Summary
מערכת זילוח כבד נורמותרמית ex vivo (NEVLP) נוצרה עבור כבדי עכברים. מערכת זו דורשת ניסיון במיקרו-כירורגיה אך מאפשרת תוצאות זילוח הניתנות לשחזור. היכולת להשתמש בכבדים של עכברים מאפשרת לחקור מסלולים מולקולריים לזיהוי תוספי פרבוסט חדשים ומאפשרת ביצוע ניסויים המתמקדים בתיקון איברים.
Abstract
פרוטוקול זה מציג מערכת NEVLP אופטימלית ללא אריתרוציטים באמצעות כבדי עכבר. שימור Ex vivo של כבדי עכברים הושג על ידי שימוש בצינוריות וטכניקות מותאמות מציוד זילוח מסחרי קונבנציונלי. המערכת שימשה להערכת תוצאות השימור לאחר 12 שעות של זילוח. עכברי C57BL/6J שימשו כתורמי כבד, והכבדים הושתלו על ידי קנולציה של וריד הפורטל (PV) וצינור המרה (BD), ולאחר מכן שטיפת האיבר במי מלח חמים (37 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, הכבדים שהושתלו הועברו לתא הזילוח והיו נתונים לזילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית (NEVLP). דגימות פרפוזט כניסה ויציאה נאספו במרווחים של 3 שעות לצורך ניתוח פרפוזאט. עם השלמת הזלוף, דגימות כבד התקבלו לניתוח היסטולוגי, עם שלמות מורפולוגית שהוערכה באמצעות Suzuki-Score שונה באמצעות צביעת Hematoxylin-Eosin (HE). ניסויי האופטימיזציה הניבו את הממצאים הבאים: (1) עכברים במשקל של מעל 30 גרם נחשבו מתאימים יותר לניסוי בשל גודלו הגדול יותר של צינור המרה שלהם (BD). (2) צינורית פוליאוריתן 2 Fr (קוטר חיצוני = 0.66 מ"מ) התאימה יותר לקנולציה של הווריד הפורטלי (PV) בהשוואה לצינורית פוליפרופילן. זה יוחס לאחיזה המשופרת של חומר הפוליאוריתן, וכתוצאה מכך החלקת קטטר מופחתת במהלך המעבר מהגוף לתא האיבר. (3) עבור קנולציה של צינור המרה (BD), צינורית פוליאוריתן 1 Fr (קוטר חיצוני = 0.33 מ"מ) נמצאה יעילה יותר בהשוואה לצינורית פוליפרופילן UT - 03 (קוטר חיצוני = 0.30 מ"מ). בעזרת פרוטוקול אופטימלי זה, כבדי עכברים נשמרו בהצלחה למשך 12 שעות ללא השפעה משמעותית על המבנה ההיסטולוגי. צביעת Hematoxylin-Eosin (HE) חשפה ארכיטקטורה מורפולוגית שמורה היטב של הכבד, המאופיינת בעיקר hepatocytes קיימא עם גרעינים גלויים בבירור התרחבות קלה של סינוסיואידים בכבד.
Introduction
השתלת כבד מייצגת את תקן הזהב לטיפול באנשים עם מחלת כבד סופנית. למרבה הצער, הביקוש לתרומת איברים עולה על ההיצע הזמין, מה שמוביל למחסור משמעותי. בשנת 2021 היו ברשימת ההמתנה להשתלת כבד כ-24,936 חולים, בעוד שרק 9,234 השתלות בוצעו בהצלחה1. הפער המשמעותי בין ההיצע והביקוש של שתלי כבד מדגיש את הצורך הדחוף לחקור אסטרטגיות חלופיות להרחבת מאגר התורמים ולשיפור הנגישות של שתלי כבד. אחת הדרכים להרחיב את מאגר התורמים היא להשתמש בתורמים שוליים2. תורמים שוליים כוללים אלה עם גיל מתקדם, סטאטוזיס בינוני או חמור. למרות שהשתלת איברים שוליים עשויה להניב תוצאות חיוביות, התוצאות הכלליות נותרות לא אופטימליות. כתוצאה מכך, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות שמטרתן לשפר את תפקודם של תורמים שוליים נמצא כיום בעיצומו 3,4.
אחת האסטרטגיות היא להשתמש בזילוח מכונה, במיוחד זילוח מכונה מחומצן נורמתרמי, כדי לשפר את תפקודם של איברים שוליים אלה5. עם זאת, עדיין קיימת הבנה מוגבלת של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההשפעות המועילות של זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית (NEVLP). עכברים, עם הזמינות השופעת שלהם של זנים מהונדסים גנטית, משמשים מודלים רבי ערך לחקר מסלולים מולקולריים. לדוגמה, המשמעות של מסלולי אוטופגיה בהקלה על פגיעה באיסכמיה בכבד הוכרה יותר ויותר 6,7. מסלול מולקולרי חשוב אחד בפגיעה באיסכמיה-רפרפוזיה בכבד הוא מסלול miR-20b-5p/ATG78. נכון לעכשיו, קיימים מספר זני עכבר מסוג ATG knockout ו-knock-out מותנה, אך אין זני חולדות מתאימים9.
בהתבסס על רקע זה, המטרה הייתה ליצור פלטפורמת NEVLP ממוזערת עבור שתלי כבד עכבר. פלטפורמה זו תקל על חקירה והערכה של אסטרטגיות פוטנציאליות מהונדסות-גנטית שמטרתן לשפר את הפונקציונליות של הכבד של התורם. בנוסף, היה חיוני שהמערכת תתאים לזילוח לטווח ארוך, ותאפשר טיפול ex vivo בכבד, המכונה בדרך כלל "תיקון איברים".
בהתחשב בזמינות המוגבלת של נתונים רלוונטיים במבחנה על זילוח כבד עכברים, סקירת הספרות התמקדה במחקרים שנערכו בחולדות. חיפוש שיטתי בספרות שנמשכה בין השנים 2010 ל-2022 בוצע באמצעות מילות מפתח כגון "זילוח כבד נורמתרמי", "ex vivo or in vitro" ו"חולדות". חיפוש זה נועד לזהות תנאים אופטימליים במכרסמים, ולאפשר לנו לקבוע את הגישה המתאימה ביותר.
מערכת הזילוח מורכבת ממאגר חיץ זכוכית אטום עם מעטפת מים, משאבת גלילים פריסטלטית, מחמצן, מלכודת בועות, מחליף חום, תא איבר ומערכת צינורות אופניים סגורה (איור 1). המערכת מבטיחה תחזוקה מדויקת של טמפרטורת זילוח קבועה של 37°C באמצעות מכונה תרמו-סטטית ייעודית. משאבת הגלילה הפריסטלטית מניעה את זרימת הפרפוסטה לאורך המעגל. מעגל הזילוח מתחיל במאגר המים המבודד. לאחר מכן, הפרפוזט מופנה דרך המחמצן, אשר מקבל תערובת גז של 95% חמצן ו -5% פחמן דו חמצני מבקבוק גז ייעודי. לאחר החמצון, הפרפוזט עובר דרך מלכודת הבועות, שבה כל הבועות הכלואות מנותבות חזרה למאגר על ידי המשאבה הפריסטלטית. הפרבוסט הנותר זורם דרך מחליף החום ונכנס לתא האיברים, משם הוא חוזר למאגר.
כאן, אנו מדווחים על ניסיוננו בהקמת NEVLP עבור כבדי עכברים וחולקים את התוצאות המבטיחות של ניסוי פיילוט שבוצע באמצעות התווך המחומצן ללא נשאי חמצן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנות הגרמניות הנוכחיות ולהנחיות לרווחת בעלי חיים ולהנחיות ARRIVE לדיווח על מחקר בבעלי חיים. פרוטוקול הניסויים בבעלי חיים אושר על ידי Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, תורינגיה, גרמניה (מספר אישור: UKJ - 17 - 106).
הערה: עכברי C57BL/6J זכרים במשקל 34 ± 4 גרם (שגיאת תקן ± ממוצעת של הממוצע [SEM]) שימשו כתורמי כבד. הם נשמרו בתנאים סביבתיים מבוקרים (50% לחות ו 18 - 23 מעלות צלזיוס) עם גישה חופשית לצ'או עכבר סטנדרטי ומים. במהלך ההליך הכירורגי נשמר קצב נשימה העולה על 60 נשימות לדקה, וטמפרטורת הגוף נשמרה מעל 34 מעלות צלזיוס.
1. הכנה
- הגדרת שולחן הניתוחים
- Autoclave כל כלי ניתוח מתכלים למטרות עיקור.
- הפעל את כל הציוד, כולל לוח החימום ואלקטרוקואגולציה.
- מניחים מזרק אחד של 50 מ"ל עם מי מלח בנפח 25 מ"ל (2,500 U/L) באינקובטור חם (37°C).
- הניחו את כלי הניתוח, תפר משי 6 - 0, מוליך כותנה קטן סטרילי, מלח וטרינרי (500 מ"ל) וספוגי גזה לא ארוגים (10 ס"מ x 10 ס"מ) על שולחן הניתוחים כראוי.
- מניחים מחט 26 G על שולחן הניתוחים כדי ליצור חור קטן במכסה של צינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מ"ל כדי לקבל את צינור המרה לאיסוף מרה.
- מניחים על שולחן הניתוחים את הצינורית (צינורית פוליאוריתן 1 Fr או UT - 03 צינורית פוליאתילן) וצינור מיקרוצנטריפוגה מעוקר בנפח 0.5 מ"ל לאיסוף מרה.
- צינורית ורידים פורטלית מתוצרת עצמית
- החזיקו את צינורית 2 Fr במלקחיים ונקבו את הדופן עם מחט 30 G במרחק של 1 ס"מ מקצה הצינורית. דוחפים את המחט דרך הצינורית עד שקצה המחט הופך גלוי.
- חותכים את קצה הצינורית ויוצרים משולש חד.
- הכנת מלוחים heparinized
- להכין 25 מ"ל של מלוחים heparinized עם ריכוז סופי של 2,500 IU / mL.
- מוציאים את כל בועות האוויר ומניחים את המזרק באינקובטור של 40 מעלות צלזיוס.
- הדגמה של מערכת הזילוח
- ראו איור 1 עבור המרכיבים העיקריים של מערכת זילוח המכונה.
- הגדרת תא העוגב
- ראו איור 2 לפריסת תא העוגב.
- הגדרת מערכת הזילוח
- הפעל את תוכנית תרשימי המעבדה לניטור לחץ.
- חבר את כיול הלחץ ואת חיישן הלחץ ברמת תא האיבר.
- התאם את כיול הלחץ לקריאת 0 מ"מ כספית ובדוק את הערך המתאים בתוכנת בקרת הלחץ.
- התאם את כיול הלחץ לקריאת 20 מ"מ כספית ושוב בדוק את הערך המתאים בתוכנת בקרת הלחץ.
- הפעל את אמבט המים, ולחמם מראש את תא האיברים ל 40 מעלות צלזיוס.
- שטפו את כל מערכת האינסטלציה פעמיים במים מזוקקים שעברו דה-יוניזציה למשך 30 דקות כל אחד, כדי להבטיח הסרה מלאה של תמיסת החיטוי.
- התחל את זרימת תמיסת החיטוי בכל המערכת למשך 20 דקות כדי להבטיח חיטוי יסודי.
- הפעל את תערובת הגזים (95% חמצן (O 2) ו 5% פחמן דו חמצני (CO2).
- מילוי פרפוזט
- תוסף 250 מ"ל של מדיום E של ויליאמס עם 50 מ"ל של סרום בקר עוברי, 3 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין (1 מ"ג/מ"ל), 0.17 מ"ל אינסולין (100 IE/מ"ל), 0.34 מ"ל הפרין (5000 U/mL), ו-0.07 מ"ל הידרוקורטיזון (100 מ"ג/2 מ"ל) להכנת מדיום E השלם של ויליאמס.
- הוסף נפחים שווים (150 מ"ל) של פרפוזט למאגר ולתא האיברים כדי להנהיג את המערכת.
הערה: יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לשמירה על סטריליות במהלך תהליך המילוי. הפרפוזט נשאב ללא הרף דרך שני מרכיבי מפתח אלה של זילוח מכונת המחזור הסגור. - הפעל את המשאבה הפריסטלטית במהירות בינונית (15 מ"ל/דקה) כדי להפעיל את מערכת הזילוח עם התווך המחומצן.
2. מטע כבד
- הכנה לפני ניתוח
- לשקול את החיה. הכן את משכך כאבים buprenorphine (0.3 מ"ג / מ"ל) (0.05 מ"ג / ק"ג משקל הגוף).
- חבר את תא האינדוקציה לשקע בקיר. הפוך חמצן ל 0.5 ליטר / דקה. הפוך isoflurane ל 3%.
- הניחו את בעל החיים בחדר עד שמגיעים להרדמה עמוקה (רפלקס ימין חיובי).
- השתמש מזרק מיקרו כדי להחיל מינון מותאם משקל הגוף של שיכוך כאבים תת עורית.
- השתמשו במכונת גילוח חשמלית כדי לקצץ את הפרווה על עור הבטן.
- העבירו את העכבר לשולחן הניתוחים והפעילו את מכשיר האידוי איזופלורן ל-2.5% כדי לשמור על הרדמה. אשר את עומק ההרדמה על ידי בדיקת רפלקס הבוהן הבין-דיגיטלי.
- הכנת בטן העכבר
- הנח את העכבר במצב שכיבה.
- בדוק רפלקס בין-דיגיטלי כדי לאשר פעמיים את עומק ההרדמה המתאים. תקן את כל ארבעת הגפיים בנייר דבק.
- יש לחטא את שני צידי הבטן עד לקו אמצע בית השחי באמצעות שלושה סבבים רצופים של יוד-אלכוהול. השתמש בגזה מעוקרת לא ארוגה כדי לכסות את האזור סביב שדה הניתוח.
- בצע חתך רוחבי של 3 ס"מ 1 ס"מ מתחת לקסיפואיד באזור הבטן של העכבר באמצעות מספריים לתינוקות מצנבאום ומלקחיים כירורגיים.
- יש להרחיב את החתך בעור באופן דו צדדי לקו אמצע בית השחי משני הצדדים.
- בזהירות לבצע חתך אורכי 2 ס"מ לאורך linea alba באמצעות מספריים קפיץ.
- חותכים דרך שכבת שרירי הבטן עם אלקטרוקואגולציה ומספריים קפיציים Vannas.
- בזהירות מניחים חתיכת גזה רטובה כדי להגן על הכבד מפני electrocoagulation.
- השתמש בתפר משי 6 - 0 עם המחט העגולה כדי למשוך את תהליך הקסיפואיד לחשיפה טובה יותר של הרצועה הכלילית.
- השתמש בשני צלעות retractors כדי לחשוף באופן מלא את חלל הבטן של העכבר.
- בזהירות להעביר את המעי הדק מתוך חלל הבטן עם צמר גפן רטוב כדי לחשוף באופן מלא את הילום.
- הכנת צינור המרה הנפוצה
- חצו את הרצועות הפלציפורמיות, הפרניות והגסטרוהפטיות בעזרת מספריים חדים.
- שחררו בזהירות את צינור המרה המשותף באמצעות מלקחיים מעוקלים עדינים ללא שיניים.
הערה: צינור המרה הנפוץ ניזוק בקלות רבה ונשבר. ברגע שהוא נשבר, אי אפשר לקנן אותו. בשל כיוון המיקום האנטומי, עדיף להשתמש במלקחיים מעוקלים. - הניחו שתי לולאות תפר משי 6 - 0 מעל צינור המרה המשותף כהכנה לשלב הבא.
- קנולציה נפוצה של צינור המרה
- בזהירות לנקב את צינור המרה עם מחט 30 גרם. השתמש במלקחיים מעוקלים מחודדים כדי להגדיל את החור הקטן כך שיתאים לקנולציה של צינור המרה.
- השתמש במלקחיים של כלי דם כדי לתפוס את צינורית צינורית צינור המרה ולדחוף אותה לתוך צינור המרה.
- אבטחו פעמיים את הצינורית עם לולאות התפרים הקבועות מראש 6 - 0.
הערה: במהלך הקנולציה מורגשת התנגדות על ידי מרה. אם הכוח אינו נשלט היטב, הצינורית תידחף החוצה מדרכי המרה על ידי הלחץ של זרימת המרה. בזהירות להתאים את עומק הצינורית. אם הוא עמוק מדי, הוא עלול לפגוע בצינור המרה, ואם הוא לא עמוק מספיק, הוא עלול להחליק החוצה. - שימו לב לזרימת המרה בצינורית לאחר קנולציה מוצלחת.
- הכנת וריד הפורטל
- מהדקים את וריד הפורטל במלקחיים שטוחים ומשחררים בזהירות את רקמת החיבור במלקחיים מעוקלים. אין למשוך חזק כדי למנוע קרע של וריד הפורטל. ברגע שווריד הפורטל ניזוק, קשה לקנטר מחדש את וריד הפורטל.
- נתחו את ה-PV בדיוק מעל הביפורקציה והניחו את לולאת התפר הראשונה באמצעות תפר משי 6 - 0 על PV קרוב למפגש לשימוש מאוחר יותר.
- מקם את לולאת התפר השנייה לקיבוע מאוחר יותר של PV קרוב ככל האפשר להילום הכבד.
- קנולציה של ורידים פורטליים
- השתמש אטב עורקי כדי לסגור את הווריד הפורטלי הדיסטלי.
- בזהירות רבה, לנקב את וריד הפורטל עם אחת צינוריות ורידי הפורטל לעיל. זרימת הדם ניתן לראות בבירור בתוך הצינורית לאחר ניקוב מוצלח.
- אבטח את צינורית ה- PV באמצעות לולאת התפרים 6 - 0 שהונחה מראש.
- שטיפת כבד
- להגדיל isoflurane ל 5% ולהרדים את העכבר עם מנת יתר של שאיפת isoflurane.
- קח תמיסת מלח הפרין שחוממה מראש מהאינקובטור. הסר את כל בועות האוויר שנוצרו בתוך מלוחים heparinized.
- תקן את המזרק עם מלוחים heparinized שחומם מראש לתוך משאבת מזרק.
- חבר את הצינורית המאריכה של משאבת המזרק לצינורית של וריד הפורטל, כוונן את המהירות ל -2 מ"ל / דקה, והתחל את שטיפת הכבד.
- שימו לב לצבע הכבד בסוף הליך השטיפה. הבלו על הכבד ברגע שהצבע הופך לצהוב הומוגני.
- טרנסקט את הסרעפת, הווריד הנבוב התחתון העל-הכבדי, הווריד האינפרא-כבד הנבוב, עורק הכבד, וריד הפורטל הדיסטלי וכל רקמת חיבור שנותרה.
- הכניסו את הכבד לצלחת הפטרי.
3. חיבור כבד ותא
- העברת כבד
- בזהירות להעביר את הכבד לתוך חדר האיברים באמצעות צלחת פטרי.
- שמרו כמות קטנה של מלח בצלחת הפטרי כדי למנוע מהכבד להתייבש.
הערה: ניתן בקלות לסובב את הווריד הפורטלי ואת צינור המרה במהלך הליך זה, מה שעלול להשפיע על זילוח הכבד ואיסוף המרה.
- חיבור צינורית ורידים פורטל
- להחדיר לאט מלח רגיל לתוך צינורית וריד הפורטל עם מזרק כדי לפנות את בועות האוויר בצינורית.
- חבר את צינורית הווריד הפורטלי לצינור זרימת הפרפוזט בתא האיבר.
- חיבור צינורית צינורית צינור המרה
- יש להנחות את צינורית צינורית צינור המרה של העכבר דרך שסתום של כובע גומי המחובר לתא האיברים.
- הכנס את צינורית צינור המרה לתוך microtube מוכן מראש 0.5 מ"ל עם חור קטן במכסה.
- הניחו את המיקרו-צינור על חימר מחוץ לתא האיברים.
4. התאמת קצב הזרימה בהתאם ללחץ PV
- הפעל את המשאבה הפריסטלטית מ 1 מ"ל / דקה.
- בדוק את קריאת לחץ ורידי הפורטל כדי להתאים את קצב הזרימה.
- שמור על לחץ הווריד הפורטלי בטווח הפיזיולוגי בין 7 - 10 מ"מ כספית על ידי התאמת קצב הזרימה.
הערה: קצב זרימה נומינלי עשוי להשתנות מעט בהתאם לשימוש ולמיקום הצינורות.
5. איסוף דוגמאות
- קבל דגימות פרפוזט כניסה מצינור זרימת הווריד הפורטלי ודגימות פרפוזט מוצא מתא האיבר במרווחים של 3 שעות.
- לאסוף דגימות מכל אונות הכבד לניתוח היסטולוגי בסוף תקופת זילוח של 12 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הקמת הליך כירורגי
בסך הכל נוצלו 17 בעלי חיים לניסוי זה: 14 עכברים הועסקו לייעול תהליך רכישת האיברים, כולל קנולציה של הווריד הפורטלי (PV) וצינור המרה (BD), ואילו 3 עכברים שימשו לאימות ההליך (טבלה 1). התוצאות ההיסטולוגיות (איור 3) הושוו כדי להקל על זיהוי מצב הזלוף האופטימלי.
בחירת פרפוסטה
מדיום תרבית הפטוציטים שהיה בשימוש בעבר נבחר למחקר זה10,11. מדיום E של ויליאם תוכנן בתחילה על ידי ויליאמס וגאן כמדיום מופחת נסיוב לטיפוח מבחנה ממושך של תאי אפיתל כבד של חולדות בוגרות12. עם זאת, הוא מצא תועלת גם בתמיכה בצמיחה ותחזוקה של הפטוציטים מכרסמים13. סרום בקר עוברי (FBS) הוא תוסף נפוץ לתרבית תאים בשל הרכבו העשיר של חומרים מזינים חיוניים וגורמי גדילה המאפשרים צמיחת תאים, שגשוגם וכדאיותם14. מדיום E של Complete William שימש כפרפוזט (טבלה 2), אשר בתוספת 20% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 5,000 U/L הפרין, 50 U/L אינסולין ו-0.010 גרם/ליטר הידרוקורטיזון.
בחירת צינורית
הליך הקנולציה כלל תחילה קנולציה של צינור המרה (BD) לאיסוף נוזל מרה, ולאחר מכן קנולציה של הווריד הפורטלי (PV). עבור קנולציה BD, צינור פוליפרופילן UT-03 עם קוטר חיצוני של 0.3 מ"מ וקוטר פנימי של 0.18 מ"מ שימש בתחילה. עם זאת, בשל חששות לגבי נזק אפשרי ל- BD והסיכון הגבוה יותר לתזוזה לא מכוונת של צנתר הקשור לקצה UT-03 החתוך והקשיח, ניתנה עדיפות לצינורות פוליאוריתן 1 Fr. צינורות הפוליאוריתן, עם החומר הרך יותר שלהם והחלקלקות מופחתת, נחשבו מתאימים יותר לקנולציית BD.
בתחילה, צינורית מחט תוך ורידית פוליפרופילן 26 גרם שימשה לקנולציה של וריד הפורטל (PV). עם זאת, הסרת המחט וחיבור הצינורית לאחר מכן לצינור הזילוח הביאו להיווצרות בועות, אשר היה פוטנציאל לחסום את הסינוסואידים intrahepatic. כדי להתגבר על בעיה זו, נבנתה צינורית מגורים באמצעות מחט 30 G שהוחדרה לתוך 1 ס"מ דיסטלי של צינורית פוליאוריתן 2 Fr. "צינורית מונחית מחט" זו מתוצרת עצמית הוכנסה לאחר מכן לתוך PV דיסטלי מעל המפגש. כאשר הצנתר היה ממוקם בתוך PV, המחט נמשכה לאט תוך כדי התקדמות הצינור. קצה הצינורית מתוצרת עצמית היה מחובר לצינור הזילוח בתוך החדר. שימוש בחומר רך בטכניקת קנולציה זו סיפק יתרון בכך שהפחית את הסיכון לפגיעה בדופן האחורית של כלי השיט.
מחקרי תיקוף
דגימות כניסה ויציאה perfusate היו כפופות לקביעת רמות pH ואשלגן. התוצאות שהתקבלו (תרשים 4) הושוו לאחר מכן לממצאים שדווחו בפרסומים האחרונים15,16,17. שלושה כבדי עכבר היו מחוררים עם מחומצן ובתוספת מדיום E של ויליאם במשך 12 שעות. במהלך תקופה זו, לחץ זילוח יציב של 7 - 10 מ"מ כספית נרשם ברציפות. ה- pH הממוצע היה יציב יחסית לאורך כל 12 שעות הזלוף ונע בין 7.3 ל -7.7. רמות אשלגן ממוצעות היו גם יציבות לאורך כל תקופת הזילוח ונעו בין 5.9 ל-6.8 מילימול לליטר (איור 4). קצב זרימת ה- PV נשמר בטווח של 0.8 - 1.2 מ"ל / דקה / גרם בהתאם לשימוש ולמיקום של צינורות המשאבה במהלך הליכי הניסוי. כל התוצאות שנצפו בזילוח כבד של עכברים הדגימו דמיון עם תצפיות שדווחו בעבר בזילוח כבד של חולדות (טבלה 3).
דגימות רקמה נאספו משלושה כבדים (N = 3) ועברו זילוח של 12 שעות באמצעות פרוטוקול אופטימלי להכתמת HE, ולאחר מכן סריקת שקופיות שלמות. כל אונת כבד קיבלה ניקוד באמצעות ציון סוזוקי שונה (טבלה 4). ציוןסוזוקי 18 הקלאסי הוגדל על ידי שילוב שלושה פרמטרים נוספים: פיקנוזיס של גרעינים, ניתוק כלי דם, ונוכחות של אריתרוציטים בסינוסואידים וכלי דם גדולים. כל פרמטר דורג כנעדר (0), קל (1), בינוני (2) וחמור (3). ציון סופי של 0 - 7 נחשב כמשקף השתמרות טובה, 8 - 14 נחשב לשימור בינוני, ו- 14 - 21 נחשב לשימור גרוע.
שימור כבדי העכבר הוערך על סמך ציון סוזוקי השונה. שני מומחים רפואיים ערכו הערכה עצמאית של המורפולוגיה של שבע האונות של שלושת הכבדים (איור 5, איור 6, איור 7). חושב הממוצע של ציוני שבע האונות עבור כל אונת כבד; ציונים נמוכים יותר מצביעים על כבד שהשתמר טוב יותר. ההערכות שניתנו על ידי המומחים הציגו רמה גבוהה של קונקורדנציה. יש לציין כי בעוד פערים קלים בציונים שהוקצו על ידי שני המומחים נצפו בהערכת פיקנוזה של גרעינים, שינויים אלה לא השפיעו באופן משמעותי על תוצאות הניקוד הכוללות.
במקרה הטוב, פרנכימת הכבד הייתה שלמה יחסית עם מבנה לובולרי טיפוסי שמור היטב, שבקושי ניתן להבחין בינו לבין כבד רגיל. הפטוציטים נראו בני קיימא עם קרומי תאים גלויים בבירור וגרעינים עגולים. עם זאת, חלק מהגרעינים עברו פיקנוזיס, וכמה סינוסיואידים בכבד היו מורחבים מעט, וכתוצאה מכך קיבל ציון 4. (איור 3, איור 6)
במקרה הרע, המבנה הלובולרי היה מעוות, עם כלי מנותק מן parenchyma ו נמק parenchymal confluent. ברמה התאית, vacuolization תאי, ו pyknosis גרעינים הפך ברור, במיוחד באזור pericentral. כמו כן, נצפתה אידוי קל עד בינוני. עד 30% מהפטוציטים עברו נמק וכתוצאה מכך ציון מקסימלי של 14. (איור 3, איור 7)
טבלה 1: ביסוס שלב אחר שלב של מודל זילוח כבד עכבר. סיבוכים שונים נצפו בתהליך ההקמה עקב הבדלים בגודל הצינורית, החומר והמיקום. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: השוואה בין שיטות שימור איברים במבחנה 15,17,19,20,21,22. אופטימיזציה של בחירת פרבוסט, בחירת נשאי חמצן והשוואת רכיבים תזונתיים היא חיונית בתנאי אחסון שונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 3: המודינמיקה וניתוח גזי דם בחולדות רגילות ובחולדות NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. המידע שסופק מתאר באופן סלקטיבי את התכונות ההמודינמיות של כבד חולדה ופרמטרים מרכזיים של זילוח נורמותרמי במבחנה. באופן ספציפי, זילוח כבד חולדה יכול להיחשב אופטימלי כאשר לחץ PV בדרך כלל נע בין 4 ל 10 מ"מ כספית, ואת הלחץ החלקי של חמצן perfusate נכנס PV נע בין 80 ל 550 מ"מ כספית, עמידה בקריטריונים הדרושים להצלחת זילוח כבד חולדה במבחנה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 4: ציון סוזוקי שונה. ציון סוזוקי המתוקן ששימש במחקר זה מרחיב את ציון סוזוקי הקלאסי על ידי שילוב שלושה פרמטרים נוספים: פיקנוזה של גרעינים, ניתוק כלי דם, ונוכחות של אריתרוציטים בסינוסואידים וכלי דם גדולים. לכל פרמטר הוקצה ציון בסולם של 0 (נעדר), 1 (קל), 2 (בינוני) או 3 (חמור). הציון הכולל, שנע בין 0 ל-8, מצביע על השתמרות טובה; 9 עד 16 מצביע על השתמרות בינונית, ו-17 עד 24 מצביע על השתמרות גרועה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 5: בחירת מדיום פרבוסט, נפח פרבוסט ולחץ זילוח בהתבסס על מחקר ספרותי של NEVLP בחולדות (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. זילוח מכונה נורמומית בכבד חולדה יכול להראות שונות בין מחקרים במונחים של סוג ונפח ספציפיים של פרפוזט בשימוש, כמו גם משך הזילוח. מחקרים שונים עשויים להשתמש בגישות שונות, כגון דיאליזה או זילוח בנפח גבוה, לפרקי זמן ממושכים. עם זאת, למרות הבדלים אלה, פרמטרים כגון לחץ פורטלי, קצב זרימת ורידים פורטלי ולחץ חלקי של חמצן בפרבוסט מראים בדרך כלל שונות מינימלית בין השיטות השונות הננקטות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
איור 1: תרשים סכמטי של מערכת הזילוח. מרכיבי המפתח הם תא האיבר, המכונה התרמוסטטית, משאבת הרולר, המחמצן והמאגר. הפרפוזט נשאב מהמאגר על ידי משאבה פריסטלטית לתוך מחמצן. יש זרימת גז רצופה של 95% O2 ו 5% CO2 בחמצן. הפרפוסטה עוברת דרך מלכודת הבועות, שם כל בועות האוויר הקיימות בפרבוסט נלכדות ונשאבות חזרה למאגר. הפרפוזט הנותר זורם לתא האיברים, שם הצינור מחובר לווריד הפורטל. זרימת הפרפוזט מתא האיברים מופנית חזרה למאגר על ידי המשאבה הפריסטלטית. צינור ניקוז מרה מחובר לתא האיברים כדי לאסוף מרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תקריב של תא הזילוח. תא הזילוח של האיברים כולל כניסה ויציאה של פרפוסט, מלכודת בועות, מחליף חום ויציאה לאיסוף מרה. ניטור בזמן אמת של לחץ משאבת הפרפוזאט מתבצע באמצעות חיישן לחץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תוצאות היסטולוגיות של כבדי עכבר רגילים ומחוררים. (A) מורפולוגיית כבד רגילה של עכבר (בקרה). (B) דוגמה למורפולוגיה שהשתמרה בצורה הטובה ביותר כפי שהיא מוצגת על ידי צביעת HE, לאחר 12 שעות של זילוח. (C). דוגמה למורפולוגיה שהשתמרה בצורה הגרועה ביותר כפי שהיא מוצגת על ידי צביעת HE, לאחר 12 שעות של זילוח. החץ השחור מציין אידוי, החץ האדום מצביע על התרחבות סינוסואידית, החץ הצהוב מציין פיקנוזה של גרעינים והחץ הירוק מציין ניתוק כלי דם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח פרפוזטים. רמות Ph (A) ואשלגן (B). שני הפרמטרים יציבים לאורך זמן תצפית של 12 שעות, מה שמצביע על תנאי זילוח קבועים לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: נזק קל לכבד שהביא לשינוי בציון סוזוקי 4-7. לאחר 12 שעות של NEVLP, נערכה הערכה כמותית למחצה של מורפולוגיה של הכבד. דגימות מכל אונת כבד הוערכו ודורגו בנפרד, והתוצאה הייתה טווח וציון ממוצע לכל כבד, כאשר הציון הגבוה ביותר האפשרי היה 4. מורפולוגיית כבד שמורה היטב עם ציון הנע בין 4-7 בהתאם לאונה של הכבד (ממוצע = 5) (ציון 0-7: מורפולוגיה של הכבד שהשתמרה היטב, ציון 8-14 מורפולוגיה שהשתמרה במידה בינונית, ציון 15-21: מורפולוגיה של הכבד שהשתמרה בצורה גרועה) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: נזק בינוני לכבד וכתוצאה מכך סוזוקי שונה ציון 7-14. הערכה סמי-כמותית של מורפולוגיית הכבד לאחר 12 שעות של זילוח מכונה מחומצנת נורמותרמית על פי ציון סוזוקי המתוקן. מורפולוגיה שהשתמרה במידה בינונית עם ציון שנע בין 7 ל-14 (ממוצע = 11). (ציון 0-7: מורפולוגיית כבד שהשתמרה היטב, ציון 8-14 מורפולוגיה שהשתמרה בינונית, ציון 15-21: מורפולוגיית כבד שהשתמרה בצורה גרועה) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: נזק קל - בינוני לכבד וכתוצאה מכך סוזוקי שונה ציון 5-11. הזלוף הלא הומוגני הביא לשימור מורפולוגיה מינורית עד בינונית באונות כבד שונות, עם ציונים שנעו בין 5 ל-11 (ממוצע = 8). (ציון 0-7: מורפולוגיית כבד שהשתמרה היטב, ציון 8-14 מורפולוגיה שהשתמרה בינונית, ציון 15-21: מורפולוגיית כבד שהשתמרה בצורה גרועה) אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שלבים קריטיים בפרוטוקול
שני השלבים המכריעים בכריתת הכבד הם קנולציה של הווריד הפורטלי (PV) והקנולציה הבאה של צינור המרה (BD). צעדים אלה הם בעלי חשיבות עליונה בהבטחת שאיבת איברים מוצלחת והליכי זילוח או השתלה לאחר מכן.
אתגרים ופתרונות
קנולציית PV מציבה שלושה אתגרים: פגיעה בדופן כלי הדם, תזוזה של הצנתר ומעשיות תהליך ההחדרה. האופי העדין של דופן כלי ה- PV הופך אותו לרגיש לנקב ודימום לאחר מכן אם לא מטפלים בו בזהירות במהלך הקנולציה. יתר על כן, כל איבוד דם מה- PV מפחית את לחץ הפורטל, מה שהופך את החדרת צינורית ה- PV למאתגרת יותר. יתר על כן, פגיעה בדופן הוורידי הפורטלי עלולה להכניס אמבולי אוויר למערכת כלי הדם התוך כבדיים. לכן, תרגול דיוק וזהירות במהלך תהליך קנולציית PV הוא חיוני כדי למזער את הסיכון לסיבוכים.
במהלך קנולציה PV, הסיכון של תזוזת קטטר הוא דאגה נפוצה, במיוחד בעת שימוש צינוריות עם חומרים חלקלקים. בהשוואה לפוליפרופילן, השימוש בצינוריות פוליאוריתן נוח יותר לקנולציה PV. אופיו הרך והגמיש של הפוליאוריתן מפחית באופן משמעותי את הסיכון לתזוזה או אובדן של קטטר, המיוחס באופן פוטנציאלי לתכונותיו החומריות. בנוסף, שימוש בצינורית רכה ממזער את הסיכוי לפגיעה בשכבת האנדותל של כלי הדם. במחקר, שלושה סוגים של צינוריות גישה וסקולרית, כלומר 24 גרם פוליפרופילן, 26 גרם פוליפרופילן, ו 2 Fr פוליאוריתן, הושוו עבור קנולציה PV. בין האפשרויות הללו, הן צינוריות פוליאוריתן 26 G והן 2 Fr הדגימו תאימות טובה יותר לגודל ה- PV של העכבר. בעוד שצינורית 26 G הציגה תאימות אנטומית טובה יותר, צינורית פוליאוריתן 2 Fr בקוטר חיצוני של 0.66 מ"מ נחשבה מתאימה ליישום המיועד בשל תכונות החומר הייחודיות שלה, ובכך למעשה מזערה את הסיכון לתזוזה לא מכוונת של קטטר מה- PV.
לגבי המעשיות של החדרה, נבדקו טכניקות שונות. דרך אחת היא להדק את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של PV, לחתוך חור קטן עם מספריים עדינים, ולהכניס את צינורית PV. טכניקה זו מחייבת מעורבות של אדם נוסף בשל המורכבות והדרישה לפעולות בו זמנית. כתוצאה מכך, אין זה ריאלי עבור מיקרוכירורג יחיד לבצע את ההליך באופן עצמאי. לכן, יש צורך בצנתר עם מחט פנימית וצינורית חיצונית. כפי שתואר קודם, שימוש בצינורית פוליפרופילן 26 G קשיחה וחלקה הזמינה מסחרית טומן בחובו סיכון של החלקה החוצה וסיכון להיווצרות בועות אוויר בעת חיבור הצינורית למערכת ההדחה. כדי להתמודד עם חששות אלה, פותחה "מערכת צינורות מונחית מחט" שנבנתה בעצמה על ידי החדרת מחט 26 G מקטטר מחט לתוך צינורית פוליאוריתן 2 Fr ארוכה וגמישה. גישה זו מציעה שלושה יתרונות מרכזיים: (1) מערכת החדרת קטטר, (2) צינור ארוך וגמיש, ו-(3) תכונות חומר חיוביות. עם זאת, במהלך שלב זה, חיוני לנקוט משנה זהירות כדי למנוע מקצה המחט לבוא במגע עם דופן ה- PV תוך כדי התקדמות, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק בלתי הפיך לדופן כלי הדם.
קנולציית BD הציגה את אותם שלושה אתגרים: פגיעה בדופן כלי הדם, תזוזה של הצנתר ומעשיות תהליך ההחדרה. בסופו של דבר, צינורית הפוליאוריתן 1 Fr נחשבה מתאימה יותר מצינורית הפוליפרופילן UT - 03 בשל תכונות החומר החיוביות שלה. למרות הקוטר החיצוני הקטן מעט יותר של צינורית UT - 03 (0.30 מ"מ) בהשוואה לצינור הפוליאוריתן הרגיש לחום 1 Fr (0.33 מ"מ), חומר הפוליאוריתן קשיח ופחות נוטה להתכופף. מצד שני, צינורית 1 Fr, בהיותה רכה וגמישה, מציעה החדרה קלה יותר ובכך הפכה לבחירה המועדפת עלינו. עם זאת, במקרים בהם גודל ה- BD קטן במיוחד ואינו מסוגל להכיל את צינורית 2 Fr הגדולה יותר, צינורית UT - 03 נשארת חלופה בת קיימא. במקרים כאלה יש לתת תשומת לב מיוחדת למניעת תזוזה של הצינורית מה-BD.
כפי שסוכם בסקירת הספרות (טבלה 5), רוב הנסיינים 19,41,42,46 השתמשו בקצב זרימה פורטלי של 1 - 3 מ"ל/דקה/גרם כבד. עם זאת, יש להתאים את קצב הזרימה כדי לשמור על לחץ הפורטל הפיזיולוגי בטווח של 4 - 10 מ"מ כספית28. לחץ PV גבוה עלול לגרום להתרחבות סינוסואידלית ולניתוק כלי דם. לחץ PV נמוך וקצב זרימת PV נמוך עלולים לגרום לתת-חמצון בזרימה נמוכה עם נמק בינוני-אזורי עד פרי-מרכזי לאחר מכן. המניפולציה של קצב זרימת ה- PV משרתת את הפונקציה של ויסות לחץ PV, אשר עשוי להשתנות בהתאם לצינורית בשימוש ולגודל הכבד, ובכך מחייב התאמות קלות לקצב זרימת ה- PV. אז, במחקר זה, זילוח התחיל בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה / גרם כבד, ובאותו זמן, לחץ PV נוטר באמצעות מתמר לחץ דם כדי לשמור על לחץ PV פיזיולוגי על ידי התאמת קצב הזרימה.
במהלך פיתוח מודל NEVLP, נעשה ניסיון לשפר עוד יותר את אספקת החמצן לכבד המחורר על ידי הוספת תאי דם אדומים שטופים לפרפוזט. עם זאת, שקיעת דם משמעותית של אריתרוציטים נצפתה בחדר הגדול ובמאגר, ובכך הפחיתה את מסירת נשאי החמצן לאיבר במהלך הזילוח. יתר על כן, נזק אריתרוציטים נגרם על ידי הפעולה המכנית של משאבת זילוח פריסטלטי, אשר מניע את perfusate על ידי דחיסת צינור סיליקון. שתי הסיבות סייעו להחלטה שלנו לא להשתמש בכדוריות דם אדומות בניסוי זה. נשאי חמצן מבוססי פרפלואורופחמן עשויים להיות מסוגלים לפתור בעיות אלה47.
כדי להעריך את הכדאיות של שתל הכבד במהלך זילוח, נוזל מרה עכבר נאסף במרווחים של 3 שעות. עם זאת, קשה לאסוף מרה באמצעות הצנתר בשל צמיגות גבוהה של נוזל מרה עכבר. זה מפוצה בתחילה על ידי כוחות נימים המושרים על ידי קטטר פוליאוריתן 1 Fr דק ממוקם BD. עם זאת, רק כ -20 מיקרוליטר של נוזל מרה יכול להיאסף בתוך השעה הראשונה של הניסוי. במקום להתנקז דרך הצינורית, נצפתה מילוי מדרדר של כיס המרה.
בתום תקופת הזילוח של 12 שעות, כיס המרה התמלא בנוזל מרה צלול המרמז על ייצור מרה פעיל במהלך זילוח המכונה. ניתן לנטרל זאת על ידי החדרת צינור גדול יותר לתוך כיס המרה.
בינתיים הוערך הנזק ההיסטולוגי של המבנה התאי והלובולרי של הכבד כדי לקבוע את תוצאת השימור. נצפה כי אפילו בתוך אותו כבד, השימור לא היה הומוגני. חוסר ההומוגניות של השינויים המבניים מצביע על כך שהזילוח היה הטרוגני בכל הכבד (איור 5, איור 6, איור 7). יתר על כן, הממצאים ההיסטולוגיים מספקים ראיות לכך שניתן לשמר את השלמות המבנית של שתל כבד העכבר למשך זמן מינימלי של 12 שעות במהלך זילוח המכונה. עם זאת, נוכחות של היסטולוגיה כבד שלם יכול רק לסייע בהערכה, אבל לא יכול לקבוע באופן סופי את תפקוד הכדאיות של הכבד. יש לציין כי נמק, כביטוי האולטימטיבי של נזק תאי, לא ניתן להבחין בקלות עד שלב מאוחר יותר. לפיכך, הסתמכות על הערכה היסטולוגית בלבד עשויה שלא לספק הבנה מקיפה של המצב התפקודי והכדאיות של הכבד. בדיקות והערכות משלימות אחרות נדרשות כדי לוודא את מצבו הכללי של הכבד, כולל בדיקות תפקודיות, סמנים ביוכימיים והערכת פעילות מטבולית.
שימור טוב הושג לאחר 12 שעות של זילוח. עם זאת, הארכה נוספת של זמן הזילוח ככל שיידרש לתיקון איברים דורשת טיפול בכמה בעיות. ראשית, יש לציין כי השגת משכי זילוח ארוכי טווח העולים על 12 שעות תחייב שמירה על תנאים סטריליים ולא רק תנאים נקיים. עם זאת, בניסויים ראשוניים אלה, ההתמקדות הייתה בשמירה על תנאים נקיים ולא על תנאים סטריליים, שכן הבטחת סטריליות תכניס מורכבויות נוספות להליך. שנית, זילוח ארוך יותר ידרוש אולי הוספת יחידת דיאליזה, כפי שתיאר הרמן טולבום22, כדי להסיר תוצרי פסולת מטבולית רעילים מצטברים. הם השתמשו במערכת עם נפח כולל של 55 - 60 מ"ל כדי לנקב כבד חולדה של 10 גרם במשך 4 שעות. במחקר זה נוצל מאגר גדול יחסית בנפח כולל של 300 מ"ל למרות גודלו הקטן של כבד העכבר, שמשקלו כ-1 גרם. תצורה זו הביאה למקדם דילול נוסף של פי 50. למרבה הפלא, לא נצפו השפעות מזיקות במהלך תקופת הזילוח של 12 שעות עם מערך זה. שלישית, זילוח ארוך יותר ידרוש גם תוספת של נשאי חמצן, במקרה הטוב בצורה של המוגלובין מלאכותי כדי להבטיח אספקת חמצן נאותה, כפי שתואר על ידי Dondossola et al.47 ו Jägers et al.48.
הפיתוח של השתלת כבד "לא איסכמית" המבוססת על NEVLP הביא ללא ספק רעיונות ושיטות חדשות לקראת פתרון או אפילו מניעת הבעיה של פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה. עם זאת, NEVLP הוא רעיון מבטיח מאוד לשיפור שימור איברים ויישומו הפוטנציאלי להרחיב את שימור האיברים לתיקון איברים47.
נכון לעכשיו, שלוש טכניקות שונות של זילוח מכונה משמשים באופן ניסיוני וקליני. ההבדל העיקרי הוא טמפרטורת העבודה: זילוח מכונה היפותרמית, זילוח מכונה תת-נותרמית וזילוח מכונה נורמותרמית (טבלה 2). הבדלים אחרים כוללים בחירה בתמיסת שימור, תמיסת פרבוסט והוספת נשאי חמצן (טבלה 5).
NEVLP הוא בעיקר יתרון כי (1) האיבר נשמר בטמפרטורה הרגילה שלו, (2) הוא מחומצן ו (3) הוא מסופק באופן מלא מטבולית. המערכת מספקת פלטפורמה מצוינת להערכה אבחנתית, טיפול התערבותי, ובסופו של דבר תיקון איברים49. עם זאת, NEVLP מציב אתגר גדול לטכנולוגיית התמיכה באיברים ex vivo. האתגר של NEVLP הוא לשקף את המצב הכמעט פיזיולוגי. עד לאחרונה, בשל גודלם הקטן והיעדר קריטריונים סטנדרטיים להערכה, בוצעו רק מספר מצומצם של מחקרי NEVLP מכרסמים 25,26,27,28,29,30,31.
הוכח כאן כי מודל העכבר הוא מודל תקף המאפשר זמן שימור של 12 שעות. לשם השוואה, רוב מחקרי החולדות דיווחו על זמני זילוח של 6 שעות או פחות28,33. בנוסף, השימוש בבעלי חיים קטנים הוא יתרון למחקרים מולקולריים בהשוואה לבעלי חיים גדולים בשל זמינותם של ריאגנטים בשפע ועלויות הניסוי הנמוכות יותר. לדוגמה, עכברים הם כיום אופציה עדיפה לבדיקת מודלים נוקאאוט של משפחת הגנים ATG, במיוחד לחקר מסלולי איתות של פגיעה איסכמיה-רפרפוזיה בכבד 8,50.
ניסויים על כבדי חולדות בנוגע ל-NEVLP גילו כי שימור זילוח מכונה נורמותרמית קשור לנזק מופחת לתאי הכבד ולשיפור ההישרדות המוקדמת לאחר ההשתלה בהשוואה לשימור קור 31,40,51,52,53,54. NEVLP באמצעות כבד חולדה מתאים גם לחקר תוספות של תרופות או תאים לפרבוסט. דוגמה מרשימה היא המחקר של שואן טיאן26, שהשתמש בתאי גזע מזנכימליים מהונדסים heme oxygenase-1 בשילוב עם זילוח מכונה נורמותרמי כדי לשפר את איכות השתלות הכבד דרך מסלול האיתות Wnt. האוג'י וואנג,בן 39, אישר במחקר האחרון שלו כי הוספת תאי גזע מזנכימליים ממח עצם לפרפוזט יכולה לשפר מאוד את איכות NEVLP בחולדות לזילוח זמן קצר. במחקר שלהם באמצעות כבדי DCD, תאי גזע מזנכימליים של מח עצם בשילוב עם NEVLP עיכבו גודש סינוסואידלי בכבד ופגיעה באנדותל. הוספת תאי גזע מזנכימליים מנעה הפעלת מקרופאגים תוך-כבדיים והיצמדות בין-תאית. יתר על כן, תוספת של תאי גזע מזנכימליים הסדירה את איזון אנדותלין-1 / תחמוצת החנקן האנדותל כדי לשפר את זילוח הכבד ואת microcirculation.
עכברים מציעים יתרון מובהק על פני חולדות כשמדובר ב- NEVLP, במיוחד בהקשר של מחקרים מולקולריים המתמקדים בכבדים מהונדסים או מהונדסים גנטית. עם זאת, בשל גודלה הקטן של החיה, ההליך מציב אתגר גדול יותר אך ניתן לניהול למיקרוכירורג37.
מערכת דירוג להערכה היסטולוגית
ההערכה ההיסטולוגית היא מכרעת לקביעת ההשפעה של תנאי זילוח על השלמות המורפולוגית של השתל.
בעוד שציון סוזוקי משמש בדרך כלל במחקרים המעריכים פתולוגיה של הכבד, צוין כי מערכת ניקוד זו עשויה שלא ללכוד כראוי את הממצאים הספציפיים שנצפו בשימור כבד ex-vivo. כדי להתמודד עם מגבלה זו, הוכנסו ארבעה קריטריונים נוספים לשיפור ההערכה המקיפה של רקמת כבד שהשתמרה (טבלה 4). ראשית, יושמה הכללת הערכת פיקנוזה גרעינית, שכן היא משמשת פרמטר חשוב המעיד על נזק תאי. שנית, הערכת ניתוק כלי הדם והפטוציטים, המסמלת נזק לאונת הכבד, שולבה כקריטריון נוסף. לבסוף, הדירוג של נוכחות אריתרוציטים בסינוסואידים שימש כאינדיקטור של שטיפה הטרוגנית וזילוח. על ידי שילוב קריטריונים משלימים אלה, הושגה הערכה מדויקת ומדויקת יותר של מצב רקמת הכבד המשומרת, המספקת הבנה עמוקה יותר של ההשפעות של שימור כבד ex-vivo.
vacuolization hepatocyte55 מתרחשת לאחר שינויים בשימוש במצע, הוצאת אנרגיה, התפוררות microtubule, ועיכוב של סינתזת חלבון. גרעין הפטוציטים נאלץ לנוע לכיוון הפריפריה של התא על ידי vacuoles גדולים. תהליך זה מלווה לעיתים קרובות בפיקנוזה גרעינית. במחקר זה, 12 שעות של זילוח מכונה נורמותרמית הובילו לדרגות שונות של vacuolization של hepatocytes בהשוואה לביקורת שמרמזת על זילוח לא הומוגני.
נוכחותם של סינוסיואידים מורחבים בין מיתרי הפטוציטים הייתה בולטת במחקר זה. תופעה זו נובעת בעיקר מחסימת זרימת ורידי הכבד, מה שמוביל לקיפאון כלי דם וגודש בתוך פרנכימה בכבד. במודל כבד עכבר זה, האתגרים הקשורים לשמירה על לחץ זילוח פורטלי עקבי עקב גודלו הקטן של האיבר עשויים לתרום להתרחבות הנצפית של סינוסיואידים בכבד.
שינויים נמקיים מתבטאים בדרך כלל בצברי תאים, אזורים אזוריים או אזורים ספציפיים. אזור הפריפורטל המחורר היטב הציג השתמרות טובה יחסית של הפטוציטים בהשוואה לאזור הפריסנטרלי. זילוח כבד דו-כלי, כפי שהודגם בכבדי חולדות20, מהווה אתגר גדול יותר בכבדים של עכברים בשל גודלו הקטן של עורק הכבד. כתוצאה מכך, ניתן לייחס את הזלוף הלא הומוגני שנצפה של כבד העכבר, לפחות בחלקו, למגבלה זו.
תצפיות אלה אינן בלעדיות לכבדי עכברים שעוברים NEVLP, אך ניתן לדמיין אותן גם בתמונות היסטולוגיות ממחקרי NEVLP אחרים, אם כי ייתכן שלא ניתן לתאר אותן במפורש.
חשיבות ויישומים פוטנציאליים של NEVLP עכבר
NEVLP של כבדי עכבר הוא הליך מאתגר אך אפשרי. מאמצים נוספים נדרשים כדי לעשות את השימוש הטוב ביותר בטכנולוגיה זו כדי להבהיר את המנגנון העומד בבסיס ההשפעה המיטיבה של NEVLP. שיפור הידע שלנו יקל על האבולוציה המתקדמת של טכנולוגיה זו, ויעביר אותה מעבר לשימור איברים לעבר תחום של "תיקון איברים".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי עניינים כספיים לחשוף.
Acknowledgments
לאורך כתיבת מאמר זה קיבלתי תמיכה וסיוע רבים. אני רוצה להודות במיוחד לחבר הצוות שלי XinPei Chen על שיתוף הפעולה הנפלא שלו ותמיכתו במטופלים במהלך הניתוח שלי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B.
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N.
- van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
