Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Dagelijkse overdrachten, archivering van populaties en het meten van fitness in het langetermijnevolutie-experiment met Escherichia coli

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65342
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,4, 1, 1, 2,3, 2,5
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2BEACON Center for the Study of Evolution in Action, Michigan State University, 3Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University, 4Department of Integrative Biology, Michigan State University, 5Biological Sciences Program, Michigan State University

Summary

Dit protocol beschrijft hoe het Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) kan worden gehandhaafd door de dagelijkse overdrachten en periodieke bevriezingen uit te voeren en hoe wedstrijdtests kunnen worden uitgevoerd om fitnessverbeteringen in geëvolueerde bacteriën te meten. Deze procedures kunnen dienen als een sjabloon voor onderzoekers die hun eigen microbiële evolutie-experimenten starten.

Abstract

Het Long-Term Evolution Experiment (LTEE) heeft twaalf populaties van Escherichia coli gevolgd omdat ze zich meer dan 35 jaar en 77.000 bacteriële generaties hebben aangepast aan een eenvoudige laboratoriumomgeving. De opzet en procedures die in de LTEE worden gebruikt, belichamen betrouwbare en reproduceerbare methoden voor het bestuderen van microbiële evolutie. In dit protocol beschrijven we eerst hoe de LTEE-populaties worden overgebracht naar vers medium en elke dag worden gekweekt. Vervolgens beschrijven we hoe de LTEE-populaties regelmatig worden gecontroleerd op mogelijke tekenen van besmetting en worden gearchiveerd om een permanent bevroren "fossielenbestand" te bieden voor later onderzoek. Meerdere beveiligingen die in deze procedures zijn opgenomen, zijn ontworpen om besmetting te voorkomen, verschillende problemen te detecteren wanneer ze zich voordoen en te herstellen van verstoringen zonder de voortgang van het experiment merkbaar te vertragen. Een manier waarop het algehele tempo en het karakter van evolutionaire veranderingen in de LTEE worden gevolgd, is door de competitieve fitheid van populaties en stammen uit het experiment te meten. We beschrijven hoe co-cultuur competitietests worden uitgevoerd en bieden zowel een spreadsheet als een R-pakket (fitnessR) voor het berekenen van de relatieve fitheid op basis van de resultaten. In de loop van de LTEE is het gedrag van sommige populaties op interessante manieren veranderd en nieuwe technologieën zoals whole-genome sequencing hebben extra mogelijkheden geboden om te onderzoeken hoe de populaties zijn geëvolueerd. We eindigen met te bespreken hoe de oorspronkelijke LTEE-procedures zijn bijgewerkt om tegemoet te komen aan of te profiteren van deze wijzigingen. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die de LTEE gebruiken als een modelsysteem voor het bestuderen van verbindingen tussen evolutie en genetica, moleculaire biologie, systeembiologie en ecologie. Meer in het algemeen biedt de LTEE een beproefde sjabloon voor degenen die hun eigen evolutie-experimenten beginnen met nieuwe microben, omgevingen en vragen.

Introduction

In februari 1988 ent Richard Lenski twaalf kolven met een gedefinieerd glucosebeperkt groeimedium met klonale culturen van Escherichia coli aan de Universiteit van Californië, Irvine1. De volgende dag bracht hij 1% van de cultuur van elke kolf over naar een set nieuwe kolven met vers groeimedium. Deze 1:100 verdunning stelde de bacteriepopulaties in staat om 100-voudig uit te breiden voordat de beschikbare glucose werd uitgeput, wat overeenkomt met ongeveer 62/3 generaties celdelingen. Deze procedure werd de volgende dag herhaald en is sindsdien elke dag geweest, met een paar onderbrekingen. Deze dagelijkse overdrachten zijn doorgegaan, zelfs toen het experiment werd verplaatst, eerst naar Michigan State University in 1992 en vervolgens naar de Universiteit van Texas in Austin in 2022. Al die tijd hebben nieuwe mutaties voortdurend genetische variatie gegenereerd in deze E. coli-populaties en natuurlijke selectie heeft ertoe geleid dat geëvolueerde cellen hun voorouders overtreffen.

Lenski ontwierp dit experiment, nu bekend als het Long-Term Evolution Experiment (LTEE), om de dynamiek en herhaalbaarheid van evolutie te onderzoeken. Om deze vragen te beantwoorden, nam hij verschillende belangrijke kenmerken op in het ontwerp van de experimentele opstelling en de protocollen2. Een van deze kenmerken was de zorgvuldige keuze van een modelorganisme. De oorspronkelijke twaalf populaties waren allemaal afkomstig uit enkele kolonies die een onmiddellijke gemeenschappelijke voorouder deelden, Escherichia coli B-stam REL606. Deze soort werd gekozen omdat het al vaak werd gebruikt in laboratoriumomgevingen, volledig ongeslachtelijk werd gereproduceerd en geen plasmiden of intacte profagen 3,4 bevatte - die allemaal het bestuderen van de evolutie ervan eenvoudiger maken. Een andere keuze die het experiment vereenvoudigde, was om een zeer lage concentratie glucose in het groeimedium te gebruiken om de dichtheid van cellen in elke kolf na de groei te beperken. Het gebruik van een lage celdichtheid was bedoeld om het gemakkelijker te maken om veranderingen in populatiefitheid te analyseren door het potentieel voor de evolutie van ecologische interacties binnen populaties te verminderen (bijvoorbeeld door kruisvoeding)5.

REL606 is niet in staat om ʟ-arabinose te gebruiken als koolstof- en energiebron (Ara−) vanwege een puntmutatie in het araA-gen. Voordat de LTEE werd gestart, werd een spontane mutant met een herstelde araA-sequentie, aangeduid als REL607, geïsoleerd uit REL6066. REL607 kan groeien op ʟ-arabinose (Ara+). REL606 werd gebruikt om zes van de LTEE-populaties te starten en REL607 werd gebruikt om de andere zes te starten. Arabinose is niet aanwezig in het groeimedium dat tijdens de LTEE wordt gebruikt, dus REL607 gedraagt zich onder deze omstandigheden hetzelfde als REL606. Wanneer ze echter op tetrazolium arabinose (TA) agar worden geplaatst, vormen Ara−- en Ara+ cellen respectievelijk rode en witte kolonies. Deze methode om onderscheid te maken tussen de twee voorouderlijke E. coli-stammen en hun nakomelingen is heel nuttig. Het kan worden gebruikt om kruisbesmetting tussen LTEE-populaties te detecteren. Het helpt ook bij het meten van de fitheid van een Ara-stam of populatie ten opzichte van een Ara+ stam wanneer ze tegen elkaar worden beconcurreerd. De fitheid wordt gemeten door een co-cultuur van tegengesteld gemarkeerde concurrenten op te zetten en vervolgens te monitoren hoe de frequenties van rode en witte kolonies (verkregen door verdunningen van de cultuur op TA-platen te verspreiden) veranderen tussen wanneer de concurrenten aanvankelijk worden gemengd en na een of meer groeicycli onder dezelfde omstandigheden als de LTEE. De representatie van het meer fitte celtype zal tijdens elke groeicyclus toenemen.

Een ander cruciaal kenmerk van de LTEE is dat steekproeven van de evoluerende populaties periodiek worden gearchiveerd. Wanneer gemengd met een cryoprotectant zoals glycerol, kunnen E. coli-cellen worden ingevroren en later nieuw leven worden ingeblazen7. Als onderdeel van het LTEE-protocol wordt elke 75e dag (wat overeenkomt met ongeveer 500 generaties) een deel van elke populatie die niet naar een nieuwe kolf is overgebracht, gemengd met glycerol, verdeeld over meerdere injectieflacons en opgeslagen in een vriezer. Dit bevroren "fossielenbestand" stelde onderzoekers in staat om de eerste studies van de LTEE uit te voeren, waarin ze de geëvolueerde E. coli-populaties uit verschillende tijdstippen nieuw leven inbliezen en ze concurreerden met de voorouderlijke stammen om bij te houden hoe snel de fitheid toenam1. Fitnessevolutie is periodiek opnieuw gemeten omdat er meer "lagen" van het bevroren "fossielenbestand" bewaard zijn gebleven. De algemene conclusie van deze metingen is dat de fitheid in de LTEE tot op de dag van vandaag blijft verbeteren, zelfs na zoveel generaties van evolutie in dezelfde omgeving 8,9,10.

Wat heeft ervoor gezorgd dat de LTEE zo lang heeft kunnen doorgaan? Veel van dezelfde functies die het mogelijk maakten om de oorspronkelijke vragen te stellen en te beantwoorden, hebben ook gediend als veiligheidsmaatregelen en fail-safes tegen onvermijdelijke verstoringen als gevolg van pech, menselijke fouten en wereldgebeurtenissen. Elke dag, wanneer de culturen worden overgebracht naar een vers groeimedium, wisselt de onderzoeker die de overdrachten uitvoert af tussen Ara- en Ara+ populaties. Wanneer de populaties vervolgens zijn bevroren, kunnen ze worden geplateerd op selectieve en indicatoragar om te controleren of "naburige" populaties per ongeluk zijn gekruist of vermengd (bijv. Witte kolonies bevinden zich in een populatie die alleen rode kolonies zou moeten vormen) of besmet met vreemde microben (bijv. Onverwachte koloniemorfologieën of celdichtheden). In het geval dat een populatie is aangetast, kan de voorloper ervan uit de vriezer worden gehaald en in plaats daarvan worden voortgezet. De Ara-markers en het bevroren archief dienen dus een tweeledig doel als zowel experimentele middelen als veiligheidsmaatregelen.

Omdat de geschiedenis zo goed bewaard en gemakkelijk toegankelijk is, zijn LTEE-monsters bestudeerd met behulp van technologieën die niet bestonden toen het experiment begon. Whole-genome sequencing is bijvoorbeeld gebruikt om de dynamiek van mutaties in de LTEE-populaties 11,12,13,14,15 te onderzoeken, en transcriptomics en ribosomale profilering zijn gebruikt om veranderingen in genexpressie 16,17 te onderzoeken. Genetische hulpmiddelen zijn gebruikt om stammen te reconstrueren die verschillen door enkele mutaties of combinaties van verschillende geëvolueerde mutaties om hun effecten op fitness en verschillende fenotypen te begrijpen 18,19,20,21. Monsters uit het bevroren "fossielenbestand" kunnen gemakkelijk worden aangevuld, zodat delen van of hele kopieën van de geschiedenis van het experiment naar andere laboratoria kunnen worden verzonden. LTEE-monsters bestaan nu op alle continenten behalve Antarctica, en ze worden bestudeerd door onderzoekers die jonger zijn dan het experiment zelf. De robuuste methoden van de LTEE en geëvolueerde E. coli-monsters en stammen uit zijn historische gegevens hebben ook gediend als uitgangspunten voor evolutie-experimenten die andere vragen en omgevingen onderzoeken 22,23,24,25,26,27,28,29.

Figure 1
Figuur 1: Overzicht van LTEE-procedures. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier demonstreren we drie kernprotocollen die worden gebruikt in het E. coli Long-Term Evolution Experiment (figuur 1). We beschrijven: (1) hoe de dagelijkse transfers uit te voeren, (2) hoe populatiemonsters en klonale isolaten te archiveren, en (3) hoe co-cultuur competitietests uit te voeren en te analyseren om fitnessverschillen te meten. Onze hoop is dat deze protocollen het voortdurende gebruik van LTEE-middelen bevorderen en het ontwerp van nieuwe microbiële evolutie-experimenten informeren.

Protocol

1. Dagelijkse overdracht van LTEE-populaties

OPMERKING: De twaalf LTEE-populaties worden dagelijks overgebracht door vers medium te enten met 1% van de culturen uit de kolven van de vorige dag. De stappen in dit proces zijn samengevat in figuur 1. De zes Ara− -populaties die zijn gestart met stam REL606 worden aangeduid als A−1 tot A−6, en de zes Ara+ -populaties die zijn gestart met stam REL607 worden aangeduid als A+1 tot A+6. Strikte naleving van de aseptische techniek en van een schema en volgorde voor het overbrengen van de populaties minimaliseert het risico op besmetting en andere verstoringen.

  1. Desinfecteer het oppervlak waarop de LTEE-overdrachten worden uitgevoerd door het af te vegen met 70% ethanol of een 10% bleekoplossing. Steek een Bunsen-brander aan om een lokale updraft te creëren en het vlammen van glaswerk mogelijk te maken.
    OPMERKING: Draag laboratoriumhandschoenen om besmetting te voorkomen. Voor de veiligheid rond een open vuur is het van cruciaal belang om alleen handschoenen te gebruiken die zijn gemaakt van een materiaal zoals nitril dat niet brandbaar is.
  2. Bereid dertien borosilicaatkolven van 50 ml met daarop 20 ml borosilicaat- of polypropyleenbekers die door autoclaveren zijn gewassen en gesteriliseerd. Controleer de kolven op zichtbaar vuil en vervang alle kolven die niet perfect schoon zijn.
  3. Etiketteer zes kolven A−1 tot en met A−6 met een rode stift en de overige zes kolven A+1 tot en met A+6 met een zwarte stift. Label de laatst overgebleven kolf, die leeg zal zijn, met de datum in maand/dagnotatie en de dag van de week.
  4. Vul elk van de 13 kolven met 9,9 ml DM25-medium met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml. Vlam de mond van elke kolf na het verwijderen van het bekerglas dat als deksel dient en voordat u het bekerglas vervangt. Vlam de punt van de pipet tussen het vullen van elke kolf.
    OPMERKING: Instructies voor het maken van DM25 zijn online beschikbaar30. Als u een plastic serologische pipet gebruikt, laat dan de punt van het vlammen achterwege of beperk de tijd in de vlam om te voorkomen dat het plastic smelt.
  5. Verwijder de LTEE-kolven van de vorige dag uit de broedmachine.
  6. Onderzoek elke kolf door deze tegen het licht te houden om de troebelheid en kleur ervan te beoordelen, controleer de integriteit van de kolf en zoek naar de aanwezigheid van vreemde stoffen.
    OPMERKING: Met het blote oog zullen alle Ara- en Ara+ culturen er enigszins troebel uitzien in vergelijking met de blanco, behalve A−3, die ~ 10 keer troebeler zal zijn dan de andere als gevolg van groei op citraat in het medium. Veel externe microbiële verontreinigingen kunnen ook op citraat groeien, dus verhoogde troebelheid in andere populaties dan A-3 duidt waarschijnlijk op besmetting. Zie de sectie Representatieve resultaten voor afbeeldingen van de LTEE-culturen vóór een overdracht.
  7. OPTIONEEL: Bevestig dat elke LTEE-cultuur de verwachte troebelheid heeft door 1 ml van de blanco en 1 ml van elke cultuur in plastic cuvetten van 1 cm te pipetteren en optische dichtheidsmetingen bij 600 nm (OD600) te doen met behulp van een spectrofotometer na het leegmaken van het instrument.
    OPMERKING: Deze extra stap kan nuttig zijn voor onderzoekers die nieuw zijn in het werken met de LTEE en niet zeker zijn over het beoordelen van de troebelheid met het oog, evenals voor het documenteren en onderzoeken van vermoedelijke anomalieën. Neem pas monsters voor het meten van OD600 uit de kolven van de vorige dag na het voltooien van de normale overbrengingen van de dag naar nieuwe kolven (de volgende stappen) om het risico op besmetting van de celpopulaties die verder zullen worden vermeerderd als de OD600-waarden zijn zoals verwacht, te minimaliseren. Zie de sectie Representatieve resultaten voor typische OD600-waarden voor LTEE-culturen.
  8. Breng met behulp van een P200-micropipettor met een steriele filterpunt 100 μL cultuur van elke LTEE-kolf over in de overeenkomstige kolf met verse DM25. Begin met A−1 en zet vervolgens A+1 over. Ga daarna verder met afwisselen tussen de -en + populaties. Om bij te houden welke culturen zijn overgebracht, verschuift u kolven naar links na het pipetteren van of naar hen.
    OPMERKING: De strikte volgorde van overdrachten en afwisseling tussen Ara- en Ara+ populaties helpt bij het voorkomen en detecteren van kruisbesmetting en verwisselingen. Neem een strikte aseptische techniek in acht: gebruik een verse pipetpunt voor elke overdracht, vlam de monden van kolven onmiddellijk na het losmaken en voordat u opnieuw wordt aangebracht, en veeg de loop en de uitwerper van de micropipettor af met een pluisvrij papieren doekje bevochtigd met 70% ethanol tussen elke overdracht. Bleekmiddel mag nooit worden gebruikt om micropipettors te desinfecteren, omdat zelfs sporenhoeveelheden de culturen kunnen doden.
  9. Incubeer de nieuw geënte kolven bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch.
  10. Bewaar de culturen van de vorige dag bij 4 °C. Bewaar deze back-upculturen gedurende twee dagen. Gooi oudere culturen weg die drie dagen eerder bij 4 °C zijn bewaard.
    OPMERKING: De culturen van de vorige twee dagen bieden twee complete sets back-ups waarmee het experiment opnieuw kan worden gestart, indien nodig, als er een probleem of ongeluk optreedt, of als besmetting van de culturen van de vorige dag wordt ontdekt voorafgaand aan de overdracht (bijvoorbeeld vreemde kleuring of onverwachte deeltjes).
  11. Voer de tijd, datum, overdrachtsnummer, naam of initialen in van de onderzoeker die de overdrachten heeft uitgevoerd, of de culturen al dan niet in orde waren en alle andere relevante informatie in het overdrachtslogboeknotitieboek. Ga verder met stap 1.12-1.14 als een van de volgende situaties zich voordoet: (1) de blanco van de vorige dag is verontreinigd, (2) een kolf of het deksel ervan is gebarsten of gebroken, (3) een kolf bevat vreemd materiaal, (4) een kolf wordt omgekieperd of gevallen tijdens het overbrengen, of (5) er is een andere gebeurtenis of waarneming die het voortzetten van deze kolven twijfelachtig maakt.
  12. Als er problemen, ongelukken of vermoedens van besmetting zijn met de LTEE-culturen van de vorige dag, draag ze dan niet over. Bewaar in plaats daarvan de hele set van twaalf culturen bij 4 °C voor later onderzoek en verdere karakterisering.
  13. Haal de kolven op met de back-upculturen die van de dag ervoor zijn overgebracht en bij 4 °C zijn bewaard. Leg ze op het bankje om op te warmen tot kamertemperatuur. Draai elke kolf voorzichtig rond om de cellen te resuspenderen.
  14. Breng over van de reservekolven naar het nieuwe stel kolven met vers medium en zet het experiment normaal voort zoals beschreven in de stappen 1.6-1.11. Noteer in het overdrachtslogboek dat de back-upculturen zijn gebruikt en noteer hetzelfde overdrachtsnummer als de dag ervoor.
    OPMERKING: Zelfs als er een probleem wordt geconstateerd in slechts één populatiekolf, breng dan alle twaalf populaties over van de reservekolven, zodat het aantal generaties dat in alle populaties is verstreken in fase blijft. Indien verontreiniging wordt geconstateerd in de bij 4 °C opgeslagen reservekolven, moeten de getroffen LTEE-populaties opnieuw worden opgestart uit bevroren voorraden volgens de procedure die is beschreven in de stappen 3.1-3.2 voor populatiemonsters. Het overdrachtsnummer voor de LTEE mag niet worden verhoogd tot de groei van de eerste culturen in DM25 na de heropleving.

2. Archivering van de LTEE-populaties

OPMERKING: Monsters van de LTEE-populaties worden elke 75 overdrachten ingevroren. De populaties groeien ~ 6 2/3 generaties per dag na de 100-voudige overdrachtsverdunning, dus deze periode komt overeen met ~ 500 generaties. Tijdens het archiveren worden de LTEE-populaties ook op verschillende soorten agarmedia geplakt om te controleren op besmetting. Optioneel kunnen representatieve klonen uit deze platen worden geplukt en op dit moment worden gearchiveerd. Deze stappen zijn samengevat in figuur 1.

  1. Bereid op de dag voor de geplande bevriezing of een paar dagen ervoor drie soorten agarplaten voor: Minimal Glucose (MG), Minimal Arabinose (MA) en Tetrazolium Arabinose (TA). Maak twaalf borden van elk type agar, plus een paar extra's. Bereid ook ten minste 250 ml van 0,85% (w / v) steriele zoutoplossing en 50 ml van 80% (v / v) steriele glycerol.
    OPMERKING: Recepten voor alle media en oplossingen zijn online beschikbaar30. De dag voordat de LTEE een generatie bereikt die een veelvoud is van 500 voor het reguliere archiveringsschema, is de74e dag sinds de laatste bevriezing plus eventuele dagen die zijn toegevoegd als gevolg van overdrachten van de 4 ° C back-upkolven wanneer problemen werden gedetecteerd of vermoed.
  2. OPTIONEEL: Als u klonale isolaten uit de LTEE-populaties archiveert, bereid dan extra benodigdheden voor: het isoleren van drie klonen uit elke populatie vereist 72 MG-platen, 80 ml 80% (v / v) glycerol en 370 ml DM1000.
  3. Bereid een extra set van twaalf kolven voor bij het uitvoeren van stap 1.2 van de dagelijkse LTEE-overdrachten op de dag vóór de geplande bevriezing. Label zes van de extra kolven xA−1 tot en met xA−6 met een rode stift en de andere zes xA+1 tot en met xA+6 met een zwarte stift.
    OPMERKING: De "x" geeft aan dat de extra set kolven zal worden gebruikt voor archivering en onderscheidt deze van de andere set kolven die zullen worden gebruikt om de dagelijkse overdracht van de LTEE parallel voort te zetten.
  4. Vul elk van de extra kolven die zullen worden gebruikt voor archivering met 14,85 ml DM25 met behulp van een serologische pipet van 25 ml bij het uitvoeren van stap 1.4 van de dagelijkse LTEE-overdrachten.
  5. Voltooi de normale LTEE-overdracht zoals beschreven in stap 1.5−1.11. Herhaal vervolgens de instructies voor stap 1.8, maar breng deze keer 150 μL over van elk van de LTEE-culturen van de vorige dag naar de extra kolven van 14,85 ml verse DM25 die zullen worden gebruikt voor archivering.
    OPMERKING: Vermijd in deze en alle volgende stappen besmetting en verwarring door deze richtlijnen te volgen. Begin met populatie A−1, breng dan A+1 over en ga dan verder met afwisselend − en + populaties. Veeg de loop en de uitwerper van de micropipettor af met een pluisvrij papieren doekje bevochtigd met 70% ethanol bij het wisselen van populaties. Verschuif kolven en reageerbuizen in hun trays of rekken na het pipetteren van of naar hen om bij te houden welke overdrachten zijn voltooid.
  6. Incubeer de set van twaalf kolven voor archivering bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch naast de twaalf LTEE-culturen en de blanco zoals beschreven in stap 1.9.
  7. Bereid voorraden voor voor het plateren van de LTEE-populaties ten minste één uur voordat de LTEE-overdrachten op de dag van de bevriezing moeten worden uitgevoerd.
    1. Selecteer twaalf MG, twaalf MA en twaalf TA agar platen. Inspecteer ze visueel om er zeker van te zijn dat ze geen duidelijke besmetting hebben.
    2. Label één van elk type plaat voor elk van de twaalf LTEE-populaties (A−1 tot en met A+6).
      OPMERKING: Schrijf bij het etiketteren van borden op de zijkanten van de bodem van de petrischaal. Dit is belangrijk om kolonies niet te verduisteren wanneer men ze van onder de agar wil onderzoeken of fotograferen. Schrijf niet op de deksels, omdat deze door elkaar kunnen worden gehaald.
    3. Plaats de agarplaten minstens 20 minuten in een incubator van 37 °C om ze op te warmen voordat u ze in stap 2.10 gebruikt.
    4. Bereid 24 reageerbuizen met 9,9 ml zoutoplossing. Schik ze in twaalf sets van elk twee buizen.
    5. Label elk van de twee sets van twaalf reageerbuizen op dezelfde manier als de platen, voeg een "1" of een "2" toe onder de LTEE-populatie-id om de volgorde aan te geven waarin ze zullen worden gebruikt voor het maken van verdunningen van die populatie.
  8. Voer stap 1.1-1.11 uit met behulp van de kolven die de dagelijkse overdracht van de LTEE zoals gewoonlijk voortzetten. Verwijder tijdens stap 1.5 ook de twaalf kolven met de extra culturen voor archivering uit de schudincubator.
  9. Pipetteer 100 μL van de cultuur uit elk van de twaalf extra kolven voor archivering in de eerste reageerbuis met zoutoplossing in het paar voor die LTEE-populatie. Draai de buizen met deze 100-voudige verdunningen grondig. Pipetteer vervolgens 100 μL van elk naar de overeenkomstige tweede buis zoutoplossing. Vortex de laatste 10.000-voudige cultuurverdunningen grondig.
  10. Pipetteer 80 μL uit elk van de buizen met een 10.000-voudige cultuurverdunning tot de gelabelde TA-, MG- en MA-platen voor die populatie. Verdeel de vloeistof gelijkmatig over het agaroppervlak met behulp van een steriele strooistaaf of steriele strooikralen, naar wens. Herhaal dit totdat alle twaalf populaties op alle drie de soorten media zijn geplaatst.
  11. Laat de platen indien nodig drogen totdat er geen vloeistof meer op de agar zichtbaar is. Plaats de platen ondersteboven (met de agarzijde naar boven) in een convectie-incubator voor zwaartekracht die is ingesteld op 37 °C.
    OPMERKING: Het ondersteboven incuberen van platen voorkomt dat de agar uitdroogt en voorkomt dat condensatie op het agaroppervlak druppelt. Beweging van cellen in vloeistof op het agaroppervlak tijdens incubatie kan kolonies uitsmeren en onjuiste kolonietellingen opleveren.
  12. Voeg 3 ml steriele 80% (v/v) glycerol toe aan elk van de twaalf extra kolven die bestemd zijn voor archivering. Meng grondig door te wervelen en zachtjes te vortexen.
  13. Verdeel het mengsel uit elke kolf over steriele cryovialen die zijn geëtiketteerd met een eenduidig identificatienummer voor het monster, de LTEE-populatie waartoe het monster behoort, de generatie waarin het is ingevroren, dat het een gemengd (populatie)monster is en de datum. Pipetteer 6 ml in één grote injectieflacon en 1,25 ml in elk van de zes kleine injectieflacons.
    OPMERKING: De grote injectieflacon is de werkvoorraad. Eén kleine injectieflacon is een back-up voor het geval de werkvoorraad uitgeput is of besmet raakt. De andere vijf kleine flesjes zijn kopieën die naar andere laboratoria kunnen worden verzonden.
  14. Vries de gevulde injectieflacons in bij −80 °C.
  15. Onderzoek en documenteer de groei en morfologieën van kolonies op de TA-, MG- en MA-platen na 24 uur en 48 uur incubatie.
    OPMERKING: Zie de sectie Representatieve resultaten voor afbeeldingen en beschrijvingen van kolonies gevormd door de REL606- en REL607-voorouders en elk van de twaalf LTEE-populaties toen ze werden geplateerd op 76.000 generaties.
  16. OPTIONEEL: Voer de volgende stappen uit bij het archiveren van klonale isolaten.
    1. Kies drie klonale isolaten (kolonies) voor elke LTEE-populatie uit de MG-platen, streep ze elk afzonderlijk op een nieuwe MG-plaat en incuber deze platen gedurende 16-24 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Als kolonies met verschillende morfologieën aanwezig zijn, is de standaardpraktijk in de LTEE om te bemonsteren voor maximale diversiteit door eerst het meest voorkomende type te kiezen en vervolgens verdere kolonies uit minderheidstypen te selecteren. Men kan ook een willekeurige bemonsteringsstrategie gebruiken door stippen aan de onderkant van de bodem van de petrischaal te markeren voordat cellen worden verspreid en vervolgens de geïsoleerde kolonie te kiezen die het dichtst bij elk merkteken na de groei ligt.
    2. Streep de volgende dag een representatieve kolonie van elke plaat op een nieuwe MG-plaat en incuber deze platen gedurende 16-24 uur bij 37 °C.
    3. De volgende dag ent u een geïsoleerde kolonie van elke MG-plaat in een kolf met 10 ml vers DM1000. Vul ook een extra kolf met 10 ml DM1000 om te dienen als een niet-geinoculeerde blanco om te testen op mediaverontreiniging.
    4. Incubeer de kolven bij 37 °C gedurende 16-24 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch.
    5. Voeg na incubatie 2 ml steriele 80% (v/v) glycerol toe aan elke kolf en wervel om te mengen.
    6. Verdeel 1,25 ml aliquots uit elke kolf in kleine, steriele injectieflacons met een unieke identificatie voor elke kloon, de LTEE-populatie en de generatie van herkomst, dat het een klonaal monster is en de datum.
    7. Vries de gevulde injectieflacons in bij −80 °C.

3. Competitieve fitnesstests

OPMERKING: In de LTEE wordt reproductieve fitheid gekwantificeerd in termen van het relatieve aantal verdubbelingen dat verschillende bacteriën bereiken gedurende een of meer 24-uurs kweekcycli onder dezelfde omstandigheden als de dagelijkse overdrachten. In het bijzonder is de relatieve fitheid van de ene concurrent ten opzichte van de andere de verhouding van hun gerealiseerde verdubbelingspercentages wanneer ze het tegen elkaar opnemen in een co-cultuur. Elke deelnemer in een paar kan een volledige populatie zijn of een klonaal isolaat dat eerder werd gearchiveerd als onderdeel van het bevroren "fossielenbestand" van de LTEE. Als alternatief kunnen een of beide concurrenten een kloon zijn die genetisch is gemodificeerd om specifieke mutaties toe te voegen of te verwijderen om hun effecten te testen. De twee concurrenten moeten tegengestelde Ara+/Ara-toestanden hebben, omdat deze genetische marker wordt gebruikt om hen tijdens deze test te differentiëren. De algemene workflow voor een wedstrijdtest wordt weergegeven in figuur 2. De duur van de co-kweekfase kan worden verlengd van één tot drie (of meer) dagen om de precisie van fitnessschattingen te verbeteren bij het testen op verschillen tussen concurrenten die bijna gelijk zijn. Zie de Disussion voor andere kritische overwegingen en mogelijke wijzigingen van dit protocol.

Figure 2
Figuur 2: Flow chart van de concurrentietest. De volledige procedure voor een eendaagse wedstrijdtest wordt getoond. De driedaagse procedure gaat door met het alternatieve traject op dag 1 en dag 2 tot de beplating op dag 3 op dezelfde manier als voor dag 1 van de eendaagse competitie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Benodigdheden voorbereiden
    1. Bepaal hoeveel LTEE-stammen en/of -populaties van concurrenten zullen worden gebruikt en hoeveel replicerende competitietests voor elk paar concurrenten zullen worden uitgevoerd. Bereid de benodigde benodigdheden voor zoals beschreven in de volgende stappen.
      OPMERKING: Recepten voor alle media en oplossingen zijn online beschikbaar30. De kolven en reageerbuizen die nodig zijn voor alle dagen van een wedstrijdexperiment kunnen vooraf worden gevuld of indien nodig op de dagen dat ze zullen worden gebruikt. Als kolven en reageerbuizen van tevoren zijn gevuld, bewaar ze dan bij kamertemperatuur in het donker om verdamping te minimaliseren. TA-platen moeten ten minste twee dagen van tevoren worden voorbereid wanneer ze zullen worden gebruikt, zodat ze na het gieten voldoende kunnen drogen om cultuurverdunningen te kunnen verspreiden. Bereid altijd een paar extra kolven, reageerbuizen en TA-platen voor, zodat een experiment kan worden voortgezet als er pipetteerfouten, vervuilde platen of andere kleine ongelukken zijn.
    2. Vul voor de opwekkingsdag (dag −2) één steriele erlenmeyer van 50 ml afgedekt met een bekerglas van 20 ml met 9,9 ml DM1000 of lysogenesebouillon (LB) per stam of populatie van E. coli die als concurrent zal worden gebruikt. Vul nog een kolf met 9,9 ml van hetzelfde medium om te dienen als een niet-geënte blanco.
    3. Vul voor de voorconditioneringsdag (dag −1) één reageerbuis met 9,9 ml 0,85% (w/v) steriele zoutoplossing per concurrent, twee kolven met 9,9 ml DM25 per replicatietest tussen een paar concurrenten en nog een kolf met 9,9 ml DM25 voor een blanco.
    4. Voor de dag dat de wedstrijd begint (dag 0), vult u één kolf met 9,9 ml DM25, vult u één reageerbuis met 9,9 ml 0,85% (m/v) steriele zoutoplossing en bereidt u één TA-plaat voor per wedstrijdtestreplicatie. Vul nog een kolf met 9,9 ml DM25 om als blanco te dienen.
    5. ALTERNATIEF: Voor elke dag van een meerdaagse wedstrijd voorbij de eerste, vul één kolf met 9,9 ml DM25 per wedstrijdreplicatie en vul nog een kolf met 9,9 ml DM25 voor een blanco.
    6. Voor de laatste dag van de wedstrijd (bijv. Dag 1 of Dag 3), vult u twee reageerbuizen met 9,9 ml van 0,85% (m / v) steriele zoutoplossing en bereidt u één TA-plaat per wedstrijdreplicatie voor.
  2. Dag −2: Deelnemers afzonderlijk nieuw leven inblazen in DM1000 of LB
    1. Etiketteer voor elk van de deelnemers een kolf gevuld met 9,9 ml DM1000 of LB. Label een extra kolf gevuld met 9,9 ml van dezelfde partij medium om te dienen als een niet-geënte blanco om te testen op verontreiniging.
      OPMERKING: Bevroren voorraden worden nieuw leven ingeblazen in LB of DM1000 voor een meer uniform en voorspelbaar herstel van gecryopreserveerde cellen. De glycerol die als cryoprotectant wordt gebruikt, kan worden gemetaboliseerd door E. coli, wat zal leiden tot hogere celdichtheden dan verwacht als monsters worden gereanimeerd in DM25. LB en DM1000 ondersteunen de groei tot zulke hoge celdichtheden dat deze complicatie verwaarloosbaar wordt.
    2. Haal de cryovialen met de diepvriesvoorraden van de concurrerende stammen uit de vriezer van −80 °C. Bewaar de injectieflacons gekoeld in een ijsemmer terwijl u ze gebruikt.
    3. Nadat elke bevroren voorraad is ontdooid, vortex het grondig om de E. coli-cellen te resuspenderen. Als u een kloon nieuw leven inblaast, ent u de kolf met vers medium met 12 μL van de bevroren bouillon. Als u een populatie nieuw leven inblaast, ent u de kolf met 120 μL van de bevroren bouillon.
      OPMERKING: Het volume van 120 μL van de ingevroren voorraad wordt gebruikt voor populaties, zodat het aantal cellen dat nieuw leven wordt ingeblazen ongeveer hetzelfde is als het dagelijkse knelpunt wanneer 1% van de LTEE-populatie wordt overgebracht naar een nieuwe kolf. Het meerdere keren ontdooien en vortexen van bevroren voorraden kan cellen stress bezorgen en de levensvatbaarheid van voorraden in de loop van de tijd verminderen. Als een bepaalde LTEE-populatie of kloon meerdere keren in wedstrijden wordt gebruikt, is het een goede gewoonte om meerdere exemplaren van de voorraad opnieuw te laten groeien en in te vriezen, zodat er geen enkele wordt ontdooid en vele malen opnieuw wordt ingevroren.
    4. Incubeer de opwekkingskolven en de blanco bij 37 °C gedurende een nacht (16-24 uur) met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch.
  3. Dag −1: Randvoorwaarden concurrenten afzonderlijk in DM25
    1. Label voor elke deelnemer een reageerbuis gevuld met 9,9 ml zoutoplossing. Label voor elke herhalingstest tussen een paar concurrenten twee kolven van 50 ml gevuld met 9,9 ml DM25, elk met het replicatienummer en de naam van een van de concurrenten. Label een extra kolf gevuld met 9,9 ml DM25 om als blanco te dienen.
    2. Haal de kolven met daarin de culturen van herleefde concurrenten uit de couveuse. Onderzoek hun troebelheid met het oog om te bevestigen dat ze zijn gegroeid en dat er geen duidelijke besmetting is.
    3. Pipetteer 100 μL uit elke kolf in de reageerbuis met zoutoplossing voor die concurrent.
      OPMERKING: Deze stap verdunt de cultuur 100-voudig, wat nodig is omdat de dichtheid van cellen veel hoger is in LB en DM1000 dan in de DM25-omgeving die wordt gebruikt in de LTEE (zie Representatieve resultaten).
    4. Draai elke verdunningsbuis grondig vlak voordat u 100 μL uit de verdunde cultuur in een kolf met verse DM25 pipetteert. Ent twee van deze voorconditioneringskolven voor elke replicaattest, één voor elk van de concurrenten.
    5. Incubeer de voorconditioneringskolven en de blanco bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch.
  4. Dag 0: Begin de competitie door concurrenten en plaat te mengen voor de eerste tellingen
    1. Etiketteer voor elke wedstrijdtest één kolf gevuld met 9,9 ml DM25 en één reageerbuis gevuld met 9,9 ml zoutoplossing. Label de kolven en buizen op een manier die elk paar concurrenten en het replicatienummer van de wedstrijdtest uniek identificeert. Label een extra kolf gevuld met 9,9 ml DM25 om als blanco te dienen.
    2. Haal de voorconditioneringskolven uit de couveuse. Onderzoek hun troebelheid met het oog om te bevestigen dat ze zijn gegroeid en dat er geen duidelijke besmetting is.
    3. Breng 50 μL van de Ara− -concurrent over in de eerste nagebouwde wedstrijdkolf gevuld met verse DM25. Breng onmiddellijk 50 μL van de Ara+ concurrent over in dezelfde concurrentiekolf en meng deze door zachtjes te draaien.
    4. Herhaal stap 3.4.3 voor alle replica's van alle paren concurrenten.
      OPMERKING: De wedstrijdkolven hebben nu een totale 100-voudige verdunning van E. coli-culturen gekweekt in DM25, dezelfde toestandscellen in de LTEE-ervaring na elke dagelijkse overdracht. De volgorde van het uitvoeren van transfers en mixen is belangrijk. Voeg beide concurrenten onmiddellijk na elkaar aan elke kolf toe, zodat geen van beide een voorsprong krijgt die in het verse medium groeit. Voeg bijvoorbeeld niet de Ara-culturen toe aan alle wedstrijdkolven en ga dan terug en voeg alle Ara+ soorten toe.
    5. Pipetteer 100 μL uit elke nieuw geënte wedstrijdkolf in de reageerbuis van zoutoplossing die voor die wedstrijdtest is geëtiketteerd, zodat elk van deze buizen een totale 10.000-voudige verdunning van de geconditioneerde DM25-culturen bevat die werden gecombineerd.
    6. Plaats de wedstrijdkolven en blanco in de broedmachine. Incubeer de wedstrijdkolven bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch.
    7. Op dezelfde dag, onmiddellijk na het plaatsen van de wedstrijdkolven in de couveuse, vortex elke reageerbuis uit stap 3.4.5 grondig en verspreid 80 μL van deze 10.000-voudige verdunningen op TA-platen zoals beschreven in stap 2.10. Label de zijkant van de onderkant van elke plaat met het paar soorten dat werd gemengd, het replicatienummer en "Dag 0" om aan te geven dat het zal worden gebruikt om de initiële vertegenwoordiging van elke concurrent te bepalen.
    8. Incubeer de TA-platen ondersteboven in een zwaartekrachtconvectie-incubator bij 37 °C totdat kolonies van zowel de Ara−- als Ara+ concurrenten zichtbaar en te onderscheiden zijn. Over het algemeen gebeurt dit binnen 16-24 uur, maar het kan langer duren voor sommige geëvolueerde stammen. Tel de aantallen Ara− (rode) en Ara+ (witte) kolonies op elke plaat ennoteer de resultaten.
      OPMERKING: Verschillen tussen de kleuren van Ara- en Ara+ kolonies op TA-platen worden in de loop van de tijd minder duidelijk, zelfs wanneer platen bij 4 °C worden bewaard, dus ze moeten zo snel mogelijk worden geteld zodra ze uit de incubator zijn verwijderd. Afbeeldingen van TA-platen met de typische verschijningsvormen van kolonies gevormd door Ara- en Ara+ -cellen zijn opgenomen in de Representatieve Resultaten. Die sectie bevat ook afbeeldingen van gemeenschappelijke "edge case" -kolonies (bijvoorbeeld overlap of uitgroei van verschillende kolonietypen) en legt uit hoe ze moeten worden geteld. Als de groeisnelheden en morfologieën van kolonies gevormd op TA-platen door een van de concurrenten niet eerder zijn gekarakteriseerd, verspreid dan 80 μL van een 10.000-voudige verdunning in zoutoplossing vanuit de voorconditioneringskolven op dag 0, wanneer de concurrenten nog steeds van elkaar gescheiden zijn. Onderzoek vervolgens kolonies op deze controleplaten na incubatie bij 37 °C gedurende 16-24 uur of langer.
  5. ALTERNATIEF: Dag 1 en 2: Vervolg driedaagse competitie
    1. Etiketteer voor elke wedstrijdtest één kolf gevuld met 9,9 ml DM25. Label de kolven op een manier die elk paar concurrenten, het replicatienummer en de dag van de wedstrijdtest uniek identificeert. Label een extra kolf gevuld met 9,9 ml DM25 om als blanco te dienen.
    2. Haal de wedstrijdkolven van de vorige dag uit de couveuse. Onderzoek hun troebelheid met het oog om de verwachte groei te verifiëren en besmetting te detecteren.
    3. Breng 100 μL van elke wedstrijdkolf over in de overeenkomstige kolf met vers medium voor de volgende dag van het vergelijkend onderzoek.
    4. Plaats de nieuwe wedstrijdkolven en blanco in de schudincubator. Incubeer ze bij 37 °C gedurende 24 ± 1 uur met 120 rpm orbitaal schudden over een diameter van 1 inch.
    5. Herhaal stap 3.5.1-3.5.4 op dag 2 van de wedstrijd voordat u verdergaat.
  6. Dag 1 of 3: Finish wedstrijd en bord voor finale tellingen
    1. Bereid voor elke wedstrijdkolf twee reageerbuizen voor gevuld met 9,9 ml zoutoplossing. Label ze op een manier die elk paar concurrenten uniek identificeert, het replicatienummer en of ze voor de eerste of tweede verdunning zijn.
    2. Haal de wedstrijdkolven uit de couveuse. Onderzoek hun troebelheid met het oog om te detecteren dat ze groeiden en dat er geen duidelijke besmetting was.
    3. Pipetteer 100 μL uit elke wedstrijdkolf in de eerste buis zoutoplossing voor die replicatie. De resulterende buizen bevatten 100-voudige verdunningen van de DM25-culturen.
    4. Vortex elke 100-voudige verdunningsbuis om het grondig te mengen en pipetteer 100 μL naar de tweede buis zoutoplossing voor die replicatie. De resulterende buizen bevatten 10.000-voudige verdunningen van de DM25-culturen.
    5. Vortex elke reageerbuis met een 10.000-voudige verdunning grondig en verspreid 80 μL ervan op een TA-plaat zoals beschreven in stap 2.10. Label de zijkant van de onderkant van elke plaat met het paar soorten dat is gemengd, het replicatienummer en "Dag 1" voor een eendaagse wedstrijd of "Dag 3" voor een driedaagse wedstrijd om aan te geven dat deze zal worden gebruikt om de uiteindelijke vertegenwoordiging van elke deelnemer te bepalen.
    6. Incubeer TA-platen bij 37 °C en tel de Ara−- en Ara+ -kolonies na groei zoals beschreven in stap 3.4.8.
      OPMERKING: Houd het replicatienummer van elke wedstrijdtest bij tijdens alle overdrachten en platingstappen. Verwarrend welke eind- en initiële tellingen overeenkomen tussen verschillende replicatietests - zelfs wanneer dezelfde twee concurrenten in elk ervan werden gemengd - zal resulteren in onjuiste fitnessschattingen.
  7. Berekening en plotgeschiktheid
    1. Als u Excel gebruikt voor het berekenen en plotten van de relatieve geschiktheid, downloadt u de XLS-spreadsheet (aanvullend bestand 1). Als u R gebruikt, installeert u het fitnessR-pakket31 en downloadt u de sjabloon voor door komma's gescheiden waarden (CSV) (aanvullend bestand 2) of genereert u een nieuwe kopie van dit bestand volgens de aanwijzingen in het vignet.
    2. Voer een "overdrachtsverdunning" van 100 in voor de vergelijkende onderzoeken die worden uitgevoerd in de aangewezen cel of kolom in het gedownloade bestand. Voer het totale aantal dagelijkse groeicycli in waarin de deelnemers werden gecocultiveerd als het "aantal transfers" (bijvoorbeeld 3 voor een driedaagse competitie).
    3. Voer de namen van elk paar deelnemers in de aangewezen cellen of kolommen in met de referentiestam als "concurrent1" en de teststam of populatie als "concurrent2".
    4. Voer voor elke wedstrijdtestreplicatie de respectievelijke initiële en laatste kolonietellingen in de aangewezen kolommen van het gedownloade bestand in.
    5. Als u de Excel-spreadsheet gebruikt, worden nu de gemiddelde relatieve fitnesswaarde en 95% betrouwbaarheidslimieten voor deze schatting weergegeven. Kopieer de resultaten voor verschillende combinaties van concurrenten naar een ander blad en maak een grafiek die de resultaten samenvat. Als u R gebruikt om de gegevens te analyseren, volgt u de aanwijzingen in het vignet voor het fitnessR-pakket om deze berekeningen uit te voeren, voert u een CSV-bestand uit met de berekende waarden en plot u de resultaten.

Representative Results

Uiterlijk en troebelheid van LTEE-culturen
Door de lage glucoseconcentratie in DM25 is de troebelheid van volgroeide LTEE-populaties in elf van de twaalf kolven nauwelijks zichtbaar. Bij het onderzoek van de LTEE-culturen met het oog naar normale groei en tekenen van besmetting (stap 1.6), moet elke kolf met een LTEE-populatie naast elkaar worden vergeleken met de blanco (figuur 3A). De uitzondering is populatie A−3, die evolueerde om citraat te gebruiken als een extra koolstof- en energiebron en daarom een hogere celdichtheid bereikt32. De troebelheid van DM25-culturen van de REL606- en REL607-voorouderstammen is vergelijkbaar met die van een typische geëvolueerde populatie (figuur 3B). LTEE-stammen en -populaties groeien naar een hogere dichtheid in DM1000 als gevolg van de hogere concentratie glucose en een veel hogere dichtheid in LB (figuur 3B). De dichtheid van DM25-culturen van de A−3 LTEE-populatie ligt tussen de dichtheden van culturen van REL606 in DM25 en DM1000 (figuur 3C).

Figure 3
Figuur 3: Uiterlijk van LTEE-culturen. (A) Kolven met de twaalf LTEE-populaties na 24 uur groei in DM25 op de dag waarop het experiment 76.253 1/3 generaties bereikte, zijn naast de blanco afgebeeld. (B) Kolven met culturen van de voorouders REL606 en REL607 die gedurende 24 uur in DM25, DM1000 en LB zijn gekweekt, worden naast media-blanco's afgebeeld. (C) Ingezoomde foto's van dezelfde kolven naast elkaar die laten zien hoe de troebelheid van de A−3-populatiekolf in DM25 zich verhoudt tot de REL606-voorouder in DM25 en DM1000. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Spectrofotometermetingen van de optische dichtheden bij 600 nm (OD600) van culturen gekweekt in DM25 (stap 1.7) komen overeen met deze visuele waarnemingen voor zowel de LTEE-populaties (figuur 4A) als hun voorouders (figuur 4B). Deze metingen kunnen worden gebruikt om de groei kwantitatief te vergelijken en te documenteren wanneer besmetting of een fout wordt vermoed. Voor metingen van de LTEE-populaties tussen 76.000 en 76.500 generaties, vonden we dat de OD600 van A−3, de populatie die evolueerde om te groeien op citraat, gemiddeld 0,223 was (0,218-0,227, 95% betrouwbaarheidsinterval). De OD600 van de andere elf populaties was gemiddeld 0,0252 (0,0239-0,0265, 95% betrouwbaarheidsinterval). Er was een lichte, maar significante variatie in OD600-metingen tussen de elf normale populaties (F 10,88 = 5,1035, p = 7,5×10−6). De LTEE-populaties bereiken de stationaire fase na ongeveer 5-6 uur incubatie. Als ze 's ochtends worden overgedragen, zal de groei halverwege tot laat in de middag van dezelfde dag zichtbaar zijn. Veel soorten microben kunnen aeroob groeien op citraat. Daarom is verhoogde troebelheid in andere populaties dan A−3 waarschijnlijk een teken van besmetting van buitenaf.

Figure 4
Figuur 4: Troebelheid van LTEE-culturen . (A) Optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van de twaalf LTEE-populaties na de 24-uurs groeicyclus op drie verschillende dagen tussen 76.000 en 76.500 generaties van het experiment. De OD600-waarden van drie aliquots van 1 ml op elk van de drie verschillende dagen worden uitgezet als punten. De gemiddelde OD600-waarde van drie verschillende aliquots van de blanco van dezelfde dag werd van deze waarden afgetrokken. Gevulde balken tonen gemiddelden. Foutbalken zijn 95% betrouwbaarheidslimieten. (B) OD600 van culturen van de voorouders REL606 en REL607 in DM25, DM1000 en LB. De OD600-waarden van drie aliquoten van 1 ml op elk van de drie verschillende dagen van twee afzonderlijke culturen voor elke aandoening en stam worden uitgezet als punten. De gemiddelde OD600-waarde van drie verschillende aliquots van de blanco van dezelfde dag werd van deze waarden afgetrokken. Gevulde balken tonen gemiddelden en foutbalken zijn 95% betrouwbaarheidslimieten. Grijs gearceerde gebieden tussen de panelen laten zien hoe de OD600-as opnieuw wordt geschaald tussen het DM25-paneel en de DM1000- en LB-panelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Groei en morfologie van LTEE-kolonies
Bij het controleren van de populaties op besmetting door ze op verschillende media te plateren (stap 2.15), vormen de REL606- en REL607-voorouders en alle geëvolueerde populaties witte kolonies met doorschijnende en enigszins onregelmatige randen op minimale glucose (MG) agarplaten (figuur 5A). De samenstelling van MG-agar is dezelfde als die van de DM25 die wordt gebruikt in de dagelijkse LTEE-overdrachten, behalve met een hogere concentratie glucose, dus de geëvolueerde LTEE-populaties vormen vaak grotere kolonies op MG dan de voorouders. Vanwege de hogere celdichtheid in DM25 zal de A-3-populatie meerdere malen meer kolonies hebben als hetzelfde volume ervoor wordt geplateerd als voor de andere populaties, en dit kan de grootte van de kolonies beperken. De meest voorkomende soorten verontreinigende microben vormen grimmige witte, ondoorzichtige en perfect cirkelvormige kolonies op MG.

Op minimale arabinose (MA) agar vormen de REL607-voorouder en de Ara+ populaties meestal allemaal licht doorschijnende witte kolonies. Dit typische groeipatroon is voor de Ara+ populaties gedurende 76.000 generaties blijven bestaan, met uitzondering van A+6, dat een defect in de groei op arabinose heeft ontwikkeld en niet langer kolonies vormt op MA (figuur 5B). Er is geen selectie om de groei op arabinose te behouden tijdens de LTEE-overdrachten in DM25, dus andere Ara + -populaties kunnen uiteindelijk ook stoppen met het vormen van kolonies op MA-agarplaten naarmate het experiment voortduurt. Met uitzondering van A−3 vormen de Ara-populaties geen kolonies op MA-agar , hoewel nauwkeurig onderzoek microkolonies kan onthullen als gevolg van sporenvoedingsstoffen in de agar. De A−3-populatie vormt talrijke kleine kolonies op MA, omdat deze cellen kunnen groeien op het citraat dat ook in dit medium aanwezig is. Verontreinigingskolonies op MA zijn zeldzaam.

Figure 5
Figuur 5: LTEE-populaties plateren om besmetting op te sporen. Verdunningen van de REL606- en REL607-voorouders en de twaalf LTEE-populaties op de dag dat het experiment 76.026 2/3-generaties bereikte, werden geplateerd op (A) MG-, (B) MA- en (C) TA-agarplaten en gefotografeerd na 24 uur en 48 uur. Dezelfde verdunningen werden gemaakt voor alle culturen, maar de helft van het volume werd verguld voor de voorouders als beschreven in het protocol voor de LTEE-populaties, om enigszins rekening te houden met hun hogere celdichtheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Op tetrazolium arabinose (TA) agar wordt verwacht dat de REL606-voorouder en alle Ara-populaties rode kolonies vormen, terwijl de REL607-voorouder en alle Ara + -populaties over het algemeen kolonies moeten vormen die wit zijn (waaronder lichtroze of perziktinten) (figuur 5C). De LTEE-voorouders vormen robuuste kolonies, die gemakkelijk binnen 16-24 uur kunnen worden geïdentificeerd als Ara− en Ara+ op TA-agar. Oorspronkelijk kon dit verschil worden gebruikt om kruisbesmetting tussen Ara- en Ara+-populaties op te sporen. TA-agar heeft echter een complexere samenstelling van voedingsstoffen dan het chemisch gedefinieerde DM25-medium dat wordt gebruikt in de dagelijkse overdrachten, en er is geen evolutionaire druk geweest voor E. coli in de LTEE om een vermogen te behouden om robuust te groeien onder deze omstandigheden. Bijgevolg vertonen sommige geëvolueerde LTEE-populaties nu een slechte groei op TA-platen, waardoor het 48 uur duurt om kolonies te vormen of helemaal niet betrouwbaar groeit. De kleuren en morfologieën van kolonies gevormd op TA door de geëvolueerde LTEE-populaties zijn ook veranderd ten opzichte van de voorouders en van elkaar afgeweken. De aanwezigheid van enkele afwijkende kolonies is niet altijd een indicatie van besmetting. Spontane mutaties kunnen optreden die de Ara-markertoestand van LTEE-stammen veranderen, vooral van Ara+ naar Ara− vanwege de grotere kans op functieverliesmutaties die het arabinosegebruik beïnvloeden versus reversiemutaties die de araA-activiteit herstellen. Mutaties die van Ara-markertoestand wisselen, komen vaker voor in populaties die hypermutatie hebben ontwikkeld (A−1, A−2, A−3, A−4, A+3 en A+6)13. Op TA-agar vormen besmettende microben van andere soorten vaak (maar niet altijd) kleine, perfect cirkelvormige kolonies met rode centra omringd door verschillende witte grenzen die anders zijn dan die gevormd door LTEE-stammen of -populaties.

Resultaten co-cultuurcompetitie
Wedstrijden tussen alle Ara−- en Ara+-paren van de twee LTEE-voorouders (respectievelijk REL606 en REL607) en de A−5- en A+5-populatiemonsters gearchiveerd op 20.000 generaties (respectievelijk REL8597 en REL8604) laten zien hoe kolonies met verschillende Ara-markertoestanden kunnen worden onderscheiden en geteld op TA-agar (stappen 3.4.8 en 3.6.6) (figuur 6). Kolonies werden geteld voor zes replicaatkolven voor elk paar concurrenten voor en na eendaagse en driedaagse assays die begonnen met opwekking in DM1000 (tabel 1). Het totale aantal kolonies dat is waargenomen voor dezelfde verdunning en hetzelfde volume varieert met welke concurrenten werden gemengd omdat culturen van geëvolueerde LTEE-populaties lagere celdichtheden bereiken dan culturen van de voorouderstammen in DM25. Dit verschil is een gevolg van de evolutie van de toegenomen celgrootte, die plaatsvond in alle LTEE-populaties tijdens de eerste paar duizend generaties van het experiment 8,33.

Figure 6
Figuur 6: Competitietests op TA-agarplaten. Voorbeelden van TA-agarplaten uit wedstrijdtests. REL606 en REL607 zijn respectievelijk de Ara− en Ara+ voorouders van de LTEE. REL8597 en REL8604 zijn de 20.000 generatie A−5 en A+5 populaties, respectievelijk, uit het bevroren "fossielenbestand" van de LTEE. TA-platen die overeenkomen met één replicatietest tussen elk paar stammen worden getoond voor dag 0, dag 1 en dag 3 van de competitie. Platen werden gefotografeerd na 24 uur groei bij 37°C. Cellen van de REL606 en REL8597 concurrenten zijn Ara− en vormen rode kolonies. Cellen van de REL607 en REL8604 concurrenten zijn Ara+ en vormen witte kolonies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De meeste kolonies op een typische competitie TA-plaat zullen goed gescheiden zijn of overlappen op manieren waarvoor het gemakkelijk is om te tellen hoeveel aanvankelijk cirkelvormige kolonies van verschillende typen samen groeiden (figuur 7A). Er kunnen zich echter situaties voordoen waarin het niet duidelijk is hoe een atypische kolonie of groei moet worden geteld die een mengsel van de twee kleuren is. Ten eerste, wanneer een witte Ara+ kolonie en een rode Ara− kolonie elkaar overlappen, heeft de Ara+ kolonie de neiging om de Ara− kolonie te overwoekeren en te omhullen. In deze situatie moet men een kleine rode vlek of doorschijnende "kloof" in de grotere Ara+ kolonie tellen als een Ara− kolonie (Figuur 7B). Ten tweede zullen er af en toe spontane Ara+ mutanten opduiken in Ara-kolonies. Deze mutanten verschijnen meestal als witte sectoren (papillen) die zich sneller verspreiden vanuit het binnenste van een rode kolonie omdat ze sneller groeien zodra ze toegang krijgen tot arabinose als extra voedingsstof (figuur 7C). Deze kolonies met witte sector worden geteld als één Ara-kolonie en geen Ara+-kolonies. Deze situatie komt vaker voor als platen gedurende 48 uur of langer worden geïncubeerd. Ten derde worden soms doorschijnende roze kolonies waargenomen (figuur 7D). Deze worden gevormd door de Ara-concurrent. Ten slotte groeit een klein aantal cirkelvormige kolonies met een binnenkant die een iets andere tint rood hebben, soms op TA-platen wanneer ze worden besmet door een paar externe microbiële cellen tijdens de bereiding van de agar of bij het verspreiden van cultuurverdunningen op hun oppervlakken (figuur 7E). Deze verontreinigingskolonies mogen niet worden meegeteld. Als besmetting van een wedstrijdcultuur wordt vermoed omdat er veel atypische kolonies op een van de TA-platen zitten, moet die replicatie worden uitgesloten.

Figure 7
Figuur 7: Randgevallen die worden aangetroffen bij het tellen van Ara- en Ara+ -kolonies op TA-agar. In elk paneel zijn enkele Ara- en Ara+ kolonies die geteld moeten worden gemarkeerd met respectievelijk effen rode en zwarte pijlen. Kolonies die niet mogen worden geteld, worden aangegeven met stippelpijlen die overeenkomen met het type dat ze lijken te zijn. Alle foto's zijn genomen na 24 uur incubatie, behalve in paneel C. (A) Voorbeelden van normale Ara− en Ara+ kolonies. (B) Voorbeelden van Ara+ kolonies die nabijgelegen Ara-kolonies overwoekeren, waaronder een kolonie die nauwelijks zichtbaar is als een transparante opening in de buitenkant van de witte kolonie. Tel elk van deze gevallen als twee kolonies, één van elk type. (C) Voorbeelden van Ara-kolonies die aanleiding geven tot Ara+ -mutantensectoren. Tel elk geval als slechts één Ara-kolonie . De witte sector (papilla) die ontstaat is te wijten aan een Ara+ mutant die in de kolonie ontstaat. Hetzelfde veld van kolonies wordt getoond na 24 uur, 48 uur en 72 uur groei. (D) Voorbeeld van een doorschijnende roze kolonie. Tel het als Ara−. (E) Voorbeelden van kolonies gevormd door externe besmetting door een microbe die geen E. coli is. Deze zijn rood maar kleiner en perfect cirkelvormig met een duidelijke witte grens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het analyseren van de kolonietellingen van deze wedstrijden met behulp van de Excel-spreadsheet (aanvullend bestand 1) of door de fitnessR-pakketfuncties in R uit te voeren op kolonietellingen die zijn ingevoerd in de CSV-sjabloon (aanvullend bestand 2) toont aan dat de twee voorouders niet te onderscheiden zijn in termen van hun geschiktheid binnen de precisie van de test, dat zowel de 20.000-generatie A−5- als A + 5-populaties significant fitter zijn dan de voorouders, en dat geen van beide geëvolueerde populaties significant fitter is dan de andere (Welch's t-tests, p > 0,05) (figuur 8). De precisie van de relatieve fitheidsschatting verbetert in de driedaagse wedstrijden ten opzichte van de eendaagse wedstrijden voor een van de nauw op elkaar afgestemde paren (REL606 vs. REL607). De precisie van deze metingen kan verder worden verhoogd door langere wedstrijden uit te voeren met meer groeicycli, indien gewenst. De resultaten van meerdaagse wedstrijden zijn echter niet informatief zodra de ene deelnemer na de extra wedstrijddagen zo overvloedig wordt ten opzichte van de andere dat de verhouding van de twee stammen niet nauwkeurig kan worden bepaald omdat er zeer weinig tot geen kolonies van het minder geschikte type zijn om te tellen. Dit is het geval voor de driedaagse competities van de voorouders tegen de geëvolueerde 20.000 generatiepopulaties (REL606 vs. REL8604 en REL607 vs. REL8597) (Figuur 6 en Tabel 1).

Tabel 1: Kolonietellingen van competitieve fitnesstests. Eendaagse en driedaagse competitietests met zes replica's werden uitgevoerd voor alle paarsgewijze combinaties van twee Ara- en de twee Ara+ -deelnemers. REL606 en REL607 zijn respectievelijk de Ara− en Ara+ voorouders van de LTEE. REL8597 en REL8604 zijn de 20.000-generatie A−5 en A+5 populaties, respectievelijk, uit het bevroren "fossielenbestand" van de LTEE. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Figure 8
Figuur 8: Relatieve fitheid gemeten met behulp van wedstrijdtesten. Resultaten van een- en driedaagse competitietests tussen LTEE-voorouders en de 20.000 generatie A-5 en A +5 LTEE-populaties. Het diagram aan de linkerkant toont de vier paarsgewijze wedstrijden als kleurgecodeerde dubbelpuntige pijlen. Elke combinatie van de twee Ara− (rode labels) en de twee Ara+ (black labels) concurrenten werd getest met zesvoudige replicatie. Kolonietellingen uit tabel 1 werden geanalyseerd in R met behulp van het fitnessR-pakket31 en de resultaten werden uitgezet met behulp van het ggplot2-pakket (versie 3.4.0)34. Fitness wordt weergegeven als de concurrent waar de pijl in het label naartoe gaat ten opzichte van de concurrent waar de pijl vandaan komt (bijv. REL8604 ten opzichte van REL606). Relatieve fitnesswaarden geschat op basis van de kolonietellingen voor elke wedstrijdtest repliceren (punten), gemiddelde relatieve fitnesswaarden voor het paar concurrenten (balken gevuld met dezelfde kleurcodering als het diagram) en 95% betrouwbaarheidsintervallen (foutbalken) worden weergegeven. Relatieve fitheidswaarden konden niet worden bepaald (N.D.) voor de driedaagse wedstrijden tussen de voorouders en de geëvolueerde populaties omdat er nul of zeer weinig kolonies van de voorouders waren op de dag 3-platen (zie tabel 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1. Excel-spreadsheetbestand voor het berekenen van de relatieve geschiktheid. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2. Invoerbestandssjabloon voor door komma's gescheiden waarden voor het berekenen van de relatieve geschiktheid in R met behulp van het fitnessR-pakket. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Veerkracht op lange termijn van de LTEE en zijn methoden
Het E. coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) bevindt zich nu in zijn vierde decennium. Voor een microbieel evolutie-experiment van welke duur dan ook, is het van cruciaal belang om een reproduceerbare omgeving te behouden, besmetting te voorkomen, monsters te archiveren en de geschiktheid nauwkeurig te meten. De LTEE demonstreert verschillende beproefde strategieën om deze doelstellingen te bereiken, waaronder het gebruik van goed geschudde kolven die een homogene omgeving creëren en een chemisch gedefinieerd groeimedium dat een lage celdichtheid ondersteunt. Bovendien gebruikt de LTEE voorouderstammen die verschillen in een genetische marker die een fenotype (koloniekleur) geeft die zowel gemakkelijk kan worden gescreend als selectief neutraal is in de evolutieomgeving. Deze experimentele ontwerpfunctie biedt een middel om interne en externe verontreiniging te identificeren en vergemakkelijkt het meten van de geschiktheid. Niet alle procedures en waarborgen die sinds 1988 door de LTEE zijn gebruikt, zijn echter even robuust gebleken. Sommige methoden die betrouwbaar waren toen de LTEE begon, zijn minder effectief geworden naarmate de E. coli-populaties zijn geëvolueerd . Gelukkig kunnen deze problematische methoden nu worden uitgebreid of vervangen met behulp van technologieën die sinds het begin van het experiment zijn ontwikkeld.

Detectie van verontreiniging
Detectie van verontreiniging is van cruciaal belang voor de LTEE. Besmetting kan van twee soorten zijn: tussen LTEE-populaties (kruisbesmetting) en met microben uit de omgeving (besmetting van buitenaf). Voor het grootste deel voorkomen zorgvuldig gebruik van aseptische technieken en veel aandacht tijdens de mediavoorbereiding en de dagelijkse overdrachten beide soorten besmetting, maar ze gebeuren wel. In het begin van het experiment kon plating op TA-agar worden gebruikt om gevallen van kruisbesmetting te detecteren, omdat overdrachten altijd hebben afgewisseld tussen Ara- en Ara+ populaties. De vingerafdruk van gevoeligheid en resistentie van deze E. coli tegen bepaalde bacteriofagen was ook bedoeld als een ontwerpkenmerk dat de LTEE-populaties kon onderscheiden van veelgebruikte E. coli-laboratoriumstammen die hen zouden kunnen besmetten4. Deze genetische markers zijn echter onbetrouwbaar geworden naarmate het experiment vorderde (sommige populaties vormen bijvoorbeeld geen kolonies meer op TA-agar)10,35. Gelukkig zijn de populaties genetisch uiteengelopen omdat ze tijdens het experiment afzonderlijke evolutionaire geschiedenissen hebben ervaren, waardoor nieuwe genetische markers zijn ontstaan die nu kunnen worden gebruikt om kruisbesmetting te detecteren. Zo heeft elke populatie een unieke combinatie van mutaties in de pykF- en nadR-genen 14,36,37 ontwikkeld. Soms versterken en sequencen we PCR deze twee genen om te testen of kolonies met ongebruikelijke morfologieën of kleuren te wijten zijn aan kruisbesmetting. Aangezien de kosten van whole-genome en whole-population sequencing blijven dalen, kan routinematige sequencing van de LTEE-populaties binnenkort mogelijk zijn, waardoor nieuwe mogelijkheden worden geboden om ze te controleren op tekenen van besmetting.

Wedstrijdconditie meten
Een ander geval waarin de LTEE zijn oorspronkelijke methoden is ontgroeid, is dat de fitheid van de geëvolueerde E. coli in de experimentele omgeving zodanig is toegenomen dat men de fitheid van de populaties van vandaag ten opzichte van hun voorouders niet langer direct kan meten met behulp van het hier beschreven protocol. De geëvolueerde populaties overtreffen de voorouders zodanig dat er na een eendaagse wedstrijd weinig tot geen voorouderkolonies overblijven om te tellen. Een benadering om met dit grote fitnessverschil om te gaan, is door ongelijke startverhoudingen van de stammen te gebruiken, waarbij de initiële volumes worden gewogen die worden gemengd in de richting van de minder fitte concurrent (bijv. 90 μL voorouder en 10 μL geëvolueerde concurrent). Een tweede benadering is om een geëvolueerde Ara-kloon te identificeren die een hogere fitheid heeft dan de LTEE-voorouder, een spontane Ara+ revertantmutant ervan te isoleren door selectie op MA-agar en vervolgens te verifiëren dat de revertantstam dezelfde fitheid heeft als zijn ouder met behulp van een competitietest 6,38. Dit nieuwe Ara−/Ara+ paar kan vervolgens worden gebruikt als een set gemeenschappelijke concurrerende stammen in plaats van REL606/REL607. Idealiter zal de geëvolueerde Ara-kloon die als gemeenschappelijke concurrent is gekozen (en zijn Ara+ revertant) een gemiddelde fitheid hebben ten opzichte van alle soorten die van belang zijn in een experiment. Gedurende de eerste 50.000 generaties van de LTEE leverden deze twee benaderingen (met behulp van ongelijke startverhoudingen of een gemeenschappelijke concurrent) geen significant verschillende fitnessmetingen op ten opzichte van de typische aanpak39.

Deze wijzigingen in het mededingingsprotocol maken bepaalde vereenvoudigende aannames die misschien niet altijd waar zijn. Een daarvan is dat fitnessmetingen transitief zijn. Dat wil zeggen, als we twee populaties elk tegen een gemeenschappelijke concurrerende stam afzonderlijk concurreren, dan kunnen we de relatieve fitheid van de twee populaties ten opzichte van elkaar afleiden. Deze relatie is voor het grootste deel waar gebleken voor de LTEE40, maar niet voor andere experimenten41. Een reden voor deze discrepantie kan de evolutie van negatieve frequentieafhankelijke fitnesseffecten zijn. Deze situatie doet zich voor wanneer stammen geïsoleerd uit twee verschillende afwijkende afstammingslijnen van populatie A−2 van de LTEE tegen elkaar worden geconcurreerd19,42. Elk heeft een voordeel wanneer het zeldzaam is, vanwege kruisvoeding, die hun co-existentie stabiliseert. Sequencinggegevens die het langdurig naast elkaar bestaan van afstammingslijnen met verschillende sets mutaties laten zien, suggereren dat vergelijkbare interacties ook kunnen zijn ontstaan in andere LTEE-populaties14,43, hoewel het niet duidelijk is of ze sterk genoeg zijn om de fitnessschattingen merkbaar te veranderen. Ten slotte betekent de evolutie van aerobe groei op citraat in populatie A−3 van de LTEE32 dat de geschiktheid van deze cellen nu het gebruik van een "privé" bron omvat wanneer ze worden beconcurreerd met cellen die geen citraat kunnen gebruiken, wat de interpretatie van deze resultaten bemoeilijkt. Ondanks deze uitzonderingen heeft het gebruik van een lage glucoseconcentratie en een goed geschudde omgeving ongetwijfeld het maken van fitnessvergelijkingen tussen LTEE-stammen en populaties vereenvoudigd.

Bij latere generaties vormen sommige LTEE-populaties niet langer kolonies op TA-agar, wat het uitvoeren van competitie-experimenten met zelfs gewijzigde protocollen moeilijk of onmogelijk maakt10. Alternatieve methoden die geen koloniegroei vereisen, kunnen mogelijk worden gebruikt om de relatieve representatie van twee concurrenten te bepalen, zoals FREQ-seq die next-generation sequencing gebruikt om het aandeel reads te tellen dat twee alternatieve allelen bevat in een amplicon44. Deze methode of een soortgelijke methode kan mogelijk worden gebruikt met de Ara-allelen of met nieuw geëvolueerde mutaties, zoals die in pykF en nadR, versus de voorouderlijke sequentie. Het uitvoeren van genetische modificaties die andere soorten neutrale markers introduceren, kan ook worden gebruikt om de relatieve fitheid te meten. Fluorescerende eiwitgenen zijn bijvoorbeeld ingebracht in de chromosomen van cellen in LTEE-uitloperexperimenten, zodat concurrenten kunnen worden geteld met behulp van flowcytometrie45. Een andere benadering, die de mogelijkheid opent om meer dan twee stammen in dezelfde concurrentiekolf te mengen, is het invoegen van barcodes die PCR-versterkt en gesequenced kunnen worden in de genomen van verschillende concurrenten. Deze benadering is gebruikt voor het traceren van afstammingslijnen in evolutie-experimenten46. Zowel flowcytometrie als barcodesequencing kunnen nauwkeurig veel extremere verhoudingen van twee stammen versus kolonietelling meten (omdat ze > 10.000 cellen / genomen kunnen bevragen versus de < 500 die op een agarplaat kunnen worden geteld), dus het gebruik van deze methoden belooft ook het dynamische bereik te vergroten in termen van fitnessverschillen die kunnen worden gemeten ten opzichte van een gemeenschappelijke concurrent.

Alternatieve ontwerpen voor langetermijnexperimenten met microbiële evolutie
Ondanks al zijn deugden is de LTEE niet perfect. Bepaalde aspecten van het ontwerp maken het arbeidsintensief en vatbaar voor menselijke fouten. Zo moet er elke dag een onderzoeker in het lab komen en pipetten tussen Erlenmeyers om het experiment voort te zetten. Concurrentie-experimenten kunnen ook ontmoedigende logistieke hindernissen opleveren, aangezien de vereisten voor steriel glaswerk, media, incubatorruimte en kolonietelling snel escaleren wanneer zelfs een klein aantal concurrenten wordt getest met bescheiden replicatie. We krijgen vaak de vraag waarom we geen gebruik maken van laboratoriumautomatiseringssystemen, zoals pipetteerrobots die werken op 96-well microplates, of continue kweeksystemen, zoals chemostaten of turbidostaten. Het antwoord is simpel: de LTEE is in zekere zin een gevangene van zijn eigen lange geschiedenis. We durven niet af te wijken van 10 ml culturen die met een bepaalde snelheid schudden in erlenmeyers van 50 ml, omdat dit het experiment fundamenteel zou kunnen veranderen. Subtiele aspecten van de omgeving waaraan deze populaties zich al tientallen jaren aanpassen (bijvoorbeeld de hoeveelheid beluchting), zouden worden veranderd in microplaten of continue kweeksystemen. Het populatieknelpunt bij elke overdracht kan ook anders zijn (kleiner in microplaten, bijvoorbeeld), waardoor de evolutionaire dynamiek verandert. Kortom, afwijken van de hier beschreven methoden zou de LTEE een ander experiment maken, of op zijn minst het risico lopen een discontinuïteit te introduceren die evolutionaire trajecten zou verstoren.

Onderzoekers die nieuwe evolutie-experimenten ontwerpen, moeten deze andere manieren overwegen om microbiële populaties te verspreiden, terwijl ze zich bewust zijn van hun potentiële voor- en nadelen. Het gebruik van pipetteerrobots om populaties in microwell-platen over te brengen is in sommige opzichten logistiek eenvoudiger en kan behoorlijk krachtig zijn vanwege de grote aantallen replicerende populaties die op deze manier kunnen worden gepropageerd47,48,49. Geautomatiseerde overdrachten in de meeste huidige opstellingen vinden echter niet plaats onder volledig steriele omstandigheden, wat de kans op besmetting van buitenaf vergroot. Om besmetting te voorkomen, wordt het groeimedium vaak aangevuld met antibiotica, die een kenmerk van de omgeving worden dat de evolutie beïnvloedt. Transfers in microwell-platen zijn ook gevoeliger voor kruisbesmettingsgebeurtenissen. Ten slotte heeft de omgeving van microwell-platen - vooral als ze niet worden geschud - de neiging om te selecteren op wandgroei, aggregatie en andere verschijnselen die de evolutie kunnen bemoeilijken door meerdere nissen in één put te creëren. Het gebruik van rijke media of hoge concentraties voedingsstoffen om de populatiegrootte groot te houden in kleine putten zal deze complexiteit waarschijnlijk verergeren. Als dergelijke interacties zich voordoen, kunnen ze het meten en interpreteren van fitness veel moeilijker maken.

Continue kweeksystemen voor microbiële evolutie omvatten chemostaten, waarbij vers medium constant wordt ingepompt en cultuur wordt weggepompt, en turbidostaten, waarin culturen periodiek worden verdund door geautomatiseerde detectie en pompen om cellen in een staat van constante groei te houden. Deze systemen zijn erg handig wanneer men microbiële fysiologie en evolutie wil modelleren, omdat ze voorkomen dat microben overgaan tussen groei en uithongering door ze in een omgeving te houden die altijd voedingsstoffen bevat50. Men kan zelfs sensoren toevoegen die real-time metingen doen van optische dichtheid, O2-verbruik, pH en andere aspecten van de omgeving en groei van een cultuur. De huidige continue kweeksystemen vereisen echter dure apparatuuraankopen of gespecialiseerde expertise om aangepaste opstellingen te bouwen51,52,53,54. Ook wandgroei, waarbij cellen aan verdunning ontsnappen door zich aan de kweekkamer te hechten, beschimpt de evolutionaire dynamiek in continue kweeksystemen, tenzij ze periodiek worden gesteriliseerd. Vanwege deze beperkingen waren de meeste chemostaat- en turbidostat-evolutie-experimenten tot nu toe van beperkte duur en / of betroffen ze relatief weinig onafhankelijk evoluerende populaties in vergelijking met experimenten met seriële overdrachtsevolutie.

Conclusie
De methoden die we hier demonstreren voor de LTEE zijn van cruciaal belang voor het bestuderen van zijn unieke historische record en het voortzetten van de open evolutie van deze E. coli-populaties. Ze bieden ook een startpunt voor anderen die nieuwe evolutie-experimenten overwegen die kunnen profiteren van laboratoriumautomatisering of verschillende elementen van de complexiteit kunnen toevoegen die te vinden zijn in natuurlijke omgevingen die doelbewust uit de LTEE zijn weggelaten. Sinds 1988 bloeit de experimentele evolutie als vakgebied. Gedurende deze tijd hebben onderzoekers in laboratoria over de hele wereld de immense flexibiliteit van deze aanpak aangetoond voor het bestuderen van evolutie, innoveren door creatieve experimentele ontwerpen te introduceren en de resultaten te volgen met behulp van nieuwe technologieën. De methoden van de LTEE vertegenwoordigen geen eindpunt, maar we hopen dat ze tot ver in de toekomst zullen blijven inspireren en een basis zullen bieden voor het veld.

Disclosures

Geen belangenconflicten aangegeven.

Acknowledgments

We danken Richard Lenski en de vele onderzoekers die het Long-Term Evolution Experiment met E. coli hebben bestudeerd en eraan hebben bijgedragen, waaronder vooral Neerja Hajela. De LTEE wordt momenteel ondersteund door de National Science Foundation (DEB-1951307).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich T8877
20 mL Glass Beaker Sigma-Aldrich CLS100020
50 mL Erlenmeyer Flasks Sigma-Aldrich CLS498050
Agar Sigma-Aldrich A1296
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich AX1385
Antifoam Sigma-Aldrich A5757
Arabinose Sigma-Aldrich A3256
Freezer Box (2") VWR 82007-142
Freezer Box (3") VWR 82007-144
Freezer Box Cell Divider (49-place) VWR 82007-150
Freezer Box Cell Divider (81-place) VWR 82007-154
Freezer Vials (1/2-Dram) VWR  66009-816 
Freezer Vials (2-Dram) VWR  66010-560 
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Glycerol Fisher Scientific G33
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich M7506
Metal Tray Winco SPJP-202
Petri Dish Fisher Scientific FB0875712
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate Sigma-Aldrich P5504
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P5379
Sodium Chloride Sigma-Aldrich M7506
Sodium Citrate Tribasic Dihydrate Sigma-Aldrich C7254
Test Tube Cap (18mm) VWR 10200-142
Test Tube Rack (18mm, steel) Adamas-Beta N/A Test Tube Racks Stainless Steel Grid Arrangement 72 Holes (17-19 mm)
Test Tubes (18 x 150 mm) VWR 47729-583
Thiamine, Hydrochloride Millipore 5871
Tryptone Gibco 211705
Yeast Extract Gibco 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and divergence during 2,000 generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
  2. Fox, J. W., Lenski, R. E. From here to eternity-the theory and practice of a really long experiment. PLoS Biology. 13 (6), e1002185 (2015).
  3. Daegelen, P., Studier, F. W., Lenski, R. E., Cure, S., Kim, J. F. Tracing ancestors and relatives of Escherichia coli B, and the derivation of B strains REL606 and BL21(DE3). Journal of Molecular Biology. 394 (4), 634-643 (2009).
  4. Studier, F. W., Daegelen, P., Lenski, R. E., Maslov, S., Kim, J. F. Understanding the differences between genome sequences of Escherichia coli B strains REL606 and BL21(DE3) and comparison of the E. coli B and K-12 genomes. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 653-680 (2009).
  5. Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
  6. Lenski, R. E. Experimental studies of pleiotropy and epistasis in Escherichia coli. II. Compensation for maladaptive pleiotropic effects associated with resistance to virus T4. Evolution. 42 (3), 425-432 (1988).
  7. Calcott, P. H., Gargett, A. M. Mutagenicity of freezing and thawing. FEMS Microbiology Letters. 10 (2), 151-155 (1981).
  8. Lenski, R. E., Travisano, M. Dynamics of adaptation and diversification: a 10,000-generation experiment with bacterial populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (15), 6808-6814 (1994).
  9. Wiser, M. J., Ribeck, N., Lenski, R. E. Long-term dynamics of adaptation in asexual populations. Science. 342 (6164), New York, N.Y. 1364-1367 (2013).
  10. Lenski, R. E., et al. Sustained fitness gains and variability in fitness trajectories in the long-term evolution experiment with Escherichia coli. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 282 (1821), 20152292 (2015).
  11. Barrick, J. E., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  12. Blount, Z. D., Barrick, J. E., Davidson, C. J., Lenski, R. E. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population. Nature. 489 (7417), 513-518 (2012).
  13. Tenaillon, O., et al. Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment. Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).
  14. Good, B. H., McDonald, M. J., Barrick, J. E., Lenski, R. E., Desai, M. M. The dynamics of molecular evolution over 60,000 generations. Nature. 551 (7678), 45-50 (2017).
  15. Consuegra, J., et al. Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria. Nature Communications. 12 (1), 980-980 (2021).
  16. Cooper, T. F., Rozen, D. E., Lenski, R. E. Parallel changes in gene expression after 20,000 generations of evolution in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (3), 1072-1077 (2003).
  17. Favate, J. S., Liang, S., Cope, A. L., Yadavalli, S. S., Shah, P. The landscape of transcriptional and translational changes over 22 years of bacterial adaptation. eLife. 11, e81979 (2022).
  18. Khan, A. I., Dinh, D. M., Schneider, D., Lenski, R. E., Cooper, T. F. Negative epistasis between beneficial mutations in an evolving bacterial population. Science. 332 (6034), 1193-1196 (2011).
  19. Plucain, J., et al. Epistasis and allele specificity in the emergence of a stable polymorphism in Escherichia coli. Science. 343 (6177), 1366-1369 (2014).
  20. Quandt, E. M., Deatherage, D. E., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Recursive genomewide recombination and sequencing reveals a key refinement step in the evolution of a metabolic innovation in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2217-2222 (2014).
  21. Leon, D., D'Alton, S., Quandt, E. M., Barrick, J. E. Innovation in an E. coli evolution experiment is contingent on maintaining adaptive potential until competition subsides. PLoS Genetics. 14 (4), e1007348 (2018).
  22. Bennett, A. F., Lenski, R. E., Mittler, J. E. Evolutionary adaptation to temperature. I. Fitness responses of Escherichia coli to changes in its thermal environment. Evolution. 46 (1), 16-30 (1992).
  23. Kibota, T. T., Lynch, M. Estimate of the genomic mutation rate deleterious to overall fitness in E. coli. Nature. 381 (6584), 694-696 (1996).
  24. Friesen, M. L., Saxer, G., Travisano, M., Doebeli, M. Experimental evidence for sympatric ecological diversification due to frequency-dependent competition in Escherichia coli. Evolution. 58 (2), 245-260 (2004).
  25. Cooper, T. F. Recombination speeds adaptation by reducing competition between beneficial mutations in populations of Escherichia coli. PLoS Biology. 5 (9), e225 (2007).
  26. Cooper, T. F., Lenski, R. E. Experimental evolution with E. coli in diverse resource environments. I. Fluctuating environments promote divergence of replicate populations. BMC Evolutionary Biology. 10, 11 (2010).
  27. Quan, S., et al. Adaptive evolution of the lactose utilization network in experimentally evolved populations of Escherichia coli. PLoS Genetics. 8 (1), e1002444 (2012).
  28. Deatherage, D. E., Kepner, J. L., Bennett, A. F., Lenski, R. E., Barrick, J. E. Specificity of genome evolution in experimental populations of Escherichia coli evolved at different temperatures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), E1904-E1912 (2017).
  29. Izutsu, M., Lake, D. M., Matson, Z. W. D., Dodson, J. P., Lenski, R. E. Effects of periodic bottlenecks on the dynamics of adaptive evolution in microbial populations. BioRixv. , 4457 (2021).
  30. Chavarria-Palma, J. E., Blount, Z. D., Barrick, J. E. LTEE Media Recipes. , (2022).
  31. Barrick, J. E., Lake, D. M. fitnessR: fitnessR-v1.0.0. barricklab. , (2023).
  32. Blount, Z. D., Borland, C. Z., Lenski, R. E. Historical contingency and the evolution of a key innovation in an experimental population of Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (23), 7899-7906 (2008).
  33. Grant, N. A., Magid, A. A., Franklin, J., Dufour, Y., Lenski, R. E. Changes in cell size and shape during 50,000 generations of experimental evolution with Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 203 (10), 22 (2021).
  34. Wickham, H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. , Springer-Verlag. New York. (2016).
  35. Meyer, J. R., et al. Parallel changes in host resistance to viral infection during 45,000 generations of relaxed selection. Evolution. 64 (10), 3024-3034 (2010).
  36. Woods, R., Schneider, D., Winkworth, C. L., Riley, M. A., Lenski, R. E. Tests of parallel molecular evolution in a long-term experiment with Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (24), 9107-9712 (2006).
  37. Barrick, J. E., Deatherage, D. E., D'Alton, S. LTEE-Ecoli: genomics resources for the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. , Available from: https://github.com/barricklab/LTEE-Ecoli (2022).
  38. Izutsu, M., Lenski, R. E. Experimental test of the contributions of initial variation and new mutations to adaptive evolution in a novel environment. Frontiers in Ecology and Evolution. 10, 958406 (2022).
  39. Wiser, M. J., Lenski, R. E. A comparison of methods to measure fitness in Escherichia coli. PLoS One. 10 (5), 0126210 (2015).
  40. de Visser, J. A. G. M., Lenski, R. E. Long-term experimental evolution in Escherichia coli. XI. Rejection of non-transitive interactions as cause of declining rate of adaptation. BMC Evolutionary Biology. 2 (1), 19 (2002).
  41. Paquin, C. E., Adams, J. Relative fitness can decrease in evolving asexual populations of S. cerevisiae. Nature. 306 (5941), 368-371 (1983).
  42. Rozen, D. E., Lenski, R. E. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. VIII. Dynamics of a balanced polymorphism. The American Naturalist. 155 (1), 24-35 (2000).
  43. Quandt, E. M., Gollihar, J., Blount, Z. D., Ellington, A. D., Georgiou, G., Barrick, J. E. Fine-tuning citrate synthase flux potentiates and refines metabolic innovation in the Lenski evolution experiment. eLife. 4, e09696 (2015).
  44. Chubiz, L. M., Lee, M. -C., Delaney, N. F., Marx, C. J. FREQ-Seq: a rapid, cost-effective, sequencing-based method to determine allele frequencies directly from mixed populations. PLoS One. 7 (10), e47959 (2012).
  45. Gallet, R., Cooper, T. F., Elena, S. F., Lenormand, T. Measuring selection coefficients below 10-3: method, questions, and prospects. Genetics. 190 (1), 175-186 (2012).
  46. Levy, S. F., et al. Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking. Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).
  47. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic variation and the fate of beneficial mutations in asexual populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  48. Frenkel, E. M., et al. Crowded growth leads to the spontaneous evolution of semistable coexistence in laboratory yeast populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (36), 11306-11311 (2015).
  49. Jordt, H., et al. Coevolution of host-plasmid pairs facilitates the emergence of novel multidrug resistance. Nature Ecology and Evolution. 4 (6), 863-869 (2020).
  50. Gresham, D., Dunham, M. J. The enduring utility of continuous culturing in experimental evolution. Genomics. 104 (6), 399-405 (2014).
  51. Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and use of multiplexed chemostat arrays). Journal of Visualized Experiments. (72), e50262 (2013).
  52. Toprak, E., et al. Building a morbidostat: an automated continuous-culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocols. 8 (3), 555-567 (2013).
  53. Wong, B. G., Mancuso, C. P., Kiriakov, S., Bashor, C. J., Khalil, A. S. Precise, automated control of conditions for high-throughput growth of yeast and bacteria with eVOLVER. Nature Biotechnology. 36 (7), 614-623 (2018).
  54. Ekkers, D. M., Branco Dos Santos, F., Mallon, C. A., Bruggeman, F., Van Doorn, G. S. The omnistat: A flexible continuous-culture system for prolonged experimental evolution. Methods in Ecology and Evolution. 11 (8), 932-942 (2020).

Tags

Genetica Nummer 198
Dagelijkse overdrachten, archivering van populaties en het meten van fitness in het langetermijnevolutie-experiment met <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, … More

Barrick, J. E., Blount, Z. D., Lake, D. M., Dwenger, J. H., Chavarria-Palma, J. E., Izutsu, M., Wiser, M. J. Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli. J. Vis. Exp. (198), e65342, doi:10.3791/65342 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter