ddH2O 中完全扩增时大 8-11 倍。 图 3 显示了使用该协议处理的 5 μm 厚的 FFPE 人肾样品的扩增前和扩增后图像示例,并成功扩增了 8 倍以上。首先用ACTN4抗体和DAPI对组织进行染色,以可视化核DNA。然后使用转盘共聚焦显微镜对标本进行成像(图3A)。按照上述方案处理组织,包括相同靶标的扩增后染色,并在重新成像之前在水中完全扩增(图3B)。热变性后,蛋白质以外的生物分子也可以进行染色和成像,如图4所示。亲脂性染料可用于揭示小鼠大脑中的细胞和线粒体膜结构(图4A)。此外,核酸可以通过FISH成像,如FFPE正常人淋巴结组织如图4B,C所示。
图5显示了样品未正确均质化时可能出现的结果。扩增后,用ACTN4和vimentin抗体以及DAPI染色组织以可视化核DNA和小麦胚芽凝集素(WGA)以标记碳水化合物。在使用转盘共聚焦显微镜成像之前,组织在PBS中扩增3.5倍。在一个肾脏切片(图5A,C)中,可以看到肾小球的无裂缝扩张。在单独的部分(图5B,D),可以在组织中清楚地看到开裂。
图 1:放大工作流程示意图。 临床存档的组织载玻片的预处理首先根据存储格式进行。自由漂浮的多聚甲醛固定部分只需在PBS中洗涤。然后将样品在包括甲基丙烯醛在内的凝胶单体溶液中孵育,以将生物分子锚定到水凝胶上。在用尿素、SDS 和 EDTA 热变性之前进行 原位 聚合。然后使用常规免疫染色方案、FISH 方案或亲脂性染料彻底洗涤和染色样品。然后在成像前将样品在纯水中扩增。这个数字是从Klimas等人17修改的。 请点击此处查看此图的大图。
图2:组织样品凝胶室 。 (A)在组织的每一侧,在凝胶单体溶液在4°C下扩散之前,放置两个垫片,例如两片#1.0盖玻片。 为防止压缩,垫片应比组织切片厚。(B)在37°C聚合之前使用盖子,例如第二个载玻片,用于覆盖样品。 请点击此处查看此图的大图。
图 3:人体肾组织切片的扩展前图像示例。 (A) 以 60 倍放大倍率 (1.4 NA) 拍摄的图像与 (B) 以 40 倍放大倍率(1.15 NA,扩展因子:8.15 倍)拍摄的扩展后相同视场的图像。洋红色,DAPI;黄色,ACTN4。扩展后图像的最大强度投影在 25 帧以上。请点击此处查看此图的大图。
图 4:使用 Magnify 的替代生物分子染色策略 。 (A)(i 和 iv)完全扩增的小鼠脑组织的NHS-酯泛蛋白标记。(ii 和 v)同一小鼠脑组织的亲脂性染料(DiD)标记。(三 和 六) 合并的渠道。(B)使用FFPE放大正常人淋巴结组织的DNA鱼。膨胀系数:1 倍 PBS 中的 3.5 倍。白色,DAPI;洋红色,丝氨酸/苏氨酸激酶1基因;蓝色,APC/C激活蛋白CDH1基因;黄色,人类卫星序列S4。(C) 与 B 相关的单个渠道。所有图像均使用转盘共聚焦显微镜以40倍放大倍率(1.15 NA)获得。 请点击此处查看此图的大图。
图 5:5 μm 厚的 FFPE 肾脏样品的代表性结果。 (A)无裂纹膨胀。白色,DAPI;黄色,紫薇;青色,α-肌动蛋白4;品红色,小麦胚芽凝集素。(B)扩大的肾脏切片出现开裂。标记靶标的开裂、变形和丢失可能是锚定和/或均质化不足的结果。(中,四)分别是 A 和 B 中框框区域的放大图像。所有图像均使用转盘共聚焦显微镜以10倍(A,B;0.45 NA)或60倍(C,D;1.2 NA)放大倍率获得。请点击此处查看此图的大图。
表1:凝胶单体溶液组成。请按此下载此表格。
表2:均质缓冲液组成。请按此下载此表格。
表3:经过验证组织的甲基丙烯醛和均质条件摘要。请按此下载此表格。
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Discussion
在这里,我们介绍了放大方案17,这是一种ExM变体,可以用单个化学锚保留多个生物分子,并通过热变性将具有挑战性的FFPE临床标本扩展至11倍。该方案区别于其他ExM方案的关键变化包括使用重新配制的凝胶,即使在完全扩增时也能保持机械坚固性,以及使用甲基丙烯醛作为生物分子锚。该方案中最关键的步骤如下:1)最终凝胶溶液的组成;2)凝胶化步骤的时间;3)凝胶室的设置;4)样品均质化参数;5)在扩增后染色之前充分洗涤样品中的SDS。
该方案最关键的参数是最终胶凝溶液的组成,特别是生物分子锚定甲基丙烯醛的浓度。扩增不同的组织类型需要不同的甲基丙烯醛浓度(表3),并且必须注意确保该值与要扩增的样品完全匹配。用甲基丙烯醛过度锚定会导致扩增因子降低和可用于扩增染色的表位损失,而锚定不足,特别是在FFPE临床样品中,可导致组织裂缝或变形。因此,必须针对未经验证的组织类型优化甲基丙烯醛浓度,尽管最佳浓度可能会接近或在此处介绍的范围内。虽然我们预计该协议适用于大多数组织类型,即使是我们尚未验证的组织类型,但已知不适用于含有骨骼的样品。
除甲基丙烯醛外,使用不正确浓度的关键凝胶成分(4HT或TEMED)可能导致实验完全失败,原因可能是由于不完全或没有凝胶(过量的4HT)或过早凝胶(过量的TEMED,降低的4HT,或在其他组分之前添加APS)。为了防止过早凝胶化,还需要将样品和凝胶保持在4°C并暴露在空气中30分钟,并且在扩散过程完成后仅覆盖样品并将其置于37°C的加湿室中。
在构建凝胶室时,在两个未涂层的载玻片之间包括垫片至关重要,特别是对于较厚的组织切片,例如PFA固定的小鼠大脑。缺少垫片会导致组织受压,导致图像失真和数据不准确。
样品均质化取决于消解缓冲液的消解时间,以及消解缓冲液的温度和组成。与给定组织类型的报告值相比,均质化不足会导致变形和膨胀因子降低。如果怀疑不完全均质化,可以增加消化时间,特别是在组织较厚的情况下。
一个简单但关键的步骤是在均质步骤后用非离子表面活性剂(例如C12E10)充分冲洗样品中的SDS。任何残留的SDS都可能导致抗体结合欠佳或完全受阻。幸运的是,如果怀疑这一点,进一步洗涤和重新应用抗体通常是一个令人满意的解决方案。
该协议为当前的超分辨率成像和电子显微镜技术提供了一种经济高效的替代方案,以询问各种组织样品(包括FFPE临床标本)中的纳米级结构。甲基丙烯醛和热变性的使用允许对组织固定过程中保存的任何生物分子进行扩增后分析(例如,这排除了FFPE样品中脂质的成像)。作为ExM框架的扩展,我们的协议是模块化的,可能与其他技术兼容,如光学超分辨率方法(STED18,STORM 19)或迭代扩展显微镜(iExM)15。然而,这些尚未用所提出的方案进行测试,并且大扩增因子可能会带来挑战,尤其是荧光团稀释。此外,在水中完全扩增后样品的大尺寸需要在处理时小心(尽管这里使用的凝胶比以前的高膨胀因子ExM凝胶配方更具弹性,例如十倍稳健扩增显微镜(TREx),以处理错误17),并且偶尔需要创造性的解决方案来转移和成像这些完全扩增的凝胶。例如,使用宽基工具(如薄塑料片)来转移完全膨胀的凝胶而不是画笔,或使用定制的大型成像板(在我们手中,这意味着激光切割或3D打印的板,大块#1.5盖玻片粘附在底部;这些可以在随附的视频中看到)。最重要的是,该方法允许在传统的宽视场或共聚焦显微镜上对常见的生物和病理样品制备进行纳米级成像,从而拓宽了纳米级成像的适用性。
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Disclosures
作者声明了以下相互竞争的经济利益:Y.Z.,A.K.,Z.C.和B.R.G.发明了几项与Magnify和ExM相关的发明。
Acknowledgments
这项工作得到了卡内基梅隆大学和DSF慈善基金会(Y.Z.和X.R.),美国国立卫生研究院(N.I.H.)的支持。导演新创新奖DP2 OD025926-01和考夫曼基金会。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | Gel Monomer component |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | |
Decaethylene glycol mono dodecyl ether (C12E10) | Sigma Aldrich | P9769 | Non-ionic surfactant |
Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | Homogenization Buffer Component |
Forceps | |||
Glycine | Sigma Aldrich | G8898 | Homogenization Buffer Component |
Heparin | Sigma Aldrich | H3393 | |
Methacrolein | Sigma Aldrich | 133035 | Anchoring Agent |
Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
N,N′-Methylenebisacrylamide (Bis) | Sigma Aldrich | M7279 | Gel Monomer component |
N,N-dimethylacrylamide (DMAA) | Sigma Aldrich | 274135 | Gel Monomer component |
Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | |
Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
Nunc™ 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
Nunc™ 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
Orbital Shaker | |||
Paint brush | |||
pH Meter | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientific | BP399-1 | |
Polyethylene glycol 200 | Sigma Aldrich | P-3015 | |
Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
Sodium acrylate (SA) | AK Scientific | R624 | Gel Monomer component |
Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Homogenization Buffer Component |
Tris Base | Fischer Scientific | BP152-1 | Homogenization Buffer Component |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Homogenization Buffer Component |
Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 | |
20x SSC | Thermo Scientific | AM9763 | |
Tween20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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