Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

نورموذرميك خارج الجسم الحي آلة الكبد التروية في الماوس

Published: September 25, 2023 doi: 10.3791/65363
Automatic Translation
1, 2, 1,3, 1, 1
1Experimental Transplantation Surgery, Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz GmbH, 3Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Menoufia University

Summary

تم إنشاء نظام نضح الكبد خارج الجسم الحي (NEVLP) لكبد الفئران. يتطلب هذا النظام خبرة في الجراحة المجهرية ولكنه يسمح بنتائج نضح قابلة للتكرار. تسهل القدرة على استخدام كبد الفأر التحقيق في المسارات الجزيئية لتحديد إضافات الفوسات الجديدة وتمكن من تنفيذ التجارب التي تركز على إصلاح الأعضاء.

Abstract

يقدم هذا البروتوكول نظام NEVLP الخالي من كريات الدم الحمراء باستخدام كبد الفأر. تم تحقيق الحفاظ على كبد الفأر خارج الجسم الحي من خلال استخدام قنيات معدلة وتقنيات مقتبسة من معدات التروية التجارية التقليدية خارج الجسم الحي. تم استخدام النظام لتقييم نتائج الحفظ بعد 12 ساعة من التروية. عملت الفئران C57BL / 6J كمتبرعين بالكبد ، وتم زرع الكبد عن طريق قنية الوريد البابي (PV) والقناة الصفراوية (BD) ، وبعد ذلك غسل العضو بمحلول ملحي دافئ (37 درجة مئوية). بعد ذلك ، تم نقل الكبد المزروع إلى غرفة التروية وإخضاعه للنضح الآلي المؤكسج الطبيعي الحرارة (NEVLP). تم جمع عينات المدخل والمخرج على فترات 3 ساعات لتحليل البيروسات. عند الانتهاء من التروية ، تم الحصول على عينات من الكبد للتحليل النسيجي ، مع تقييم السلامة المورفولوجية باستخدام سوزوكي سكور المعدل من خلال تلطيخ الهيماتوكسيلين-إيوسين (HE). أسفرت تجارب التحسين عن النتائج التالية: (1) اعتبرت الفئران التي يزيد وزنها عن 30 جراما أكثر ملاءمة للتجربة بسبب الحجم الأكبر للقناة الصفراوية (BD). (2) كانت قنية البولي يوريثين 2 Fr (القطر الخارجي = 0.66 مم) أكثر ملاءمة لقنية الوريد البابي (PV) عند مقارنتها بقنية البولي بروبلين. ويعزى ذلك إلى القبضة المعززة لمادة البولي يوريثين ، مما أدى إلى تقليل انزلاق القسطرة أثناء النقل من الجسم إلى غرفة الأعضاء. (3) لقنية القناة الصفراوية (BD) ، تم العثور على قنية 1 Fr (القطر الخارجي = 0.33 مم) من مادة البولي يوريثين لتكون أكثر فعالية مقارنة بقنية البولي بروبلين UT - 03 (القطر الخارجي = 0.30 مم). مع هذا البروتوكول الأمثل ، تم الحفاظ على كبد الفأر بنجاح لمدة 12 ساعة دون تأثير كبير على البنية النسيجية. كشف تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوسين (HE) عن بنية مورفولوجية محفوظة جيدا للكبد ، تتميز بخلايا كبدية قابلة للحياة في الغالب مع نوى مرئية بوضوح وتمدد خفيف للجيوب الأنفية الكبدية.

Introduction

تمثل زراعة الكبد العلاج القياسي الذهبي للأفراد المصابين بأمراض الكبد في المرحلة النهائية. ومما يؤسف له أن الطلب على الأعضاء المانحة يتجاوز العرض المتاح، مما يؤدي إلى نقص كبير. في عام 2021 ، كان ما يقرب من 24,936 مريضا على قائمة الانتظار للحصول على ترقيع الكبد ، بينما تم إجراء 9,234 عملية زرع فقط بنجاح1. يسلط التفاوت الكبير بين العرض والطلب على ترقيع الكبد الضوء على الضرورة الملحة للتحقيق في استراتيجيات بديلة لتوسيع مجموعة المانحين وتعزيز إمكانية الوصول إلى ترقيع الكبد. تتمثل إحدى طرق توسيع مجموعة المانحين في استخدام المانحينالهامشيين 2. يشمل المتبرعون الهامشيون أولئك الذين يعانون من تقدم العمر أو التنكس الدهني المعتدل أو الشديد. على الرغم من أن زرع الأعضاء الهامشية قد يؤدي إلى نتائج إيجابية ، إلا أن النتائج الإجمالية تظل دون المستوى الأمثل. ونتيجة لذلك ، يجري حاليا تطوير استراتيجيات علاجية تهدف إلى تعزيز وظيفة المانحين الهامشيين 3,4.

تتمثل إحدى الاستراتيجيات في استخدام التروية الآلية ، وخاصة التروية الآلية المؤكسجة ذات الحرارة العادية ، لتحسين وظيفة هذه الأعضاء الهامشية5. ومع ذلك ، لا يزال هناك فهم محدود للآليات الجزيئية التي تكمن وراء الآثار المفيدة للنضح الآلي المؤكسج الطبيعي الحرارة (NEVLP). الفئران ، مع توافرها الوفير من السلالات المعدلة وراثيا ، بمثابة نماذج قيمة للتحقيق في المسارات الجزيئية. على سبيل المثال ، تم التعرف بشكل متزايد على أهمية مسارات الالتهام الذاتي في التخفيف من إصابة نقص التروية الكبدية 6,7. أحد المسارات الجزيئية المهمة في إصابة نقص التروية الكبدية هو مسار miR-20b-5p / ATG78. حاليا ، هناك عدد من سلالات ATG بالضربة القاضية والضربة القاضية الشرطية المتاحة ولكن لا توجد سلالات الفئران المقابلة9.

بناء على هذه الخلفية ، كان الهدف هو إنشاء منصة NEVLP مصغرة لترقيع كبد الفئران. ستسهل هذه المنصة استكشاف وتقييم الاستراتيجيات المعدلة وراثيا المحتملة التي تهدف إلى تحسين وظائف كبد المتبرع. بالإضافة إلى ذلك ، كان من الضروري أن يكون النظام مناسبا للتروية على المدى الطويل ، مما يتيح العلاج خارج الجسم الحي للكبد ، والذي يشار إليه عادة باسم "إصلاح الأعضاء".

بالنظر إلى محدودية توافر البيانات ذات الصلة في المختبر حول نضح كبد الفئران ، ركزت مراجعة الأدبيات على الدراسات التي أجريت على الفئران. تم إجراء بحث منهجي للأدبيات يمتد من عام 2010 إلى عام 2022 باستخدام كلمات رئيسية مثل "نضح الكبد الطبيعي الحرارة" و "خارج الجسم الحي أو في المختبر" و "الفئران". يهدف هذا البحث إلى تحديد الظروف المثلى في القوارض ، مما يسمح لنا بتحديد النهج الأنسب.

يتكون نظام الإرواء من خزان عازل زجاجي مغلق مغلف بالماء ، ومضخة أسطوانية تمعجية ، وأكسجين ، ومصيدة فقاعات ، ومبادل حراري ، وغرفة عضو ، ونظام أنابيب ركوب دراجات مغلق (الشكل 1). يضمن النظام الصيانة الدقيقة لدرجة حرارة التروية الثابتة التي تبلغ 37 درجة مئوية باستخدام آلة ثابتة حراري مخصصة. تدفع المضخة الدوارة التمعجية تدفق البيرفوسات في جميع أنحاء الدائرة. تبدأ دائرة التروية في الخزان المعزول المغلف بالماء. بعد ذلك ، يتم توجيه perfusate من خلال جهاز الأكسجين ، الذي يتلقى خليط غاز من 95 ٪ من الأكسجين و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون من زجاجة غاز مخصصة. بعد الأوكسجين ، يمر البيروزيت عبر مصيدة الفقاعات ، حيث يتم إعادة توجيه أي فقاعات محاصرة مرة أخرى إلى الخزان بواسطة المضخة التمعجية. يتدفق البيرفوسات المتبقي عبر المبادل الحراري ويدخل غرفة العضو ، حيث يعود إلى الخزان.

هنا ، نبلغ عن تجاربنا في إنشاء NEVLP لكبد الفئران ونشارك النتائج الواعدة لتجربة تجريبية أجريت باستخدام الوسط المؤكسج بدون حاملات الأكسجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء التجارب على الحيوانات وفقا للوائح والمبادئ التوجيهية الألمانية الحالية لرعاية الحيوان وإرشادات REACH للإبلاغ عن الأبحاث الحيوانية. تمت الموافقة على بروتوكول التجارب على الحيوانات من قبل Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz ، تورينجيا ، ألمانيا (رقم الموافقة: UKJ - 17 - 106).

ملاحظة: تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J التي تزن 34 ± 4 جم (متوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط [SEM]) كمتبرعين بالكبد. تم الحفاظ عليها في ظل ظروف بيئية خاضعة للرقابة (50٪ رطوبة و 18-23 درجة مئوية) مع حرية الوصول إلى الفأر القياسي والماء. طوال العملية الجراحية ، تم الحفاظ على معدل تنفس يتجاوز 60 نفسا / دقيقة ، وتم الحفاظ على درجة حرارة الجسم أعلى من 34 درجة مئوية.

1. التحضير

  1. إعداد جدول العمليات
    1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والمواد الاستهلاكية لأغراض التعقيم.
    2. قم بتشغيل جميع المعدات ، بما في ذلك لوحة الاحترار والتخثير الكهربائي.
    3. ضع حقنة واحدة سعة 50 مل مع محلول ملحي 25 مل من الهيبارين (2500 وحدة / لتر) في حاضنة دافئة (37 درجة مئوية).
    4. ضع الأدوات الجراحية ، وخياطة الحرير 6-0 ، وقضيب القطن الصغير المعقم ، والمحلول الملحي البيطري (500 مل) ، وإسفنج الشاش غير المنسوج (10 سم × 10 سم) على طاولة العمليات بشكل مناسب.
    5. ضع إبرة 26 جيجا على طاولة العمليات لإنشاء ثقب صغير في غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 0.5 مل لاستقبال الأنبوب الصفراوي لجمع الصفراء.
    6. ضع القنية (1 قنية بولي يوريثين Fr أو UT - 03 قنية بولي إيثيلين) وأنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 0.5 مل لجمع الصفراء على طاولة العمليات.
  2. قنية الوريد البابي عصامي
    1. امسك قنية 2 Fr بالملقط وثقب الجدار بإبرة 30 جم على مسافة 1 سم من نهاية القنية. ادفع الإبرة عبر القنية حتى يصبح طرف الإبرة مرئيا.
    2. تقليم طرف القنية مما يؤدي إلى مثلث حاد.
  3. تحضير محلول ملحي هيبارين
    1. تحضير 25 مل من محلول ملحي هيبارين بتركيز نهائي 2500 وحدة دولية / مل.
    2. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء ووضع المحقنة في حاضنة 40 درجة مئوية.
  4. مظاهرة من نظام التروية
    1. انظر الشكل 1 لمعرفة المكونات الرئيسية لنظام نضح الماكينة.
  5. إعداد غرفة الجهاز
    1. انظر الشكل 2 لتخطيط حجرة الأرغن.
  6. إعداد نظام التروية
    1. قم بتشغيل برنامج مخطط المختبر لمراقبة الضغط.
    2. قم بتوصيل معاير الضغط ومستشعر الضغط على مستوى غرفة الجهاز.
    3. اضبط معاير الضغط لقراءة 0 مم زئبق وتحقق من القيمة المقابلة في برنامج التحكم في الضغط.
    4. اضبط معاير الضغط لقراءة 20 مم زئبق وتحقق مرة أخرى من القيمة المقابلة في برنامج التحكم في الضغط.
    5. قم بتشغيل الحمام المائي ، وقم بتسخين حجرة العضو إلى 40 درجة مئوية.
    6. اغسل نظام السباكة بالكامل مرتين بالماء المقطر منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة لكل منهما ، مما يضمن الإزالة الكاملة لمحلول التعقيم.
    7. ابدأ في تداول محلول التطهير في جميع أنحاء النظام بأكمله لمدة 20 دقيقة لضمان التطهير الشامل.
    8. قم بتشغيل خليط الغاز (95٪ أكسجين (O 2) و 5٪ ثاني أكسيد الكربون (CO2).
  7. ملء البيرفوسات
    1. مكمل 250 مل من وسط ويليامز E مع 50 مل من مصل الجنين البقري ، و 3 مل من البنسلين / الستربتومايسين (1 مجم / مل) ، و 0.17 مل من الأنسولين (100 IE / mL) ، و 0.34 مل من الهيبارين (5000 وحدة / مل) ، و 0.07 مل من الهيدروكورتيزون (100 مجم / 2 مل) لإعداد وسط Williams 'E الكامل.
    2. أضف كميات متساوية (150 مل) من البيرفوسات إلى الخزان وغرفة الجهاز لتجهيز النظام.
      ملاحظة: يجب إيلاء اهتمام خاص للحفاظ على العقم أثناء عملية التعبئة. يتم ضخ البيرفوسات باستمرار من خلال هذين المكونين الرئيسيين لنضح آلة إعادة التدوير المغلقة.
    3. قم بتشغيل المضخة التمعجية بسرعة متوسطة (15 مل / دقيقة) لتجهيز نظام التروية بالوسط المؤكسج.

2. زرع الكبد

  1. التحضير قبل الجراحة
    1. وزن الحيوان. تحضير البوبرينورفين المسكن (0.3 مجم / مل) (0.05 مجم / كجم من وزن الجسم).
    2. قم بتوصيل غرفة الحث بمقبس الحائط. تحويل الأكسجين إلى 0.5 لتر / دقيقة. بدوره إيزوفلوران إلى 3 ٪.
    3. ضع الحيوان في الغرفة حتى يتم الوصول إلى التخدير العميق (تصحيح رد الفعل الإيجابي).
    4. استخدم حقنة صغيرة لتطبيق جرعة متكيفة مع وزن الجسم من التسكين تحت الجلد.
    5. استخدم ماكينة حلاقة كهربائية لتقليم الفراء على جلد البطن.
    6. انقل الماوس إلى طاولة العمليات وقم بتشغيل مبخر الأيزوفلوران إلى 2.5٪ للحفاظ على التخدير. تأكد من عمق التخدير عن طريق اختبار منعكس إصبع القدم بين الأصابع.
  2. إعداد بطن الفأر
    1. ضع الماوس في وضع ضعيف.
    2. اختبر المنعكس بين الأصابع لمضاعفة تأكيد عمق التخدير المناسب. إصلاح جميع الأطراف الأربعة مع الشريط.
    3. تطهير جانبي البطن إلى خط منتصف الإبط باستخدام ثلاث جولات متتالية من كحول اليود. استخدم شاشا معقم غير منسوج لتغطية المنطقة المحيطة بالمجال الجراحي.
    4. قم بعمل شق عرضي 3 سم 1 سم تحت الخنجري في منطقة البطن من الفأر باستخدام مقص الأطفال Metzenbaum والملقط الجراحي.
    5. قم بتمديد شق الجلد بشكل ثنائي إلى خط منتصف الإبط على كلا الجانبين.
    6. قم بعمل شق طولي بطول 2 سم بعناية على طول خط ألبا باستخدام مقص الربيع.
    7. قطع من خلال طبقة العضلات في البطن مع التخثير الكهربائي ومقص الربيع فاناس.
    8. ضع بعناية قطعة من الشاش الرطب لحماية الكبد من التخثير الكهربائي.
    9. استخدم خياطة حريرية 6-0 مع الإبرة المستديرة لسحب عملية الخنجري من أجل تعرض أفضل للرباط التاجي.
    10. استخدم اثنين من مبعدات الأضلاع لفضح تجويف البطن للفأر بالكامل.
    11. حرك الأمعاء الدقيقة بعناية من تجويف البطن باستخدام قطعة قطن مبللة لفضح الهيلوم بالكامل.
  3. إعداد القناة الصفراوية المشتركة
    1. قم بتحويل الأربطة المنجلية والفرينية والمعدية الكبدية بمقص حاد.
    2. حرر القناة الصفراوية المشتركة بعناية باستخدام ملقط منحني ناعم بدون أسنان.
      ملاحظة: القناة الصفراوية المشتركة تتلف بسهولة وتتكسر. بمجرد أن ينكسر ، لا يمكن تقليبه. بسبب اتجاه الموضع التشريحي ، من الأفضل استخدام الملقط المنحني.
    3. ضع حلقتين من الحرير 6 - 0 فوق القناة الصفراوية المشتركة استعدادا للخطوة التالية.
  4. قنية القناة الصفراوية الشائعة
    1. ثقب بعناية القناة الصفراوية بإبرة 30 غرام. استخدم ملقط منحني مدبب لتكبير الفتحة الصغيرة لتناسب قنية القناة الصفراوية.
    2. استخدم ملقط قنية الأوعية الدموية للإمساك بقنية القناة الصفراوية ودفعها إلى القناة الصفراوية.
    3. قم بتأمين القنية مرتين باستخدام حلقات خياطة 6-0 المحددة مسبقا.
      ملاحظة: أثناء القنية ، يتم الشعور بمقاومة الصفراء. إذا لم يتم التحكم في القوة بشكل جيد ، دفع القنية خارج القناة الصفراوية عن طريق ضغط تدفق الصفراء. ضبط بعناية عمق القنية. إذا كان عميقا جدا ، فقد يؤدي إلى تلف القناة الصفراوية ، وإذا لم يكن عميقا بدرجة كافية ، فقد ينزلق.
    4. مراقبة تدفق الصفراء في القنية بعد القنية الناجحة.
  5. إعداد الوريد البابي
    1. قم بتثبيت الوريد البابي بالملقط المسطح وحرر النسيج الضام بعناية باستخدام ملقط منحني. لا تسحب بقوة لتجنب التسبب في تمزق الوريد البابي. بمجرد تلف الوريد البابي ، من الصعب إعادة تقليب الوريد البابي.
    2. تشريح PV فقط أعلى من التشعب ووضع حلقة خياطة الأولى باستخدام 6-0 خياطة الحرير على PV بالقرب من التقاء لاستخدامها لاحقا.
    3. ضع حلقة الخياطة الثانية للتثبيت اللاحق لل PV بالقرب من الهيلوم الكبدي قدر الإمكان.
  6. قنية الوريد البابي
    1. استخدم مشبكا شريانيا لإغلاق الوريد البابي البعيد.
    2. بعناية فائقة ، ثقب الوريد البابي بأحد قنيات الوريد البابي أعلاه. يمكن ملاحظة تدفق الدم بوضوح داخل القنية بعد ثقب ناجح.
    3. قم بتأمين القنية الكهروضوئية بحلقة خياطة 6-0 الموضوعة مسبقا.
  7. احمرار الكبد
    1. زيادة الأيزوفلوران إلى 5 ٪ والقتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة من استنشاق الأيزوفلوران.
    2. خذ محلول ملحي من الهيبارين من الحاضنة. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء المتكونة داخل محلول ملحي هيبارين.
    3. ثبت المحقنة بمحلول ملحي مسخن مسبقا في مضخة المحقنة.
    4. قم بتوصيل أنبوب تمديد مضخة المحقنة بقنية الوريد البابي ، واضبط السرعة على 2 مل / دقيقة ، وابدأ في تنظيف الكبد.
    5. راقب لون الكبد في نهاية عملية التنظيف. استأصل الكبد بمجرد أن يتحول اللون إلى أصفر متجانس.
    6. عبر الحجاب الحاجز ، الوريد الأجوف السفلي فوق الكبدي ، الوريد الأجوف تحت الكبدي ، الشريان الكبدي ، الوريد البابي البعيد ، وأي نسيج ضام متبقي.
    7. ضع الكبد في طبق بتري.

3. اتصال الكبد والغرفة

  1. نقل الكبد
    1. نقل الكبد بعناية إلى غرفة الجهاز باستخدام طبق بتري.
    2. احتفظ بكمية صغيرة من المحلول الملحي في طبق بتري لمنع جفاف الكبد.
      ملاحظة: يمكن بسهولة التواء الوريد البابي والقناة الصفراوية أثناء هذا الإجراء ، مما قد يؤثر على تروية الكبد وجمع الصفراء.
  2. اتصال قنية الوريد البابي
    1. قم بضخ محلول ملحي طبيعي ببطء في قنية الوريد البابي باستخدام حقنة لإخلاء فقاعات الهواء في القنية.
    2. قم بتوصيل قنية الوريد البابي بأنبوب التدفق الخارجي perfusate في غرفة الجهاز.
  3. اتصال قنية القناة الصفراوية
    1. قم بتوجيه قنية القناة الصفراوية للفأر من خلال صمام غطاء مطاطي متصل بغرفة الجهاز.
    2. أدخل قنية القناة الصفراوية في أنبوب دقيق معد مسبقا سعة 0.5 مل مع وجود ثقب صغير في الغطاء.
    3. ضع الأنبوب الدقيق على الطين خارج حجرة الجهاز.

4. ضبط معدل التدفق وفقا للضغط الكهروضوئي

  1. قم بتشغيل المضخة التمعجية من 1 مل / دقيقة.
  2. تحقق من قراءة ضغط الوريد البابي لضبط معدل التدفق.
  3. الحفاظ على ضغط الوريد البابي في النطاق الفسيولوجي بين 7 - 10 مم زئبق عن طريق ضبط معدل التدفق.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف معدل التدفق الاسمي قليلا حسب استخدام الأنابيب وتحديد موضعها.

5. جمع العينات

  1. الحصول على عينات مدخل perfusate من أنبوب تدفق الوريد البابي وعينات perfusate مخرج من غرفة الجهاز في فترات 3h.
  2. جمع عينات من جميع فصوص الكبد للتحليل النسيجي في نهاية فترة التروية من 12 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إنشاء العملية الجراحية
تم استخدام ما مجموعه 17 حيوانا لهذه التجربة: تم استخدام 14 فأرا لتحسين عملية شراء الأعضاء ، بما في ذلك قنية الوريد البابي (PV) والقناة الصفراوية (BD) ، بينما تم استخدام 3 فئران للتحقق من صحة الإجراء (الجدول 1). تمت مقارنة النتائج النسيجية (الشكل 3) لتسهيل تحديد حالة التروية المثلى.

اختيار البيرفوسات
تم اختيار وسط زراعة خلايا الكبد المستخدم سابقا لهذه الدراسة10,11. تم تصميم وسيط William E في البداية بواسطة Williams and Gunn كوسيط منخفض المصل للزراعة المطولة في المختبر للخلايا الظهارية الناضجة لكبد الفئران12. ومع ذلك ، فقد وجد أيضا فائدة في دعم نمو وصيانة خلايا الكبد القوارض13. مصل الجنين البقري (FBS) هو مكمل لزراعة الخلايا يستخدم على نطاق واسع نظرا لتكوينه الغني بالعناصر الغذائية الأساسية وعوامل النمو التي تسهل نمو الخلايا وتكاثرها وصلاحيتها14. تم استخدام وسط ويليام E الكامل كبروفوسات (الجدول 2) ، والذي يتم استكماله بمصل بقري جنيني بنسبة 20٪ ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، و 5000 وحدة / لتر هيبارين ، و 50 وحدة / لتر أنسولين ، و 0.010 جم / لتر هيدروكورتيزون.

اختيار القنية
تضمن إجراء القنية أولا قنية القناة الصفراوية (BD) لجمع السوائل الصفراوية ، تليها قنية الوريد البابي (PV). بالنسبة للقنية BD ، تم استخدام أنبوب البولي بروبلين UT-03 بقطر خارجي 0.3 مم وقطر داخلي 0.18 مم في البداية. ومع ذلك ، نظرا للمخاوف المتعلقة بتلف BD المحتمل وارتفاع خطر إزاحة القسطرة غير المقصودة المرتبطة بطرف UT-03 المشذب والصلب ، تم إعطاء الأفضلية لأنابيب البولي يوريثين 1 Fr. اعتبرت أنابيب البولي يوريثين ، بموادها الأكثر نعومة وتقليل الانزلاق ، أكثر ملاءمة لقنية BD.

في البداية ، تم استخدام قنية إبرة في الوريد 26 G من مادة البولي بروبيلين لقنية الوريد البابي (PV). ومع ذلك ، فإن إزالة الإبرة والتعلق اللاحق للقنية بأنبوب التروية أدى إلى تكوين فقاعات ، والتي كان لديها القدرة على عرقلة الجيوب الأنفية داخل الكبد. للتغلب على هذه المشكلة ، تم بناء قنية مسكن باستخدام إبرة 30 G يتم إدخالها في 1 سم البعيدة من قنية البولي يوريثين 2 Fr. ثم تم إدخال هذه "القنية الموجهة بالإبرة" ذاتية الصنع في PV البعيد فوق التقاء. عندما تم وضع القسطرة داخل الكهروضوئية ، تم سحب الإبرة ببطء أثناء دفع الأنبوب في نفس الوقت. تم توصيل نهاية القنية ذاتية الصنع بأنبوب التروية داخل الغرفة. يوفر استخدام مادة ناعمة في تقنية القنية هذه ميزة من خلال تقليل مخاطر إصابة الجدار الخلفي للسفينة.

دراسات التحقق من الصحة
خضعت عينات المدخل والمخرج لتحديد مستويات الأس الهيدروجيني والبوتاسيوم. ثم تمت مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها (الشكل 4) بالنتائج المبلغ عنها في المنشورات الحديثة15،16،17. تم ترشيح ثلاثة أكباد فأر بالأكسجين واستكملت بوسط ويليام E لمدة 12 ساعة. طوال هذه الفترة ، تم تسجيل ضغط نضح مستقر من 7 إلى 10 مم زئبق بشكل مستمر. كان متوسط الرقم الهيدروجيني مستقرا نسبيا طوال فترة التروية لمدة 12 ساعة وتراوح بين 7.3 و 7.7. كان متوسط مستويات البوتاسيوم مستقرا أيضا طوال فترة التروية وتراوح بين 5.9 و 6.8 مليمول / لتر (الشكل 4). تم الحفاظ على معدل التدفق الكهروضوئي في نطاق 0.8 - 1.2 مل / دقيقة / جم اعتمادا على استخدام وتحديد موضع أنابيب المضخة أثناء الإجراءات التجريبية. أظهرت جميع النتائج التي لوحظت في تروية كبد الفأر أوجه تشابه مع الملاحظات المبلغ عنها سابقا في تروية كبد الفئران (الجدول 3).

تم جمع عينات الأنسجة من ثلاثة أكباد (N = 3) وخضعت للتروية لمدة 12 ساعة باستخدام البروتوكول الأمثل لتلطيخ HE، متبوعا بمسح الشريحة بالكامل. تم تسجيل كل فص كبد باستخدام درجة سوزوكي المعدلة (الجدول 4). تم تعزيز درجة سوزوكي الكلاسيكية18 من خلال دمج ثلاثة معلمات إضافية: pyknosis من النوى ، انفصال الأوعية ، ووجود كريات الدم الحمراء في الجيوب الأنفية والأوعية الكبيرة. تم تصنيف كل معلمة على أنها غائبة (0) وخفيفة (1) ومعتدلة (2) وشديدة (3). تم اعتبار النتيجة النهائية من 0 إلى 7 لتعكس الحفظ الجيد ، وتم اعتبار 8 - 14 بمثابة حفظ معتدل ، و 14 - 21 أشارت إلى حفظ سيء.

تم تقييم الحفاظ على كبد الفأر بناء على درجة سوزوكي المعدلة. أجرى خبيران طبيان تقييما مستقلا لمورفولوجيا الفصوص السبعة للكبد الثلاثة (الشكل 5 ، الشكل 6 ، الشكل 7). تم حساب متوسط درجات الفص السبع لكل فص كبدي. تشير الدرجات المنخفضة إلى الحفاظ على الكبد بشكل أفضل. وأظهرت التقييمات التي أجراها الخبراء درجة عالية من التوافق. والجدير بالذكر أنه في حين لوحظت اختلافات طفيفة في الدرجات التي حددها الخبيران في تقييم pyknosis للنوى ، فإن هذه الاختلافات لم تؤثر على نتائج التسجيل الإجمالية بشكل كبير.

في أحسن الأحوال ، كانت حمة الكبد سليمة نسبيا مع بنية مفصصة نموذجية محفوظة جيدا ، بالكاد يمكن تمييزها عن الكبد الطبيعي. بدت خلايا الكبد قابلة للحياة مع أغشية خلايا مرئية بوضوح ونوى مستديرة. ومع ذلك ، خضعت بعض النوى ل pyknosis ، وتم توسيع بعض الجيوب الأنفية الكبدية قليلا ، مما أدى إلى درجة 4. (الشكل 3 ، الشكل 6)

في أسوأ الأحوال ، كان الهيكل الفصيصي مشوها ، مع فصل الأوعية عن الحمة ونخر متني متقارب. على المستوى الخلوي ، أصبح الفراغ الخلوي ، و pyknosis النوى واضحا ، خاصة في المنطقة المحيطة بالمركز. علاوة على ذلك ، لوحظ فراغ خفيف إلى معتدل. ما يصل إلى 30 ٪ من خلايا الكبد كانت تخضع للنخر مما أدى إلى درجة قصوى من 14. (الشكل 3 ، الشكل 7)

الجدول 1: إنشاء نموذج نضح كبد الفأر خطوة بخطوة. لوحظت مضاعفات مختلفة أثناء عملية التأسيس بسبب الاختلافات في حجم القنية والمواد وتحديد المواقع. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: مقارنة طرق حفظ الأعضاء في المختبر 15،17،19،20،21،22. يعد تحسين اختيار البيروسات واختيار حامل الأكسجين ومقارنة المكونات الغذائية أمرا بالغ الأهمية في ظل ظروف التخزين المختلفة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: ديناميكا الدم وتحليل غازات الدم في الفئران الطبيعية والفئران NEVLP 11،15،16،17،18،20،21،23،24،25،26،27،28،29،30،31. تصف المعلومات المقدمة بشكل انتقائي السمات الديناميكية الدموية لكبد الفئران والمعلمات الرئيسية للنضح الطبيعي في المختبر. على وجه التحديد ، يمكن اعتبار نضح كبد الفئران الأمثل عندما يتراوح الضغط الكهروضوئي عادة من 4 إلى 10 مم زئبق ، ويتراوح الضغط الجزئي للأكسجين في البيرفوسات التي تدخل الكهروضوئية من 80 إلى 550 مم زئبق ، مما يلبي المعايير اللازمة للنجاح في نضح كبد الفئران في المختبر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 4: درجة سوزوكي المعدلة. تتوسع درجة سوزوكي المعدلة المستخدمة في هذه الدراسة في درجة سوزوكي الكلاسيكية من خلال دمج ثلاثة معلمات إضافية: pyknosis من النوى ، وانفصال الأوعية ، ووجود كريات الدم الحمراء في الجيوب الأنفية والأوعية الكبيرة. تم تعيين درجة لكل معلمة على مقياس من 0 (غائب) أو 1 (خفيف) أو 2 (معتدل) أو 3 (شديد). تشير النتيجة الإجمالية ، التي تتراوح من 0 إلى 8 ، إلى الحفاظ الجيد ؛ 9 إلى 16 تشير إلى حفظ معتدل ، و 17 إلى 24 تشير إلى سوء الحفظ. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 5: اختيار وسط البيرفوسات وحجم البيرفوسات وضغط التروية بناء على دراسة أدبية ل NEVLP في الفئران (2010-2022) 3،8،10،14،17،19،27،30،31،32،33،34،35،3637,38,
39،40،41،42،43،44،45.يمكن أن يظهر نضح آلة Normothermic في كبد الفئران تباينا عبر الدراسات من حيث النوع المحدد وحجم البيروسات المستخدم ، وكذلك مدة التروية. قد تستخدم الدراسات المختلفة طرقا مختلفة ، مثل غسيل الكلى أو التروية بكميات كبيرة ، لفترات طويلة. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الاختلافات ، فإن المعلمات مثل ضغط البوابة ، ومعدل تدفق الوريد البابي ، والضغط الجزئي للأكسجين في البيرفوسات تظهر عموما الحد الأدنى من الاختلاف عبر الطرق المختلفة المستخدمة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لنظام التروية. المكونات الرئيسية هي غرفة الجهاز ، آلة ثرموستاتية ، مضخة الأسطوانة ، الأوكسجين ، والخزان. يتم ضخ perfusate من الخزان بواسطة مضخة تمعجية إلى جهاز الأكسجين. هناك تدفق غاز متواصل بنسبة 95٪ O2 و 5٪ CO2 في جهاز الأكسجين. يمر perfusate عبر مصيدة الفقاعات ، حيث يتم التقاط أي فقاعات هواء موجودة في perfusate وضخها مرة أخرى إلى الخزان. يتدفق البيرفوسات المتبقي إلى غرفة العضو ، حيث يتم توصيل الأنبوب بالوريد البابي. يتم توجيه التدفق الخارجي من غرفة العضو مرة أخرى إلى الخزان بواسطة المضخة التمعجية. يتم توصيل أنبوب تصريف الصفراء بغرفة العضو لجمع الصفراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: لقطة مقربة لحجرة التروية. تتكون غرفة تروية الأعضاء من مدخل ومخرج معطل ، ومصيدة فقاعات ، ومبادل حراري ، ومنفذ تجميع الصفراء. يتم إجراء المراقبة في الوقت الفعلي لضغط مضخة البيروسات باستخدام مستشعر الضغط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: النتائج النسيجية لكبد الفأر الطبيعي والمثقوب. (أ) مورفولوجيا كبد الفأر الطبيعي (التحكم). (ب) مثال على أفضل مورفولوجيا محفوظة كما تصورها تلطيخ HE-بعد 12 ساعة من التروية. (ج). مثال على التشكل الأسوأ حفظا كما هو موضح بواسطة تلطيخ HE-بعد 12 ساعة من التروية. يشير السهم الأسود إلى الفراغ ، ويشير السهم الأحمر إلى توسع الجيوب الأنفية ، ويظهر السهم الأصفر pyknosis من النوى والسهم الأخضر يحدد انفصال الأوعية الدموية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل البيرفوسات. درجة الحموضة (أ) ومستويات البوتاسيوم (ب). كلتا المعلمتين مستقرتان طوال أوقات المراقبة البالغة 12 ساعة ، مما يشير إلى ظروف نضح ثابتة يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 5
الشكل 5: تلف طفيف في الكبد أدى إلى تعديل درجة سوزوكي 4-7. بعد 12 ساعة من NEVLP ، تم إجراء تقييم شبه كمي لمورفولوجيا الكبد. تم تقييم العينات من كل فص كبد وتصنيفها بشكل منفصل ، مما أدى إلى نطاق ومتوسط درجة لكل كبد ، مع أعلى درجة ممكنة هي 4. مورفولوجيا الكبد المحفوظة جيدا بدرجة تتراوح من 4-7 اعتمادا على فص الكبد (المتوسط = 5) (النتيجة 0-7: مورفولوجيا الكبد المحفوظة جيدا ، النتيجة 8-14 مورفولوجيا محفوظة بشكل معتدل ، الدرجة 15-21: مورفولوجيا الكبد المحفوظة بشكل سيئ) الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تلف معتدل في الكبد يؤدي إلى تعديل درجة سوزوكي 7-14. تقييم شبه كمي لمورفولوجيا الكبد بعد 12 ساعة من نضح آلة الأكسجين الطبيعي الحرارة وفقا لدرجة سوزوكي المعدلة. مورفولوجيا محفوظة بشكل معتدل بدرجة تتراوح من 7 إلى 14 (المتوسط = 11). (النتيجة 0-7: مورفولوجيا الكبد المحفوظة جيدا ، النتيجة 8-14 مورفولوجيا محفوظة بشكل معتدل ، النتيجة 15-21: مورفولوجيا الكبد المحفوظة بشكل سيئ) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تلف طفيف - معتدل في الكبد مما أدى إلى تعديل درجة سوزوكي 5-11. أدى التروية غير المتجانسة إلى مورفولوجيا طفيفة إلى معتدلة محفوظة في فصوص الكبد المختلفة ، مع درجات تتراوح من 5 إلى 11 (المتوسط = 8). (النتيجة 0-7: مورفولوجيا الكبد المحفوظة جيدا ، النتيجة 8-14 مورفولوجيا محفوظة بشكل معتدل ، النتيجة 15-21: مورفولوجيا الكبد المحفوظة بشكل سيئ) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الحاسمة في البروتوكول
الخطوتان الحاسمتان في زراعة الكبد هما قنية الوريد البابي (PV) والقنية اللاحقة للقناة الصفراوية (BD). هذه الخطوات ذات أهمية قصوى في ضمان استرجاع الأعضاء بنجاح وإجراءات التروية أو الزرع اللاحقة.

التحديات والحلول
يمثل القنية الكهروضوئية ثلاثة تحديات: إصابة جدار الوعاء الدموي ، وإزاحة القسطرة ، وإمكانية عملية الإدخال. الطبيعة الحساسة لجدار الوعاء الكهروضوئي تجعله عرضة للثقب والنزيف اللاحق إذا لم يتم التعامل معه بعناية أثناء القنية. علاوة على ذلك ، فإن أي فقدان للدم من الكهروضوئية يقلل من ضغط البوابة ، مما يجعل إدخال القنية الكهروضوئية أكثر صعوبة. علاوة على ذلك ، قد تؤدي إصابة الجدار الوريدي البابي إلى إدخال الصمات الهوائية في نظام الأوعية الدموية داخل الكبد. لذلك ، فإن توخي الدقة والحذر أثناء عملية القنية الكهروضوئية أمر بالغ الأهمية لتقليل مخاطر حدوث مضاعفات.

أثناء القنية الكهروضوئية ، يعد خطر إزاحة القسطرة مصدر قلق شائع ، خاصة عند استخدام القنية ذات المواد الزلقة. بالمقارنة مع مادة البولي بروبيلين ، فإن استخدام قنيات البولي يوريثين أكثر ملاءمة للقنية الكهروضوئية. تقلل الطبيعة الناعمة والمرنة للبولي يوريثين بشكل كبير من خطر إزاحة القسطرة أو فقدانها ، والتي يحتمل أن تعزى إلى خصائصها المادية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام قنية ناعمة يقلل من احتمالية إتلاف الطبقة البطانية من الأوعية الدموية. في الدراسة ، تمت مقارنة ثلاثة أنواع من قنيات الوصول إلى الأوعية الدموية ، وهي 24 جم بولي بروبيلين ، و 26 جم بولي بروبيلين ، و 2 Fr من البولي يوريثين ، للقنية الكهروضوئية. من بين هذه الخيارات ، أظهر كل من قنيات البولي يوريثين 26 G و 2 Fr توافقا أفضل مع حجم الماوس PV. في حين أن قنية 26 G أظهرت توافقا تشريحيا أفضل ، فقد اعتبرت قنية البولي يوريثين 2 Fr بقطر خارجي يبلغ 0.66 مم مناسبة للتطبيق المقصود نظرا لخصائصها المادية الفريدة ، مما يقلل بشكل فعال من خطر إزاحة القسطرة غير المقصودة من PV.

فيما يتعلق بإمكانية الإدراج ، تم اختبار تقنيات مختلفة. تتمثل إحدى الطرق في تثبيت الأطراف القريبة والبعيدة من الكهروضوئية ، وقطع ثقب صغير بمقص ناعم ، وإدخال القنية الكهروضوئية. تتطلب هذه التقنية مشاركة شخص إضافي بسبب التعقيد ومتطلبات الإجراءات المتزامنة. وبالتالي ، ليس من الممكن لجراح مجهري واحد إجراء العملية بشكل مستقل. لذلك ، هناك حاجة إلى قسطرة مع إبرة داخلية وقنية خارجية. كما هو موضح من قبل ، فإن استخدام قنية البولي بروبلين الصلبة والسلسة 26 G المتاحة تجاريا ينطوي على خطر الانزلاق والمخاطرة بتكوين فقاعات هواء عند توصيل القنية بنظام التنظيف. لمعالجة هذه المخاوف ، تم ابتكار "نظام أنبوب موجه بالإبرة" تم بناؤه ذاتيا عن طريق إدخال إبرة 26 G من قسطرة إبرة في قنية طويلة ومرنة من مادة البولي يوريثين 2 Fr. يقدم هذا النهج ثلاث مزايا رئيسية: (1) نظام إدخال القسطرة ، (2) أنبوب طويل ومرن ، و (3) خصائص المواد المواتية. ومع ذلك ، خلال هذه الخطوة ، من الضروري توخي الحذر لمنع طرف الإبرة من الاتصال بالجدار الكهروضوئي أثناء التقدم ، لأن هذا قد يتسبب في تلف لا رجعة فيه لجدار الوعاء.

قدم قنية BD نفس التحديات الثلاثة: إصابة جدار الوعاء الدموي ، وإزاحة القسطرة ، وإمكانية عملية الإدخال. في النهاية ، تم اعتبار قنية البولي يوريثين 1 Fr أكثر ملاءمة من قنية البولي بروبلين UT - 03 نظرا لخصائصها المادية المواتية. على الرغم من القطر الخارجي الأصغر قليلا لقنية UT - 03 (0.30 مم) مقارنة بأنبوب البولي يوريثين الحساس للحرارة 1 Fr (0.33 مم) ، فإن مادة البولي يوريثين صلبة وأقل عرضة للانحناء. من ناحية أخرى ، فإن قنية 1 Fr ، كونها ناعمة ومرنة ، توفر إدخالا أسهل وبالتالي أصبحت خيارنا المفضل. ومع ذلك ، في الحالات التي يكون فيها حجم BD صغيرا بشكل استثنائي وغير قادر على استيعاب قنية 2 Fr الأكبر ، تظل قنية UT - 03 بديلا قابلا للتطبيق. في مثل هذه الحالات ، يجب إيلاء اهتمام خاص لمنع إزاحة القنية من BD.

كما تم تلخيصه في مراجعة الأدبيات (الجدول 5) ، استخدم معظم المجربين19،41،42،46 معدل تدفق بوابة من 1-3 مل / دقيقة / جم كبد. ومع ذلك ، يجب ضبط معدل التدفق للحفاظ على ضغط البوابة الفسيولوجية في حدود 4-10 مم زئبق28. قد يتسبب الضغط الكهروضوئي المرتفع في توسع الجيوب الأنفية وانفصال الأوعية الدموية. قد يؤدي الضغط الكهروضوئي المنخفض ومعدل التدفق الكهروضوئي المنخفض إلى انخفاض تدفق الأكسجين مع نخر لاحق في منتصف المنطقة إلى المنطقة المحيطة بالمركز. يخدم التلاعب بمعدل التدفق الكهروضوئي وظيفة تنظيم الضغط الكهروضوئي ، والذي قد يختلف وفقا للقنية المستخدمة وحجم الكبد ، مما يستلزم إجراء تعديلات طفيفة على معدل التدفق الكهروضوئي. لذلك ، في هذه الدراسة ، بدأ التروية بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة / جم كبد ، وفي الوقت نفسه ، تمت مراقبة الضغط الكهروضوئي باستخدام محول ضغط الدم للحفاظ على الضغط الكهروضوئي الفسيولوجي عن طريق ضبط معدل التدفق.

أثناء تطوير نموذج NEVLP ، جرت محاولة لزيادة تحسين إمدادات الأكسجين إلى الكبد المثقوب عن طريق إضافة خلايا الدم الحمراء المغسولة إلى البيرفوسات. ومع ذلك ، لوحظ ترسيب كبير من كريات الدم الحمراء في الغرفة الكبيرة والخزان ، مما يقلل من توصيل ناقلات الأكسجين إلى العضو أثناء التروية. علاوة على ذلك ، كان الضرر الذي لحق كريات الدم الحمراء ناتجا عن الحركة الميكانيكية لمضخة التروية التمعجية ، والتي تدفع البيرفوسات عن طريق ضغط أنبوب السيليكون. كلا السببين سهلوا قرارنا بعدم استخدام خلايا الدم الحمراء في هذه التجربة. قد تكون حاملات الأكسجين القائمة على الكربون المشبع بالفلور قادرة على حل هذه المشاكل47.

لتقييم صلاحية الكسب غير المشروع الكبد أثناء التروية ، تم جمع السائل الصفراوي للفأر على فترات 3 ساعات. ومع ذلك ، من الصعب جمع الصفراء عبر القسطرة بسبب اللزوجة العالية للسائل الصفراوي للفأر. يتم تعويض هذا في البداية عن طريق القوى الشعرية التي تسببها قسطرة البولي يوريثين الدقيقة 1 Fr الموضوعة في BD. ومع ذلك ، يمكن جمع حوالي 20 ميكرولتر فقط من السائل الصفراوي خلال الساعة الأولى من التجربة. بدلا من التصريف من خلال القنية ، لوحظ ملء إلى الوراء من المرارة.

في نهاية فترة التروية لمدة 12 ساعة ، امتلأت المرارة بسائل صفراوي صاف مما يشير إلى إنتاج الصفراء النشط أثناء نضح الجهاز. يمكن مواجهة ذلك عن طريق وضع أنبوب أكبر في المرارة.

في غضون ذلك ، تم تقييم الضرر النسيجي للبنية الخلوية والفصيصية الكبدية لتحديد نتيجة الحفظ. لوحظ أنه حتى داخل نفس الكبد ، كان الحفظ غير متجانس. يشير عدم تجانس التغييرات الهيكلية إلى أن التروية كانت غير متجانسة في جميع أنحاء الكبد (الشكل 5 ، الشكل 6 ، الشكل 7). علاوة على ذلك ، تقدم النتائج النسيجية دليلا على أنه من الممكن الحفاظ على السلامة الهيكلية لطعم كبد الفأر لمدة لا تقل عن 12 ساعة أثناء نضح الآلة. ومع ذلك ، فإن وجود أنسجة الكبد السليمة يمكن أن يساعد فقط في التقييم ولكن لا يمكن تحديد وظيفة الكبد وصلاحيته بشكل قاطع. تجدر الإشارة إلى أن النخر ، باعتباره المظهر النهائي للتلف الخلوي ، قد لا يكون من السهل ملاحظته حتى مرحلة لاحقة. وبالتالي ، فإن الاعتماد فقط على التقييم النسيجي قد لا يوفر فهما شاملا للحالة الوظيفية للكبد وقابليته للحياة. هناك حاجة إلى فحوصات وتقييمات تكميلية أخرى للتأكد من الحالة العامة للكبد ، بما في ذلك المقايسات الوظيفية ، والعلامات الكيميائية الحيوية ، وتقييم النشاط الأيضي.

تم تحقيق الحفاظ الجيد بعد 12 ساعة من التروية. ومع ذلك ، فإن تمديد وقت التروية حسب الحاجة لإصلاح الأعضاء يتطلب معالجة بعض المشكلات. أولا ، تجدر الإشارة إلى أن تحقيق فترات نضح طويلة الأجل تتجاوز 12 ساعة سيتطلب الحفاظ على ظروف معقمة بدلا من مجرد ظروف نظيفة. ومع ذلك ، في هذه التجارب الأولية ، كان التركيز على الحفاظ على ظروف نظيفة بدلا من الظروف المعقمة ، لأن ضمان العقم من شأنه أن يدخل تعقيدات إضافية على الإجراء. ثانيا، قد يتطلب التروية الأطول إضافة وحدة غسيل الكلى، كما وصفها هيرمان تولبوم22، لإزالة الفضلات الأيضية المتراكمة استخدموا نظاما بحجم إجمالي يتراوح بين 55 و 60 مل لتغذية كبد الفئران بمقدار 10 جم لمدة 4 ساعات. في هذه الدراسة ، تم استخدام خزان كبير نسبيا بحجم إجمالي 300 مل على الرغم من صغر حجم كبد الفأر ، والذي يزن حوالي 1 جرام. نتج عن هذا التكوين عامل تخفيف إضافي قدره 50 مرة. ومن اللافت للنظر أنه لم يلاحظ أي آثار ضارة خلال فترة التروية لمدة 12 ساعة مع هذا الإعداد. ثالثا ، يتطلب التروية الأطول أيضا إضافة ناقلات الأكسجين ، في أحسن الأحوال في شكل هيموجلوبين اصطناعي لضمان إمدادات كافية من الأكسجين ، كما وصفها Dondossola et al.47 و Jägers et al.48.

لا شك أن تطوير زراعة الكبد "غير الإقفارية" على أساس NEVLP قد جلب أفكارا وأساليب جديدة نحو حل أو حتى منع مشكلة إصابة نقص التروية. ومع ذلك ، فإن NEVLP هو مفهوم واعد للغاية لتحسين الحفاظ على الأعضاء وتطبيقه المحتمل لتوسيع نطاق الحفاظ على الأعضاء لإصلاح الأعضاء47.

حاليا ، يتم استخدام ثلاث تقنيات مختلفة للتروية الآلية تجريبيا وسريريا. الفرق الرئيسي هو درجة حرارة العمل: نضح آلة انخفاض حرارة الجسم ، نضح آلة تحت الأم ، ونضح آلة الحرارة العادية (الجدول 2). تشمل الاختلافات الأخرى اختيار محلول الحفظ ، ومحلول البيروسات ، وإضافة ناقلات الأكسجين (الجدول 5).

يعتبر NEVLP مفيدا بشكل أساسي لأنه (1) يتم الحفاظ على العضو في درجة حرارته العادية ، (2) يتم أكسجته و (3) يتم تزويده بالكامل من الناحية الأيضية. يوفر النظام منصة ممتازة للتقييم التشخيصي والعلاج التدخلي وإصلاح الأعضاء في نهاية المطاف49. ومع ذلك ، يشكل NEVLP تحديا كبيرا لتقنية دعم الأعضاء خارج الجسم الحي. التحدي الذي يواجه NEVLP هو عكس الحالة شبه الفسيولوجية. حتى وقت قريب ، نظرا لصغر الحجم وعدم وجود معايير تقييم قياسية ، تم إجراء عدد محدود فقط من دراسات NEVLP للقوارض25،26،27،28،29،30،31.

لقد ثبت هنا أن نموذج الماوس هو نموذج صالح يسمح بوقت حفظ يبلغ 12 ساعة. بالمقارنة ، أبلغت معظم دراسات الفئران عن أوقات تروية تبلغ 6 ساعات أو أقل28,33. بالإضافة إلى ذلك ، يعد استخدام الحيوانات الصغيرة مفيدا للدراسات الجزيئية مقارنة بالحيوانات الكبيرة بسبب توفر الكواشف الوفيرة وانخفاض التكاليف التجريبية. على سبيل المثال ، تعد الفئران حاليا خيارا مفضلا لاختبار نماذج خروج المغلوب لعائلة جينات ATG ، خاصة لدراسة مسارات الإشارات لإصابة نقص التروية في الكبد 8,50.

كشفت التجارب التي أجريت على كبد الفئران فيما يتعلق ب NEVLP أن الحفاظ على التروية الآلية الحرارية العادية يرتبط بانخفاض تلف الخلايا الكبدية وتحسين البقاء على قيد الحياة في وقت مبكر بعد الزرع مقارنة بالحفظ البارد31،40،51،52،53،54. NEVLP باستخدام كبد الفئران مناسب أيضا لدراسة إضافات الأدوية أو الخلايا إلى perfusate. ومن الأمثلة المثيرة للإعجاب دراسة Xuan Tian26 ، الذي استخدم الخلايا الجذعية الوسيطة المعدلة من الهيم أوكسيجيناز -1 جنبا إلى جنب مع نضح آلة الحرارة العادية لتحسين جودة ترقيع الكبد عبر مسار إشارات Wnt. أكد Haojie Wang39 في دراسته الأخيرة أن إضافة الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم إلى perfusate يمكن أن يحسن بشكل كبير من جودة NEVLP في الفئران للتروية لفترة قصيرة. في دراستهم باستخدام كبد DCD ، قامت الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم جنبا إلى جنب مع NEVLP بتثبيط احتقان الجيوب الأنفية الكبدية وإصابة البطانة. منعت إضافة الخلايا الجذعية الوسيطة تنشيط البلاعم داخل الكبد والالتصاق بين الخلايا. علاوة على ذلك ، فإن إضافة الخلايا الجذعية الوسيطة تنظم توازن الإندوثيلين -1 / أكسيد النيتريك البطاني لتحسين نضح الكبد ودوران الأوعية الدقيقة.

تقدم الفئران ميزة واضحة على الفئران عندما يتعلق الأمر ب NEVLP ، لا سيما في سياق الدراسات الجزيئية التي تركز على الكبد المعدل وراثيا أو المعدل وراثيا. ومع ذلك ، نظرا لصغر حجم الحيوان ، فإن الإجراء يشكل تحديا أكبر ولكن يمكن التحكم فيه للجراح المجهري37.

نظام الدرجات للتقييم النسيجي
التقييم النسيجي حاسم لتحديد تأثير ظروف التروية على السلامة المورفولوجية للكسب غير المشروع.

في حين أن درجة سوزوكي تستخدم بشكل شائع في الدراسات التي تقيم أمراض الكبد ، فقد لوحظ أن نظام التسجيل هذا قد لا يلتقط بشكل كاف النتائج المحددة التي لوحظت في الحفاظ على الكبد خارج الجسم الحي. لمعالجة هذا القيد ، تم تقديم أربعة معايير إضافية لتعزيز التقييم الشامل لأنسجة الكبد المحفوظة (الجدول 4). أولا ، تم تنفيذ إدراج تقييم pyknosis النووي ، لأنه بمثابة معلمة قيمة تدل على تلف الخلايا. ثانيا ، تم دمج تقييم انفصال الأوعية الدموية وخلايا الكبد ، مما يدل على تلف الفصيص الكبدي ، كمعيار إضافي. أخيرا ، تم استخدام تصنيف وجود كريات الدم الحمراء في الجيوب الأنفية كمؤشر على الاحمرار غير المتجانس والتروية. من خلال دمج هذه المعايير التكميلية ، تم تحقيق تقييم أكثر دقة ودقة لحالة أنسجة الكبد المحفوظة ، مما يوفر فهما أعمق لآثار الحفاظ على الكبد خارج الجسم الحي.

يحدث فراغ خلايا الكبد55 بعد تغييرات في استخدام الركيزة ، وإنفاق الطاقة ، وتفكك الأنابيب الدقيقة ، وتثبيط تخليق البروتين. تضطر نواة الخلية الكبدية إلى التحول نحو محيط الخلية بواسطة فجوات كبيرة. وكثيرا ما تكون هذه العملية مصحوبة بالتهاب نووي. في هذه الدراسة ، أدى 12 ساعة من التروية الآلية الحرارية العادية إلى درجات مختلفة من فراغ خلايا الكبد مقارنة بالسيطرة التي تشير إلى نضح غير متجانس.

كان وجود الجيوب الأنفية المتوسعة بين حبال خلايا الكبد ملحوظا في هذه الدراسة. تنشأ هذه الظاهرة في المقام الأول من انسداد التدفق الوريدي الكبدي ، مما يؤدي إلى ركود الأوعية الدموية والازدحام داخل الحمة الكبدية. في نموذج كبد الفأر هذا ، قد تساهم التحديات المرتبطة بالحفاظ على ضغط نضح بابي ثابت بسبب صغر حجم العضو في التمدد الملحوظ للجيوب الأنفية الكبدية.

تظهر التغيرات النخرية عادة في مجموعات الخلايا أو المناطق الإقليمية أو مناطق محددة. أظهرت المنطقة المحيطة بالبوابة جيدة الأداء حفظا أفضل نسبيا لخلايا الكبد مقارنة بالمنطقة المحيطة بالمركز. يمثل نضح الكبد ثنائي الأوعية ، كما هو موضح في كبد الفئران20 ، تحديا أكبر في كبد الفئران بسبب صغر حجم الشريان الكبدي. وبالتالي ، يمكن أن يعزى التروية غير المتجانسة الملحوظة لكبد الفأر ، جزئيا على الأقل ، إلى هذا القيد.

هذه الملاحظات ليست حصرية لكبد الفئران التي تخضع ل NEVLP ولكن يمكن أيضا تصورها في الصور النسيجية من دراسات NEVLP الأخرى ، على الرغم من أنها قد لا تكون موصوفة صراحة.

الأهمية والتطبيقات المحتملة للماوس NEVLP
NEVLP من كبد الفأر هو إجراء صعب ولكنه ممكن. هناك حاجة إلى مزيد من الجهود لتحقيق أفضل استخدام لهذه التكنولوجيا لتوضيح الآلية الكامنة وراء التأثير المفيد ل NEVLP. إن تعزيز معرفتنا سيسهل التطور التدريجي لهذه التكنولوجيا ، ونقلها إلى ما بعد الحفاظ على الأعضاء نحو عالم "إصلاح الأعضاء".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يوجد تضارب في المصالح المالية للإفصاح عنه.

Acknowledgments

طوال كتابة هذه الورقة ، تلقيت قدرا كبيرا من الدعم والمساعدة. أود بشكل خاص أن أعرب عن تقديري لزميلي في الفريق XinPei Chen لتعاونه الرائع ودعمه الصبور أثناء عمليتي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 ml Micro Tube PP Sarstedt 72699
1 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
10 µL Micro Syringe Hamilton 701N
2 Fr Rubber Cannula Vygon Sample Cannula
24 G Butterfly Cannula Terumo SR+OF2419
26 G Butterfly Cannula Terumo SR+DU2619WX
30 G Hypodermic Needle Sterican 100246
50 ml Syringe Pump Braun 110356
6-0 Perma-Hand Seide Ethicon 639H
Arterial Clip Braun BH014R
Autoclavable Moist Chamber Hugo Sachs Elektronik 73-4733
Big Cotton Applicator  NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974018
Bubble Trap Hugo-Sachs-Elektronik V83163
Buprenovet (0.3 mg / ml) Elanco /
CIDEX OPA solution (2 L) Cilag GmbH 20391
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C ERBE /
Fetal Bovine Serum(500 ml)  Sigma-Aldrich F7524-500ML
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) House Supply /
Heating Circulating Baths Harvard-Apparatus 75-0310
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) Braun 1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) Pfizer 15427276
Insulin(100 IE / ml) Sigma I0516-5ML
Iris Scissors  Fine Science Instruments 15000-03
Isofluran (250 ml) Cp-Pharma 1214
Membrane Oxygenator Hugo Sachs Elektronik T18728
Microsurgery Microscope  Leica M60
Mouse Retractor Set  Carfil Quality 180000056
NanoZoomer 2.0 HT Hamamatsu /
Non-Woven Sponges  Kompressen 866110
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml)  C.C.Pro Z-13-M
Perfusion Extension Tube (30 cm) Braun 4256000
Peristaltic Pump Harvard-Apparatus P-70
Petri Dishc 100x15 mm VWR® 391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) Livisto 799-416
Pressure Transducer Simulator UTAH Medical Products 650-950
Reusable Blood Pressure Transducers AD Instruments MLT-0380/D
S & T Vessel Cannulation Forceps Fine Science Instruments 00608-11
Small Cotton Applicator NOBA Verbandmittel Danz GmbH 974116
Straight Forceps 10 cm  Fine Science Instruments 00632-11
Suture Tying Forceps Fine Science Instruments 11063-07
Syringe 50ml Original Perfusor Braun 8728810F-06
UT - 03 Cannula Unique Medical, Japan /
Vannas Spring Scissors Fine Science Instruments 15018-10
Veterinary Saline (500 ml) WDT 18X1807
Water Jacketed Reservoir  2 L Harvard-Apparatus 73-3441
William's E Medium (500 ML) Thermofischer Scientific A1217601

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
  2. Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
  3. Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
  4. Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
  5. Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
  6. Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
  7. Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
  8. Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
  9. Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
  10. van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
  11. Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
  12. Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
  13. Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
  14. Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
  15. Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
  16. Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
  17. Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
  18. Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
  19. Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
  20. Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
  21. Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
  22. Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
  23. Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
  24. Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
  25. Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
  26. Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
  27. Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
  28. Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
  29. Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
  30. Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
  31. Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
  32. Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
  33. Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
  34. Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
  35. Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
  36. Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
  37. Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
  38. Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
  39. Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
  40. Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
  41. Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
  42. Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
  43. Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
  44. Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
  45. Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
  46. Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
  47. Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
  48. Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
  49. Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
  50. Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
  51. Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
  52. Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
  53. Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
  54. Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
  55. van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 199 ، نضح الكبد ، نورمومرميك ، فأر ، خارج الجسم الحي
نورموذرميك <em>خارج الجسم</em> الحي آلة الكبد التروية في الماوس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, H., Dirsch, O., Albadry, M.,… More

Chen, H., Dirsch, O., Albadry, M., Ana, P. H., Dahmen, U. Normothermic Ex Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse. J. Vis. Exp. (199), e65363, doi:10.3791/65363 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter