Summary
Een normotherm ex vivo leverperfusie (NEVLP) systeem werd gecreëerd voor muizenlevers. Dit systeem vereist ervaring in microchirurgie, maar zorgt voor reproduceerbare perfusieresultaten. Het vermogen om muizenlevers te gebruiken vergemakkelijkt het onderzoek van moleculaire routes om nieuwe perfusaatadditieven te identificeren en maakt de uitvoering van experimenten gericht op orgaanherstel mogelijk.
Abstract
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd erytrocytenvrij NEVLP-systeem met behulp van muizenlevers. Ex vivo conservering van muizenlevers werd bereikt door gebruik te maken van gemodificeerde canules en technieken die waren aangepast aan conventionele commerciële ex vivo perfusieapparatuur. Het systeem werd gebruikt om de conserveringsresultaten na 12 uur perfusie te evalueren. C57BL / 6J-muizen dienden als leverdonoren en de levers werden geëxplanteerd door de poortader (PV) en galwegen (BD) te cannuleren en vervolgens het orgaan te spoelen met warme (37 ° C) gehepariniseerde zoutoplossing. Vervolgens werden de geëxplanteerde levers overgebracht naar de perfusiekamer en onderworpen aan normotherme zuurstofrijke machineperfusie (NEVLP). Inlaat- en uitlaatperfuaatmonsters werden met tussenpozen van 3 uur verzameld voor perfuaatanalyse. Na voltooiing van de perfusie werden levermonsters verkregen voor histologische analyse, waarbij de morfologische integriteit werd beoordeeld met behulp van gemodificeerde Suzuki-Score door hematoxyline-eosine (HE) kleuring. De optimalisatie-experimenten leverden de volgende bevindingen op: (1) muizen met een gewicht van meer dan 30 g werden geschikter geacht voor het experiment vanwege de grotere omvang van hun galwegen (BD). (2) een 2 Fr (buitendiameter = 0,66 mm) polyurethaan canule was beter geschikt voor het cannuleren van de poortader (PV) in vergelijking met een polypropyleen canule. Dit werd toegeschreven aan de verbeterde grip van het polyurethaanmateriaal, wat resulteerde in minder slippen van de katheter tijdens de overdracht van het lichaam naar de orgaankamer. (3) voor cannulatie van de galwegen (BD) bleek een polyurethaancanule van 1 Fr (buitendiameter = 0,33 mm) effectiever te zijn in vergelijking met de polypropyleen UT - 03 (buitendiameter = 0,30 mm) canule. Met dit geoptimaliseerde protocol werden muizenlevers met succes bewaard voor een duur van 12 uur zonder significante impact op de histologische structuur. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring onthulde een goed bewaard gebleven morfologische architectuur van de lever, gekenmerkt door overwegend levensvatbare hepatocyten met duidelijk zichtbare kernen en milde verwijding van hepatische sinusoïden.
Introduction
Levertransplantatie vertegenwoordigt de gouden standaardbehandeling voor personen met een leverziekte in het eindstadium. Helaas overtreft de vraag naar donororganen het beschikbare aanbod, wat leidt tot een aanzienlijk tekort. In 2021 stonden ongeveer 24.936 patiënten op de wachtlijst voor een levertransplantatie, terwijl slechts 9.234 transplantaties succesvol werden uitgevoerd1. Het aanzienlijke verschil tussen vraag en aanbod van levertransplantaten benadrukt de dringende noodzaak om alternatieve strategieën te onderzoeken om de donorpool te verbreden en de toegankelijkheid van levertransplantaten te verbeteren. Een manier om de donorpool uit te breiden is het gebruik van marginale donoren2. Marginale donoren zijn mensen met gevorderde leeftijd, matige of ernstige steatose. Hoewel de transplantatie van marginale organen gunstige resultaten kan opleveren, blijven de algemene resultaten suboptimaal. Als gevolg hiervan is de ontwikkeling van therapeutische strategieën gericht op het verbeteren van de functie van marginale donoren momenteel aan de gang 3,4.
Een van de strategieën is om machineperfusie te gebruiken, met name normotherme zuurstofrijke machineperfusie, om de functie van deze marginale organen te verbeteren5. Er is echter nog steeds een beperkt begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gunstige effecten van normotherme zuurstofrijke machineperfusie (NEVLP). Muizen, met hun overvloedige beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen, dienen als waardevolle modellen voor het onderzoeken van moleculaire routes. Bijvoorbeeld, het belang van autofagie pathways bij het verminderen van hepatische ischemie-reperfusie letsel is in toenemende mate erkend 6,7. Een belangrijke moleculaire route in de hepatische ischemie-reperfusie schade is de miR-20b-5p/ATG7 pathway8. Momenteel zijn er een aantal ATG knock-out en voorwaardelijke knock-out muizenstammen beschikbaar, maar geen overeenkomstige rattenstammen9.
Op basis van deze achtergrond was het doel om een geminiaturiseerd NEVLP-platform voor muizenlevertransplantaten te genereren. Dit platform zou de verkenning en evaluatie van potentiële genetisch gemodificeerde strategieën vergemakkelijken die gericht zijn op het verbeteren van de functionaliteit van de lever van de donor. Bovendien was het essentieel dat het systeem geschikt was voor langdurige perfusie, waardoor de ex vivo behandeling van de lever mogelijk werd, gewoonlijk "orgaanreparatie" genoemd.
Gezien de beperkte beschikbaarheid van relevante in vitro gegevens over leverperfusie bij muizen, richtte het literatuuronderzoek zich op studies uitgevoerd bij ratten. Een systematische zoektocht van literatuur van 2010 tot 2022 werd uitgevoerd met behulp van trefwoorden zoals "normotherme leverperfusie", "ex vivo of in vitro" en "ratten". Deze zoektocht was gericht op het identificeren van optimale omstandigheden bij knaagdieren, waardoor we de meest geschikte aanpak konden bepalen.
Het perfusiesysteem bestaat uit een afgesloten glazen bufferreservoir met watermantel, een peristaltische rollenpomp, een oxygenator, een bellenvanger, een warmtewisselaar, een orgelkamer en een gesloten cyclusbuizensysteem (figuur 1). Het systeem zorgt voor een nauwkeurige handhaving van een constante perfusietemperatuur van 37 °C met behulp van een speciale thermostatische machine. De peristaltische rollenpomp drijft de stroom van het perfusaat door het hele circuit aan. Het perfusiecircuit begint bij het geïsoleerde wateromhulde reservoir. Vervolgens wordt het perfusaat door de oxygenator geleid, die een gasmengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide uit een speciale gasfles ontvangt. Na oxygenatie passeert het perfusaat de bellenvanger, waarbij eventuele ingesloten bellen door de peristaltische pomp terug naar het reservoir worden geleid. Het resterende perfusaat stroomt door de warmtewisselaar en komt in de orgelkamer, van waaruit het terugkeert naar het reservoir.
Hier rapporteren we onze ervaringen met het opzetten van een NEVLP voor muizenlevers en delen we de veelbelovende resultaten van een proefexperiment uitgevoerd met behulp van het zuurstofrijke medium zonder zuurstofdragers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierproeven werden uitgevoerd volgens de huidige Duitse regelgeving en richtlijnen voor dierenwelzijn en de ARRIVE-richtlijnen voor het rapporteren van dierproeven. Het protocol voor dierproeven is goedgekeurd door het Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thüringen, Duitsland (goedkeuringsnummer: UKJ - 17 - 106).
OPMERKING: Mannelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van 34 ± 4 g (gemiddelde ± standaardfout van de gemiddelde [SEM]) werden gebruikt als leverdonor. Ze werden onderhouden onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden (50% vochtigheid en 18 - 23 °C) met vrije toegang tot standaard muischow en water. Gedurende de gehele chirurgische ingreep werd een ademhalingsfrequentie van meer dan 60 ademhalingen/min gehandhaafd en werd de lichaamstemperatuur boven 34 °C gehouden.
1. Voorbereiding
- De operatietafel instellen
- Autoclaaf alle chirurgische instrumenten en verbruiksartikelen voor sterilisatiedoeleinden.
- Schakel alle apparatuur in, inclusief het verwarmingsbord en de elektrocoagulatie.
- Plaats een spuit van 50 ml met 25 ml gehepariniseerde (2.500 U/L) zoutoplossing in een warme couveuse (37 °C).
- Plaats de chirurgische instrumenten, de 6 - 0 zijden hechtdraad, steriele kleine katoenen applicator, veterinaire zoutoplossing (500 ml) en niet-geweven gaassponzen (10 cm x 10 cm) op de juiste manier op de operatietafel.
- Plaats een naald van 26 G op de operatietafel om een klein gaatje in het deksel van de microcentrifugebuis van 0,5 ml te maken om de galbuis te ontvangen voor galverzameling.
- Plaats de canule (1 Fr polyurethaan canule of UT - 03 polyethyleen canule) en een gesteriliseerde 0,5 ml microcentrifugebuis voor galopvang op de operatietafel.
- Zelfgemaakte poortadercanule
- Houd de 2 Fr canule met een tang vast en prik de wand door met een naald van 30 G op 1 cm afstand van het uiteinde van de canule. Duw de naald door de canule totdat de punt van de naald zichtbaar wordt.
- Snijd de punt van de canule af, wat resulteert in een scherpe driehoek.
- Bereiding van gehepariniseerde zoutoplossing
- Bereid 25 ml gehepariniseerde zoutoplossing met een eindconcentratie van 2.500 IE/ml.
- Verwijder alle luchtbellen en plaats de spuit in de couveuse van 40 °C.
- Demonstratie van het perfusiesysteem
- Zie figuur 1 voor de belangrijkste onderdelen van het machineperfusiesysteem.
- Opstelling van de orgelkamer
- Zie figuur 2 voor de indeling van de orgelkamer.
- Opstelling van het perfusiesysteem
- Schakel het labdiagramprogramma in voor drukbewaking.
- Sluit de drukkalibrator en druksensor aan op het niveau van de orgelkamer.
- Stel de drukkalibrator in op 0 mmHg en controleer de overeenkomstige waarde op de drukregelsoftware.
- Stel de drukkalibrator in op 20 mmHg en controleer nogmaals de overeenkomstige waarde op de drukregelingssoftware.
- Zet het waterbad aan en verwarm de orgelkamer voor op 40 °C.
- Spoel het hele sanitairsysteem twee keer met gedestilleerd gedeïoniseerd water gedurende 30 minuten elk, zodat de ontsmettingsoplossing volledig wordt verwijderd.
- Start de circulatie van de desinfectieoplossing door het hele systeem gedurende een duur van 20 minuten om een grondige desinfectie te garanderen.
- Zet het gasmengsel (95% zuurstof (O 2) en 5% koolstofdioxide (CO2) aan.
- Perfusaat vulling
- Supplement 250 ml van Williams ' E-medium met 50 ml foetaal runderserum, 3 ml penicilline / streptomycine (1 mg / ml), 0,17 ml insuline (100 IE / ml), 0,34 ml heparine (5000 U / ml) en 0,07 ml hydrocortison (100 mg / 2 ml) om het volledige Williams 'E-medium te bereiden.
- Voeg gelijke volumes (150 ml) perfusaat toe aan het reservoir en de orgelkamer om het systeem voor te bereiden.
OPMERKING: Speciale aandacht moet worden besteed aan het handhaven van de steriliteit tijdens het vulproces. Het perfusaat wordt constant door deze twee belangrijke componenten van de gesloten recirculerende machineperfusie gepompt. - Zet de peristaltische pomp op gemiddelde snelheid (15 ml / min) aan om het perfusiesysteem te primen met het zuurstofrijke medium.
2. Leverexplantatie
- Pre-operatieve voorbereiding
- Weeg het dier. Bereid het pijnstillend middel buprenorfine (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg lichaamsgewicht).
- Verbind de inductiekamer met het stopcontact. Zet de zuurstof op 0,5 L/min. Draai isofluraan naar 3%.
- Plaats het dier in de kamer totdat diepe anesthesie (rechtrichtreflex positief) is bereikt.
- Gebruik een microspuit om de aan het lichaamsgewicht aangepaste dosis analgesie subcutaan aan te brengen.
- Gebruik een elektrisch scheerapparaat om de vacht op de buikhuid te trimmen.
- Breng de muis over naar de operatietafel en zet de isofluraan vaporizer aan tot 2,5% om de anesthesie te behouden. Bevestig de diepte van de anesthesie door de interdigitale teenreflex te testen.
- Voorbereiding van de buik van de muis
- Plaats de muis in rugligging.
- Test interdigitale reflex om de juiste diepte van de anesthesie te bevestigen. Bevestig alle vier de ledematen met tape.
- Desinfecteer beide zijden van de buik tot de mid-oksellijn met behulp van drie opeenvolgende rondes jodiumalcohol. Gebruik niet-geweven gesteriliseerd gaas om het gebied rond het chirurgische veld te bedekken.
- Maak een transversale incisie van 3 cm 1 cm onder de xiphoid in de buikstreek van de muis met behulp van een Metzenbaum-babyschaar en een chirurgische tang.
- Verleng de huidincisie bilateraal naar de midaxillaire lijn aan beide zijden.
- Maak voorzichtig een longitudinale incisie van 2 cm langs de linea alba met behulp van een voorjaarsschaar.
- Knip de buikspierlaag door met elektrocoagulatie en Vannas veerschaar.
- Plaats voorzichtig een stuk nat gaas om de lever te beschermen tegen elektrocoagulatie.
- Gebruik een 6 - 0 zijden hechting met de ronde naald om het xiphoid-proces in te trekken voor een betere blootstelling van het coronaire ligament.
- Gebruik twee rib retractors om de buikholte van de muis volledig bloot te leggen.
- Beweeg de dunne darm voorzichtig uit de buikholte met een nat wattenstaafje om het hilum volledig bloot te leggen.
- Gemeenschappelijke galwegvoorbereiding
- Transect de falciforme, phrenic en gastrohepatische ligamenten met een scherpe schaar.
- Maak het gemeenschappelijke galkanaal voorzichtig vrij met een fijne gebogen tang zonder tanden.
OPMERKING: Het gemeenschappelijke galkanaal is zeer gemakkelijk beschadigd en breekt. Zodra het breekt, kan het niet meer worden gecannuleerd. Vanwege de richting van de anatomische positie is een gebogen tang beter te gebruiken. - Plaats twee 6 - 0 zijden hechtlussen over het gemeenschappelijke galkanaal ter voorbereiding op de volgende stap.
- Gemeenschappelijke galwegcannulatie
- Prik voorzichtig door het galkanaal met een naald van 30 G. Gebruik een puntige gebogen tang om het kleine gaatje te vergroten zodat het in de galwegcannulatie past.
- Gebruik een vaatcannulatietang om de galwegcanule vast te pakken en in het galkanaal te duwen.
- Zet de canule dubbel vast met de vooraf ingestelde 6 - 0 hechtlussen.
OPMERKING: Tijdens de cannulatie wordt weerstand door gal gevoeld. Als de kracht niet goed wordt gecontroleerd, wordt de canule uit de galwegen geduwd door de druk van galuitstroom. Pas de diepte van de canule zorgvuldig aan. Als het te diep is, kan het de galwegen beschadigen en als het niet diep genoeg is, kan het uitglijden. - Observeer de galstroom in de canule na succesvolle cannulatie.
- Portaaladervoorbereiding
- Klem de poortader vast met een platte tang en maak het bindweefsel voorzichtig vrij met een gebogen tang. Trek niet hard om te voorkomen dat de poortader scheurt. Zodra de poortader is beschadigd, is het moeilijk om de poortader opnieuw te kannuleren.
- Ontleed de PV net superieur aan de bifurcatie en plaats de eerste hechtlus met behulp van 6 - 0 zijdehechting op PV dicht bij de samenvloeiing voor later gebruik.
- Plaats de tweede hechtlus voor latere fixatie van de PV zo dicht mogelijk bij de leverhilum.
- Portaalader cannulatie
- Gebruik een arteriële clip om de distale poortader te sluiten.
- Prik heel voorzichtig de poortader door met een van de bovenstaande portaladercanules. De bloedstroom kan duidelijk worden waargenomen in de canule na een succesvolle punctie.
- Bevestig de PV-canule met de vooraf geplaatste 6 - 0 hechtlus.
- Blozen van de lever
- Verhoog isofluraan tot 5% en euthanaseer de muis met een overdosis isofluraaninhalatie.
- Neem voorverwarmde heparine zoutoplossing uit de incubator. Verwijder alle luchtbellen gevormd in de gehepariniseerde zoutoplossing.
- Bevestig de spuit met voorverwarmde gehepariniseerde zoutoplossing in de spuitpomp.
- Sluit de verlengbuis van de spuitpomp aan op de canule van de poortader, stel de snelheid in op 2 ml / min en start het spoelen van de lever.
- Observeer de kleur van de lever aan het einde van de spoelprocedure. Snijd de lever weg zodra de kleur homogeen geel wordt.
- Transect het diafragma, suprahepatische inferieure vena cava, infra hepatische vena cava, leverslagader, distale poortader en eventueel overblijvend bindweefsel.
- Plaats de lever in de petrischaal.
3. Lever- en kamerverbinding
- Leveroverdracht
- Breng de lever voorzichtig over in de orgaankamer met behulp van een petrischaaltje.
- Bewaar een kleine hoeveelheid zoutoplossing in de petrischaal om te voorkomen dat de lever uitdroogt.
OPMERKING: Portaalader en galwegen kunnen gemakkelijk worden gedraaid tijdens deze procedure, wat de leverperfusie en galverzameling kan beïnvloeden.
- Portaal ader canule verbinding
- Infundeer langzaam normale zoutoplossing in de poortadercanule met een spuit om de luchtbellen in de canule te evacueren.
- Sluit de poortadercanule aan op de perfusate uitstroombuis in de orgelkamer.
- Galwegcanule aansluiting
- Leid de galkanaalcanule van de muis door de klep van een rubberen dop die is verbonden met de orgelkamer.
- Plaats de galwegcanule in een vooraf voorbereide microbuis van 0,5 ml met een klein gaatje in het deksel.
- Plaats de microbuis op klei buiten de orgelkamer.
4. Pas het debiet aan volgens de PV-druk
- Zet de peristaltische pomp aan vanaf 1 ml/min.
- Controleer de poortaderdrukmeting om het debiet aan te passen.
- Houd de poortaderdruk in het fysiologische bereik tussen 7 - 10 mmHg door het debiet aan te passen.
OPMERKING: Het nominale debiet kan enigszins variëren, afhankelijk van het gebruik en de positionering van buizen.
5. Monsterverzameling
- Verkrijg inlaatperfuaatmonsters uit de poortaderinstroombuis en uitlaatperfusaatmonsters uit de orgelkamer met intervallen van 3 uur.
- Verzamel monsters van alle leverkwabben voor histologische analyse aan het einde van de perfusieperiode van 12 uur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vaststelling van de chirurgische procedure
In totaal werden 17 dieren gebruikt voor dit experiment: 14 muizen werden gebruikt voor het optimaliseren van het orgaanverkrijgingsproces, inclusief cannulatie van de poortader (PV) en galwegen (BD), terwijl 3 muizen werden gebruikt om de procedure te valideren (tabel 1). Histologische resultaten (figuur 3) werden vergeleken om de identificatie van de optimale perfusieconditie te vergemakkelijken.
Selectie van perfusate
Voor deze studie werd een eerder gebruikt hepatocytenkweekmedium geselecteerd10,11. William's E-medium werd oorspronkelijk ontworpen door Williams en Gunn als een serum-gereduceerd medium voor langdurige in vitro kweek van volwassen rattenleverepitheelcellen12. Niettemin heeft het ook nut gevonden bij het ondersteunen van de groei en het onderhoud van knaagdierhepatocyten13. Foetaal runderserum (FBS) is een veel gebruikt celkweeksupplement vanwege de rijke samenstelling van essentiële voedingsstoffen en groeifactoren die celgroei, proliferatie en levensvatbaarheid vergemakkelijken14. Complete William's E-medium werd gebruikt als het perfusaat (tabel 2), dat wordt aangevuld met 20% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 5.000 U / L heparine, 50 U / L insuline en 0,010 g / L hydrocortison.
Selectie van canules
De cannulatieprocedure omvatte eerst het cannuleren van het galkanaal (BD) voor galvochtverzameling, gevolgd door de cannulatie van de poortader (PV). Voor BD-cannulatie werd aanvankelijk een UT-03 polypropyleen buis met een buitendiameter van 0,3 mm en een binnendiameter van 0,18 mm gebruikt. Vanwege bezorgdheid over mogelijke BD-schade en het hogere risico op onbedoelde katheterverplaatsing in verband met de bijgesneden en stijve UT-03-tip, werd echter de voorkeur gegeven aan de 1 Fr polyurethaanbuizen. De polyurethaan buizen, met hun zachtere materiaal en verminderde gladheid, werden geschikter geacht voor BD-cannulatie.
Aanvankelijk werd een 26 G polypropyleen intraveneuze naaldcanule gebruikt voor het cannuleren van de poortader (PV). Het verwijderen van de naald en de daaropvolgende bevestiging van de canule aan de perfusiebuis resulteerde echter in de vorming van bellen, die het potentieel hadden om de intrahepatische sinusoïden te belemmeren. Om dit probleem op te lossen, werd een inwonende canule geconstrueerd met behulp van een naald van 30 G die in de distale 1 cm van een 2 Fr polyurethaan canule werd ingebracht. Deze zelfgemaakte "naaldgeleide canule" werd vervolgens ingebracht in de distale PV boven de samenvloeiing. Terwijl de katheter in de PV werd geplaatst, werd de naald langzaam teruggetrokken terwijl tegelijkertijd de buis werd verplaatst. Het uiteinde van de zelfgemaakte canule was verbonden met de perfusiebuis in de kamer. Het gebruik van een zacht materiaal in deze cannulatietechniek bood een voordeel door het risico op letsel aan de achterwand van het vat te verminderen.
Validatiestudies
Inlaat- en uitlaatperfusaatmonsters werden onderworpen aan de bepaling van pH- en kaliumgehalten. De verkregen resultaten (figuur 4) werden vervolgens vergeleken met de bevindingen gerapporteerd in recente publicaties15,16,17. Drie muizenlevers werden gedurende 12 uur doordrenkt met zuurstof en aangevuld met William's E-medium. Gedurende deze periode werd continu een stabiele perfusiedruk van 7 - 10 mmHg geregistreerd. De gemiddelde pH was relatief stabiel gedurende de 12 uur perfusie en varieerde tussen 7,3 en 7,7. De gemiddelde kaliumspiegels waren ook stabiel gedurende de perfusieperiode en varieerden tussen 5,9 en 6,8 mmol / L (figuur 4). Het PV-debiet werd binnen een bereik van 0,8 - 1,2 ml/min/g gehouden, afhankelijk van het gebruik en de positionering van pompbuizen tijdens de experimentele procedures. Alle resultaten waargenomen bij leverperfusie bij muizen vertoonden overeenkomsten met eerder gerapporteerde waarnemingen bij leverperfusie bij ratten (tabel 3).
Weefselmonsters werden verzameld uit drie levers (N = 3) en werden onderworpen aan 12 uur perfusie met behulp van het geoptimaliseerde protocol voor HE-kleuring, gevolgd door het scannen van hele dia's. Elke leverkwab werd gescoord met behulp van een aangepaste Suzuki-score (tabel 4). De klassieke Suzuki-score18 werd aangevuld met drie extra parameters: pyknosis van kernen, loslating van bloedvaten en aanwezigheid van erytrocyten in sinusoïden en grote vaten. Elke parameter werd beoordeeld als afwezig (0), mild (1), matig (2) en ernstig (3). Een eindscore van 0 - 7 werd beschouwd als een weerspiegeling van goed behoud, 8 - 14 werd beschouwd als matig behoud en 14 - 21 duidde op slecht behoud.
Het behoud van de muizenlevers werd beoordeeld op basis van de aangepaste Suzuki-score. Twee medische experts voerden een onafhankelijke beoordeling uit van de morfologie van de zeven lobben van de drie levers (figuur 5, figuur 6, figuur 7). Het gemiddelde van de zeven kwabscores voor elke leverkwab werd berekend; lagere scores duiden op een beter bewaarde lever. De door de deskundigen uitgevoerde evaluaties vertoonden een hoge mate van overeenstemming. Met name hoewel kleine discrepanties in de scores die door de twee deskundigen werden toegekend, werden waargenomen bij de beoordeling van de pyknosis van kernen, hadden deze variaties geen significante invloed op de algehele scoreresultaten.
In het beste geval was het leverparenchym relatief intact met een goed bewaard gebleven typische lobulaire structuur, nauwelijks te onderscheiden van een normale lever. Hepatocyten bleken levensvatbaar met duidelijk zichtbare celmembranen en ronde kernen. Sommige kernen ondergingen echter een pyknosis en sommige hepatische sinusoïden waren licht verwijd, wat resulteerde in een score van 4. (Figuur 3, figuur 6)
In het slechtste geval was de lobulaire structuur vervormd, met vaten losgemaakt van het parenchym en confluente parenchymale necrose. Op cellulair niveau werden cellulaire vacuolisatie en nuclei pyknosis duidelijk, vooral in het pericentrale gebied. Verder werd lichte tot matige vacuolisatie waargenomen. Tot 30% van de hepatocyten onderging necrose, wat resulteerde in een maximale score van 14. (Figuur 3, Figuur 7)
Tabel 1: Stapsgewijze vaststelling van een leverperfusiemodel bij muizen. Tijdens het vestigingsproces werden verschillende complicaties waargenomen als gevolg van verschillen in canulegrootte, materiaal en positionering. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Vergelijking van in vitro orgaanconserveringsmethoden 15,17,19,20,21,22. De optimalisatie van perfusaatselectie, zuurstofdragerselectie en vergelijking van voedingscomponenten is cruciaal onder verschillende opslagomstandigheden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Hemodynamiek en bloedgasanalyse bij normale ratten en raten NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. De verstrekte informatie beschrijft selectief de hemodynamische kenmerken van rattenlever en de belangrijkste parameters van normotherme perfusie in vitro. In het bijzonder kan de leverperfusie van ratten als optimaal worden beschouwd wanneer de PV-druk meestal varieert van 4 tot 10 mmHg, en de partiële druk van zuurstof in het perfusaat dat de PV binnenkomt, varieert van 80 tot 550 mmHg, wat voldoet aan de noodzakelijke criteria voor succesvolle leverperfusie bij ratten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Gewijzigde Suzuki score. De aangepaste Suzuki-score die in deze studie wordt gebruikt, breidt de klassieke Suzuki-score uit door drie extra parameters op te nemen: pyknosis van kernen, loslating van bloedvaten en de aanwezigheid van erytrocyten in sinusoïden en grote vaten. Elke parameter kreeg een cijfer toegewezen op een schaal van 0 (afwezig), 1 (mild), 2 (matig) of 3 (ernstig). De totaalscore, variërend van 0 tot 8, duidt op een goede conservering; 9 tot 16 suggereert matig behoud en 17 tot 24 duidt op slecht behoud. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 5: Selectie van perfusaatmedium, perfusaatvolume en perfusiedruk op basis van een literatuuronderzoek van NEVLP bij ratten (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. Normothermische machineperfusie in rattenlever kan variabiliteit vertonen tussen studies in termen van het specifieke type en volume van het gebruikte perfusaat, evenals de duur van de perfusie. Verschillende studies kunnen verschillende benaderingen gebruiken, zoals dialyse of hoogvolumeperfusie, gedurende langere perioden. Ondanks deze verschillen vertonen parameters zoals portale druk, poortaderdebiet en partiële druk van zuurstof in het perfusaat over het algemeen minimale variatie tussen de verschillende gebruikte methoden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Figuur 1: Schematisch schema van het perfusiesysteem. De belangrijkste componenten zijn de orgelkamer, thermostatische machine, rollenpomp, oxygenator en reservoir. Het perfusaat wordt door een peristaltische pomp uit het reservoir in een oxygenator gepompt. Er is een ononderbroken gasstroom van 95% O2 en 5% CO2 in de oxygenator. Het perfusaat gaat door de bellenvanger, waar eventuele luchtbellen die in het perfusaat aanwezig zijn, worden opgevangen en teruggepompt naar het reservoir. Het resterende perfusaat stroomt naar de orgelkamer, waar de buis is verbonden met de poortader. De perfusaatuitstroom uit de orgelkamer wordt door de peristaltische pomp terug naar het reservoir geleid. Een galdrainagebuis is verbonden met de orgaankamer om gal te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Close-up van de perfusiekamer. De orgaanperfusiekamer bestaat uit een perfusate inlaat en uitlaat, een bellenvanger, een warmtewisselaar en een galopvangpoort. Real-time bewaking van de perfusaat pompdruk wordt bereikt met behulp van een druksensor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Histologische resultaten van normale en doordrenkte muizenlevers. (A) Normale morfologie van de muizenlever (controle). (B) Voorbeeld van best bewaarde morfologie zoals gevisualiseerd door HE-kleuring na 12 uur perfusie. (C). Voorbeeld van slechtst bewaarde morfologie zoals gevisualiseerd door HE-kleuring na 12 uur perfusie. De zwarte pijl geeft vacuolisatie aan, de rode pijl wijst naar sinusoïdale dilatatie, de gele pijl toont de pyknosis van kernen en de groene pijl geeft vasculaire loslating aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Perfusaatanalyse. Ph (A) en kaliumgehalte (B). Beide parameters zijn stabiel gedurende de waarnemingstijden van 12 uur, wat wijst op constante perfusieomstandigheden Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kleine leverschade met als gevolg een aangepaste Suzuki score 4-7. Na 12 uur NEVLP werd een semikwantitatieve beoordeling van de levermorfologie uitgevoerd. Monsters van elke leverkwab werden afzonderlijk beoordeeld en beoordeeld, wat resulteerde in een bereik en een gemiddelde score voor elke lever, met de hoogst mogelijke score van 4. Goed bewaarde levermorfologie met een score variërend van 4-7 afhankelijk van de leverkwab (gemiddelde = 5) (Score 0-7: goed bewaarde levermorfologie, score 8-14 matig geconserveerde morfologie, score 15-21: slecht geconserveerde levermorfologie) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Matige leverschade resulterend in een aangepaste Suzuki score 7-14. Semikwantitatieve beoordeling van levermorfologie na 12 uur normotherme zuurstofrijke machineperfusie volgens de gewijzigde Suzuki-score. Matig bewaarde morfologie met een score variërend van 7 tot 14 (gemiddelde = 11). (Score 0-7: goed bewaarde levermorfologie, score 8-14 matig geconserveerde morfologie, score 15-21: slecht bewaarde levermorfologie) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Kleine - matige leverschade resulterend in een aangepaste Suzuki score 5-11. De inhomogene perfusie resulteerde in een kleine tot matige geconserveerde morfologie in verschillende leverkwabben, met scores variërend van 5 tot 11 (gemiddelde = 8). (Score 0-7: goed bewaarde levermorfologie, score 8-14 matig geconserveerde morfologie, score 15-21: slecht bewaarde levermorfologie) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritieke stappen in het protocol
De twee cruciale stappen bij leverexplantatie zijn de cannulatie van de poortader (PV) en de daaropvolgende cannulatie van het galkanaal (BD). Deze stappen zijn van het grootste belang voor het succesvol ophalen van organen en de daaropvolgende perfusie- of transplantatieprocedures.
Uitdagingen en oplossingen
PV-cannulatie brengt drie uitdagingen met zich mee: letsel van de vaatwand, verplaatsing van de katheter en uitvoerbaarheid van het inbrengproces. De delicate aard van de PV-vatwand maakt het vatbaar voor punctie en daaropvolgende bloedingen als het niet zorgvuldig wordt behandeld tijdens de cannulatie. Bovendien vermindert elk bloedverlies van de PV de poortdruk, waardoor het inbrengen van de PV-canule uitdagender wordt. Bovendien kan een verwonding aan de portale veneuze wand luchtembolieën in het intrahepatische vasculaire systeem brengen. Daarom is het van cruciaal belang om precisie en voorzichtigheid te betrachten tijdens het PV-cannulatieproces om het risico op complicaties te minimaliseren.
Tijdens PV-cannulatie is het risico van katheterverplaatsing een veel voorkomende zorg, vooral bij het gebruik van canules met gladde materialen. In vergelijking met polypropyleen is het gebruik van polyurethaan canules gunstiger voor PV-cannulatie. De zachte en buigzame aard van polyurethaan vermindert het risico op verplaatsing of verlies van katheters aanzienlijk, mogelijk toegeschreven aan de materiaaleigenschappen. Bovendien minimaliseert het gebruik van een zachte canule de kans op beschadiging van de endotheellaag van bloedvaten. In de studie werden drie soorten vasculaire toegangscanules, namelijk 24 G polypropyleen, 26 G polypropyleen en 2 Fr polyurethaan, vergeleken voor PV-cannulatie. Onder deze opties toonden zowel de 26 G als 2 Fr polyurethaan canules een betere compatibiliteit met de grootte van de muis PV. Terwijl de canule van 26 G een betere anatomische compatibiliteit vertoonde, werd de 2 Fr polyurethaan canule met een buitendiameter van 0,66 mm geschikt geacht voor de beoogde toepassing vanwege zijn unieke materiaaleigenschappen, waardoor het risico van onbedoelde katheterloslating van de PV effectief werd geminimaliseerd.
Met betrekking tot de uitvoerbaarheid van insertie werden verschillende technieken getest. Een manier is om de proximale en distale uiteinden van de PV vast te klemmen, een klein gaatje te knippen met een fijne schaar en de PV-canule in te brengen. Deze techniek vereist de betrokkenheid van een extra persoon vanwege de complexiteit en de vereiste voor gelijktijdige acties. Bijgevolg is het voor een enkele microchirurg niet haalbaar om de procedure zelfstandig uit te voeren. Daarom is een katheter met een binnennaald en een buitencanule nodig. Zoals eerder beschreven, brengt het gebruik van de in de handel verkrijgbare stijve en gladde 26 G polypropyleen canule het risico met zich mee dat er uitglijdt en dat er luchtbellen ontstaan bij het aansluiten van de canule op het spoelsysteem. Om deze zorgen weg te nemen, werd een zelfgebouwd "naaldgeleid buissysteem" bedacht door een naald van 26 G uit een naaldkatheter in te brengen in een lange en buigzame polyurethaan 2 Fr canule. Deze aanpak biedt drie belangrijke voordelen: (1) een katheter-inbrengsysteem, (2) een lange en flexibele buis en (3) gunstige materiaaleigenschappen. Tijdens deze stap is het echter van cruciaal belang om voorzichtig te zijn om te voorkomen dat de naaldpunt tijdens het oprukken in contact komt met de PV-wand, omdat dit onomkeerbare schade aan de vaatwand kan veroorzaken.
BD-cannulatie bracht dezelfde drie uitdagingen met zich mee: letsel van de vaatwand, verplaatsing van de katheter en uitvoerbaarheid van het inbrengproces. Uiteindelijk werd de 1 Fr polyurethaan canule geschikter geacht dan de UT - 03 polypropyleen canule vanwege de gunstige materiaaleigenschappen. Ondanks de iets kleinere buitendiameter van de UT - 03 canule (0,30 mm) in vergelijking met de 1 Fr thermogevoelige polyurethaanbuis (0,33 mm), is het polyurethaanmateriaal stijf en minder gevoelig voor buigen. Aan de andere kant biedt de 1 Fr canule, die zacht en flexibel is, gemakkelijker in te brengen en werd zo onze voorkeurskeuze. In gevallen waarin de BD-grootte uitzonderlijk klein is en niet geschikt is voor de grotere 2 Fr-canule, blijft de UT - 03-canule echter een levensvatbaar alternatief. In dergelijke gevallen moet speciale aandacht worden besteed aan het voorkomen van de verplaatsing van de canule uit de BD.
Zoals samengevat in het literatuuronderzoek (tabel 5), gebruikten de meeste experimentatoren 19,41,42,46 een portale stroomsnelheid van 1 - 3 ml / min / g lever. Het debiet moet echter worden aangepast om de fysiologische portale druk in het bereik van 4 - 10 mmHg28 te houden. Hoge PV-druk kan sinusoïdale dilatatie en vasculaire loslating veroorzaken. Lage PV-druk en lage PV-stroomsnelheid kunnen resulteren in een lage stroom hypo-oxygenatie met daaropvolgende mid-zonale tot pericentrale necrose. De manipulatie van het PV-debiet dient de functie van het reguleren van de PV-druk, die kan variëren afhankelijk van de gebruikte canule en de grootte van de lever, waardoor kleine aanpassingen aan het PV-debiet nodig zijn. Dus in deze studie werd perfusie gestart met een stroomsnelheid van 1 ml / min / g lever, en tegelijkertijd werd de PV-druk gecontroleerd met behulp van een bloeddrukomvormer om de fysiologische PV-druk te handhaven door de stroomsnelheid aan te passen.
Tijdens de ontwikkeling van het NEVLP-model werd geprobeerd de zuurstoftoevoer naar de doordrenkte lever verder te verbeteren door gewassen rode bloedcellen aan het perfusaat toe te voegen. Niettemin werd significante sedimentatie van erytrocyten waargenomen in de grote kamer en het reservoir, waardoor de levering van zuurstofdragers aan het orgaan tijdens perfusie werd verminderd. Bovendien werd schade aan erytrocyten veroorzaakt door de mechanische werking van de peristaltische perfusiepomp, die het perfusaat aandrijft door een siliciumbuis samen te drukken. Beide redenen vergemakkelijkten onze beslissing om geen rode bloedcellen te gebruiken in dit experiment. Op perfluorkoolstof gebaseerde zuurstofdragers kunnen deze problemen mogelijk oplossen47.
Om de levensvatbaarheid van het levertransplantaat tijdens perfusie te beoordelen, werd galvloeistof van muizen met tussenpozen van 3 uur verzameld. Toch is het moeilijk om gal via de katheter op te vangen vanwege de hoge viscositeit van muizengalvloeistof. Dit wordt in eerste instantie gecompenseerd door de capillaire krachten die worden geïnduceerd door de fijne 1 Fr polyurethaankatheter die in de BD is geplaatst. Echter, slechts ongeveer 20 μL galvloeistof kon worden verzameld binnen het eerste uur van het experiment. In plaats van af te tappen via de canule, werd retrograde vulling van de galblaas waargenomen.
Aan het einde van de perfusieperiode van 12 uur was de galblaas gevuld met helder galvocht dat wijst op actieve galproductie tijdens machineperfusie. Dit kan mogelijk worden tegengegaan door een grotere buis in de galblaas te plaatsen.
In de tussentijd werd de histologische schade van de levercellulaire en lobulaire structuur beoordeeld om het resultaat van conservering te bepalen. Er werd waargenomen dat zelfs binnen dezelfde lever het behoud inhomogeen was. De inhomogeniteit van de structurele veranderingen suggereert dat de perfusie heterogeen was in de hele lever (figuur 5, figuur 6, figuur 7). Bovendien leveren de histologische bevindingen bewijs dat het haalbaar is om de structurele integriteit van het muizenlevertransplantaat te behouden gedurende een minimale duur van 12 uur tijdens machineperfusie. De aanwezigheid van intacte leverhistologie kan echter alleen helpen bij de beoordeling, maar kan de functie en levensvatbaarheid van de lever niet definitief bepalen. Opgemerkt moet worden dat necrose, als de ultieme manifestatie van cellulaire schade, mogelijk pas in een later stadium gemakkelijk waarneembaar is. Het is dus mogelijk dat alleen vertrouwen op histologische beoordeling geen volledig inzicht biedt in de functionele status en levensvatbaarheid van de lever. Andere aanvullende testen en evaluaties zijn nodig om de algehele toestand van de lever vast te stellen, inclusief functionele assays, biochemische markers en beoordeling van metabole activiteit.
Een goede conservering werd bereikt na 12 uur perfusie. Het verder verlengen van de perfusietijd als mogelijk nodig is voor orgaanreparatie vereist echter het aanpakken van enkele problemen. Ten eerste moet worden opgemerkt dat het bereiken van langdurige perfusieduur van meer dan 12 uur het handhaven van steriele omstandigheden vereist in plaats van alleen schone omstandigheden. In deze eerste experimenten lag de focus echter op het handhaven van schone omstandigheden in plaats van steriele omstandigheden, omdat het waarborgen van steriliteit extra complexiteit aan de procedure zou toevoegen. Ten tweede zou langere perfusie mogelijk het toevoegen van een dialyse-eenheid vereisen, zoals beschreven door Herman Tolboom22, om zich ophopende giftige metabole afvalproducten te verwijderen. Ze gebruikten een systeem met een totaal volume van 55 - 60 ml om een rattenlever van 10 g gedurende 4 uur te perfuseren. In deze studie werd een relatief groot reservoir met een totaal volume van 300 ml gebruikt, ondanks de kleine omvang van de muizenlever, die ongeveer 1 g weegt. Deze configuratie resulteerde in een extra verdunningsfactor van 50 keer. Opmerkelijk genoeg werden er geen nadelige effecten waargenomen tijdens de perfusieperiode van 12 uur met deze opstelling. Ten derde zou langere perfusie ook de toevoeging van zuurstofdragers vereisen, in het beste geval in de vorm van kunstmatig hemoglobine om voldoende zuurstoftoevoer te garanderen, zoals beschreven door Dondossola et al.47 en Jägers et al.48.
De ontwikkeling van "niet-ischemische" levertransplantatie op basis van NEVLP heeft ongetwijfeld nieuwe ideeën en methoden gebracht om het probleem van ischemie-reperfusieschade op te lossen of zelfs te voorkomen. NEVLP is echter een veelbelovend concept voor het verbeteren van orgaanbehoud en de mogelijke toepassing ervan om orgaanbehoud uit te breiden naar orgelreparatie47.
Momenteel worden drie verschillende technieken van machineperfusie experimenteel en klinisch gebruikt. Het belangrijkste verschil is de werktemperatuur: hypothermische machineperfusie, subnomothermische machineperfusie en normotherme machineperfusie (tabel 2). Andere verschillen zijn de keuze van de conserveringsoplossing, de perfusaatoplossing en de toevoeging van zuurstofdragers (tabel 5).
NEVLP is vooral van voordeel omdat (1) het orgaan op zijn normale temperatuur wordt gehouden, (2) het zuurstofrijk is en (3) het metabolisch volledig wordt geleverd. Het systeem biedt een uitstekend platform voor diagnostische evaluatie, interventietherapie en uiteindelijk orgaanherstel49. NEVLP vormt echter een grote uitdaging voor de ex vivo orgaanondersteuningstechnologie. De uitdaging voor NEVLP is om de bijna-fysiologische toestand te spiegelen. Tot voor kort werd vanwege de kleine omvang en het ontbreken van standaard evaluatiecriteria slechts een beperkt aantal NEVLP-onderzoeken naar knaagdieren uitgevoerd 25,26,27,28,29,30,31.
Hier is aangetoond dat het muismodel een geldig model is dat een bewaartijd van 12 uur mogelijk maakt. Ter vergelijking: de meeste rattenstudies hebben perfusietijden van 6 uur of mindergemeld 28,33. Bovendien is het gebruik van kleine dieren van voordeel voor moleculaire studies in vergelijking met grote dieren vanwege de beschikbaarheid van overvloedige reagentia en de lagere experimentele kosten. Muizen zijn momenteel bijvoorbeeld een voorkeursoptie voor het testen van knock-outmodellen van de ATG-genfamilie, vooral voor het bestuderen van signaalroutes van ischemie-reperfusieletsel in de lever 8,50.
Experimenten met rattenlevers met betrekking tot NEVLP hebben aangetoond dat normotherm machineperfusiebehoud geassocieerd is met verminderde hepatocellulaire schade en verbeterde vroege overleving na transplantatie in vergelijking met koudebehoud 31,40,51,52,53,54. NEVLP met behulp van rattenlevers is ook geschikt voor het bestuderen van de toevoegingen van geneesmiddelen of cellen aan het perfusaat. Een indrukwekkend voorbeeld is de studie van Xuan Tian26, die heemoxygenase-1 gemodificeerde mesenchymale stamcellen in combinatie met normotherme machineperfusie gebruikte om de kwaliteit van levertransplantaten via de Wnt-signaleringsroute te verbeteren. Haojie Wang39 heeft in zijn recente studie bevestigd dat het toevoegen van mesenchymale stamcellen uit het beenmerg aan het perfusaat de kwaliteit van NEVLP bij ratten voor kortstondige perfusie aanzienlijk kan verbeteren. In hun studie met DCD-levers remden mesenchymale stamcellen van het beenmerg in combinatie met NEVLP hepatische sinusoïdale congestie en endotheelletsel. De toevoeging van mesenchymale stamcellen voorkwam intrahepatische macrofaagactivatie en intercellulaire adhesie. Bovendien reguleerde de toevoeging van mesenchymale stamcellen de endotheline-1 / endotheliale stikstofmonoxidebalans om de leverperfusie en microcirculatie te verbeteren.
Muizen bieden een duidelijk voordeel ten opzichte van ratten als het gaat om NEVLP, vooral in de context van moleculaire studies gericht op transgene of genetisch gemodificeerde levers. Vanwege de kleine omvang van het dier vormt de procedure echter een grotere maar beheersbare uitdaging voor de microchirurg37.
Beoordelingssysteem voor histologische beoordeling
De histologische beoordeling is bepalend voor het bepalen van de impact van perfusiecondities op de morfologische integriteit van het transplantaat.
Hoewel de Suzuki-score vaak wordt gebruikt in onderzoeken naar leverpathologie, is opgemerkt dat dit scoresysteem de specifieke bevindingen die zijn waargenomen bij ex-vivo leverconservering mogelijk niet adequaat vastlegt. Om deze beperking aan te pakken, werden vier aanvullende criteria ingevoerd om de uitgebreide evaluatie van geconserveerd leverweefsel te verbeteren (tabel 4). Ten eerste werd de opname van nucleaire pyknosisbeoordeling geïmplementeerd, omdat deze dient als een waardevolle parameter die indicatief is voor cellulaire schade. Ten tweede werd de evaluatie van het loslaten van vaten en hepatocyten, wat schade aan de leverkwab betekent, als een aanvullend criterium opgenomen. Ten slotte werd de gradatie van de aanwezigheid van erytrocyten in sinusoïden gebruikt als een indicator van heterogeen blozen en perfusie. Door deze aanvullende criteria op te nemen, werd een meer genuanceerde en nauwkeurige beoordeling van de toestand van het geconserveerde leverweefsel bereikt, waardoor een dieper inzicht werd verkregen in de effecten van ex-vivo leverconservering.
Hepatocytenvacuolisatie55 treedt op na veranderingen in substraatgebruik, energieverbruik, desintegratie van microtubuli en remming van eiwitsynthese. De kern van de hepatocyt wordt door grote vacuolen gedwongen te verschuiven naar de periferie van de cel. Dit proces gaat vaak gepaard met nucleaire pyknosis. In deze studie leidde 12 uur normotherme machineperfusie tot verschillende graden van vacuolisatie van hepatocyten in vergelijking met de controle die inhomogene perfusie suggereert.
De aanwezigheid van verwijde sinusoïden tussen hepatocytenstrengen was opmerkelijk in deze studie. Dit fenomeen ontstaat voornamelijk door lever veneuze uitstroomobstructie, wat leidt tot vasculaire stasis en congestie binnen het leverparenchym. In dit muizenlevermodel kunnen de uitdagingen die gepaard gaan met het handhaven van een consistente portale perfusiedruk als gevolg van de kleine omvang van het orgaan bijdragen aan de waargenomen verwijding van hepatische sinusoïden.
Necrotische veranderingen manifesteren zich meestal in celclusters, regionale gebieden of specifieke zones. Het goed doordrenkte periportaalgebied vertoonde een relatief beter behoud van hepatocyten in vergelijking met het pericentrale gebied. Leverperfusie met twee vaten, zoals aangetoond bij rattenlevers20, vormt een grotere uitdaging bij muizenlevers vanwege de kleine omvang van de leverslagader. Bijgevolg kan de waargenomen inhomogene perfusie van de muizenlever, althans gedeeltelijk, aan deze beperking worden toegeschreven.
Deze waarnemingen zijn niet exclusief voor muizenlevers die NEVLP ondergaan, maar kunnen ook worden gevisualiseerd in histologische beelden uit andere NEVLP-onderzoeken, hoewel ze mogelijk niet expliciet worden beschreven.
Belang en potentiële toepassingen van muis NEVLP
NEVLP van muizenlevers is een uitdagende maar haalbare procedure. Verdere inspanningen zijn nodig om optimaal gebruik te maken van deze technologie om het mechanisme dat ten grondslag ligt aan het gunstige effect van NEVLP op te helderen. Het verbeteren van onze kennis zal de progressieve evolutie van deze technologie vergemakkelijken, waardoor het voorbij orgaanbehoud naar het rijk van "orgaanreparatie" gaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen financiële belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Tijdens het schrijven van dit artikel heb ik veel steun en hulp gekregen. Ik wil in het bijzonder mijn teamgenoot XinPei Chen bedanken voor zijn geweldige samenwerking en geduldige ondersteuning tijdens mijn operatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B.
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N.
- van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
