Summary
Für die Leber von Mäusen wurde ein normothermisches ex vivo Leberperfusionssystem (NEVLP) entwickelt. Dieses System erfordert Erfahrung in der Mikrochirurgie, ermöglicht aber reproduzierbare Perfusionsergebnisse. Die Möglichkeit, Mäuselebern zu verwenden, erleichtert die Untersuchung molekularer Signalwege zur Identifizierung neuartiger Perfusat-Additive und ermöglicht die Durchführung von Experimenten, die sich auf die Reparatur von Organen konzentrieren.
Abstract
Dieses Protokoll stellt ein optimiertes erythrozytenfreies NEVLP-System unter Verwendung von Mauslebern dar. Die Ex-vivo-Konservierung von Mäuselebern wurde durch den Einsatz modifizierter Kanülen und Techniken erreicht, die von konventionellen kommerziellen Ex-vivo-Perfusionsgeräten übernommen wurden. Das System wurde verwendet, um die Konservierungsergebnisse nach 12 h Perfusion zu bewerten. C57BL/6J-Mäuse dienten als Leberspender, und die Lebern wurden explantiert, indem die Pfortader (PV) und der Gallengang (BD) kanüliert und das Organ anschließend mit warmer (37 °C) heparinisierter Kochsalzlösung gespült wurde. Anschließend wurden die explantierten Lebern in die Perfusionskammer überführt und einer normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) unterzogen. Die Einlass- und Auslassproben des Perfusats wurden in Abständen von 3 Stunden zur Perfusatanalyse entnommen. Nach Abschluss der Perfusion wurden Leberproben zur histologischen Analyse entnommen, wobei die morphologische Integrität mittels modifiziertem Suzuki-Score durch Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung beurteilt wurde. Die Optimierungsexperimente ergaben folgende Ergebnisse: (1) Mäuse mit einem Gewicht von über 30 g wurden aufgrund der größeren Größe ihres Gallengangs (BD) als besser geeignet für das Experiment erachtet. (2) Eine 2 Fr (Außendurchmesser = 0,66 mm) Polyurethankanüle war im Vergleich zu einer Polypropylenkanüle besser für die Kanülierung der Pfortader (PV) geeignet. Dies wurde auf die verbesserte Griffigkeit des Polyurethanmaterials zurückgeführt, die zu einem geringeren Katheterschlupf während des Transfers vom Körper in die Organkammer führte. (3) Für die Kanülierung des Gallengangs (BD) erwies sich eine 1 Fr (Außendurchmesser = 0,33 mm) Polyurethankanüle als wirksamer als die Polypropylenkanüle UT - 03 (Außendurchmesser = 0,30 mm). Mit diesem optimierten Protokoll konnten Mauslebern erfolgreich für eine Dauer von 12 Stunden konserviert werden, ohne dass die histologische Struktur signifikant beeinflusst wurde. Die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung ergab eine gut erhaltene morphologische Architektur der Leber, die durch überwiegend lebensfähige Hepatozyten mit deutlich sichtbaren Zellkernen und eine leichte Dilatation der hepatischen Sinusoide gekennzeichnet ist.
Introduction
Die Lebertransplantation stellt den Goldstandard für die Behandlung von Personen mit Lebererkrankungen im Endstadium dar. Bedauerlicherweise übersteigt die Nachfrage nach Spenderorganen das verfügbare Angebot, was zu einer erheblichen Verknappung führt. Im Jahr 2021 standen etwa 24.936 Patienten auf der Warteliste für ein Lebertransplantat, während nur 9.234 Transplantationen erfolgreich durchgeführt wurden1. Die erhebliche Diskrepanz zwischen Angebot und Nachfrage nach Lebertransplantaten unterstreicht die dringende Notwendigkeit, alternative Strategien zur Erweiterung des Spenderpools und zur Verbesserung der Zugänglichkeit von Lebertransplantaten zu untersuchen. Eine Möglichkeit, den Spenderpool zu erweitern, ist der Einsatz von marginalen Spendern2. Zu den marginalen Spendern gehören Personen mit fortgeschrittenem, mittelschwerer oder schwerer Steatose. Obwohl die Transplantation von marginalen Organen zu günstigen Ergebnissen führen kann, bleiben die Gesamtergebnisse suboptimal. Daher ist derzeit die Entwicklung therapeutischer Strategien im Gange, die darauf abzielen, die Funktion marginaler Spender zu verbessern 3,4.
Eine der Strategien besteht darin, die maschinelle Perfusion, insbesondere die normotherme sauerstoffhaltige maschinelle Perfusion, zu nutzen, um die Funktion dieser marginalen Organe zu verbessern5. Es gibt jedoch noch ein begrenztes Verständnis der molekularen Mechanismen, die den positiven Effekten der normothermen oxygenierten maschinellen Perfusion (NEVLP) zugrunde liegen. Mäuse mit ihrer reichlichen Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Stämmen dienen als wertvolle Modelle für die Untersuchung molekularer Signalwege. So wurde beispielsweise die Bedeutung von Autophagie-Signalwegen bei der Linderung von Leberischämie-Reperfusionsschäden zunehmend anerkannt 6,7. Ein wichtiger molekularer Signalweg bei der hepatischen Ischämie-Reperfusions-Schädigung ist der miR-20b-5p/ATG7-Signalweg8. Derzeit gibt es eine Reihe von ATG-Knockout- und bedingten Knockout-Mausstämmen, aber keine entsprechenden Rattenstämme9.
Vor diesem Hintergrund war es das Ziel, eine miniaturisierte NEVLP-Plattform für Lebertransplantate von Mäusen zu generieren. Diese Plattform würde die Erforschung und Bewertung potenzieller genetisch veränderter Strategien zur Verbesserung der Funktionalität der Leber des Spenders erleichtern. Darüber hinaus war es wichtig, dass das System für eine langfristige Perfusion geeignet ist, um die Ex-vivo-Behandlung der Leber zu ermöglichen, die gemeinhin als "Organreparatur" bezeichnet wird.
In Anbetracht der begrenzten Verfügbarkeit relevanter In-vitro-Daten zur Leberperfusion von Mäusen konzentrierte sich die Literaturrecherche auf Studien, die an Ratten durchgeführt wurden. Eine systematische Literaturrecherche aus den Jahren 2010 bis 2022 wurde anhand von Schlagworten wie "normotherme Leberperfusion", "ex vivo oder in vitro" und "Ratten" durchgeführt. Diese Suche zielte darauf ab, optimale Bedingungen für Nagetiere zu identifizieren, so dass wir den am besten geeigneten Ansatz bestimmen konnten.
Das Perfusionssystem besteht aus einem abgedichteten, wasserummantelten Glaspufferreservoir, einer peristaltischen Rollenpumpe, einem Oxygenator, einer Blasenfalle, einem Wärmetauscher, einer Orgelkammer und einem geschlossenen Schlauchsystem (Abbildung 1). Das System gewährleistet die präzise Aufrechterhaltung einer konstanten Perfusionstemperatur von 37 °C mit einer speziellen thermostatischen Maschine. Die peristaltische Rollenpumpe treibt den Durchfluss des Perfusats durch den gesamten Kreislauf. Der Perfusionskreislauf beginnt am isolierten, wasserummantelten Reservoir. Anschließend wird das Perfusat durch den Oxygenator geleitet, der aus einer speziellen Gasflasche ein Gasgemisch aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid erhält. Nach der Sauerstoffanreicherung durchläuft das Perfusat die Blasenfalle, in der alle eingeschlossenen Blasen von der Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet werden. Das verbleibende Perfusat fließt durch den Wärmetauscher und gelangt in den Orgelraum, von wo aus es in den Vorratsbehälter zurückkehrt.
Hier berichten wir über unsere Erfahrungen bei der Etablierung eines NEVLP für Mauslebern und teilen die vielversprechenden Ergebnisse eines Pilotversuchs, das mit dem sauerstoffhaltigen Medium ohne Sauerstoffträger durchgeführt wurde.
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Protocol
Die Tierversuche wurden nach den aktuellen deutschen Vorschriften und Richtlinien für den Tierschutz und den ARRIVE-Richtlinien für die Berichterstattung über Tierversuche durchgeführt. Das Tierversuchsprotokoll wurde vom Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Deutschland genehmigt (Zulassungsnummer: UKJ - 17 - 106).
HINWEIS: Als Leberspender wurden männliche C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von 34 ± 4 g (Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts [REM]) verwendet. Sie wurden unter kontrollierten Umgebungsbedingungen (50 % Luftfeuchtigkeit und 18 - 23 °C) mit freiem Zugang zu Standard-Mäusefutter und Wasser gehalten. Während des gesamten chirurgischen Eingriffs wurde eine Atemfrequenz von mehr als 60 Atemzügen/min aufrechterhalten und die Körpertemperatur über 34 °C gehalten.
1. Vorbereitung
- Einrichten des Operationstisches
- Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien zu Sterilisationszwecken.
- Schalten Sie alle Geräte ein, einschließlich des Wärmebretts und der Elektrokoagulation.
- Eine 50-ml-Spritze mit 25 ml heparinisierter Kochsalzlösung (2.500 U/L) in einen warmen Inkubator (37 °C) geben.
- Legen Sie die chirurgischen Instrumente, das 6 - 0 Seidennahtmaterial, den sterilen kleinen Baumwollapplikator, die Veterinärkochsalzlösung (500 ml) und die Vliesmullschwämme (10 cm x 10 cm) entsprechend auf den Operationstisch.
- Legen Sie eine 26-g-Nadel auf den Operationstisch, um ein kleines Loch in den Deckel des 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens zu bohren, um das Gallenröhrchen zur Gallenentnahme aufzunehmen.
- Legen Sie die Kanüle (1 Fr Polyurethankanüle oder UT - 03 Polyethylenkanüle) und ein sterilisiertes 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zur Gallenentnahme auf den Operationstisch.
- Selbstgebaute Pfortaderkanüle
- Halten Sie die 2-Fr-Kanüle mit einer Pinzette fest und stechen Sie die Wand mit einer 30-G-Nadel in einem Abstand von 1 cm vom Ende der Kanüle ein. Schieben Sie die Nadel durch die Kanüle, bis die Nadelspitze sichtbar wird.
- Schneiden Sie die Spitze der Kanüle ab, sodass ein scharfes Dreieck entsteht.
- Herstellung von heparinisierter Kochsalzlösung
- Bereiten Sie 25 ml heparinisierte Kochsalzlösung mit einer Endkonzentration von 2.500 IU/ml vor.
- Entfernen Sie alle Luftblasen und legen Sie die Spritze in den 40 °C-Inkubator.
- Demonstration des Perfusionssystems
- In Abbildung 1 sind die Hauptkomponenten des maschinellen Perfusionssystems aufgeführt.
- Aufbau des Orgelraums
- Siehe Abbildung 2 für den Grundriss des Orgelraums.
- Aufbau des Perfusionssystems
- Schalten Sie das Lab-Chart-Programm für die Drucküberwachung ein.
- Verbinden Sie den Druckkalibrator und den Drucksensor auf der Ebene des Orgelraums.
- Stellen Sie den Druckkalibrator so ein, dass er 0 mmHg anzeigt, und überprüfen Sie den entsprechenden Wert in der Druckregelungssoftware.
- Stellen Sie den Druckkalibrator auf 20 mmHg ein und überprüfen Sie den entsprechenden Wert erneut in der Druckregelungssoftware.
- Schalten Sie das Wasserbad ein und wärmen Sie den Orgelraum auf 40 °C vor.
- Spülen Sie das gesamte Sanitärsystem zweimal 30 Minuten lang mit destilliertem deionisiertem Wasser, um sicherzustellen, dass die Desinfektionslösung vollständig entfernt wird.
- Initiieren Sie die Zirkulation der Desinfektionslösung im gesamten System für eine Dauer von 20 Minuten, um eine gründliche Desinfektion zu gewährleisten.
- Schalten Sie das Gasgemisch (95 % Sauerstoff (O2) und 5 % Kohlendioxid (CO2) ein.
- Perfusat-Füllung
- Ergänzen Sie 250 ml E-Medium von Williams mit 50 ml fötalem Kälberserum, 3 ml Penicillin/Streptomycin (1 mg/ml), 0,17 ml Insulin (100 IE/ml), 0,34 ml Heparin (5000 U/ml) und 0,07 ml Hydrocortison (100 mg/2 ml), um das vollständige E-Medium von Williams herzustellen.
- Geben Sie gleiche Volumina (150 ml) Perfusat in das Reservoir und die Orgelkammer, um das System vorzubereiten.
HINWEIS: Besonderes Augenmerk muss auf die Aufrechterhaltung der Sterilität während des Füllvorgangs gelegt werden. Das Perfusat wird ständig durch diese beiden Schlüsselkomponenten der Perfusion der geschlossenen Umlaufmaschine gepumpt. - Schalten Sie die Peristaltikpumpe bei mittlerer Geschwindigkeit (15 ml/min) ein, um das Perfusionssystem mit dem sauerstoffhaltigen Medium zu füllen.
2. Explantation der Leber
- Vorbereitung vor der Operation
- Wiegen Sie das Tier. Bereiten Sie das Analgetikum Buprenorphin (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg Körpergewicht) vor.
- Verbinden Sie die Induktionskammer mit der Steckdose. Drehen Sie den Sauerstoff auf 0,5 l/min. Verwandeln Sie Isofluran auf 3%.
- Legen Sie das Tier in die Kammer, bis eine tiefe Betäubung (Aufrichtungsreflex positiv) erreicht ist.
- Verwenden Sie eine Mikrospritze, um die an das Körpergewicht angepasste Dosis der Analgesie subkutan aufzutragen.
- Verwenden Sie einen Elektrorasierer, um das Fell auf der Bauchhaut zu trimmen.
- Legen Sie die Maus auf den Operationstisch und schalten Sie den Isofluran-Verdampfer auf 2,5 % ein, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Bestätigen Sie die Narkosetiefe, indem Sie den Zehenreflex zwischen den Zehen testen.
- Präparation des Mausabdomens
- Bringen Sie die Maus in Rückenlage.
- Testen Sie den Interdigitalreflex, um die entsprechende Narkosetiefe zu bestätigen. Fixiere alle vier Gliedmaßen mit Klebeband.
- Desinfizieren Sie beide Seiten des Bauches bis zur mittleren Achsellinie mit drei aufeinanderfolgenden Runden Jodalkohol. Verwenden Sie sterilisierte Vliesgaze, um den Bereich um das Operationsfeld herum abzudecken.
- Einen 3 cm langen Querschnitt 1 cm unterhalb des Xiphoid im Bauchbereich der Maus mit Metzenbaum Babyschere und OP-Zange machen.
- Verlängern Sie den Hautschnitt beidseitig beidseitig bis zur Mittelachsellinie.
- Machen Sie vorsichtig einen 2 cm langen Längsschnitt entlang der Linea alba mit einer Federschere.
- Durchtrennen Sie die Bauchmuskelschicht mit Elektrokoagulation und Vannas Federschere.
- Legen Sie vorsichtig ein Stück nasse Gaze auf, um die Leber vor Elektrokoagulation zu schützen.
- Verwenden Sie eine 6 - 0 Seidennaht mit der Rundnadel, um den Xiphoideusfortsatz zurückzuziehen, um das Koronarband besser freizulegen.
- Verwenden Sie zwei Rippenhalter, um die Bauchhöhle der Maus vollständig freizulegen.
- Bewegen Sie den Dünndarm vorsichtig mit einem feuchten Wattestäbchen aus der Bauchhöhle, um den Hilus vollständig freizulegen.
- Präparation der gemeinsamen Gallengänge
- Durchtrennen Sie die falziformen, phrenen und gastrohepatischen Bänder mit einer scharfen Schere.
- Befreien Sie den gemeinsamen Gallengang vorsichtig mit einer fein gebogenen Pinzette ohne Zähne.
HINWEIS: Der gemeinsame Gallengang wird sehr leicht beschädigt und bricht. Sobald es bricht, kann es nicht mehr kanüliert werden. Aufgrund der Richtung der anatomischen Position sind gebogene Pinzetten besser zu verwenden. - Legen Sie zwei 6 - 0 Seidennahtschlaufen über den gemeinsamen Gallengang, um sich auf den nächsten Schritt vorzubereiten.
- Kanülierung des Gallengangs
- Stechen Sie den Gallengang vorsichtig mit einer 30-G-Nadel ein. Verwenden Sie eine spitze, gebogene Pinzette, um das kleine Loch so zu vergrößern, dass es in die Gallengangskanülierung passt.
- Fassen Sie die Gallengangskanüle mit einer Kanülenzange und schieben Sie sie in den Gallengang.
- Befestigen Sie die Kanüle doppelt mit den voreingestellten 6 - 0 Nahtschlaufen.
HINWEIS: Während der Kanülierung ist ein Widerstand der Galle zu spüren. Wenn die Kraft nicht gut kontrolliert wird, wird die Kanüle durch den Druck des Gallenabflusses aus den Gallenwegen gedrückt. Stellen Sie die Tiefe der Kanüle vorsichtig ein. Wenn es zu tief ist, kann es den Gallengang beschädigen, und wenn es nicht tief genug ist, kann es herausrutschen. - Beobachten Sie den Gallenfluss in der Kanüle nach erfolgreicher Kanülierung.
- Vorbereitung der Pfortader
- Klemmen Sie die Pfortader mit einer flachen Pinzette ab und befreien Sie vorsichtig das Bindegewebe mit einer gebogenen Pinzette. Ziehen Sie nicht zu stark, um einen Riss der Pfortader zu vermeiden. Sobald die Pfortader beschädigt ist, ist es schwierig, die Pfortader wieder zu kanulieren.
- Präparieren Sie die PV direkt über der Bifurkation und platzieren Sie die erste Nahtschlaufe mit 6 - 0 Seidennaht auf PV in der Nähe der Konfluenz für die spätere Verwendung.
- Platzieren Sie die zweite Nahtschlaufe zur späteren Fixierung des PV so nah wie möglich am Leberhilus.
- Pfortader-Kanülierung
- Verwenden Sie eine arterielle Klammer, um die distale Pfortader zu verschließen.
- Punktieren Sie die Pfortader sehr vorsichtig mit einer der oben genannten Pfortaderkanülen. Der Blutfluss innerhalb der Kanüle ist nach einer erfolgreichen Punktion deutlich zu beobachten.
- Befestigen Sie die PV-Kanüle mit der vorplatzierten 6 - 0 Nahtschlaufe.
- Leberspülung
- Erhöhen Sie den Isoflurangehalt auf 5 % und euthanasieren Sie die Maus mit einer Überdosis Isofluran-Inhalation.
- Nehmen Sie vorgewärmte Heparin-Kochsalzlösung aus dem Inkubator. Entfernen Sie alle Luftblasen, die sich in der heparinisierten Kochsalzlösung gebildet haben.
- Fixieren Sie die Spritze mit der vorgewärmten heparinisierten Kochsalzlösung in der Spritzenpumpe.
- Schließen Sie den Verlängerungsschlauch der Spritzenpumpe an die Kanüle der Pfortader an, stellen Sie die Geschwindigkeit auf 2 ml/min ein und starten Sie die Leberspülung.
- Beobachten Sie die Farbe der Leber am Ende des Spülvorgangs. Schneiden Sie die Leber heraus, sobald die Farbe ein homogenes Gelb annimmt.
- Durchtrennen Sie das Zwerchfell, die suprahepatische untere Hohlvene, die infrahepatische Hohlvene, die Leberarterie, die distale Pfortader und das verbleibende Bindegewebe.
- Legen Sie die Leber in die Petrischale.
3. Leber- und Kammerverbindung
- Leberübertragung
- Übertragen Sie die Leber vorsichtig mit einer Petrischale in die Organkammer.
- Bewahren Sie eine kleine Menge Kochsalzlösung in der Petrischale auf, um ein Austrocknen der Leber zu verhindern.
HINWEIS: Pfortader und Gallengang können während dieses Eingriffs leicht verdreht werden, was die Leberdurchblutung und die Gallensammlung beeinträchtigen kann.
- Pfortaderkanülenverbindung
- Infundieren Sie mit einer Spritze langsam normale Kochsalzlösung in die Pfortaderkanüle, um die Luftblasen in der Kanüle zu entfernen.
- Verbinden Sie die Pfortaderkanüle mit dem Perfusat-Abflussschlauch in der Orgelkammer.
- Gallengang-Kanülenanschluss
- Führen Sie die Gallengangskanüle der Maus durch das Ventil einer Gummikappe, die mit der Organkammer verbunden ist.
- Führen Sie die Gallengangskanüle in ein vorbereitetes 0,5-ml-Mikroröhrchen mit einem kleinen Loch im Deckel ein.
- Legen Sie das Mikroröhrchen außerhalb des Orgelraums auf Ton.
4. Passen Sie die Durchflussmenge entsprechend dem PV-Druck an
- Schalten Sie die Peristaltikpumpe ab 1 ml/min ein.
- Überprüfen Sie den Pfortaderdruck, um die Durchflussrate anzupassen.
- Halten Sie den Pfortaderdruck im physiologischen Bereich zwischen 7 - 10 mmHg, indem Sie die Flussrate anpassen.
Anmerkungen: Der Nenndurchfluss kann je nach Verwendung und Positionierung der Rohre leicht variieren.
5. Probenentnahme
- Entnahme von Einlass-Perfusat-Proben aus dem Pfortader-Einströmrohr und Auslass-Perfusat-Proben aus der Orgelkammer in 3-Stunden-Intervallen.
- Entnahme von Proben aus allen Leberlappen zur histologischen Analyse am Ende der Perfusionszeit von 12 h.
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Representative Results
Etablierung des chirurgischen Verfahrens
Insgesamt wurden 17 Tiere für dieses Experiment verwendet: 14 Mäuse wurden zur Optimierung des Organbeschaffungsprozesses einschließlich der Kanülierung der Pfortader (PV) und des Gallengangs (BD) eingesetzt, während 3 Mäuse zur Validierung des Verfahrens verwendet wurden (Tabelle 1). Die histologischen Ergebnisse (Abbildung 3) wurden verglichen, um die Identifizierung der optimalen Perfusionsbedingungen zu erleichtern.
Auswahl des Perfusats
Für diese Studie wurde ein zuvor verwendetes Hepatozyten-Kulturmedium ausgewählt10,11. Williams E-Medium wurde ursprünglich von Williams und Gunn als serumreduziertes Medium für die verlängerte In-vitro-Kultivierung reifer Rattenleberepithelzellen entwickelt12. Nichtsdestotrotz hat es sich auch als nützlich erwiesen, das Wachstum und die Aufrechterhaltung von Nagetierhepatozyten zu unterstützen13. Fötales Kälberserum (FBS) ist aufgrund seiner reichhaltigen Zusammensetzung an essentiellen Nährstoffen und Wachstumsfaktoren, die das Zellwachstum, die Proliferation und die Lebensfähigkeit fördern, ein weit verbreitetes Zellkulturpräparat14. Als Perfusat wurde Complete Williams E-Medium verwendet (Tabelle 2), das mit 20 % fötalem Kälberserum, 1 % Penicillin/Streptomycin, 5.000 U/L Heparin, 50 U/L Insulin und 0,010 g/L Hydrocortison ergänzt wird.
Auswahl der Kanüle
Bei der Kanülierung wurde zunächst der Gallengang (BD) zur Gallenflüssigkeitsentnahme kanüliert, gefolgt von der Kanülierung der Pfortader (PV). Für die BD-Kanülierung wurde zunächst ein UT-03 Polypropylen-Röhrchen mit einem Außendurchmesser von 0,3 mm und einem Innendurchmesser von 0,18 mm verwendet. Aufgrund von Bedenken hinsichtlich einer möglichen BD-Schädigung und des höheren Risikos einer unbeabsichtigten Katheterverschiebung im Zusammenhang mit der getrimmten und starren UT-03-Spitze wurde jedoch den 1-Fr-Polyurethanschläuchen der Vorzug gegeben. Die Polyurethan-Schläuche mit ihrem weicheren Material und der geringeren Glätte wurden als besser geeignet für die BD-Kanülierung angesehen.
Zunächst wurde für die Kanülierung der Pfortader (PV) eine intravenöse 26 G Polypropylen-Nadelkanüle verwendet. Durch die Entfernung der Nadel und die anschließende Befestigung der Kanüle am Perfusionsschlauch kam es jedoch zur Bildung von Blasen, die das Potenzial hatten, die intrahepatischen Sinusoide zu verstopfen. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Verweilkanüle mit einer 30-G-Nadel konstruiert, die in die distalen 1 cm einer 2-Fr-Polyurethankanüle eingeführt wurde. Diese selbstgebaute "nadelgeführte Kanüle" wurde dann oberhalb der Konfluenz in die distale PV eingeführt. Als der Katheter im PV positioniert wurde, wurde die Nadel langsam zurückgezogen, während gleichzeitig der Schlauch vorgeschoben wurde. Das Ende der selbstgebauten Kanüle wurde mit dem Perfusionsschlauch in der Kammer verbunden. Die Verwendung eines weichen Materials bei dieser Kanülierungstechnik bot einen Vorteil, da das Verletzungsrisiko an der Gefäßrückwand verringert wurde.
Validierungsstudien
Die Einlass- und Auslassperfusatproben wurden der Bestimmung des pH-Wertes und des Kaliumgehalts unterzogen. Die erhaltenen Ergebnisse (Abbildung 4) wurden dann mit den Ergebnissen verglichen, die in neueren Publikationen berichtet wurden15,16,17. Drei Mäuselebern wurden mit Sauerstoff durchblutet und mit Williams E-Medium für 12 h ergänzt. Während dieses Zeitraums wurde kontinuierlich ein stabiler Perfusionsdruck von 7 - 10 mmHg gemessen. Der mittlere pH-Wert war während der 12-stündigen Perfusion relativ stabil und lag zwischen 7,3 und 7,7. Die mittleren Kaliumspiegel waren ebenfalls während der gesamten Perfusionsperiode stabil und lagen zwischen 5,9 und 6,8 mmol/l (Abbildung 4). Die PV-Durchflussrate wurde in einem Bereich von 0,8 - 1,2 ml/min/g gehalten, abhängig von der Verwendung und Positionierung der Pumprohre während der experimentellen Verfahren. Alle Ergebnisse, die bei der Leberperfusion von Mäusen beobachtet wurden, zeigten Ähnlichkeiten mit zuvor berichteten Beobachtungen bei der Leberperfusion von Ratten (Tabelle 3).
Gewebeproben wurden aus drei Lebern (N = 3) entnommen und einer 12-stündigen Perfusion unterzogen, wobei das für die HE-Färbung optimierte Protokoll verwendet wurde, gefolgt von einem Scannen des gesamten Objektträgers. Jeder Leberlappen wurde mit einem modifizierten Suzuki-Score bewertet (Tabelle 4). Der klassische Suzuki-Score18 wurde durch die Einbeziehung von drei zusätzlichen Parametern erweitert: Pyknose der Zellkerne, Ablösung der Gefäße und Vorhandensein von Erythrozyten in Sinusoiden und großen Gefäßen. Jeder Parameter wurde als fehlend (0), leicht (1), mittel (2) und schwer (3) eingestuft. Eine Endnote von 0 - 7 wurde als gut erachtet, 8 - 14 als mäßig und 14 - 21 als schlechte Erhaltung.
Die Konservierung der Mäuseleber wurde anhand des modifizierten Suzuki-Scores beurteilt. Zwei medizinische Experten führten eine unabhängige Beurteilung der Morphologie der sieben Lappen der drei Lebern durch (Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7). Der Durchschnitt der sieben Lappenwerte für jeden Leberlappen wurde berechnet; Niedrigere Werte deuten auf eine besser erhaltene Leber hin. Die Bewertungen der Gutachter wiesen eine hohe Übereinstimmung auf. Bemerkenswert ist, dass bei der Beurteilung der Pyknose der Zellkerne zwar leichte Diskrepanzen in den von den beiden Experten vergebenen Scores beobachtet wurden, diese Variationen jedoch keinen signifikanten Einfluss auf die Gesamtergebnisse des Scorings hatten.
Bestenfalls war das Leberparenchym relativ intakt mit einer gut erhaltenen typischen lobulären Struktur, die kaum von einer normalen Leber zu unterscheiden war. Hepatozyten erschienen lebensfähig mit deutlich sichtbaren Zellmembranen und runden Zellkernen. Einige Zellkerne wurden jedoch einer Pyknose unterzogen, und einige hepatische Sinusoide waren leicht erweitert, was zu einem Wert von 4 führte. (Abbildung 3, Abbildung 6)
Im schlimmsten Fall war die lobuläre Struktur verzerrt, mit vom Parenchym abgelösten Gefäßen und konfluierender parenchymaler Nekrose. Auf zellulärer Ebene wurden die zelluläre Vakuolisierung und die Kernpyknose deutlich, insbesondere in der perizentralen Region. Des Weiteren wurde eine leichte bis mäßige Vakuolisierung beobachtet. Bis zu 30 % der Hepatozyten befanden sich in einer Nekrose, was zu einem maximalen Wert von 14 führte. (Abbildung 3, Abbildung 7)
Tabelle 1: Schritt-für-Schritt-Etablierung eines Leberperfusionsmodells der Maus. Während des Etablierungsprozesses wurden verschiedene Komplikationen aufgrund von Unterschieden in der Kanülengröße, dem Material und der Positionierung beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Vergleich der Methoden zur In-vitro-Organkonservierung 15,17,19,20,21,22. Die Optimierung der Perfusatauswahl, der Sauerstoffträgerauswahl und des Vergleichs der Nährstoffkomponenten ist unter verschiedenen Lagerbedingungen von entscheidender Bedeutung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: Hämodynamik und Blutgasanalyse bei gesunden Ratten und Ratten NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Die bereitgestellten Informationen beschreiben selektiv die hämodynamischen Merkmale der Rattenleber und Schlüsselparameter der normothermen Perfusion in vitro. Insbesondere kann die Rattenleberperfusion als optimal angesehen werden, wenn der PV-Druck typischerweise zwischen 4 und 10 mmHg liegt und der Partialdruck von Sauerstoff im Perfusat, der in die PV eintritt, zwischen 80 und 550 mmHg liegt, was die notwendigen Kriterien für eine erfolgreiche In-vitro-Rattenleberperfusion erfüllt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 4: Modifizierter Suzuki-Score. Der modifizierte Suzuki-Score, der in dieser Studie verwendet wurde, erweitert den klassischen Suzuki-Score, indem er drei zusätzliche Parameter einbezieht: Pyknose der Zellkerne, Ablösung von Gefäßen und das Vorhandensein von Erythrozyten in Sinusoiden und großen Gefäßen. Jedem Parameter wurde eine Note auf einer Skala von 0 (fehlend), 1 (leicht), 2 (mittelschwer) oder 3 (schwer) zugewiesen. Die Gesamtpunktzahl, die von 0 bis 8 reicht, weist auf eine gute Erhaltung hin. 9 bis 16 deutet auf eine mäßige Erhaltung hin, und 17 bis 24 auf eine schlechte Erhaltung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 5: Auswahl des Perfusatmediums, des Perfusatvolumens und des Perfusionsdrucks basierend auf einer Literaturrecherche zu NEVLP bei Ratten (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. Die normotherme maschinelle Perfusion in Rattenleber kann in Bezug auf die spezifische Art und das Volumen des verwendeten Perfusats sowie die Dauer der Perfusion eine Variabilität zwischen den Studien aufweisen. Verschiedene Studien können unterschiedliche Ansätze verwenden, wie z. B. Dialyse oder Perfusion mit hohem Volumen, über einen längeren Zeitraum. Trotz dieser Unterschiede weisen Parameter wie Pfortaderdruck, Pfortaderflussrate und Sauerstoffpartialdruck im Perfusat im Allgemeinen eine minimale Variation zwischen den verschiedenen verwendeten Methoden auf. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Perfusionssystems. Die Schlüsselkomponenten sind der Orgelraum, die Thermostatmaschine, die Rollenpumpe, der Oxygenator und das Reservoir. Das Perfusat wird aus dem Reservoir durch eine Peristaltikpumpe in einen Oxygenator gepumpt. Es gibt einen ununterbrochenen Gasfluss von 95 % O2 und 5 % CO2 im Oxygenator. Das Perfusat durchläuft die Blasenfalle, wo alle im Perfusat vorhandenen Luftblasen aufgefangen und zurück in das Reservoir gepumpt werden. Das verbleibende Perfusat fließt in den Orgelraum, wo der Schlauch mit der Pfortader verbunden wird. Der Perfusatabfluss aus dem Orgelraum wird durch die Peristaltikpumpe zurück in das Reservoir geleitet. Ein Gallendrainageschlauch ist mit der Orgelkammer verbunden, um die Galle aufzufangen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Nahaufnahme der Perfusionskammer. Die Organperfusionskammer besteht aus einem Perfusatein- und -auslass, einer Blasenfalle, einem Wärmetauscher und einer Gallensammelöffnung. Die Echtzeitüberwachung des Perfusatpumpendrucks erfolgt über einen Drucksensor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Histologische Befunde von normaler und perfundierter Mausleber. (A) Normale Lebermorphologie der Maus (Kontrolle). (B) Beispiel für eine am besten erhaltene Morphologie, dargestellt durch HE-Färbung nach 12 h Perfusion. (C). Beispiel für die am schlechtesten erhaltene Morphologie, dargestellt durch HE-Färbung nach 12 h Perfusion. Der schwarze Pfeil zeigt die Vakuolisierung an, der rote Pfeil zeigt auf eine sinusförmige Dilatation, der gelbe Pfeil zeigt die Pyknose der Zellkerne und der grüne Pfeil die Gefäßablösung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Perfusat-Analyse. pH-Wert (A) und Kaliumspiegel (B). Beide Parameter sind über die Beobachtungszeiten von 12 h stabil, was auf konstante Perfusionsbedingungen hinweist .
Abbildung 5: Leichte Leberschäden, die zu einem modifizierten Suzuki-Ergebnis von 4-7 führen. Nach 12-stündiger NEVLP wurde eine semiquantitative Beurteilung der Lebermorphologie durchgeführt. Proben aus jedem Leberlappen wurden separat bewertet und bewertet, was zu einer Spanne und einem Mittelwert für jede Leber führte, wobei die höchstmögliche Punktzahl 4 war. Gut erhaltene Lebermorphologie mit einem Score von 4-7 je nach Leberlappen (Mittelwert = 5) (Score 0-7: gut erhaltene Lebermorphologie, Score 8-14 mäßig erhaltene Morphologie, Score 15-21: schlecht erhaltene Lebermorphologie) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Mäßige Leberschädigung, die zu einem modifizierten Suzuki-Score von 7-14 führt. Semiquantitative Beurteilung der Lebermorphologie nach 12 Stunden normothermer oxygenierter maschineller Perfusion gemäß dem modifizierten Suzuki-Score. Mäßig erhaltene Morphologie mit einem Score von 7 bis 14 (Mittelwert = 11). (Ergebnis 0-7: gut erhaltene Lebermorphologie, Ergebnis 8-14 mäßig erhaltene Morphologie, Ergebnis 15-21: schlecht erhaltene Lebermorphologie) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Leichte bis mittelschwere Leberschäden, die zu einem modifizierten Suzuki-Score 5-11 führen. Die inhomogene Perfusion führte zu einer geringen bis mäßig erhaltenen Morphologie in verschiedenen Leberlappen mit Werten von 5 bis 11 (Mittelwert = 8). (Ergebnis 0-7: gut erhaltene Lebermorphologie, Ergebnis 8-14 mäßig erhaltene Morphologie, Ergebnis 15-21: schlecht erhaltene Lebermorphologie) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Kritische Schritte im Protokoll
Die beiden entscheidenden Schritte bei der Leberexplantation sind die Kanülierung der Pfortader (PV) und die anschließende Kanülierung des Gallengangs (BD). Diese Schritte sind von größter Bedeutung, um eine erfolgreiche Organentnahme und anschließende Perfusions- oder Transplantationsverfahren zu gewährleisten.
Herausforderungen und Lösungen
Die PV-Kanülierung stellt drei Herausforderungen dar: Verletzung der Gefäßwand, Verschiebung des Katheters und Praktikabilität des Einführprozesses. Die empfindliche Beschaffenheit der PV-Gefäßwand macht sie anfällig für Punktionen und anschließende Blutungen, wenn sie während der Kanülierung nicht sorgfältig gehandhabt wird. Darüber hinaus verringert jeder Blutverlust aus dem PV den Pfortaderdruck, was das Einführen der PV-Kanüle erschwert. Darüber hinaus kann eine Verletzung der Pfortadervenenwand Luftembolien in das intrahepatische Gefäßsystem einbringen. Daher ist Präzision und Vorsicht während des PV-Kanülierungsprozesses von entscheidender Bedeutung, um das Risiko von Komplikationen zu minimieren.
Bei der PV-Kanülierung ist das Risiko einer Katheterverschiebung ein häufiges Problem, insbesondere bei der Verwendung von Kanülen mit rutschigen Materialien. Im Vergleich zu Polypropylen ist die Verwendung von Polyurethankanülen für die PV-Kanülierung günstiger. Die weiche und biegsame Beschaffenheit von Polyurethan reduziert das Risiko einer Katheterverschiebung oder eines Katheterverlusts erheblich, was möglicherweise auf seine Materialeigenschaften zurückzuführen ist. Darüber hinaus minimiert die Verwendung einer weichen Kanüle die Wahrscheinlichkeit, dass die Endothelschicht der Blutgefäße beschädigt wird. In der Studie wurden drei Arten von Gefäßzugangskanülen, nämlich 24 G Polypropylen, 26 G Polypropylen und 2 Fr Polyurethan, für die PV-Kanülierung verglichen. Unter diesen Optionen zeigten sowohl die 26 G als auch die 2 Fr Polyurethankanülen eine bessere Kompatibilität mit der Größe der Maus PV. Während die 26-G-Kanüle eine bessere anatomische Kompatibilität aufwies, wurde die 2-Fr-Polyurethankanüle mit einem Außendurchmesser von 0,66 mm aufgrund ihrer einzigartigen Materialeigenschaften als geeignet für die beabsichtigte Anwendung erachtet, wodurch das Risiko einer unbeabsichtigten Katheterlösung aus dem PV effektiv minimiert wurde.
Hinsichtlich der Praktikabilität der Insertion wurden verschiedene Techniken getestet. Eine Möglichkeit besteht darin, die proximalen und distalen Enden des PV einzuklemmen, mit einer feinen Schere ein kleines Loch zu schneiden und die PV-Kanüle einzuführen. Diese Technik erfordert aufgrund der Komplexität und der Notwendigkeit gleichzeitiger Aktionen die Beteiligung einer zusätzlichen Person. Folglich ist es für einen einzelnen Mikrochirurgen nicht möglich, den Eingriff unabhängig durchzuführen. Daher wird ein Katheter mit einer inneren Nadel und einer äußeren Kanüle benötigt. Wie bereits beschrieben, besteht bei der Verwendung der handelsüblichen steifen und glatten 26 G Polypropylenkanüle die Gefahr des Herausrutschens und der Bildung von Luftblasen beim Anschluss der Kanüle an das Spülsystem. Um diese Bedenken auszuräumen, wurde ein selbst konstruiertes "nadelgeführtes Schlauchsystem" entwickelt, bei dem eine 26-G-Nadel aus einem Nadelkatheter in eine lange und biegsame Polyurethan-2-Fr-Kanüle eingeführt wurde. Dieser Ansatz bietet drei wesentliche Vorteile: (1) ein Kathetereinführungssystem, (2) einen langen und flexiblen Schlauch und (3) günstige Materialeigenschaften. Bei diesem Schritt ist jedoch Vorsicht geboten, um zu verhindern, dass die Nadelspitze beim Vorrücken die PV-Wand berührt, da dies zu irreversiblen Schäden an der Gefäßwand führen kann.
Die BD-Kanülierung stellte die gleichen drei Herausforderungen dar: Verletzung der Gefäßwand, Verschiebung des Katheters und Praktikabilität des Einführprozesses. Letztendlich wurde die Polyurethankanüle 1 Fr aufgrund ihrer günstigen Materialeigenschaften als geeigneter erachtet als die Polypropylenkanüle UT - 03. Trotz des etwas kleineren Außendurchmessers der UT-03-Kanüle (0,30 mm) im Vergleich zum thermosensitiven Polyurethan-Schlauch 1 Fr (0,33 mm) ist das Polyurethan-Material steif und weniger biegeanfällig. Auf der anderen Seite bietet die 1-Fr-Kanüle, die weich und flexibel ist, ein leichteres Einführen und wurde daher zu unserer bevorzugten Wahl. In Fällen, in denen die BD-Größe außergewöhnlich klein ist und die größere 2-Fr-Kanüle nicht aufgenommen werden kann, bleibt die UT-03-Kanüle jedoch eine praktikable Alternative. In solchen Fällen muss besonders darauf geachtet werden, dass die Kanüle nicht aus dem BD verdrängt wird.
Wie in der Literaturrecherche (Tabelle 5) zusammengefasst, verwendeten die meisten Experimentatoren 19,41,42,46 eine Pfortaderflussrate von 1 - 3 ml/min/g Leber. Die Durchflussmenge sollte jedoch so eingestellt werden, dass der physiologische Pfortaderdruck im Bereich von 4 - 10 mmHg28 gehalten wird. Ein hoher PV-Druck kann zu einer sinusförmigen Erweiterung und einer Gefäßablösung führen. Niedriger PV-Druck und niedrige PV-Durchflussrate können zu einer Hypooxygenierung mit niedrigem Durchfluss und anschließender mittelzonaler bis perizentraler Nekrose führen. Die Manipulation der PV-Durchflussrate dient der Regulierung des PV-Drucks, der je nach verwendeter Kanüle und Größe der Leber variieren kann, so dass geringfügige Anpassungen der PV-Durchflussrate erforderlich sind. In dieser Studie wurde die Perfusion also mit einer Flussrate von 1 ml/min/g Leber begonnen und gleichzeitig der PV-Druck mit einem Blutdruckwandler überwacht, um den physiologischen PV-Druck durch Anpassung der Flussrate aufrechtzuerhalten.
Bei der Entwicklung des NEVLP-Modells wurde versucht, die Sauerstoffversorgung der perfundierten Leber weiter zu verbessern, indem gewaschene rote Blutkörperchen in das Perfusat eingebracht wurden. Dennoch wurde eine signifikante Sedimentation der Erythrozyten in der großen Kammer und im Reservoir beobachtet, wodurch die Abgabe von Sauerstoffträgern an das Organ während der Perfusion verringert wurde. Darüber hinaus wurde die Schädigung der Erythrozyten durch die mechanische Wirkung der peristaltischen Perfusionspumpe verursacht, die das Perfusat durch Kompression eines Silikonschlauchs antreibt. Beide Gründe haben uns die Entscheidung erleichtert, in diesem Experiment keine roten Blutkörperchen zu verwenden. Sauerstoffträger auf Perfluorkohlenwasserstoffbasis könnten in der Lage sein, diese Probleme zu lösen47.
Um die Lebensfähigkeit des Lebertransplantats während der Perfusion zu beurteilen, wurde die Gallenflüssigkeit der Maus in Abständen von 3 Stunden entnommen. Dennoch ist es aufgrund der hohen Viskosität der Gallenflüssigkeit der Maus schwierig, die Galle über den Katheter zu gewinnen. Dies wird zunächst durch die Kapillarkräfte kompensiert, die durch den feinen 1 Fr Polyurethankatheter im BD induziert werden. Innerhalb der ersten Stunde des Experiments konnten jedoch nur etwa 20 μl Gallenflüssigkeit gewonnen werden. Anstatt durch die Kanüle zu drainieren, wurde eine retrograde Füllung der Gallenblase beobachtet.
Am Ende der 12-stündigen Perfusionszeit war die Gallenblase mit klarer Gallenflüssigkeit gefüllt, was auf eine aktive Gallenproduktion während der maschinellen Perfusion hindeutet. Dem kann möglicherweise entgegengewirkt werden, indem ein größerer Schlauch in die Gallenblase eingeführt wird.
In der Zwischenzeit wurde die histologische Schädigung der hepatischen zellulären und lobulären Struktur beurteilt, um das Ergebnis der Konservierung zu bestimmen. Es wurde beobachtet, dass selbst innerhalb derselben Leber die Konservierung inhomogen war. Die Inhomogenität der strukturellen Veränderungen deutet darauf hin, dass die Perfusion in der gesamten Leber heterogen war (Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7). Darüber hinaus liefern die histologischen Befunde Hinweise darauf, dass es möglich ist, die strukturelle Integrität des Lebertransplantats der Maus für eine Mindestdauer von 12 Stunden während der maschinellen Perfusion zu erhalten. Das Vorhandensein einer intakten Leberhistologie kann jedoch nur bei der Beurteilung helfen, aber die Funktion und Lebensfähigkeit der Leber nicht definitiv bestimmen. Es sollte beachtet werden, dass Nekrosen als ultimative Manifestation von Zellschäden möglicherweise erst in einem späteren Stadium ohne weiteres beobachtet werden können. Sich nur auf die histologische Beurteilung zu verlassen, liefert daher möglicherweise kein umfassendes Verständnis des funktionellen Status und der Lebensfähigkeit der Leber. Weitere ergänzende Assays und Auswertungen sind erforderlich, um den Gesamtzustand der Leber zu ermitteln, einschließlich funktioneller Assays, biochemischer Marker und der Beurteilung der Stoffwechselaktivität.
Eine gute Konservierung wurde nach 12 Stunden Perfusion erreicht. Um die Perfusionszeit weiter zu verlängern, wie es für die Organreparatur erforderlich ist, müssen jedoch einige Probleme behoben werden. Zunächst ist zu beachten, dass das Erreichen einer langfristigen Perfusionsdauer von mehr als 12 Stunden die Aufrechterhaltung steriler und nicht nur sauberer Bedingungen erfordern würde. Bei diesen ersten Experimenten lag der Schwerpunkt jedoch eher auf der Aufrechterhaltung sauberer als steriler Bedingungen, da die Gewährleistung der Sterilität das Verfahren zusätzlich komplex machen würde. Zweitens würde eine längere Perfusion möglicherweise die Hinzufügung einer Dialyseeinheit erfordern, wie von Herman Tolboom22 beschrieben, um angesammelte toxische Stoffwechselendprodukte zu entfernen. Sie verwendeten ein System mit einem Gesamtvolumen von 55 - 60 ml, um eine Rattenleber von 10 g für 4 h zu perfundieren. In dieser Studie wurde trotz der geringen Größe der Mausleber, die ca. 1 g wiegt, ein relativ großes Reservoir mit einem Gesamtvolumen von 300 ml verwendet. Diese Konfiguration führte zu einem zusätzlichen Verdünnungsfaktor von 50-fach. Bemerkenswert ist, dass während der 12-stündigen Perfusionszeit mit diesem Setup keine nachteiligen Auswirkungen beobachtet wurden. Drittens würde eine längere Perfusion auch die Zugabe von Sauerstoffträgern erfordern, bestenfalls in Form von künstlichem Hämoglobin, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu gewährleisten, wie von Dondossola et al.47 und Jägers et al.48 beschrieben.
Die Entwicklung der "nicht-ischämischen" Lebertransplantation auf der Grundlage von NEVLP hat zweifellos neue Ideen und Methoden zur Lösung oder sogar Vorbeugung des Problems der Ischämie-Reperfusionsverletzung hervorgebracht. NEVLP ist jedoch ein sehr vielversprechendes Konzept zur Verbesserung der Organkonservierung und seiner potenziellen Anwendung, um die Organkonservierung auf die Organreparatur auszudehnen47.
Derzeit werden drei verschiedene Techniken der maschinellen Perfusion experimentell und klinisch eingesetzt. Der Hauptunterschied ist die Arbeitstemperatur: hypotherme maschinelle Perfusion, subnomothermische maschinelle Perfusion und normotherme maschinelle Perfusion (Tabelle 2). Weitere Unterschiede sind die Wahl der Konservierungslösung, der Perfusatlösung und der Zugabe von Sauerstoffträgern (Tabelle 5).
NEVLP ist prinzipiell von Vorteil, weil (1) das Organ auf seiner normalen Temperatur gehalten wird, (2) es mit Sauerstoff angereichert wird und (3) es metabolisch vollständig versorgt wird. Das System bietet eine hervorragende Plattform für die diagnostische Auswertung, die Interventionstherapie und schließlich die Organreparatur49. NEVLP stellt jedoch eine große Herausforderung für die ex vivo Organunterstützungstechnologie dar. Die Herausforderung für NEVLP besteht darin, den nahezu physiologischen Zustand widerzuspiegeln. Bis vor kurzem wurde aufgrund der geringen Größe und des Fehlens standardisierter Bewertungskriterien nur eine begrenzte Anzahl von NEVLP-Studien an Nagetieren durchgeführt 25,26,27,28,29,30,31.
Hier konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem Mausmodell um ein valides Modell handelt, das eine Erhaltungszeit von 12 Stunden erlaubt. Im Vergleich dazu haben die meisten Rattenstudien Perfusionszeiten von 6 Stunden oder weniger berichtet28,33. Darüber hinaus ist die Verwendung von Kleintieren für molekulare Studien im Vergleich zu Großtieren von Vorteil, da reichlich Reagenzien zur Verfügung stehen und die Versuchskosten geringer sind. Zum Beispiel sind Mäuse derzeit eine bevorzugte Option für die Erprobung von Knockout-Modellen der ATG-Genfamilie, insbesondere für die Untersuchung von Signalwegen von Ischämie-Reperfusionsschäden in der Leber 8,50.
Experimente an Rattenlebern in Bezug auf NEVLP haben gezeigt, dass die normotherme maschinelle Perfusionserhaltung im Vergleich zur Kältekonservierung mit einer reduzierten hepatozellulären Schädigung und einem verbesserten frühen Überleben nach der Transplantation verbunden ist 31,40,51,52,53,54. NEVLP mit Rattenleber eignet sich auch für die Untersuchung der Zugabe von Medikamenten oder Zellen zum Perfusat. Ein beeindruckendes Beispiel ist die Studie von Xuan Tian26, der Hämoxygenase-1-modifizierte mesenchymale Stammzellen in Kombination mit normothermer maschineller Perfusion verwendete, um die Qualität von Lebertransplantaten über den Wnt-Signalweg zu verbessern. Haojie Wang,39, hat in seiner aktuellen Studie bestätigt, dass die Zugabe von mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark zum Perfusat die Qualität von NEVLP bei Ratten bei kurzzeitiger Perfusion erheblich verbessern kann. In ihrer Studie mit DCD-Lebern hemmten mesenchymale Stammzellen aus dem Knochenmark in Kombination mit NEVLP die Stauung des Sinusoidums in der Leber und die Endothelverletzung. Die Zugabe von mesenchymalen Stammzellen verhinderte die intrahepatische Makrophagenaktivierung und die interzelluläre Adhäsion. Darüber hinaus regulierte die Zugabe von mesenchymalen Stammzellen das Gleichgewicht zwischen Endothelin-1 und endothelialem Stickstoffmonoxid, um die Leberdurchblutung und Mikrozirkulation zu verbessern.
Mäuse bieten einen deutlichen Vorteil gegenüber Ratten, wenn es um NEVLP geht, insbesondere im Zusammenhang mit molekularen Studien, die sich auf transgene oder genetisch veränderte Lebern konzentrieren. Aufgrund der geringen Größe des Tieres stellt der Eingriff jedoch eine größere, aber überschaubare Herausforderung für den Mikrochirurgendar 37.
Bewertungssystem für die histologische Beurteilung
Die histologische Beurteilung ist entscheidend für die Bestimmung des Einflusses der Perfusionsbedingungen auf die morphologische Integrität des Transplantats.
Während der Suzuki-Score häufig in Studien zur Beurteilung der Leberpathologie verwendet wird, wurde festgestellt, dass dieses Scoring-System die spezifischen Ergebnisse, die bei der Ex-vivo-Leberkonservierung beobachtet wurden, möglicherweise nicht angemessen erfasst. Um dieser Einschränkung entgegenzuwirken, wurden vier zusätzliche Kriterien eingeführt, um die umfassende Bewertung von konserviertem Lebergewebe zu verbessern (Tabelle 4). Zunächst wurde die Bewertung der nukleären Pyknose eingeführt, da sie als wertvoller Parameter dient, der auf zelluläre Schäden hinweist. Zweitens wurde die Beurteilung der Gefäß- und Hepatozytenablösung, die eine Schädigung des Leberläppchens anzeigt, als zusätzliches Kriterium einbezogen. Schließlich wurde die Gradierung des Vorhandenseins von Erythrozyten in Sinusoiden als Indikator für heterogene Flushing und Perfusion verwendet. Durch die Einbeziehung dieser ergänzenden Kriterien wurde eine nuanciertere und genauere Beurteilung des Zustands des konservierten Lebergewebes erreicht, die ein tieferes Verständnis der Auswirkungen der ex-vivo-Leberkonservierung ermöglichte.
Die Vakuolisierung der Hepatozyten55 erfolgt nach Veränderungen der Substratnutzung, des Energieverbrauchs, des Zerfalls der Mikrotubuli und der Hemmung der Proteinsynthese. Der Zellkern der Hepatozyten wird durch große Vakuolen gezwungen, sich in Richtung Peripherie der Zelle zu verschieben. Dieser Prozess geht häufig mit einer nukleären Pyknose einher. In dieser Studie führte eine normotherme maschinelle Perfusion von 12 h zu unterschiedlichen Vakuolisierungsgraden der Hepatozyten im Vergleich zur Kontrolle, was auf eine inhomogene Perfusion hindeutet.
Das Vorhandensein von dilatierten Sinusoiden zwischen den Hepatozytensträngen war in dieser Studie bemerkenswert. Dieses Phänomen entsteht in erster Linie durch eine Obstruktion des hepatischen venösen Abflusses, die zu einer vaskulären Stauung und Stauung im Leberparenchym führt. In diesem Lebermodell der Maus könnten die Herausforderungen, die mit der Aufrechterhaltung eines konstanten Pfortaderperfusionsdrucks aufgrund der geringen Größe des Organs verbunden sind, zur beobachteten Erweiterung der hepatischen Sinusoide beitragen.
Nekrotische Veränderungen manifestieren sich typischerweise in Zellclustern, regionalen Bereichen oder bestimmten Zonen. Der gut durchblutete periportale Bereich zeigte im Vergleich zum perizentralen Bereich eine relativ bessere Erhaltung der Hepatozyten. Die Perfusion der Leber mit zwei Gefäßen, wie sie in der Leber der Ratte20 nachgewiesen wurde, stellt bei Mäuselebern aufgrund der geringen Größe der Leberarterie eine größere Herausforderung dar. Folglich kann die beobachtete inhomogene Perfusion der Mausleber zumindest teilweise auf diese Einschränkung zurückgeführt werden.
Diese Beobachtungen sind nicht nur auf Mäuselebern beschränkt, die sich einer NEVLP unterziehen, sondern können auch in histologischen Bildern aus anderen NEVLP-Studien visualisiert werden, obwohl sie möglicherweise nicht explizit beschrieben werden.
Bedeutung und Anwendungsmöglichkeiten von Maus-NEVLP
Die NEVLP von Mäuselebern ist ein anspruchsvolles, aber machbares Verfahren. Weitere Anstrengungen sind erforderlich, um diese Technologie optimal zu nutzen, um den Mechanismus aufzuklären, der der positiven Wirkung von NEVLP zugrunde liegt. Die Erweiterung unseres Wissens wird die fortschreitende Entwicklung dieser Technologie erleichtern und sie über die Organkonservierung hinaus in den Bereich der "Organreparatur" überführen.
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Disclosures
Es bestehen keine finanziellen Interessenkonflikte, die offengelegt werden müssen.
Acknowledgments
Während des Schreibens dieses Artikels habe ich viel Unterstützung und Hilfe erhalten. Besonders bedanken möchte ich mich bei meinem Teamkollegen XinPei Chen für die wunderbare Zusammenarbeit und die geduldige Unterstützung während meiner Operation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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