Summary
Un système de perfusion hépatique ex vivo normothermique (NEVLP) a été créé pour les foies de souris. Ce système nécessite de l’expérience en microchirurgie mais permet des résultats de perfusion reproductibles. La capacité d’utiliser des foies de souris facilite l’étude des voies moléculaires pour identifier de nouveaux additifs perfusats et permet l’exécution d’expériences axées sur la réparation d’organes.
Abstract
Ce protocole présente un système NEVLP optimisé sans érythrocytes utilisant des foies de souris. La préservation ex vivo des foies de souris a été réalisée en utilisant des canules modifiées et des techniques adaptées de l’équipement de perfusion ex vivo commercial conventionnel. Le système a été utilisé pour évaluer les résultats de la préservation après 12 heures de perfusion. Les souris C57BL / 6J ont servi de donneurs de foie, et les foies ont été explantés en canulant la veine porte (PV) et le canal biliaire (BD), puis en rinçant l’organe avec une solution saline héparinée chaude (37 ° C). Ensuite, les foies explantés ont été transférés dans la chambre de perfusion et soumis à une perfusion machine oxygénée normotherme (NEVLP). Des échantillons de perfusat à l’entrée et à la sortie ont été prélevés à intervalles de 3 heures pour analyse du perfusat. À la fin de la perfusion, des échantillons de foie ont été obtenus pour analyse histologique, l’intégrité morphologique étant évaluée à l’aide de Suzuki-Score modifié par coloration à l’hématoxyline-éosine (HE). Les expériences d’optimisation ont donné les résultats suivants: (1) les souris pesant plus de 30 g ont été jugées plus appropriées pour l’expérience en raison de la plus grande taille de leur canal biliaire (BD). (2) une canule en polyuréthane de 2 Fr (diamètre extérieur = 0,66 mm) était mieux adaptée à la canulation de la veine porte (PV) qu’une canule en polypropylène. Cela a été attribué à l’adhérence accrue du matériau polyuréthane, ce qui a réduit le glissement du cathéter lors du transfert du corps à la chambre de l’organe. (3) pour la canulation des voies biliaires (BD), une canule en polyuréthane de 1 Fr (diamètre extérieur = 0,33 mm) s’est avérée plus efficace que la canule en polypropylène UT - 03 (diamètre extérieur = 0,30 mm). Avec ce protocole optimisé, les foies de souris ont été préservés avec succès pendant une durée de 12 h sans impact significatif sur la structure histologique. La coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) a révélé une architecture morphologique bien préservée du foie, caractérisée par des hépatocytes principalement viables avec des noyaux clairement visibles et une légère dilatation des sinusoïdes hépatiques.
Introduction
La transplantation hépatique représente le traitement de référence pour les personnes atteintes d’une maladie hépatique terminale. Malheureusement, la demande de donneurs d’organes dépasse l’offre disponible, ce qui entraîne une pénurie importante. En 2021, environ 24 936 patients étaient sur la liste d’attente pour une greffe de foie, alors que seulement 9 234 greffes ont été réalisées avec succès1. La disparité importante entre l’offre et la demande de greffons hépatiques souligne la nécessité urgente d’étudier des stratégies alternatives pour élargir le bassin de donneurs et améliorer l’accessibilité des greffes de foie. Une façon d’élargir le bassin de donneurs est d’utiliser des donneurs marginaux2. Les donneurs marginaux comprennent ceux qui ont un âge avancé, une stéatose modérée ou sévère. Bien que la transplantation d’organes marginaux puisse donner des résultats favorables, les résultats globaux restent sous-optimaux. En conséquence, l’élaboration de stratégies thérapeutiques visant à renforcer la fonction des donneurs marginaux est actuellement en cours 3,4.
L’une des stratégies consiste à utiliser la perfusion machine, en particulier la perfusion machine oxygénée normotherme, pour améliorer la fonction de ces organes marginaux5. Cependant, il existe encore une compréhension limitée des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets bénéfiques de la perfusion oxygénée normothermique (NEVLP). Les souris, avec leur disponibilité abondante de souches génétiquement modifiées, servent de modèles précieux pour étudier les voies moléculaires. Par exemple, l’importance des voies d’autophagie dans l’atténuation des lésions d’ischémie-reperfusion hépatique est de plus en plus reconnue 6,7. Une voie moléculaire importante dans la lésion d’ischémie-reperfusion hépatique est la voie miR-20b-5p/ATG78. Actuellement, il existe un certain nombre de souches de souris knock-out ATG et knock-out conditionnelles disponibles, mais aucune souche de ratcorrespondante 9.
Sur la base de ce contexte, l’objectif était de générer une plate-forme NEVLP miniaturisée pour les greffes de foie de souris. Cette plateforme faciliterait l’exploration et l’évaluation de stratégies potentielles génétiquement modifiées visant à améliorer la fonctionnalité du foie du donneur. De plus, il était essentiel que le système soit adapté à la perfusion à long terme, permettant le traitement ex vivo du foie, communément appelé « réparation d’organes ».
Compte tenu de la disponibilité limitée de données in vitro pertinentes sur la perfusion du foie de souris, la revue de la littérature s’est concentrée sur des études menées chez le rat. Une recherche systématique dans la littérature couvrant la période de 2010 à 2022 a été effectuée à l’aide de mots clés tels que « perfusion hépatique normothermique », « ex vivo ou in vitro » et « rats ». Cette recherche visait à identifier les conditions optimales chez les rongeurs, nous permettant de déterminer l’approche la plus appropriée.
Le système de perfusion se compose d’un réservoir tampon en verre scellé à chemise d’eau, d’une pompe à rouleaux péristaltiques, d’un oxygénateur, d’un piège à bulles, d’un échangeur de chaleur, d’une chambre d’orgue et d’un système fermé de tubes de cyclage (figure 1). Le système assure le maintien précis d’une température de perfusion constante de 37 °C à l’aide d’une machine thermostatique dédiée. La pompe à rouleaux péristaltiques entraîne le flux du perfusat dans tout le circuit. Le circuit de perfusion commence au niveau du réservoir isolé à chemise d’eau. Par la suite, le perfusat est dirigé à travers l’oxygénateur, qui reçoit un mélange gazeux de 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone provenant d’une bouteille de gaz dédiée. Après l’oxygénation, le perfusat passe à travers le piège à bulles, dans lequel toutes les bulles piégées sont redirigées vers le réservoir par la pompe péristaltique. Le perfusat restant s’écoule à travers l’échangeur de chaleur et pénètre dans la chambre de l’orgue, d’où il retourne au réservoir.
Ici, nous rapportons nos expériences d’établissement d’un NEVLP pour les foies de souris et partageons les résultats prometteurs d’une expérience pilote réalisée en utilisant le milieu oxygéné sans transporteurs d’oxygène.
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Protocol
Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à la réglementation et aux directives allemandes en vigueur en matière de bien-être animal et aux directives ARRIVE pour la déclaration de la recherche animale. Le protocole d’expérimentation animale a été approuvé par le Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thuringe, Allemagne (numéro d’agrément: UKJ - 17 - 106).
NOTE: Des souris mâles C57BL / 6J pesant 34 ± 4 g (moyenne ± erreur type de la moyenne [SEM]) ont été utilisées comme donneurs de foie. Ils ont été maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (50% d’humidité et 18 - 23 ° C) avec un accès gratuit à la souris standard et à l’eau. Tout au long de l’intervention chirurgicale, une fréquence respiratoire supérieure à 60 respirations/min a été maintenue et la température corporelle a été maintenue au-dessus de 34 °C.
1. Préparation
- Configuration de la table des opérations
- Autoclave tous les instruments chirurgicaux et consommables à des fins de stérilisation.
- Allumez tout l’équipement, y compris la planche chauffante et l’électrocoagulation.
- Placer une seringue de 50 mL contenant 25 mL de solution saline héparinée (2 500 U/L) dans un incubateur chaud (37 °C).
- Placez les instruments chirurgicaux, la suture en soie 6 - 0, l’applicateur de petit coton stérile, la solution saline vétérinaire (500 ml) et les éponges de gaze non tissées (10 cm x 10 cm) sur la table d’opération de manière appropriée.
- Placez une aiguille de 26 g sur la table d’opération pour créer un petit trou dans le couvercle du tube microcentrifuge de 0,5 mL pour recevoir le tube biliaire pour la collecte de la bile.
- Placez la canule (canule en polyuréthane 1 Fr ou canule en polyéthylène UT - 03) et un tube microcentrifuge stérilisé de 0,5 mL pour la collecte de la bile sur la table d’opération.
- Canule de veine porte fabriquée par soi-même
- Tenez la canule 2 Fr avec une pince et percez la paroi avec une aiguille de 30 G à une distance de 1 cm de l’extrémité de la canule. Poussez l’aiguille à travers la canule jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille devienne visible.
- Coupez la pointe de la canule pour obtenir un triangle pointu.
- Préparation de solution saline héparinée
- Préparer 25 mL de solution saline héparinée avec une concentration finale de 2 500 UI/mL.
- Retirez toutes les bulles d’air et placez la seringue dans l’incubateur à 40 °C.
- Démonstration du système de perfusion
- Voir la figure 1 pour les principaux composants du système de perfusion de la machine.
- Mise en place de la chambre de l’orgue
- Voir la figure 2 pour la disposition de la chambre de l’orgue.
- Mise en place du système de perfusion
- Activez le programme de diagramme de laboratoire pour la surveillance de la pression.
- Connectez le calibrateur de pression et le capteur de pression au niveau de la chambre de l’orgue.
- Ajustez le calibrateur de pression pour lire 0 mmHg et vérifiez la valeur correspondante sur le logiciel de contrôle de pression.
- Ajustez le calibrateur de pression pour lire 20 mmHg et vérifiez à nouveau la valeur correspondante sur le logiciel de contrôle de pression.
- Allumez le bain-marie et préchauffez la chambre de l’orgue à 40 °C.
- Rincer l’ensemble du système de plomberie deux fois avec de l’eau distillée désionisée pendant 30 minutes chacun, en assurant l’élimination complète de la solution désinfectante.
- Initier la circulation de la solution de désinfection dans tout le système pendant une durée de 20 minutes pour assurer une désinfection complète.
- Allumez le mélange gazeux (95 % d’oxygène (O2) et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
- Remplissage perfusé
- Compléter 250 mL de milieu E de Williams avec 50 mL de sérum bovin fœtal, 3 mL de pénicilline/streptomycine (1 mg/mL), 0,17 mL d’insuline (100 IE/mL), 0,34 mL d’héparine (5000 U/mL) et 0,07 mL d’hydrocortisone (100 mg/2 mL) pour préparer le milieu E complet de Williams.
- Ajouter des volumes égaux (150 mL) de perfusat au réservoir et à la chambre de l’orgue pour amorcer le système.
NOTE: Une attention particulière doit être accordée au maintien de la stérilité pendant le processus de remplissage. Le perfusat est constamment pompé à travers ces deux composants clés de la perfusion de la machine de recirculation fermée. - Allumez la pompe péristaltique à vitesse moyenne (15 mL/min) pour amorcer le système de perfusion avec le milieu oxygéné.
2. Explantation hépatique
- Préparation préopératoire
- Pesez l’animal. Préparer l’analgésique buprénorphine (0,3 mg/mL) (0,05 mg/kg de poids corporel).
- Connectez la chambre d’induction à la prise murale. Porter l’oxygène à 0,5 L/min. Tourner l’isoflurane à 3%.
- Placez l’animal dans la chambre jusqu’à ce qu’une anesthésie profonde (réflexe de redressement positif) soit atteinte.
- Utilisez une micro-seringue pour appliquer une dose d’analgésie adaptée au poids corporel par voie sous-cutanée.
- Utilisez un rasoir électrique pour couper la fourrure sur la peau abdominale.
- Transférez la souris sur la table d’opération et allumez le vaporisateur d’isoflurane à 2,5% pour maintenir l’anesthésie. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe interdigital de l’orteil.
- Préparation de l’abdomen de la souris
- Placez la souris en décubitus dorsal.
- Testez le réflexe interdigital pour confirmer deux fois la profondeur appropriée de l’anesthésie. Fixez les quatre membres avec du ruban adhésif.
- Désinfecter les deux côtés de l’abdomen jusqu’à la ligne axillaire médiane en utilisant trois cycles consécutifs d’alcool iodé. Utilisez de la gaze stérilisée non tissée pour couvrir la zone autour du champ chirurgical.
- Faites une incision transversale de 3 cm à 1 cm sous la xiphoïde dans la région abdominale de la souris à l’aide de ciseaux Metzenbaum et de forceps chirurgicaux.
- Étendre l’incision cutanée bilatéralement à la ligne midaxillaire des deux côtés.
- Faites soigneusement une incision longitudinale de 2 cm le long de la linea alba à l’aide de ciseaux à ressort.
- Coupez à travers la couche musculaire abdominale avec l’électrocoagulation et les ciseaux à ressort Vannas.
- Placez soigneusement un morceau de gaze humide pour protéger le foie de l’électrocoagulation.
- Utilisez une suture de soie 6 - 0 avec l’aiguille ronde pour rétracter le processus xiphoïde pour une meilleure exposition du ligament coronaire.
- Utilisez deux rétracteurs de côtes pour exposer complètement la cavité abdominale de la souris.
- Déplacez soigneusement l’intestin grêle hors de la cavité abdominale avec un coton-tige humide pour exposer complètement le hile.
- Préparation des voies cholédoques
- Transecter les ligaments falciformes, phréniques et gastrohépatiques avec des ciseaux tranchants.
- Libérez soigneusement le canal cholédoque à l’aide de fines pinces incurvées sans dents.
REMARQUE: Le canal cholédoque est très facilement endommagé et se brise. Une fois qu’il se brise, il ne peut pas être canulé. En raison de la direction de la position anatomique, il est préférable d’utiliser des pinces incurvées. - Placez deux boucles de suture en soie 6 - 0 sur le canal cholédoque en préparation de l’étape suivante.
- Canulation des voies biliaires
- Percez soigneusement le canal biliaire avec une aiguille de 30 G. Utilisez des pinces incurvées pointues pour agrandir le petit trou afin de l’adapter à la canulation des canaux biliaires.
- Utilisez une pince à canulation vasculaire pour saisir la canule des voies biliaires et la pousser dans le canal biliaire.
- Fixez deux fois la canule avec les boucles de suture prédéfinies 6 - 0.
REMARQUE: Pendant la canulation, la résistance par la bile est ressentie. Si la force n’est pas bien contrôlée, la canule sera poussée hors des voies biliaires par la pression de l’écoulement de la bile. Ajustez soigneusement la profondeur de la canule. S’il est trop profond, il peut endommager le canal biliaire, et s’il n’est pas assez profond, il peut glisser. - Observez l’écoulement de la bile dans la canule après une canulation réussie.
- Préparation de la veine porte
- Serrez la veine porte avec une pince plate et libérez soigneusement le tissu conjonctif avec une pince incurvée. Ne tirez pas fort pour éviter de provoquer une déchirure de la veine porte. Une fois que la veine porte est endommagée, il est difficile de ré-canuler la veine porte.
- Disséquez le PV juste au-dessus de la bifurcation et placez la première boucle de suture en utilisant une suture de soie 6 - 0 sur PV près de la confluence pour une utilisation ultérieure.
- Placez la deuxième boucle de suture pour une fixation ultérieure du PV aussi près que possible du hile hépatique.
- Canulation de la veine porte
- Utilisez un clip artériel pour fermer la veine porte distale.
- Très soigneusement, percez la veine porte avec l’une des canules de la veine porte ci-dessus. Le flux sanguin peut être clairement observé dans la canule après une ponction réussie.
- Fixez la canule PV avec la boucle de suture 6 - 0 pré-placée.
- Bouffées vasomotrices du foie
- Augmenter l’isoflurane à 5% et euthanasier la souris avec une surdose d’isoflurane inhalée.
- Prenez une solution saline d’héparine préchauffée de l’incubateur. Enlevez toutes les bulles d’air formées à l’intérieur de la solution saline héparinisée.
- Fixez la seringue avec une solution saline héparinée préchauffée dans la pompe à seringue.
- Connectez le tube d’extension de la pompe à seringue à la canule de la veine porte, réglez la vitesse à 2 mL/min et commencez le rinçage du foie.
- Observez la couleur du foie à la fin de la procédure de rinçage. Excise le foie une fois que la couleur devient jaune homogène.
- Transecter le diaphragme, la veine cave inférieure suprahépatique, la veine cave infra-hépatique, l’artère hépatique, la veine porte distale et tout tissu conjonctif restant.
- Placez le foie dans la boîte de Pétri.
3. Connexion du foie et de la chambre
- Transfert de foie
- Transférer soigneusement le foie dans la chambre de l’organe à l’aide d’une boîte de Pétri.
- Gardez une petite quantité de solution saline dans la boîte de Petri pour empêcher le foie de se dessécher.
REMARQUE: La veine porte et le canal biliaire peuvent facilement être tordus au cours de cette procédure, ce qui peut affecter la perfusion hépatique et la collecte de la bile.
- Raccord de canule de veine porte
- Infuser lentement une solution saline normale dans la canule de la veine porte avec une seringue pour évacuer les bulles d’air dans la canule.
- Connectez la canule de la veine porte au tube d’écoulement perfusat de la chambre de l’orgue.
- Raccord de canule biliaire
- Guidez la canule du canal biliaire de la souris à travers la valve d’un capuchon en caoutchouc qui est relié à la chambre de l’organe.
- Insérez la canule biliaire dans un microtube prépréparé de 0,5 mL avec un petit trou dans le couvercle.
- Placez le microtube sur de l’argile à l’extérieur de la chambre de l’orgue.
4. Ajustez le débit en fonction de la pression PV
- Allumez la pompe péristaltique à partir de 1 mL/min.
- Vérifiez la lecture de la pression de la veine porte pour ajuster le débit.
- Maintenir la pression de la veine porte dans la plage physiologique comprise entre 7 et 10 mmHg en ajustant le débit.
NOTE: Le débit nominal peut varier légèrement en fonction de l’utilisation et du positionnement des tubes.
5. Prélèvement d’échantillons
- Obtenir des échantillons de perfusat d’entrée à partir du tube d’entrée de la veine porte et des échantillons de perfusat de sortie de la chambre d’orgue à intervalles de 3 heures.
- Prélever des échantillons de tous les lobes du foie pour analyse histologique à la fin de la période de perfusion de 12 h.
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Representative Results
Mise en place d’une intervention chirurgicale
Au total, 17 animaux ont été utilisés pour cette expérience: 14 souris ont été utilisées pour optimiser le processus d’obtention d’organes, y compris la canulation de la veine porte (PV) et du canal biliaire (BD), tandis que 3 souris ont été utilisées pour valider la procédure (tableau 1). Les résultats histologiques (Figure 3) ont été comparés pour faciliter l’identification de l’état optimal de perfusion.
Sélection du perfusat
Un milieu de culture hépatocytes précédemment utilisé a été sélectionné pour cette étude10,11. Le milieu E de William a été initialement conçu par Williams et Gunn comme milieu réduit au sérum pour la culture in vitro prolongée de cellules épithéliales hépatiques de rats matures12. Néanmoins, il a également trouvé une utilité pour soutenir la croissance et le maintien des hépatocytes de rongeurs13. Le sérum bovin fœtal (FBS) est un supplément de culture cellulaire largement utilisé en raison de sa riche composition en nutriments essentiels et en facteurs de croissance qui facilitent la croissance, la prolifération et la viabilitécellulaires 14. Le milieu E complet de William a été utilisé comme perfusat (tableau 2), qui est complété par 20 % de sérum bovin fœtal, 1 % de pénicilline/streptomycine, 5 000 U/L d’héparine, 50 U/L d’insuline et 0,010 g/L d’hydrocortisone.
Sélection de canule
La procédure de canulation consistait d’abord à canuler le canal biliaire (BD) pour le prélèvement des liquides biliaires, puis à canuler la veine porte (PV). Pour la canulation BD, un tube en polypropylène UT-03 d’un diamètre extérieur de 0,3 mm et d’un diamètre intérieur de 0,18 mm a été initialement utilisé. Cependant, en raison des préoccupations concernant les dommages potentiels au BD et le risque plus élevé de déplacement involontaire du cathéter associé à l’extrémité coupée et rigide de l’UT-03, une préférence a été accordée aux tubes en polyuréthane 1 Fr . Les tubes en polyuréthane, avec leur matériau plus doux et leur glissement réduit, ont été jugés plus appropriés pour la canulation BD.
Initialement, une canule intraveineuse en polypropylène de 26 G a été utilisée pour canuler la veine porte (PV). Cependant, le retrait de l’aiguille et la fixation ultérieure de la canule au tube de perfusion ont entraîné la formation de bulles, qui avaient le potentiel d’obstruer les sinusoïdes intrahépatiques. Pour surmonter ce problème, une canule à demeure a été construite à l’aide d’une aiguille de 30 G insérée dans le 1 cm distal d’une canule en polyuréthane 2 Fr. Cette « canule guidée par aiguille » fabriquée par l’homme a ensuite été insérée dans le PV distal au-dessus de la confluence. Lorsque le cathéter a été positionné à l’intérieur du PV, l’aiguille a été lentement retirée tout en avançant simultanément le tube. L’extrémité de la canule fabriquée par l’entreprise était reliée au tube de perfusion à l’intérieur de la chambre. L’utilisation d’un matériau souple dans cette technique de canulation a fourni un avantage en réduisant le risque de blessure à la paroi arrière du navire.
Etudes de validation
Les échantillons de perfusat d’entrée et de sortie ont été soumis à la détermination des niveaux de pH et de potassium. Les résultats obtenus (Figure 4) ont ensuite été comparés aux résultats rapportés dans les publications récentes15,16,17. Trois foies de souris ont été perfusés avec du milieu oxygéné et complété avec le milieu E de William pendant 12 h. Tout au long de cette période, une pression de perfusion stable de 7 à 10 mmHg a été enregistrée en continu. Le pH moyen était relativement stable tout au long de la perfusion de 12 heures et variait entre 7,3 et 7,7. Les concentrations moyennes de potassium étaient également stables tout au long de la période de perfusion et variaient entre 5,9 et 6,8 mmol/L (figure 4). Le débit PV a été maintenu dans une plage de 0,8 à 1,2 mL/min/g en fonction de l’utilisation et du positionnement des tubes de pompe pendant les procédures expérimentales. Tous les résultats observés dans la perfusion hépatique de souris ont démontré des similitudes avec les observations précédemment rapportées dans la perfusion hépatique de rat (tableau 3).
Des échantillons de tissus ont été prélevés dans trois foies (N = 3) et ont été soumis à une perfusion de 12 heures en utilisant le protocole optimisé pour la coloration HE, suivie d’un balayage de lames entières. Chaque lobe du foie a été noté à l’aide d’un score Suzuki modifié (tableau 4). Le score Suzuki classiquede 18 a été augmenté en incorporant trois paramètres supplémentaires: pycnose des noyaux, détachement des vaisseaux et présence d’érythrocytes dans les sinusoïdes et les gros vaisseaux. Chaque paramètre a été classé comme absent (0), léger (1), modéré (2) et grave (3). Un score final de 0 à 7 a été considéré comme reflétant une bonne conservation, 8 - 14 a été considéré comme une conservation modérée et 14 - 21 a indiqué une mauvaise conservation.
La préservation des foies de souris a été évaluée sur la base du score Suzuki modifié. Deux experts médicaux ont effectué une évaluation indépendante de la morphologie des sept lobes des trois foies (Figure 5, Figure 6, Figure 7). La moyenne des scores des sept lobes pour chaque lobe du foie a été calculée; Des scores plus faibles indiquent un foie mieux préservé. Les évaluations effectuées par les experts ont montré un degré élevé de concordance. Notamment, bien que de légères divergences dans les scores attribués par les deux experts aient été observées dans l’évaluation de la pycnose des noyaux, ces variations n’ont pas eu d’impact significatif sur les résultats globaux de la notation.
Au mieux, le parenchyme hépatique était relativement intact avec une structure lobulaire typique bien préservée, à peine distinguable d’un foie normal. Les hépatocytes semblaient viables avec des membranes cellulaires clairement visibles et des noyaux ronds. Cependant, certains noyaux ont subi une pyknose et certaines sinusoïdes hépatiques ont été légèrement dilatées, ce qui a donné un score de 4. (Figure 3, Figure 6)
Au pire, la structure lobulaire était déformée, avec des vaisseaux détachés du parenchyme et une nécrose parenchymateuse confluente. Au niveau cellulaire, la vacuolisation cellulaire et la pycnose des noyaux sont devenues évidentes, en particulier dans la région péricentrale. De plus, une vacuolisation légère à modérée a été observée. Jusqu’à 30 % des hépatocytes subissaient une nécrose, ce qui a donné un score maximal de 14. (Figure 3, Figure 7)
Tableau 1 : Établissement étape par étape d’un modèle de perfusion hépatique chez la souris. Diverses complications ont été observées au cours du processus d’établissement en raison de différences dans la taille, le matériau et le positionnement des canules. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2: Comparaison des méthodes de conservation in vitro des organes 15,17,19,20,21,22. L’optimisation de la sélection du perfusat, de la sélection des transporteurs d’oxygène et de la comparaison des composants nutritionnels est cruciale dans diverses conditions de stockage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 3 : Hémodynamique et analyse des gaz du sang chez le rat normal et le rat NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Les informations fournies décrivent sélectivement les caractéristiques hémodynamiques du foie de rat et les paramètres clés de la perfusion normothermique in vitro. Plus précisément, la perfusion hépatique du rat peut être considérée comme optimale lorsque la pression PV varie généralement de 4 à 10 mmHg et que la pression partielle d’oxygène dans le perfusat entrant dans le PV varie de 80 à 550 mmHg, répondant aux critères nécessaires pour réussir la perfusion hépatique in vitro du rat. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 4 : Score Suzuki modifié. Le score Suzuki modifié utilisé dans cette étude élargit le score Suzuki classique en incorporant trois paramètres supplémentaires: pycnose des noyaux, détachement des vaisseaux et présence d’érythrocytes dans les sinusoïdes et les gros vaisseaux. Chaque paramètre s’est vu attribuer une note sur une échelle de 0 (absent), 1 (léger), 2 (modéré) ou 3 (sévère). Le score total, allant de 0 à 8, indique une bonne conservation; 9 à 16 suggère une conservation modérée, et 17 à 24 indique une mauvaise conservation. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 5 : Sélection du milieu perfusat, du volume de perfusat et de la pression de perfusion sur la base d’un bilan de la littérature sur le NEVLP chez le rat (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. La perfusion par machine normamère dans le foie de rat peut présenter une variabilité d’une étude à l’autre en termes de type et de volume spécifiques de perfusat utilisé, ainsi que de durée de perfusion. Différentes études peuvent utiliser différentes approches, telles que la dialyse ou la perfusion à grand volume, pendant de longues périodes. Cependant, malgré ces différences, des paramètres tels que la pression portale, le débit de la veine porte et la pression partielle d’oxygène dans le perfusat présentent généralement une variation minimale entre les diverses méthodes utilisées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Figure 1 : Schéma de principe du système de perfusion. Les composants clés sont la chambre d’orgue, la machine thermostatique, la pompe à rouleaux, l’oxygénateur et le réservoir. Le perfusat est pompé du réservoir par une pompe péristaltique dans un oxygénateur. Il y a un flux de gaz ininterrompu de 95% O2 et 5% CO2 dans l’oxygénateur. Le perfusat passe à travers le piège à bulles, où toutes les bulles d’air présentes dans le perfusat sont capturées et pompées vers le réservoir. Le perfusat restant s’écoule vers la chambre de l’organe, où le tube est relié à la veine porte. L’écoulement du perfusat de la chambre de l’orgue est dirigé vers le réservoir par la pompe péristaltique. Un tube de drainage biliaire est relié à la chambre de l’organe pour recueillir la bile. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Gros plan de la chambre de perfusion. La chambre de perfusion d’organes comprend une entrée et une sortie de perfusat, un piège à bulles, un échangeur de chaleur et un orifice de collecte de la bile. La surveillance en temps réel de la pression de la pompe perfusate est effectuée à l’aide d’un capteur de pression. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Résultats histologiques des foies de souris normaux et perfusés. (A) Morphologie normale du foie de souris (témoin). (B) Exemple de morphologie la mieux conservée telle que visualisée par coloration HE après 12 h de perfusion. (C). Exemple de morphologie la moins bien conservée telle que visualisée par coloration HE après 12 h de perfusion. La flèche noire indique la vacuolisation, la flèche rouge pointe vers une dilatation sinusoïdale, la flèche jaune indique la pycnose des noyaux et la flèche verte indique le décollement vasculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse du perfusat. Ph (A) et taux de potassium (B). Les deux paramètres sont stables pendant toute la durée de l’observation de 12 h, indiquant des conditions de perfusion constantes Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Dommages mineurs au foie entraînant un score Suzuki modifié de 4-7. Après 12 heures de NEVLP, une évaluation semi-quantitative de la morphologie du foie a été effectuée. Les échantillons de chaque lobe hépatique ont été évalués et classés séparément, ce qui a donné une plage et un score moyen pour chaque foie, le score le plus élevé possible étant de 4. Morphologie hépatique bien conservée avec un score allant de 4 à 7 selon le lobe du foie (moyenne = 5) (Score 0-7 : morphologie hépatique bien préservée, score 8-14 morphologie modérément préservée, score 15-21 : morphologie hépatique mal conservée) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Lésions hépatiques modérées entraînant un score Suzuki modifié de 7 à 14. Évaluation semi-quantitative de la morphologie du foie après 12 heures de perfusion normothermique de la machine oxygénée selon le score Suzuki modifié. Morphologie modérément préservée avec un score allant de 7 à 14 (moyenne = 11). (Score 0-7: morphologie hépatique bien préservée, score 8-14 morphologie modérément préservée, score 15-21: morphologie hépatique mal conservée) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Dommages hépatiques mineurs à modérés entraînant un score Suzuki modifié de 5 à 11. La perfusion inhomogène a entraîné une morphologie préservée mineure à modérée dans différents lobes hépatiques, avec des scores allant de 5 à 11 (moyenne = 8). (Score 0-7: morphologie hépatique bien préservée, score 8-14 morphologie modérément préservée, score 15-21: morphologie hépatique mal conservée) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Étapes critiques du protocole
Les deux étapes cruciales de l’explantation hépatique sont la canulation de la veine porte (PV) et la canulation subséquente du canal biliaire (BD). Ces étapes sont d’une importance capitale pour assurer le succès du prélèvement d’organes et des procédures ultérieures de perfusion ou de transplantation.
Défis et solutions
La canulation PV présente trois défis : une blessure de la paroi du vaisseau, le déplacement du cathéter et la praticabilité du processus d’insertion. La nature délicate de la paroi du vaisseau PV la rend vulnérable à la perforation et aux saignements ultérieurs si elle n’est pas manipulée avec précaution pendant la canulation. De plus, toute perte de sang du PV réduit la pression portale, ce qui rend l’insertion de la canule PV plus difficile. De plus, une lésion de la paroi veineuse porte peut introduire des embolies gazeuses dans le système vasculaire intrahépatique. Par conséquent, faire preuve de précision et de prudence pendant le processus de canulation PV est crucial pour minimiser le risque de complications.
Lors de la canulation PV, le risque de déplacement du cathéter est une préoccupation courante, en particulier lors de l’utilisation de canules avec des matériaux glissants. Par rapport au polypropylène, l’utilisation de canules en polyuréthane est plus favorable pour les canulations PV. La nature souple et souple du polyuréthane réduit considérablement le risque de déplacement ou de perte du cathéter, potentiellement attribué à ses propriétés matérielles. De plus, l’utilisation d’une canule souple minimise la probabilité d’endommager la couche endothéliale des vaisseaux sanguins. Dans l’étude, trois types de canules d’accès vasculaire, à savoir le polypropylène 24 G, le polypropylène 26 G et le polyuréthane 2 Fr, ont été comparés pour la canulation PV. Parmi ces options, les canules en polyuréthane 26 G et 2 Fr ont démontré une meilleure compatibilité avec la taille de la souris PV. Alors que la canule 26 G présentait une meilleure compatibilité anatomique, la canule en polyuréthane 2 Fr d’un diamètre extérieur de 0,66 mm a été jugée appropriée pour l’application prévue en raison de ses propriétés matérielles uniques, minimisant efficacement le risque de déplacement involontaire du cathéter du PV.
En ce qui concerne la praticabilité de l’insertion, différentes techniques ont été testées. Une façon consiste à serrer les extrémités proximales et distales du PV, à percer un petit trou avec de fins ciseaux et à insérer la canule PV. Cette technique nécessite l’intervention d’une personne supplémentaire en raison de la complexité et de la nécessité d’actions simultanées. Par conséquent, il n’est pas possible pour un seul microchirurgien d’effectuer la procédure indépendamment. Par conséquent, un cathéter avec une aiguille interne et une canule externe est nécessaire. Comme décrit précédemment, l’utilisation de la canule en polypropylène 26 G rigide et lisse disponible dans le commerce comporte le risque de glisser et de risquer la formation de bulles d’air lors de la connexion de la canule au système de rinçage. Pour répondre à ces préoccupations, un « système de tube guidé par aiguille » auto-construit a été conçu en insérant une aiguille de 26 G provenant d’un cathéter à aiguille dans une canule longue et souple en polyuréthane 2 Fr. Cette approche offre trois avantages clés : (1) un système d’insertion de cathéter, (2) un tube long et flexible, et (3) des propriétés matérielles favorables. Cependant, au cours de cette étape, il est crucial de faire preuve de prudence pour éviter que la pointe de l’aiguille n’entre en contact avec la paroi photovoltaïque en avançant, car cela pourrait causer des dommages irréversibles à la paroi du vaisseau.
La canulation BD présentait les trois mêmes défis : blessure de la paroi du vaisseau, déplacement du cathéter et praticabilité du processus d’insertion. En fin de compte, la canule en polyuréthane 1 Fr a été jugée plus appropriée que la canule en polypropylène UT - 03 en raison de ses propriétés matérielles favorables. Malgré le diamètre extérieur légèrement inférieur de la canule UT - 03 (0,30 mm) par rapport au tube en polyuréthane thermosensible 1 Fr (0,33 mm), le matériau en polyuréthane est rigide et moins sujet à la flexion. D’autre part, la canule 1 Fr, étant douce et flexible, offre une insertion plus facile et est ainsi devenue notre choix préféré. Cependant, dans les cas où la taille BD est exceptionnellement petite et incapable d’accueillir la canule 2 Fr plus grande, la canule UT - 03 reste une alternative viable. Dans de tels cas, une attention particulière doit être accordée pour empêcher le déplacement de la canule de la BD.
Comme le résume la revue de la littérature (tableau 5), la plupart des expérimentateurs 19,41,42,46 ont utilisé un débit portail de 1 à 3 mL/min/g de foie. Cependant, le débit doit être ajusté pour maintenir la pression portale physiologique dans la plage de 4 à 10 mmHg28. Une pression PV élevée peut provoquer une dilatation sinusoïdale et un décollement vasculaire. Une faible pression PV et un faible débit PV peuvent entraîner une hypo-oxygénation à faible débit avec nécrose subséquente de la zone centrale à péricentrale. La manipulation du débit PV sert à réguler la pression PV, qui peut varier en fonction de la canule utilisée et de la taille du foie, nécessitant ainsi des ajustements mineurs du débit PV. Ainsi, dans cette étude, la perfusion a commencé à un débit de 1 ml / min / g de foie, et en même temps, la pression PV a été surveillée à l’aide d’un transducteur de pression artérielle pour maintenir la pression PV physiologique en ajustant le débit.
Au cours du développement du modèle NEVLP, une tentative a été faite pour améliorer encore l’apport d’oxygène au foie perfusé en ajoutant des globules rouges lavés au perfusat. Néanmoins, une sédimentation importante des érythrocytes a été observée dans la grande chambre et le réservoir, réduisant ainsi l’apport de transporteurs d’oxygène à l’organe pendant la perfusion. De plus, les dommages aux érythrocytes ont été causés par l’action mécanique de la pompe de perfusion péristaltique, qui entraîne le perfusat en comprimant un tube de silicium. Ces deux raisons ont facilité notre décision de ne pas utiliser de globules rouges dans cette expérience. Les transporteurs d’oxygène à base de fluorocarbones peuvent être en mesure de résoudre ces problèmes47.
Pour évaluer la viabilité du greffon hépatique pendant la perfusion, le liquide biliaire de souris a été prélevé à intervalles de 3 heures. Néanmoins, il est difficile de recueillir la bile via le cathéter en raison de la viscosité élevée du liquide biliaire de souris. Ceci est initialement compensé par les forces capillaires induites par le cathéter fin en polyuréthane 1 Fr placé dans le BD. Cependant, seulement environ 20 μL de liquide biliaire ont pu être recueillis dans la première heure de l’expérience. Au lieu de s’écouler à travers la canule, un remplissage rétrograde de la vésicule biliaire a été observé.
À la fin de la période de perfusion de 12 heures, la vésicule biliaire était remplie de liquide biliaire clair, ce qui suggère une production active de bile pendant la perfusion de la machine. Cela peut être potentiellement contrecarré en plaçant un tube plus grand dans la vésicule biliaire.
Entre-temps, les dommages histologiques de la structure cellulaire et lobulaire hépatique ont été évalués pour déterminer le résultat de la conservation. Il a été observé que même au sein d’un même foie, la conservation était inhomogène. L’inhomogénéité des changements structurels suggère que la perfusion était hétérogène dans tout le foie (Figure 5, Figure 6, Figure 7). De plus, les résultats histologiques fournissent la preuve qu’il est viable de préserver l’intégrité structurelle de la greffe hépatique de souris pendant une durée minimale de 12 heures pendant la perfusion de la machine. Cependant, la présence d’une histologie hépatique intacte ne peut qu’aider à l’évaluation, mais ne peut pas déterminer définitivement la fonction et la viabilité du foie. Il convient de noter que la nécrose, en tant que manifestation ultime des dommages cellulaires, peut ne pas être facilement observable avant un stade ultérieur. Ainsi, se fier uniquement à l’évaluation histologique peut ne pas fournir une compréhension complète de l’état fonctionnel et de la viabilité du foie. D’autres tests et évaluations complémentaires sont nécessaires pour déterminer l’état général du foie, y compris les tests fonctionnels, les marqueurs biochimiques et l’évaluation de l’activité métabolique.
Une bonne conservation a été obtenue après 12 heures de perfusion. Cependant, prolonger davantage le temps de perfusion si nécessaire pour la réparation des organes nécessite de résoudre certains problèmes. Tout d’abord, il convient de noter que l’obtention de durées de perfusion à long terme supérieures à 12 heures nécessiterait le maintien de conditions stériles plutôt que de conditions de propreté. Cependant, dans ces expériences initiales, l’accent était mis sur le maintien de conditions propres plutôt que stériles, car assurer la stérilité introduirait des complexités supplémentaires à la procédure. Deuxièmement, une perfusion plus longue nécessiterait éventuellement l’ajout d’une unité de dialyse, comme décrit par Herman Tolboom22, pour éliminer les déchets métaboliques toxiques qui s’accumulent. Ils ont utilisé un système d’un volume total de 55 à 60 mL pour perfuser un foie de rat de 10 g pendant 4 h. Dans cette étude, un réservoir relativement grand d’un volume total de 300 mL a été utilisé malgré la petite taille du foie de souris, qui pèse environ 1 g. Cette configuration a entraîné un facteur de dilution supplémentaire de 50 fois. Remarquablement, aucun effet néfaste n’a été observé pendant la période de perfusion de 12 heures avec cette configuration. Troisièmement, une perfusion plus longue nécessiterait également l’ajout de transporteurs d’oxygène, au mieux sous forme d’hémoglobine artificielle pour assurer un apport adéquat en oxygène, comme décrit par Dondossola et al.47 et Jägers et al.48.
Le développement de la transplantation hépatique « non ischémique » basée sur le NEVLP a sans aucun doute apporté de nouvelles idées et méthodes pour résoudre ou même prévenir le problème des lésions d’ischémie-reperfusion. Cependant, le NEVLP est un concept très prometteur pour améliorer la préservation des organes et son application potentielle pour étendre la préservation des organes à la réparationdes organes 47.
Actuellement, trois techniques différentes de perfusion mécanique sont utilisées expérimentalement et cliniquement. La principale différence est la température de fonctionnement: perfusion de machine hypothermique, perfusion de machine sous-nomothermique et perfusion de machine normothermique (tableau 2). D’autres différences comprennent le choix de la solution de conservation, de la solution perfusée et de l’ajout de transporteurs d’oxygène (tableau 5).
Le NEVLP est principalement avantageux parce que (1) l’organe est maintenu à sa température normale, (2) il est oxygéné et (3) il est métaboliquement entièrement approvisionné. Le système fournit une excellente plate-forme pour l’évaluation diagnostique, la thérapie d’intervention et, finalement, la réparation d’organes49. Cependant, le NEVLP pose un grand défi à la technologie de support d’organes ex vivo. Le défi pour NEVLP est de refléter l’état quasi physiologique. Jusqu’à récemment, en raison de la petite taille et de l’absence de critères d’évaluation standard, seul un nombre limité d’études NEVLP sur les rongeurs ont été réalisées 25,26,27,28,29,30,31.
Il a été démontré ici que le modèle murin est un modèle valide qui permet un temps de conservation de 12 heures. En comparaison, la plupart des études sur les rats ont rapporté des temps de perfusion de 6 heures ou moins28,33. En outre, l’utilisation de petits animaux est avantageuse pour les études moléculaires par rapport aux grands animaux en raison de la disponibilité de réactifs abondants et des coûts expérimentaux inférieurs. Par exemple, les souris sont actuellement une option préférable pour tester des modèles knockout de la famille des gènes ATG, en particulier pour étudier les voies de signalisation des lésions d’ischémie-reperfusion dans le foie 8,50.
Des expériences sur des foies de rats concernant le NEVLP ont révélé que la préservation de la perfusion de la machine normothermique est associée à une réduction des dommages hépatocellulaires et à une amélioration de la survie précoce après la transplantation par rapport à la conservation à froid 31,40,51,52,53,54. NEVLP utilisant des foies de rat convient également pour étudier les ajouts de médicaments ou de cellules au perfusat. Un exemple impressionnant est l’étude de Xuan Tian26, qui a utilisé des cellules souches mésenchymateuses modifiées par l’hème oxygénase-1 combinées à une perfusion de machine normothermique pour améliorer la qualité des greffes hépatiques via la voie de signalisation Wnt. Haojie Wang39 a confirmé dans sa récente étude que l’ajout de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse au perfusat peut grandement améliorer la qualité du NEVLP chez le rat pour une perfusion de courte durée. Dans leur étude utilisant des foies DCD, les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse combinées à NEVLP ont inhibé la congestion sinusoïdale hépatique et les lésions endothéliales. L’ajout de cellules souches mésenchymateuses a empêché l’activation intrahépatique des macrophages et l’adhésion intercellulaire. De plus, l’ajout de cellules souches mésenchymateuses régulait l’équilibre endothéline-1 / oxyde nitrique endothélial pour améliorer la perfusion hépatique et la microcirculation.
Les souris offrent un net avantage sur les rats en ce qui concerne le NEVLP, en particulier dans le contexte d’études moléculaires axées sur des foies transgéniques ou génétiquement modifiés. Cependant, en raison de la petite taille de l’animal, la procédure pose un défi plus grand mais gérable au microchirurgien37.
Système de classement pour l’évaluation histologique
L’évaluation histologique est déterminante pour déterminer l’impact des conditions de perfusion sur l’intégrité morphologique du greffon.
Bien que le score Suzuki soit couramment utilisé dans les études évaluant la pathologie hépatique, il a été noté que ce système de notation peut ne pas saisir adéquatement les résultats spécifiques observés dans la préservation du foie ex vivo. Pour remédier à cette limite, quatre critères supplémentaires ont été introduits pour améliorer l’évaluation complète du tissu hépatique préservé (tableau 4). Tout d’abord, l’inclusion de l’évaluation de la pyknose nucléaire a été mise en œuvre, car elle constitue un paramètre précieux indiquant les dommages cellulaires. Deuxièmement, l’évaluation du vaisseau et du détachement des hépatocytes, qui signifie une lésion du lobule hépatique, a été incorporée comme critère supplémentaire. Enfin, le classement de la présence d’érythrocytes dans les sinusoïdes a été utilisé comme indicateur de rinçage et de perfusion hétérogènes. En intégrant ces critères supplémentaires, une évaluation plus nuancée et plus précise de l’état du tissu hépatique préservé a été réalisée, ce qui a permis de mieux comprendre les effets de la préservation du foie ex vivo.
La vacuolisation des hépatocytes55 se produit après des modifications de l’utilisation du substrat, de la dépense énergétique, de la désintégration des microtubules et de l’inhibition de la synthèse des protéines. Le noyau de l’hépatocytes est forcé de se déplacer vers la périphérie de la cellule par de grandes vacuoles. Ce processus s’accompagne souvent d’une pyknose nucléaire. Dans cette étude, 12 h de perfusion machine normothermique ont conduit à différents degrés de vacuolisation des hépatocytes par rapport au contrôle suggérant une perfusion inhomogène.
La présence de sinusoïdes dilatées entre les cordons hépatocytes était notable dans cette étude. Ce phénomène provient principalement de l’obstruction de l’écoulement veineux hépatique, entraînant une stase vasculaire et une congestion dans le parenchyme hépatique. Dans ce modèle de foie de souris, les défis associés au maintien d’une pression de perfusion portale constante en raison de la petite taille de l’organe peuvent contribuer à la dilatation observée des sinusoïdes hépatiques.
Les changements nécrotiques se manifestent généralement dans des amas cellulaires, des zones régionales ou des zones spécifiques. La zone périportale bien perfusée présentait une préservation relativement meilleure des hépatocytes par rapport à la zone péricentrale. La perfusion hépatique à deux vaisseaux, telle que démontrée dans les foies de rats20, présente un plus grand défi dans les foies de souris en raison de la petite taille de l’artère hépatique. Par conséquent, la perfusion inhomogène observée du foie de souris peut être attribuée, au moins en partie, à cette limitation.
Ces observations ne sont pas exclusives aux foies de souris subissant le NEVLP, mais peuvent également être visualisées dans des images histologiques provenant d’autres études NEVLP, bien qu’elles puissent ne pas être explicitement décrites.
Importance et applications potentielles du NEVLP de souris
NEVLP du foie de souris est une procédure difficile mais réalisable. Des efforts supplémentaires sont nécessaires pour tirer le meilleur parti de cette technologie afin d’élucider le mécanisme sous-jacent à l’effet bénéfique du NEVLP. L’amélioration de nos connaissances facilitera l’évolution progressive de cette technologie, en la faisant passer de la préservation des organes au domaine de la « réparation des organes ».
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Disclosures
Il n’y a pas de conflits d’intérêts financiers à divulguer.
Acknowledgments
Tout au long de la rédaction de cet article, j’ai reçu beaucoup de soutien et d’aide. Je tiens particulièrement à remercier mon coéquipier XinPei Chen pour sa merveilleuse collaboration et son soutien patient pendant mon opération.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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