यह प्रोटोकॉल बताता है कि एस्चेरिचिया कोलाई लॉन्ग-टर्म इवोल्यूशन एक्सपेरिमेंट (एलटीईई) को इसके दैनिक हस्तांतरण और आवधिक फ्रीज-डाउन करके कैसे बनाए रखा जाए और विकसित बैक्टीरिया में फिटनेस सुधार को मापने के लिए प्रतियोगिता परख कैसे आयोजित की जाए। ये प्रक्रियाएं अपने स्वयं के माइक्रोबियल विकास प्रयोगों को शुरू करने वाले शोधकर्ताओं के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम कर सकती हैं।
दीर्घकालिक विकास प्रयोग (एलटीईई) ने एस्चेरिचिया कोलाई की बारह आबादी का पालन किया है क्योंकि उन्होंने 35 से अधिक वर्षों और 77,000 जीवाणु पीढ़ियों के लिए एक सरल प्रयोगशाला वातावरण के लिए अनुकूलित किया है। एलटीईई में उपयोग किए जाने वाले सेटअप और प्रक्रियाएं माइक्रोबियल विकास का अध्ययन करने के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीकों का प्रतीक हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम पहले वर्णन करते हैं कि एलटीईई आबादी को प्रत्येक दिन ताजा माध्यम और सुसंस्कृत में कैसे स्थानांतरित किया जाता है। फिर, हम वर्णन करते हैं कि एलटीईई आबादी को नियमित रूप से संदूषण के संभावित संकेतों के लिए कैसे जांचा जाता है और बाद के अध्ययन के लिए एक स्थायी जमे हुए “जीवाश्म रिकॉर्ड” प्रदान करने के लिए संग्रहीत किया जाता है। इन प्रक्रियाओं में शामिल कई सुरक्षा उपायों को संदूषण को रोकने, विभिन्न समस्याओं का पता लगाने और प्रयोग की प्रगति को पर्याप्त रूप से वापस स्थापित किए बिना व्यवधानों से उबरने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक तरीका यह है कि एलटीईई में विकासवादी परिवर्तनों की समग्र गति और चरित्र की निगरानी प्रयोग से आबादी और उपभेदों की प्रतिस्पर्धी फिटनेस को मापकर की जाती है। हम वर्णन करते हैं कि सह-संस्कृति प्रतियोगिता परख कैसे आयोजित की जाती है और परिणामों से सापेक्ष फिटनेस की गणना के लिए एक स्प्रेडशीट और एक आर पैकेज (फिटनेसआर) दोनों प्रदान करते हैं। एलटीईई के दौरान, कुछ आबादी के व्यवहार दिलचस्प तरीकों से बदल गए हैं, और पूरे जीनोम अनुक्रमण जैसी नई तकनीकों ने यह जांचने के लिए अतिरिक्त रास्ते प्रदान किए हैं कि आबादी कैसे विकसित हुई है। हम इस बात पर चर्चा करके समाप्त करते हैं कि इन परिवर्तनों को समायोजित करने या लाभ उठाने के लिए मूल एलटीईई प्रक्रियाओं को कैसे अपडेट किया गया है। यह प्रोटोकॉल उन शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी होगा जो विकास और आनुवंशिकी, आणविक जीव विज्ञान, सिस्टम जीव विज्ञान और पारिस्थितिकी के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में एलटीईई का उपयोग करते हैं। अधिक व्यापक रूप से, एलटीईई उन लोगों के लिए एक आजमाया हुआ और सच्चा टेम्पलेट प्रदान करता है जो नए रोगाणुओं, वातावरण और प्रश्नों के साथ अपने स्वयं के विकास प्रयोगों की शुरुआत कर रहे हैं।
फरवरी 1988 में, रिचर्ड लेंसकी ने कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, इरविन1 में एस्चेरिचिया कोलाई के क्लोनल कल्चर के साथ एक परिभाषित ग्लूकोज-सीमित विकास माध्यम वाले बारह फ्लास्क लगाए। अगले दिन, उन्होंने प्रत्येक फ्लास्क से संस्कृति का 1% नए फ्लास्क के एक सेट में स्थानांतरित कर दिया जिसमें ताजा विकास माध्यम था। इस 1: 100 कमजोर पड़ने से बैक्टीरिया की आबादी को उपलब्ध ग्लूकोज को समाप्त करने से पहले 100 गुना विस्तार करने की अनुमति मिली, जो कोशिका विभाजन की लगभग 62/3 पीढ़ियों के अनुरूप थी। इस प्रक्रिया को अगले दिन दोहराया गया था और तब से हर दिन कुछ रुकावटों के साथ किया गया है। ये दैनिक स्थानांतरण जारी रहे हैं, यहां तक कि प्रयोग को स्थानांतरित करने के बाद भी, पहले 1992 में मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी में, और फिर 2022 में ऑस्टिन में टेक्सास विश्वविद्यालय में। हर समय, नए उत्परिवर्तन ने इन ई कोलाई आबादी में लगातार आनुवंशिक भिन्नता उत्पन्न की है और प्राकृतिक चयन ने विकसित कोशिकाओं को अपने पूर्वजों से आगे बढ़ा दिया है।
लेंसकी ने इस प्रयोग को डिजाइन किया, जिसे अब दीर्घकालिक विकास प्रयोग (एलटीईई) के रूप में जाना जाता है, विकास की गतिशीलता और पुनरावृत्ति की जांच करने के लिए। इन सवालों के जवाब देने के लिए, उन्होंने प्रयोगात्मक सेटअप और इसके प्रोटोकॉल2 के डिजाइन में कई महत्वपूर्ण विशेषताओं को शामिल किया। इन विशेषताओं में से एक मॉडल जीव का सावधानीपूर्वक विकल्प था। मूल बारह आबादी सभी एकल उपनिवेशों से शुरू हुई थी जो एक तत्काल सामान्य पूर्वज, एस्चेरिचिया कोलाई बी स्ट्रेन आरईएल 606 को साझा करते थे। इस तनाव को चुना गया था क्योंकि यह पहले से ही आमतौर पर प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपयोग किया जाता था, पूरी तरह से अलैंगिक रूप से पुन: पेश किया गया था, और इसमें कोई प्लास्मिड या बरकरार प्रोफेज 3,4 नहीं था – जिनमें से सभी इसके विकास का अध्ययन सरल बनाते हैं। प्रयोग को सरल बनाने वाला एक और विकल्प विकास के बाद प्रत्येक फ्लास्क में कोशिकाओं के घनत्व को सीमित करने के लिए विकास माध्यम में ग्लूकोज की बहुत कम सांद्रता का उपयोग करना था। कम सेल घनत्व का उपयोग करने का उद्देश्य आबादी के भीतर पारिस्थितिक बातचीत के विकास की क्षमता को कम करके जनसंख्या फिटनेस में परिवर्तन का विश्लेषण करना आसान बनाना था (उदाहरण के लिए, क्रॉस-फीडिंग द्वारा)5।
आरईएल 606 एआरएए जीन में एक बिंदु उत्परिवर्तन के कारण कार्बन और ऊर्जा स्रोत (आरा-) के रूप में ओ-अरबिनोज का उपयोग करने में असमर्थ है। एलटीईई शुरू करने से पहले, आरईएल 607 नामक एक पुनर्स्थापित एआरएए अनुक्रम के साथ एक सहज उत्परिवर्ती को आरईएल 6066 से अलग किया गया था। आरईएल 607 अरबीनोज़ (आरा +) पर बढ़ने में सक्षम है। आरईएल 606 का उपयोग एलटीईई आबादी में से छह को शुरू करने के लिए किया गया था, और आरईएल 607 का उपयोग अन्य छह को शुरू करने के लिए किया गया था। एलटीईई के दौरान उपयोग किए जाने वाले विकास माध्यम में अरबीनोज़ मौजूद नहीं है, इसलिए आरईएल 607 इन स्थितियों के तहत आरईएल 606 के समान व्यवहार करता है। हालांकि, जब टेट्राज़ोलियम अरबीनोज़ (टीए) आगर पर चढ़ाया जाता है, तो आरा − और आरा + कोशिकाएं क्रमशः लाल और सफेद कॉलोनियां बनाती हैं। दो पैतृक ई कोलाई उपभेदों और उनके वंशजों के बीच भेदभाव करने की यह विधि काफी उपयोगी है। इसका उपयोग एलटीईई आबादी के बीच क्रॉस-संदूषण का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। यह एक आरा + के सापेक्ष आरा – स्ट्रेन या आबादी की फिटनेस को मापने में भी सहायता करता है जब वे एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा करते हैं। फिटनेस को विपरीत रूप से चिह्नित प्रतियोगियों की सह-संस्कृति स्थापित करके मापा जाता है और फिर निगरानी की जाती है कि लाल और सफेद कॉलोनियों की आवृत्तियों (टीए प्लेटों पर संस्कृति के कमजोर पड़ने से प्राप्त) कैसे बदलती हैं जब प्रतियोगियों को शुरू में मिश्रित किया जाता है और एलटीईई के समान परिस्थितियों में एक या अधिक विकास चक्रों के बाद। प्रत्येक विकास चक्र के दौरान अधिक फिट सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व बढ़ेगा।
एलटीईई की एक और महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि विकसित आबादी के नमूने समय-समय पर संग्रहीत किए जाते हैं। जब ग्लिसरॉल जैसे क्रायोप्रोटेक्टेंट के साथ मिलाया जाता है, तो ई कोलाई कोशिकाओं को जमे हुए और बाद मेंपुनर्जीवित किया जा सकता है। एलटीईई प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में, हर 75 वें दिन (जो लगभग 500 पीढ़ियों के बराबर है), प्रत्येक आबादी का एक हिस्सा जिसे एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित नहीं किया गया था, उसे ग्लिसरॉल के साथ मिलाया जाता है, कई शीशियों के बीच विभाजित किया जाता है, और फ्रीजर में संग्रहीत किया जाता है। इस जमे हुए “जीवाश्म रिकॉर्ड” ने शोधकर्ताओं को एलटीईई के पहले अध्ययन करने में सक्षम बनाया, जिसमें उन्होंने विभिन्न समय बिंदुओं से विकसित ई कोलाई आबादी को पुनर्जीवित किया और उन्हें पैतृक उपभेदों के खिलाफ प्रतिस्पर्धा की ताकि यह पता लगाया जा सके कि फिटनेस कितनी तेजीसे बढ़ रही थी। फिटनेस विकास को समय-समय पर फिर से मापा गया है क्योंकि जमे हुए “जीवाश्म रिकॉर्ड” के अधिक “स्तर” को संरक्षित किया गया है। इन मापों से समग्र निष्कर्ष यह है कि फिटनेस आज भी एलटीईई में सुधार जारी है, यहां तक कि एक ही वातावरण में विकास की इतनी पीढ़ियों के बाद भी 8,9,10।
एलटीईई को इतने लंबे समय तक जारी रखने की अनुमति किसने दी है? कई समान विशेषताएं जिन्होंने इसके मूल प्रश्नों को पूछने और उत्तर देने में सक्षम बनाया, ने बुरी किस्मत, मानवीय त्रुटि और दुनिया की घटनाओं के कारण अपरिहार्य व्यवधानों के खिलाफ सुरक्षा उपायों और असफल-सुरक्षा के रूप में भी काम किया है। हर दिन, जब संस्कृतियों को ताजा विकास माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है, तो शोधकर्ता आरा − और आरा + आबादी के बीच स्थानांतरण करता है। फिर, जब आबादी जमी हुई होती है, तो उन्हें चयनात्मक और संकेतक आगर पर चढ़ाया जा सकता है ताकि यह जांचा जा सके कि क्या कोई “पड़ोसी” आबादी गलती से क्रॉस-दूषित या मिश्रित हो गई है (उदाहरण के लिए, सफेद कॉलोनियां ऐसी आबादी में हैं जिन्हें केवल लाल उपनिवेश बनाना चाहिए) या विदेशी रोगाणुओं (जैसे, अप्रत्याशित कॉलोनी आकृति विज्ञान या सेल घनत्व) से दूषित हैं। इस घटना में कि एक आबादी से समझौता किया गया है, इसके पूर्वज को फ्रीजर से पुनर्जीवित किया जा सकता है और इसके स्थान पर आगे बढ़ाया जा सकता है। आरा मार्कर और जमे हुए संग्रह इस प्रकार प्रयोगात्मक संसाधनों और सुरक्षा उपायों दोनों के रूप में दोहरे उद्देश्यों की सेवा करते हैं।
क्योंकि इसका इतिहास इतनी अच्छी तरह से संरक्षित और आसानी से सुलभ है, एलटीईई नमूनों का अध्ययन उन प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके किया गया है जो प्रयोग शुरू होने पर मौजूद नहीं थे। उदाहरण के लिए, एलटीईई आबादी 11,12,13,14,15 में उत्परिवर्तन की गतिशीलता की जांच करने के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण का उपयोग किया गया है, और जीन अभिव्यक्ति 16,17 में परिवर्तन की जांच करने के लिए ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स और राइबोसोमल प्रोफाइलिंग का उपयोग किया गया है। आनुवंशिक उपकरणों का उपयोग उन उपभेदों के पुनर्निर्माण के लिए किया गया है जो एकल उत्परिवर्तन या कई विकसित उत्परिवर्तनों के संयोजन से भिन्न होते हैं ताकि फिटनेस और विभिन्न फेनोटाइप 18,19,20,21 पर उनके प्रभावों को समझा जा सके। जमे हुए “जीवाश्म रिकॉर्ड” से नमूने आसानी से फिर से भर दिए जाते हैं ताकि प्रयोग के इतिहास के कुछ हिस्सों या पूरी प्रतियों को अन्य प्रयोगशालाओं में भेज दिया जा सके। एलटीईई नमूने अब अंटार्कटिका को छोड़कर सभी महाद्वीपों पर मौजूद हैं, और उनका अध्ययन उन शोधकर्ताओं द्वारा किया जा रहा है जो प्रयोग से छोटे हैं। एलटीईई के मजबूत तरीकों और विकसित ई कोलाई नमूनों और इसके ऐतिहासिक रिकॉर्ड से उपभेदों ने अन्य प्रश्नों और वातावरण 22,23,24,25,26,27,28,29 की जांच करने वाले विकास प्रयोगों के लिए शुरुआती बिंदुओं के रूप में भी काम किया है।
चित्र 1: एलटीईई प्रक्रियाओं का अवलोकन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
यहां, हम ई कोलाई दीर्घकालिक विकास प्रयोग (चित्रा 1) में उपयोग किए जाने वाले तीन कोर प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। हम वर्णन करते हैं: (1) दैनिक स्थानान्तरण कैसे करें, (2) जनसंख्या के नमूने और क्लोनल आइसोलेट्स को कैसे संग्रहीत करें, और (3) फिटनेस मतभेदों को मापने के लिए सह-संस्कृति प्रतियोगिता परख का प्रदर्शन और विश्लेषण कैसे करें। हमारी आशा है कि ये प्रोटोकॉल एलटीईई संसाधनों के निरंतर उपयोग को बढ़ावा देते हैं और नए माइक्रोबियल विकास प्रयोगों के डिजाइन को सूचित करते हैं।
एलटीईई और इसके तरीकों का दीर्घकालिक लचीलापन
ई कोलाई लॉन्ग-टर्म इवोल्यूशन एक्सपेरिमेंट (एलटीईई) अब अपने चौथे दशक में है। किसी भी अवधि के माइक्रोबियल विकास प्रयोग के लिए, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वातावरण को बनाए रखना, संदूषण से बचना, नमूने संग्रहीत करना और फिटनेस को सटीक रूप से मापना महत्वपूर्ण है। एलटीईई इन उद्देश्यों को प्राप्त करने के लिए कई समय-परीक्षण की गई रणनीतियों को प्रदर्शित करता है, जिसमें अच्छी तरह से हिला हुआ फ्लास्क का उपयोग शामिल है जो एक समरूप वातावरण और एक रासायनिक रूप से परिभाषित विकास माध्यम बनाता है जो कम सेल घनत्व का समर्थन करता है। इसके अलावा, एलटीईई पूर्वज उपभेदों को नियोजित करता है जो एक आनुवंशिक मार्कर में भिन्न होते हैं जो एक फेनोटाइप (कॉलोनी रंग) देता है जो विकास वातावरण में आसानी से जांच और चुनिंदा रूप से तटस्थ होता है। यह प्रयोगात्मक डिजाइन सुविधा आंतरिक और बाहरी संदूषण की पहचान करने का एक साधन प्रदान करती है और फिटनेस को मापने की सुविधा प्रदान करती है। हालांकि, 1988 के बाद से एलटीईई द्वारा उपयोग की जाने वाली सभी प्रक्रियाएं और सुरक्षा उपाय समान रूप से मजबूत साबित नहीं हुए हैं। एलटीईई शुरू होने पर विश्वसनीय कुछ तरीके कम प्रभावी हो गए हैं क्योंकि ई कोलाई आबादी विकसित हुई है। सौभाग्य से, इन समस्याग्रस्त तरीकों को अब प्रयोग की शुरुआत के बाद से विकसित प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके बढ़ाया या प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
संदूषण का पता लगाना
एलटीईई के लिए संदूषण का पता लगाना महत्वपूर्ण है। संदूषण दो प्रकार का हो सकता है: एलटीईई आबादी (क्रॉस-संदूषण) और पर्यावरण से रोगाणुओं के साथ (बाहरी संदूषण)। अधिकांश भाग के लिए, मीडिया की तैयारी और दैनिक स्थानान्तरण के दौरान सड़न रोकनेवाली तकनीकों का सावधानीपूर्वक उपयोग और करीबी ध्यान दोनों प्रकार के संदूषण को रोकता है, लेकिन वे होते हैं। प्रयोग की शुरुआत में, टीए एगर पर चढ़ाना का उपयोग क्रॉस-संदूषण के उदाहरणों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है क्योंकि स्थानांतरण हमेशा आरा – और आरा + आबादी के बीच वैकल्पिक होता है। कुछ बैक्टीरियोफेज के लिए इन ई कोलाई की संवेदनशीलता और प्रतिरोध के फिंगरप्रिंट का उद्देश्य एक डिजाइन विशेषता भी था जो एलटीईई आबादी को आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले ई कोलाई प्रयोगशाला उपभेदों से अलग कर सकता हैजो उन्हें दूषित कर सकते हैं। हालांकि, ये आनुवंशिक मार्कर अविश्वसनीय हो गए हैं क्योंकि प्रयोग आगे बढ़ गया है (उदाहरण के लिए, कुछ आबादी अब टीए एगर पर उपनिवेश नहीं बनाती है)10,35। सौभाग्य से, आबादी आनुवंशिक रूप से अलग हो गई है क्योंकि उन्होंने प्रयोग के दौरान अलग-अलग विकासवादी इतिहास का अनुभव किया है, जिसने नए आनुवंशिक मार्कर बनाए हैं जिनका उपयोग अब क्रॉस-संदूषण का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रत्येक आबादी ने पाइकेएफ और एनएडीआर जीन 14,36,37 में उत्परिवर्तन का एक अनूठा संयोजन विकसित किया है। हम कभी-कभी पीसीआर इन दो जीनों को बढ़ाते हैं और सेंगर अनुक्रमित करते हैं ताकि यह परीक्षण किया जा सके कि असामान्य आकृति विज्ञान या रंगों वाली कॉलोनियां क्रॉस-संदूषण के कारण हैं या नहीं। चूंकि पूरे जीनोम और पूरी आबादी के अनुक्रमण की लागत में गिरावट जारी है, एलटीईई आबादी का नियमित अनुक्रमण जल्द ही संभव हो सकता है, जिससे संदूषण के संकेतों के लिए उनकी निगरानी करने के नए अवसर पेश किए जा सकते हैं।
प्रतिस्पर्धी फिटनेस को मापना
एक और मामला जिसमें एलटीईई ने अपने मूल तरीकों को पीछे छोड़ दिया है, वह यह है कि विकसित ई कोलाई की फिटनेस प्रयोगात्मक वातावरण में इस हद तक बढ़ गई है कि कोई भी यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके अपने पूर्वजों के सापेक्ष आज की आबादी की फिटनेस को सीधे नहीं माप सकता है। विकसित आबादी पूर्वजों को इस हद तक पछाड़ ती है कि एक दिवसीय प्रतियोगिता के बाद कुछ ही पूर्वज उपनिवेश ों की गिनती नहीं रह जाती है। इस बड़े फिटनेस अंतर से निपटने के लिए एक दृष्टिकोण उपभेदों के असमान शुरुआती अनुपात का उपयोग करना है, प्रारंभिक संस्करणों को भारित करना जो कम-फिट प्रतियोगी (जैसे, 90 μL पूर्वज और 10 μL विकसित प्रतियोगी) की ओर मिश्रित हैं। एक दूसरा दृष्टिकोण एक विकसित आरा- क्लोन की पहचान करना है जिसमें एलटीईई पूर्वज की तुलना में अधिक फिटनेस है, एमए एगर पर चयन करके इसके एक सहज आरा + प्रत्यावर्ती उत्परिवर्ती को अलग करें, और फिर सत्यापित करें कि प्रत्यावर्तित तनाव में प्रतियोगिता परख 6,38 का उपयोग करके अपने माता-पिता के समान फिटनेस है। इस नए आरा–/आरा + जोड़ी को आरईएल 606/आरईएल 607 के बदले आम प्रतियोगी उपभेदों के एक सेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। आदर्श रूप से, एक सामान्य प्रतियोगी (और इसके आरा + रिवर्टेंट) के रूप में चुने गए विकसित आरा– क्लोन में एक प्रयोग में रुचि के सभी उपभेदों के सापेक्ष मध्यवर्ती फिटनेस होगी। एलटीईई की पहली 50,000 पीढ़ियों में, इन दो दृष्टिकोणों (असमान शुरुआती अनुपात या एक सामान्य प्रतियोगी का उपयोग करके) ने विशिष्ट दृष्टिकोण39 के मुकाबले सार्थक रूप से अलग फिटनेस माप का उत्पादन नहीं किया।
प्रतियोगिता प्रोटोकॉल में ये संशोधन कुछ सरल धारणाएं बनाते हैं जो हमेशा सच नहीं हो सकते हैं। एक यह है कि फिटनेस माप सकर्मक हैं। यही है, यदि हम दो आबादी बनाम एक सामान्य प्रतियोगी तनाव के खिलाफ अलग-अलग प्रतिस्पर्धा करते हैं, तो हम एक दूसरे के लिए दो आबादी की सापेक्ष फिटनेस का अनुमान लगा सकते हैं। यह संबंध एलटीईई40 के लिए सही पाया गया है, अधिकांश भाग के लिए, लेकिन यह अन्य प्रयोगोंके लिए नहीं है। इस विसंगति का एक कारण नकारात्मक आवृत्ति-निर्भर फिटनेस प्रभावों का विकास हो सकता है। यह स्थिति तब होती है जब एलटीईई की आबादी ए -2 से दो अलग-अलग वंशों से अलग उपभेदों कोएक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा की जाती है। क्रॉस-फीडिंग के कारण दुर्लभ होने पर प्रत्येक का एक फायदा होता है, जो उनके सह-अस्तित्व को स्थिर करता है। उत्परिवर्तन के विभिन्न सेटों के साथ वंशावली के दीर्घकालिक सह-अस्तित्व को दिखाने वाले अनुक्रमण डेटा से पता चलता है कि इसी तरह की बातचीत अन्य एलटीईई आबादी14,43 में भी उत्पन्न हो सकती है, हालांकि यह स्पष्ट नहीं है कि क्या वे फिटनेस अनुमानों को बदलने के लिए पर्याप्त मजबूत हैं। अंत में, एलटीईई32 की आबादी ए -3 में साइट्रेट पर एरोबिक विकास के विकास का मतलब है कि इन कोशिकाओं की फिटनेस अब “निजी” संसाधन के उपयोग को शामिल करती है जब वे उन कोशिकाओं के खिलाफ प्रतिस्पर्धा करते हैं जो साइट्रेट का उपयोग नहीं कर सकते हैं, जो इन परिणामों की व्याख्या को जटिल बनाता है। इन अपवादों के बावजूद, कम ग्लूकोज एकाग्रता और अच्छी तरह से हिला हुआ वातावरण के उपयोग ने निस्संदेह एलटीईई उपभेदों और आबादी के बीच फिटनेस तुलना करना सरल बना दिया है।
बाद की पीढ़ियों में, एलटीईई आबादी में से कुछ अब टीए एगर पर उपनिवेश नहीं बनाते हैं, जो संशोधित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रतियोगिता प्रयोगों को करना मुश्किलया असंभव बनाता है। वैकल्पिक तरीके जिन्हें कॉलोनी विकास की आवश्यकता नहीं होती है, उनका उपयोग संभावित रूप से दो प्रतियोगियों के सापेक्ष प्रतिनिधित्व को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि एफआरईक्यू-सेक जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करता है ताकि एम्पलीकॉन44 में दो वैकल्पिक एलील वाले रीड के अनुपात की गणना की जा सके। इस विधि या इसी तरह के एक का उपयोग संभावित रूप से आरा एलील्स के साथ या नए विकसित उत्परिवर्तनों के साथ किया जा सकता है, जैसे कि पाइकेएफ और एनएडीआर में, बनाम पैतृक अनुक्रम। आनुवंशिक संशोधन करना जो अन्य प्रकार के तटस्थ मार्करों को पेश करते हैं, का उपयोग सापेक्ष फिटनेस को मापने के लिए भी किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीन को एलटीईई ऑफशूट प्रयोगों में कोशिकाओं के गुणसूत्रों में डाला गया है ताकि फ्लो साइटोमेट्री45 का उपयोग करके प्रतियोगियों की गिनती की जा सके। एक अन्य दृष्टिकोण, जो एक ही प्रतियोगिता फ्लास्क में दो से अधिक उपभेदों को एक साथ मिलाने की संभावना को खोलता है, बारकोड डालना है जिसे पीसीआर प्रवर्धित किया जा सकता है और विभिन्न प्रतियोगियों के जीनोम में अनुक्रमित किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग विकास प्रयोगों में वंश अनुरेखण के लिए किया गयाहै। फ्लो साइटोमेट्री और बारकोड अनुक्रमण दोनों दो उपभेदों बनाम कॉलोनी गिनती के अधिक चरम अनुपात को सटीक रूप से माप सकते हैं (क्योंकि वे 10,000 कोशिकाओं / जीनोम बनाम क्वेरी कर सकते हैं जिन्हें एक आगर प्लेट पर गिना जा सकता है), इसलिए इन विधियों का उपयोग फिटनेस मतभेदों के संदर्भ में गतिशील सीमा को बढ़ाने का भी वादा करता है जिसे एक सामान्य प्रतियोगी के सापेक्ष मापा जा सकता है।
दीर्घकालिक माइक्रोबियल विकास प्रयोगों के लिए वैकल्पिक डिजाइन।
अपने सभी गुणों के लिए, एलटीईई सही नहीं है। इसके डिजाइन के कुछ पहलू इसे श्रम गहन और मानव त्रुटि के लिए अतिसंवेदनशील बनाते हैं। उदाहरण के लिए, प्रत्येक दिन एक शोधकर्ता को प्रयोग जारी रखने के लिए एर्लेनमेयर फ्लास्क के बीच प्रयोगशाला और पिपेट में आना चाहिए। प्रतिस्पर्धा प्रयोग भी चुनौतीपूर्ण तार्किक बाधाएं पैदा कर सकते हैं, यह देखते हुए कि बाँझ ग्लासवेयर, मीडिया, इनक्यूबेटर स्पेस और कॉलोनी गिनती की आवश्यकताएं तेजी से बढ़ जाती हैं जब प्रतियोगियों की एक छोटी संख्या को भी मामूली प्रतिकृति के साथ परीक्षण किया जा रहा है। हमसे अक्सर पूछा जाता है कि हम प्रयोगशाला स्वचालन प्रणालियों का लाभ क्यों नहीं उठाते हैं, जैसे कि पाइपिंग रोबोट जो 96-वेल माइक्रोप्लेट्स पर काम करते हैं, या निरंतर संस्कृति प्रणाली, जैसे कि केमोस्टैट्स या टर्बिडोस्टैट्स। जवाब सरल है: एलटीईई, एक अर्थ में, अपने लंबे इतिहास का कैदी है। हम 50 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क में एक विशिष्ट गति से हिलने वाली 10 एमएल संस्कृतियों से विचलित होने की हिम्मत नहीं करते हैं क्योंकि इससे प्रयोग को मौलिक रूप से बदलने का खतरा होगा। पर्यावरण के सूक्ष्म पहलू जिनके लिए ये आबादी दशकों से अनुकूल रही है (उदाहरण के लिए, वातन की मात्रा), माइक्रोप्लेट्स या निरंतर संस्कृति प्रणालियों में बदल जाएगी। प्रत्येक हस्तांतरण पर जनसंख्या की अड़चन भी अलग हो सकती है (उदाहरण के लिए, माइक्रोप्लेट्स में छोटी), विकासवादी गतिशीलता को बदल रही है। संक्षेप में, यहां वर्णित विधियों से विचलित होने से एलटीईई एक अलग प्रयोग बन जाएगा, या कम से कम एक अलगाव पेश करने का जोखिम होगा जो विकासवादी प्रक्षेपपथ को बाधित करेगा।
नए विकास प्रयोगों को डिजाइन करने वाले शोधकर्ताओं को माइक्रोबियल आबादी के प्रचार के इन अन्य तरीकों पर विचार करना चाहिए, जबकि उनके संभावित लाभों और कमियों के बारे में पता होना चाहिए। माइक्रोवेल प्लेटों में आबादी को स्थानांतरित करने के लिए पाइपिंग रोबोट का उपयोग करना कुछ मायनों में तार्किक रूप से सरल है और प्रतिकृति आबादी की उच्च संख्या के कारण काफी शक्तिशाली साबित हो सकता है जिसे इस तरह से प्रचारित किया जा सकता है47,48,49। हालांकि, अधिकांश वर्तमान सेटअपों में स्वचालित स्थानांतरण पूरी तरह से बाँझ परिस्थितियों में नहीं होते हैं, जिससे बाहरी संदूषण की संभावना बढ़ जाती है। संदूषण को रोकने के लिए, विकास माध्यम को अक्सर एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया जाता है, जो विकास को प्रभावित करने वाले पर्यावरण की एक विशेषता बन जाता है। माइक्रोवेल प्लेटों में स्थानांतरण भी क्रॉस-संदूषण घटनाओं के लिए अधिक प्रवण हैं। अंत में, माइक्रोवेल प्लेटों का वातावरण – खासकर यदि वे हिलते नहीं हैं – दीवार के विकास, एकत्रीकरण और अन्य घटनाओं के लिए चयन करते हैं जो एक कुएं में कई जगह बनाकर विकास को जटिल कर सकते हैं। छोटे कुओं में आबादी के आकार को बड़ा रखने के लिए समृद्ध मीडिया या पोषक तत्वों की उच्च सांद्रता का उपयोग करने से इन जटिलताओं को बढ़ाने की संभावना है। यदि इस तरह की बातचीत उत्पन्न होती है, तो वे फिटनेस को मापने और व्याख्या करने को और अधिक कठिन बना सकते हैं।
माइक्रोबियल विकास के लिए निरंतर संस्कृति प्रणालियों में केमोस्टैट्स शामिल हैं, जिसमें ताजा माध्यम को लगातार पंप किया जाता है और संस्कृति को बाहर निकाला जाता है, और टर्बिडोस्टैट्स, जिसमें संस्कृतियों को समय-समय पर कोशिकाओं को निरंतर विकास की स्थिति में बनाए रखने के लिए स्वचालित संवेदन और पंपिंग के माध्यम से पतला किया जाता है। ये प्रणालियां बहुत उपयोगी होती हैं जब कोई माइक्रोबियल फिजियोलॉजी और विकास को मॉडल करना चाहता है क्योंकि वे विकास और भुखमरी के बीच रोगाणुओं के संक्रमण से बचते हैं, उन्हें ऐसे वातावरण में रखते हैं जिसमें हमेशा पोषक तत्वहोते हैं। यहां तक कि सेंसर भी जोड़ सकते हैं जो ऑप्टिकल घनत्व, ओ2 खपत, पीएच और संस्कृति के पर्यावरण और विकास के अन्य पहलुओं के वास्तविक समय माप करते हैं। हालांकि, वर्तमान निरंतर संस्कृति प्रणालियों को कस्टम सेटअप51,52,53,54 बनाने के लिए या तो महंगे उपकरण खरीद या विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, दीवार विकास, जिसमें कोशिकाएं संस्कृति कक्ष का पालन करके कमजोर पड़ने से बच जाती हैं, निरंतर संस्कृति प्रणालियों में विकासवादी गतिशीलता को बाधित करती हैं जब तक कि उन्हें समय-समय पर निष्फल नहीं किया जाता है। इन बाधाओं के कारण, आज तक अधिकांश केमोस्टैट और टर्बिडोस्टैट विकास प्रयोग सीमित अवधि के रहे हैं और / या सीरियल ट्रांसफर विकास प्रयोगों की तुलना में अपेक्षाकृत कम स्वतंत्र रूप से विकसित आबादी शामिल हैं।
समाप्ति
एलटीईई के लिए हम यहां जिन तरीकों का प्रदर्शन करते हैं, वे इसके अद्वितीय ऐतिहासिक रिकॉर्ड का अध्ययन करने और इन ई कोलाई आबादी के खुले विकास को जारी रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे उन लोगों के लिए एक प्रारंभिक बिंदु भी प्रदान करते हैं जो नए विकास प्रयोगों पर विचार कर रहे हैं जो प्रयोगशाला स्वचालन का लाभ उठा सकते हैं या प्राकृतिक वातावरण में पाई जाने वाली जटिलता के विभिन्न तत्वों को वापस जोड़ सकते हैं जिन्हें एलटीईई से उद्देश्यपूर्ण रूप से छोड़ दिया गया था। 1988 के बाद से, प्रयोगात्मक विकास एक क्षेत्र के रूप में विकसित हुआ है। इस समय के दौरान, दुनिया भर की प्रयोगशालाओं में शोधकर्ताओं ने विकास का अध्ययन करने, रचनात्मक प्रयोगात्मक डिजाइन पेश करके और नई प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके परिणामों की निगरानी करके नवाचार करने के लिए इस दृष्टिकोण के विशाल लचीलेपन का प्रदर्शन किया है। एलटीईई के तरीके एक समापन बिंदु का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं, लेकिन हमें उम्मीद है कि वे भविष्य में क्षेत्र के लिए प्रेरणा और आधार प्रदान करना जारी रखेंगे।
The authors have nothing to disclose.
हम रिचर्ड लेंसकी और कई शोधकर्ताओं को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने ई कोलाई के साथ दीर्घकालिक विकास प्रयोग को बनाए रखने में अध्ययन और योगदान दिया है, जिसमें विशेष रूप से नीरजा हजेला शामिल हैं। एलटीईई वर्तमान में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (डीईबी -1951307) द्वारा समर्थित है।
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich | T8877 | |
20 mL Glass Beaker | Sigma-Aldrich | CLS100020 | |
50 mL Erlenmeyer Flasks | Sigma-Aldrich | CLS498050 | |
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | |
Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385 | |
Antifoam | Sigma-Aldrich | A5757 | |
Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
Freezer Box (2") | VWR | 82007-142 | |
Freezer Box (3") | VWR | 82007-144 | |
Freezer Box Cell Divider (49-place) | VWR | 82007-150 | |
Freezer Box Cell Divider (81-place) | VWR | 82007-154 | |
Freezer Vials (1/2-Dram) | VWR | 66009-816 | |
Freezer Vials (2-Dram) | VWR | 66010-560 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Metal Tray | Winco | SPJP-202 | |
Petri Dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | Sigma-Aldrich | P5504 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | C7254 | |
Test Tube Cap (18mm) | VWR | 10200-142 | |
Test Tube Rack (18mm, steel) | Adamas-Beta | N/A | Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm) |
Test Tubes (18 x 150 mm) | VWR | 47729-583 | |
Thiamine, Hydrochloride | Millipore | 5871 | |
Tryptone | Gibco | 211705 | |
Yeast Extract | Gibco | 212750 |