Summary
정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.
Abstract
이 프로토콜은 마우스 간을 사용하여 최적화된 적혈구가 없는 NEVLP 시스템을 제공합니다. 마우스 간의 생체 외 보존은 변형된 캐뉼라와 기존의 상업용 생체 외 관류 장비에서 채택된 기술을 사용하여 달성되었습니다. 이 시스템은 12시간의 관류 후 보존 결과를 평가하는 데 활용되었습니다. C57BL/6J 마우스를 간 기증자로 사용하였고, 간을 문맥(PV)과 담관(BD)에 캐뉼라(cannul)시킨 후, 따뜻한(37°C) 헤파린화된 식염수로 장기를 세척하여 이식하였다. 이어서, 이식된 간을 관류실로 옮기고 정상 체온 산소화 기계 관류(NEVLP)를 실시했습니다. 관류액 분석을 위해 입구 및 출구 관류액 샘플을 3시간 간격으로 수집했습니다. 관류가 완료되면 조직학적 분석을 위해 간 샘플을 얻었고, Hematoxylin-Eosin(HE) 염색을 통해 변형된 Suzuki-Score를 사용하여 형태학적 완전성을 평가했습니다. 최적화 실험은 다음과 같은 결과를 산출했다 : (1) 30 g 이상의 마우스는 담관 (BD)의 크기가 더 크기 때문에 실험에 더 적합한 것으로 간주되었다. (2) 2 Fr (외경 = 0.66 mm) 폴리우레탄 캐뉼라는 폴리프로필렌 캐뉼라와 비교할 때 문맥 캐뉼라(PV)를 캐뉼레이팅하는 데 더 적합하였다. 이는 폴리우레탄 소재의 향상된 그립감으로 인해 신체에서 장기 챔버로 이동하는 동안 카테터 미끄러짐이 감소했기 때문입니다. (3) 담관(BD)의 캐뉼라의 경우, 1 Fr(외경 = 0.33 mm) 폴리우레탄 캐뉼라가 폴리프로필렌 UT-03(외경 = 0.30 mm) 캐뉼라에 비해 더 효과적인 것으로 나타났다. 이 최적화된 프로토콜을 사용하여 마우스 간은 조직학적 구조에 큰 영향을 미치지 않고 12시간 동안 성공적으로 보존되었습니다. 헤마톡실린-에오신(HE) 염색은 간에서 잘 보존된 형태학적 구조를 나타냈으며, 이는 명확하게 보이는 핵과 간 정현파의 경미한 확장을 가진 주로 생존 가능한 간세포를 특징으로 합니다.
Introduction
간 이식은 말기 간 질환이 있는 개인을 위한 황금 표준 치료법입니다. 유감스럽게도 기증자 장기에 대한 수요가 가용 공급을 초과하여 심각한 부족 현상이 발생합니다. 2021년에는 약 24,936명의 환자가 간 이식 대기자 명단에 올랐고 9,234건의 이식만이 성공적으로 수행되었습니다1. 간 이식편의 수요와 공급 사이의 상당한 격차는 기증자 풀을 넓히고 간 이식편의 접근성을 향상시키기 위한 대체 전략을 조사해야 할 시급한 필요성을 강조합니다. 기증자 풀을 확장하는 한 가지 방법은 한계 기증자를 사용하는 것입니다2. 한계 기증자에는 고령, 중등도 또는 중증 지방증이 있는 사람이 포함됩니다. 한계 장기의 이식이 유리한 결과를 가져올 수 있지만 전반적인 결과는 차선책으로 남아 있습니다. 결과적으로, 한계 기증자의 기능을 향상시키기위한 치료 전략의 개발이 현재 진행 중이다 3,4.
전략 중 하나는 기계 관류, 특히 정상 체온 산소 기계 관류를 사용하여 이러한 변연 기관의 기능을 향상시키는 것입니다5. 그러나 정상 체온 산소 기계 관류(NEVLP)의 유익한 효과의 기초가 되는 분자 메커니즘에 대한 이해는 여전히 제한적입니다. 유전자 변형 균주를 풍부하게 이용할 수 있는 마우스는 분자 경로를 조사하기 위한 귀중한 모델 역할을 합니다. 예를 들어, 간 허혈-재관류 손상을 완화하는 데 있어 자가포식 경로의 중요성이 점점 더 인식되고 있습니다 6,7. 간 허혈-재관류 손상에서 중요한 분자 경로 중 하나는 miR-20b-5p/ATG7 경로8입니다. 현재, 다수의 ATG 녹아웃 및 조건부 녹아웃 마우스 균주가 이용 가능하지만, 상응하는 쥐 균주는 없다9.
이러한 배경을 바탕으로 마우스 간 이식을 위한 소형화된 NEVLP 플랫폼을 생성하는 것이 목표였습니다. 이 플랫폼은 기증자의 간 기능 향상을 목표로 하는 잠재적인 유전자 변형 전략의 탐색 및 평가를 용이하게 합니다. 또한 시스템이 장기 관류에 적합하여 일반적으로 "장기 복구"라고 하는 간의 생체 외 치료가 가능해야 했습니다.
마우스 간 관류에 대한 관련 시험관 내 데이터의 제한된 가용성을 고려하여 문헌 검토는 쥐에서 수행된 연구에 초점을 맞췄습니다. 2010년부터 2022년까지의 문헌에 대한 체계적인 검색은 "정상 체온 간 관류", "생체 외 또는 시험관 내" 및 "쥐"와 같은 키워드를 사용하여 수행되었습니다. 이 검색은 설치류에서 최적의 조건을 식별하여 가장 적절한 접근 방식을 결정할 수 있도록하는 것을 목표로했습니다.
관류 시스템은 밀폐된 방수 유리 버퍼 저장소, 연동 롤러 펌프, 산소 공급기, 버블 트랩, 열교환기, 오르간 챔버 및 폐쇄형 사이클링 튜브 시스템으로 구성됩니다(그림 1). 이 시스템은 전용 온도 조절기를 사용하여 37°C의 일정한 관류 온도를 정밀하게 유지합니다. 연동 롤러 펌프는 회로 전체에 걸쳐 관류물의 흐름을 구동합니다. 관류 회로는 절연된 워터 재킷 저장소에서 시작됩니다. 그 후, 관류액은 전용 가스통에서 95% 산소와 5% 이산화탄소의 가스 혼합물을 받는 산소 공급기를 통해 전달됩니다. 산소 공급 후, 관류액은 버블 트랩을 통과하며, 여기서 갇힌 버블은 연동 펌프에 의해 저장소로 다시 리디렉션됩니다. 나머지 관류액은 열교환기를 통해 흐르고 오르간 챔버로 들어가 저장소로 돌아갑니다.
여기에서 우리는 마우스 간을 위한 NEVLP를 확립한 경험을 보고하고 산소 운반체 없이 산소가 함유된 배지를 사용하여 수행된 파일럿 실험의 유망한 결과를 공유합니다.
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Protocol
동물 실험은 동물 복지에 대한 현행 독일 규정 및 지침과 동물 연구 보고를 위한 ARRIVE 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 실험 프로토콜은 독일 튀링겐의 Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz에 의해 승인되었습니다(승인 번호: UKJ - 17 - 106).
참고: 체중이 34± 4g인 수컷 C57BL/6J 마우스(평균 ± 표준 오차[SEM])를 간 기증자로 사용했습니다. 그들은 통제된 환경 조건(50% 습도 및 18 - 23 °C)에서 표준 마우스 차우와 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 유지되었습니다. 수술 과정 내내 60회/분 이상의 호흡수를 유지하고, 체온을 34°C 이상으로 유지하였다.
1. 준비
- 작업 테이블 설정
- 멸균 목적으로 모든 수술 기구와 소모품을 고압증기멸균합니다.
- 온난화 보드 및 전기 응고를 포함한 모든 장비를 켭니다.
- 따뜻한 인큐베이터(37°C)에 25mL 헤파린화(2,500U/L) 식염수가 담긴 50mL 주사기 1개를 넣습니다.
- 수술 도구, 6 - 0 실크 봉합사, 멸균 소형 면 어플리케이터, 수의학 식염수(500mL), 부직포 거즈 스폰지(10cm x 10cm)를 수술대에 적절하게 놓습니다.
- 26G 바늘을 수술대에 올려 0.5mL 미세원심분리기 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 만들어 담즙 수집을 위한 담도관을 수용합니다.
- 캐뉼라(1Fr 폴리우레탄 캐뉼라 또는 UT - 03 폴리에틸렌 캐뉼라)와 담즙 수집을 위해 멸균된 0.5mL 미세원심분리기 튜브를 수술대에 놓습니다.
- 자체 제작 문맥 캐뉼라
- 집게로 2 Fr 캐뉼라를 잡고 캐뉼라 끝에서 30cm 떨어진 곳에서 1G 바늘로 벽을 뚫습니다. 바늘 끝이 보일 때까지 캐뉼라를 통해 바늘을 밀어 넣습니다.
- 캐뉼라의 끝을 다듬어 날카로운 삼각형을 만듭니다.
- 헤파린화 식염수의 제조
- 최종 농도가 2,500 IU/mL인 헤파린화 식염수 25mL를 준비합니다.
- 모든 기포를 제거하고 주사기를 40°C 인큐베이터에 넣습니다.
- 관류 시스템의 시연
- 기계 관류 시스템의 주요 구성 요소에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
- 오르간실 설치
- 오르간 챔버의 레이아웃은 그림 2 를 참조하십시오.
- 관류 시스템 설정
- 압력 모니터링을 위해 실험실 차트 프로그램을 켭니다.
- 오르간 챔버 수준에서 압력 교정기와 압력 센서를 연결합니다.
- 압력 교정기를 조정하여 0mmHg를 읽고 압력 제어 소프트웨어에서 해당 값을 확인합니다.
- 압력 교정기를 20mmHg로 조정하고 압력 제어 소프트웨어에서 해당 값을 다시 확인하십시오.
- 수조를 켜고 오르간 챔버를 40°C로 예열합니다.
- 증류수 탈이온수로 전체 배관 시스템을 각각 30분 동안 두 번 세척하여 살균 용액이 완전히 제거되도록 합니다.
- 철저한 소독을 위해 20분 동안 전체 시스템에 소독 용액의 순환을 시작합니다.
- 가스 혼합물(95% 산소(O2)과 5% 이산화탄소(CO2))을 켭니다.
- 관류수 충전
- 윌리엄스 E 배지 250mL에 소 태아 혈청 50mL, 페니실린/스트렙토마이신 3mL(1mg/mL), 인슐린 0.17mL(100IE/mL), 헤파린 0.34mL(5000U/mL), 하이드로코르티손 0.07mL(100mg/2mL)를 보충하여 완전한 Williams' E 배지를 준비합니다.
- 동일한 부피(150mL)의 관류수를 저장소와 오르간 챔버에 추가하여 시스템을 프라이밍합니다.
알림: 충전 과정에서 무균 상태를 유지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다. 관류액은 폐쇄형 재순환 기계 관류의 이 두 가지 핵심 구성 요소를 통해 지속적으로 펌핑됩니다. - 중간 속도(15mL/분)로 연동 펌프를 켜서 산소가 공급된 매체로 관류 시스템을 프라이밍합니다.
2. 간 이식
- 수술 전 준비
- 동물의 무게를 잰다. 진통제 부프레노르핀(0.3mg/mL)(0.05mg/kg 체중)을 준비합니다.
- 인덕션 챔버를 벽면 콘센트와 연결합니다. 산소를 0.5L/min으로 돌립니다. 이소플루란을 3%로 바꾸십시오.
- 깊은 마취 (오른쪽 반사 양성)에 도달 할 때까지 동물을 챔버에 넣으십시오.
- 마이크로 주사기를 사용하여 체중에 맞는 용량의 진통제를 피하 투여합니다.
- 전기 면도기를 사용하여 복부 피부의 털을 다듬습니다.
- 마우스를 수술대로 옮기고 이소플루란 기화기를 2.5%로 켜서 마취를 유지합니다. interdigital toe reflex를 테스트하여 마취 깊이를 확인합니다.
- 마우스 복부의 준비
- 마우스를 앙와위 자세로 놓습니다.
- 적절한 마취 깊이를 두 번 확인하기 위해 디지털 간 반사를 테스트합니다. 네 팔다리를 모두 테이프로 고정하십시오.
- 복부의 양쪽을 겨드랑이 중간 라인까지 3 회 연속 요오드 알코올을 사용하여 소독하십시오. 부직포 멸균 거즈를 사용하여 수술 부위 주변을 덮으십시오.
- Metzenbaum 아기 가위와 수술용 집게를 사용하여 마우스의 복부 부위에서 검상돌기 아래 1cm 아래에 3cm 가로 절개를 합니다.
- 피부 절개를 양쪽의 겨드랑이 선까지 양측으로 확장합니다.
- 스프링 가위를 사용하여 linea alba를 따라 조심스럽게 2cm 세로 절개를합니다.
- 전기 응고 및 Vannas 스프링 가위로 복부 근육층을 자릅니다.
- 전기 응고로부터 간을 보호하기 위해 젖은 거즈를 조심스럽게 놓으십시오.
- 관상 동맥 인대의 더 나은 노출을 위해 xiphoid 과정을 수축시키기 위해 둥근 바늘로 6-0 실크 봉합사를 사용하십시오.
- 두 개의 리브 리트랙터를 사용하여 마우스의 복강을 완전히 노출시킵니다.
- 젖은 면봉으로 소장을 복강 밖으로 조심스럽게 옮겨 문문을 완전히 노출시킵니다.
- 일반적인 담관 준비
- 날카로운 가위로 falciform, phrenic 및 gastrohepatic ligaments를 Transect하십시오.
- 치아가 없는 미세한 곡선 집게를 사용하여 총담관을 조심스럽게 제거합니다.
참고: 총담관은 매우 쉽게 손상되어 파손됩니다. 한 번 깨지면 캐뉼러를 사용할 수 없습니다. 해부학 적 위치의 방향으로 인해 구부러진 집게를 사용하는 것이 좋습니다. - 다음 단계를 준비하기 위해 두 개의 6 - 0 실크 봉합사 루프를 총 담관 위에 놓습니다.
- 일반적인 담관 캐뉼러 삽입
- 30G 바늘로 담관을 조심스럽게 뚫습니다. 뾰족한 곡선 집게를 사용하여 담관 캐뉼러에 맞게 작은 구멍을 확대합니다.
- 혈관 캐뉼레이션 집게를 사용하여 담관 캐뉼라를 잡고 담관으로 밀어 넣습니다.
- 사전 설정된 6 - 0 봉합 루프로 캐뉼라를 이중으로 고정합니다.
알림: 캐뉼러 삽입 중에 담즙에 의한 저항이 느껴집니다. 힘이 잘 조절되지 않으면 담즙 유출 압력에 의해 캐뉼라가 담도 밖으로 밀려납니다. 캐뉼라의 깊이를 조심스럽게 조정하십시오. 너무 깊으면 담관이 손상될 수 있고, 충분히 깊지 않으면 빠져나갈 수 있습니다. - 성공적인 캐뉼라 삽입 후 캐뉼라의 담즙 흐름을 관찰하십시오.
- 문맥 준비
- 편평한 집게로 문맥을 고정하고 구부러진 집게로 결합 조직을 조심스럽게 풀어줍니다. 문맥이 찢어지지 않도록 세게 당기지 마십시오. 문맥이 손상되면 문맥을 다시 캐뉼러링하기가 어렵습니다.
- 분기점보다 약간 우수한 PV를 해부하고 나중에 사용할 수 있도록 합류점에 가까운 PV에 6 - 0 실크 봉합사를 사용하여 첫 번째 봉합사 루프를 배치합니다.
- PV의 나중에 고정을 위해 두 번째 봉합사 루프를 가능한 한 간 문에 가깝게 배치합니다.
- 문맥 캐뉼라 삽입
- 동맥 클립을 사용하여 원위 문맥을 닫습니다.
- 매우 조심스럽게 위의 문맥 캐뉼라 중 하나로 문맥을 뚫습니다. 성공적인 천자 후 캐뉼라 내에서 혈류를 명확하게 관찰 할 수 있습니다.
- 미리 배치된 6 - 0 봉합 루프로 PV 캐뉼라를 고정합니다.
- 간 홍조
- 이소플루란을 5%로 늘리고 이소플루란 흡입의 과다 복용으로 마우스를 안락사시킵니다.
- 인큐베이터에서 예열 된 헤파린 식염수를 섭취하십시오. 헤파린화 식염수 내부에 형성된 모든 기포를 제거합니다.
- 예열 된 헤파린 처리 식염수로 주사기를 주사기 펌프에 고정하십시오.
- 주사기 펌프의 연장 튜브를 문맥의 캐뉼라에 연결하고 속도를 2mL/min으로 조정한 후 간 세척을 시작합니다.
- 홍조 절차가 끝날 때 간색을 관찰하십시오. 색이 균질한 노란색으로 변하면 간을 절제하십시오.
- 횡격막, 간상하 대정맥, 간대정맥, 간동맥, 원위 문맥 및 나머지 결합 조직을 절제합니다.
- 간을 페트리 접시에 넣으십시오.
3. 간과 챔버 연결
- 간 이식
- 페트리 접시를 사용하여 간을 장기 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.
- 간이 마르지 않도록 페트리 접시에 소량의 식염수를 보관하십시오.
참고: 이 과정에서 문맥과 담관이 쉽게 뒤틀릴 수 있으며, 이는 간 관류 및 담즙 수집에 영향을 줄 수 있습니다.
- 문맥 캐뉼라 연결
- 주사기로 문맥 캐뉼라에 생리 식염수를 천천히 주입하여 캐뉼라의 기포를 배출합니다.
- 문맥 캐뉼라를 장기 챔버의 관류액 유출 튜브에 연결합니다.
- 담관 캐뉼라 연결
- 장기 챔버에 연결된 고무 캡의 밸브를 통해 마우스 담관 캐뉼라를 안내합니다.
- 담관 캐뉼라를 뚜껑에 작은 구멍이 있는 미리 준비된 0.5mL 마이크로튜브에 삽입합니다.
- 오르간 챔버 외부의 점토에 마이크로튜브를 놓습니다.
4. PV 압력에 따라 유량 조정
- 연동 펌프를 1mL/분으로 켭니다.
- 문맥 압력 판독값을 확인하여 유속을 조정하십시오.
- 유속을 조절하여 문맥압을 7 - 10 mmHg 사이의 생리학적 범위로 유지한다.
알림: 공칭 유량은 튜브의 사용 및 위치에 따라 약간 다를 수 있습니다.
5. 시료 채취
- 문맥 유입 튜브에서 입구 관류액 샘플을 얻고 기관 챔버에서 3시간 간격으로 출구 관류액 샘플을 얻습니다.
- 12시간의 관류 기간이 끝날 때 조직학적 분석을 위해 모든 간엽에서 샘플을 수집합니다.
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Representative Results
외과 절차의 확립
이 실험에는 총 17마리의 동물이 활용되었다: 14마리의 마우스는 문맥(PV) 및 담관(BD)의 캐뉼라 삽입을 포함하여 장기 조달 과정을 최적화하기 위해 사용되었고, 3마리의 마우스는 절차를 검증하는 데 사용되었다(표 1). 조직학적 결과(도 3)는 최적의 관류 조건의 식별을 용이하게 하기 위해 비교되었다.
관류액의 선택
이전에 활용된 간세포 배양 배지를 본 연구를 위해 선택하였다10,11. 윌리엄스 E 배지는 처음에 윌리엄스와 건에 의해 성숙한 쥐 간 상피 세포의 장기간 시험관 내 배양을 위한 혈청 환원 배지로 설계되었다12. 그럼에도 불구하고, 설치류 간세포의 성장과 유지를 지원하는 데에도 유용성이 발견되었다13. 소태아혈청(FBS)은 세포 성장, 증식, 생존을 촉진하는 필수 영양소와 성장 인자로 풍부하게 구성되어 있어 세포 배양 보충제로 널리 사용되고 있다14. 완전한 William's E 배지를 관류액으로 사용했으며(표 2), 20% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 5,000U/L 헤파린, 50U/L 인슐린 및 0.010g/L 하이드로코르티손이 보충되었습니다.
캐뉼라 선택
캐뉼라 삽입 절차는 먼저 담즙액 수집을 위해 담관(BD)을 캐뉼라한 다음 문맥(PV)의 캐뉼라를 삽입하는 것이었습니다. BD 캐뉼레이션의 경우 외경이 0.3mm이고 내경이 0.18mm인 UT-03 폴리프로필렌 튜브가 처음에 사용되었습니다. 그러나 잠재적인 BD 손상에 대한 우려와 트리밍되고 단단한 UT-03 팁과 관련된 의도하지 않은 카테터 변위의 위험이 더 높기 때문에 1 Fr 폴리우레탄 튜브를 선호했습니다. 폴리 우레탄 튜브는 더 부드러운 소재와 미끄럼 방지를 통해 BD 캐뉼 라임에 더 적합한 것으로 간주되었습니다.
처음에는 26G 폴리프로필렌 정맥 주사 바늘 캐뉼라를 문맥(PV)에 캐뉼라하는 데 사용했습니다. 그러나 바늘을 제거하고 캐뉼라를 관류 튜브에 부착하면 기포가 형성되어 간내 정현파를 막을 가능성이 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해 2Fr 폴리우레탄 캐뉼라의 말단 1cm에 삽입된 30G 바늘을 사용하여 유치 캐뉼라를 구성했습니다. 이 자체 제작 한 "바늘 유도 캐뉼라"는 합류점 위의 원위 PV에 삽입되었습니다. 카테터가 PV 내에 위치함에 따라 바늘이 천천히 빠져 나가면서 동시에 튜브를 전진시켰다. 자체 제작 된 캐뉼라의 끝은 챔버 내부의 관류 튜브에 연결되었습니다. 이 캐뉼러 화 기술에서 부드러운 재료를 사용하면 용기 뒤쪽 벽의 부상 위험을 줄임으로써 이점을 얻을 수 있습니다.
검증 연구
입구 및 출구 관류액 샘플을 pH 및 칼륨 수준의 측정을 거쳤습니다. 이어서, 얻어진 결과(도 4)를 최근 간행물15,16,17에 보고된 결과와 비교하였다. 3 마리의 마우스 간을 산소로 관류하고 12 시간 동안 William의 E 배지를 보충했습니다. 이 기간 동안 7 - 10 mmHg의 안정적인 관류 압력이 지속적으로 기록되었습니다. 평균 pH는 12시간 관류 동안 비교적 안정적이었고 7.3 내지 7.7 사이였다. 평균 칼륨 수준도 관류 기간 동안 안정적이었고 5.9에서 6.8mmol/L 사이였습니다(그림 4). PV 유량은 실험 절차 동안 펌프 튜브의 사용 및 위치에 따라 0.8 - 1.2 mL/min/g 범위 내에서 유지되었습니다. 마우스 간 관류에서 관찰된 모든 결과는 쥐 간 관류에서 이전에 보고된 관찰과 유사성을 입증했습니다(표 3).
조직 샘플을 3개의 간(N = 3)에서 수집하고 HE-염색을 위해 최적화된 프로토콜을 사용하여 12시간 관류한 후 전체 슬라이드 스캐닝을 수행했습니다. 각각의 간엽은 변형된 스즈키 점수를 사용하여 점수를 매겼다(표 4). 고전적인 스즈키 점수18 은 핵의 pyknosis, 혈관 분리, 정현파 및 큰 혈관의 적혈구 존재라는 세 가지 추가 매개 변수를 통합하여 보강되었습니다. 각 매개변수는 없음(0), 경증(1), 중등도(2) 및 중증(3)으로 등급이 매겨졌습니다. 최종 점수 0 - 7은 양호한 보존을 반영하는 것으로 간주되었고, 8 - 14는 중간 보존으로 간주되었으며, 14 - 21은 불량 보존을 나타냈다.
마우스 간의 보존은 수정된 스즈키 점수에 기초하여 평가하였다. 두 명의 의료 전문가가 3 개의 간에서 7 개의 엽의 형태에 대한 독립적 인 평가를 수행했습니다 (그림 5, 그림 6, 그림 7). 각각의 간엽에 대한 7개의 엽 점수의 평균을 계산하였다; 점수가 낮을수록 간이 더 잘 보존되었음을 나타냅니다. 전문가들이 내린 평가는 높은 수준의 일치를 나타냈다. 특히, 핵의 pyknosis 평가에서 두 전문가가 할당한 점수의 약간의 불일치가 관찰되었지만 이러한 차이는 전체 점수 결과에 큰 영향을 미치지 않았습니다.
기껏해야 간 실질은 정상 간과 거의 구별 할 수없는 잘 보존 된 전형적인 소엽 구조로 비교적 손상되지 않았습니다. 간세포는 명확하게 보이는 세포막과 둥근 핵으로 생존 가능한 것으로 나타났습니다. 그러나 일부 핵은 pyknosis를 겪었고 일부 간 정현파는 약간 확장되어 4 점을 받았습니다. (그림 3, 그림 6)
최악의 경우, 소엽 구조가 왜곡되어 실질에서 혈관이 분리되고 합류 실질 괴사가 발생했습니다. 세포 수준에서, 세포 공포 및 핵 pyknosis는 특히 중심 주변 지역에서 분명 해졌다. 또한, 경증 내지 중등도의 공포화가 관찰되었다. 간세포의 최대 30%가 괴사를 겪고 있어 최대 점수는 14점이었습니다. (그림 3, 그림 7)
표 1: 마우스 간 관류 모델의 단계별 확립. 캐뉼라 크기, 재질 및 위치의 차이로 인해 설립 과정에서 다양한 합병증이 관찰되었습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 시험관 내 장기 보존 방법비교 15,17,19,20,21,22. 관류액 선택, 산소 운반체 선택 및 영양 성분 비교의 최적화는 다양한 보관 조건에서 매우 중요합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 3: 정상 쥐 및 쥐의 혈역학 및 혈액 가스 분석 NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. 제공된 정보는 쥐 간의 혈역학적 특징과 시험관 내 정상 체온 관류의 주요 매개변수를 선택적으로 설명합니다. 구체적으로, 래트 간 관류는 PV 압력이 전형적으로 4 내지 10 mmHg의 범위이고, PV로 유입되는 관류액 내의 산소의 분압이 80 내지 550 mmHg 범위일 때, 시험관내 래트 간 관류의 성공을 위한 필수 기준을 충족할 때 최적으로 간주될 수 있다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 4 : 수정 된 스즈키 점수. 이 연구에서 사용된 수정된 스즈키 점수는 핵의 pyknosis, 혈관 분리, 정현파 및 큰 혈관의 적혈구 존재라는 세 가지 추가 매개변수를 통합하여 고전적인 Suzuki 점수를 확장합니다. 각 매개변수에는 0(없음), 1(경증), 2(중등도) 또는 3(심함)의 척도로 등급이 할당되었습니다. 0에서 8까지의 총점은 양호한 보존을 나타냅니다. 9 내지 16은 중간 정도의 보존을 나타내고, 17 내지 24는 보존 불량을 나타낸다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 5: 쥐(2010-2022)에서 NEVLP의 문헌 정밀 검사를 기반으로 한 관류액 배지, 관류액 부피 및 관류 압력 선택3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. 쥐 간에서 Normothermic 기계 관류는 사용되는 관류액의 특정 유형 및 부피와 관류 기간 측면에서 연구 전반에 걸쳐 가변성을 나타낼 수 있습니다. 다른 연구에서는 장기간 투석 또는 대량 관류와 같은 다양한 접근 방식을 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 차이에도 불구하고 문맥 압력, 문맥 유속 및 관류액의 산소 분압과 같은 매개변수는 일반적으로 사용된 다양한 방법에 걸쳐 최소한의 변동을 보여줍니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1: 관류 시스템의 개략도. 주요 구성 요소는 오르간 챔버, 자동 온도 조절 기계, 롤러 펌프, 산소 공급기 및 저장소입니다. 관류액은 연동 펌프에 의해 저장소에서 산소 공급기로 펌핑됩니다. 산소 공급기에는 95% O2 및 5% CO2의 중단 없는 가스 흐름이 있습니다. 관류액은 버블 트랩을 통과하여 관류액에 존재하는 기포가 포집되어 저장소로 다시 펌핑됩니다. 나머지 관류액은 장기 챔버로 흐르며, 여기서 튜브는 문맥에 연결됩니다. 오르간 챔버에서 유출된 관류액은 연동 펌프에 의해 저장소로 다시 보내집니다. 담즙 배액관은 담즙을 수집하기 위해 장기 챔버에 연결됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 관류 챔버의 확대 . 장기 관류 챔버는 관류액 입구 및 출구, 버블 트랩, 열교환기 및 담즙 수집 포트를 포함합니다. 관류수 펌프 압력의 실시간 모니터링은 압력 센서를 사용하여 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 정상 및 관류된 마우스 간의 조직학적 결과. (A) 정상 마우스 간 형태(대조군). (B) 관류 12시간 후 HE 염색으로 시각화된 가장 잘 보존된 형태의 예. (C). 관류 12시간 후 HE 염색으로 시각화한 최악의 보존 형태의 예. 검은색 화살표는 공포화, 빨간색 화살표는 정현파 팽창, 노란색 화살표는 핵의 pyknosis, 녹색 화살표는 혈관 박리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 관류액 분석. Ph (A) 및 칼륨 수준 (B). 두 매개변수 모두 12시간의 관찰 시간 동안 안정적이며, 이는 일정한 관류 조건을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 경미한 간 손상으로 인해 수정 된 스즈키 점수 4-7. NEVLP 12시간 후, 간 형태에 대한 반정량적 평가가 수행되었습니다. 각 간엽의 샘플을 별도로 평가하고 등급을 매겨 각 간에 대한 범위와 평균 점수를 얻었으며 가능한 최고 점수는 4점이었습니다. 간엽에 따라 4-7 범위의 점수로 잘 보존된 간 형태(평균 = 5)(점수 0-7: 잘 보존된 간 형태, 점수 8-14 적당히 보존된 형태, 점수 15-21: 잘 보존되지 않은 간 형태) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 수정 된 스즈키 점수 7-14를 초래하는 중등도의 간 손상. 수정된 스즈키 점수에 따른 정상 체온 산소 기계 관류 12시간 후 간 형태의 반정량적 평가. 7에서 14 사이의 점수(평균 = 11)로 적당히 보존된 형태. (점수 0-7: 잘 보존된 간 형태, 점수 8-14 적당히 보존된 형태, 점수 15-21: 잘 보존되지 않은 간 형태) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 경미한 - 중등도의 간 손상으로 인해 수정된 스즈키 점수 5-11. 불균일한 관류는 5에서 11(평균 = 8) 범위의 점수로 다른 간엽에서 경미하거나 중간 정도의 보존된 형태를 초래했습니다. (점수 0-7: 잘 보존된 간 형태, 점수 8-14 적당히 보존된 형태, 점수 15-21: 잘 보존되지 않은 간 형태) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
프로토콜의 중요한 단계
간 이식의 두 가지 중요한 단계는 문맥의 캐뉼라 삽입(PV)과 후속 담관 캐뉼라(BD)입니다. 이러한 단계는 성공적인 장기 회수 및 후속 관류 또는 이식 절차를 보장하는 데 가장 중요합니다.
도전과 해결책
PV 캐뉼러는 혈관벽의 손상, 카테터의 변위 및 삽입 과정의 실행 가능성이라는 세 가지 문제를 제시합니다. PV 혈관 벽의 섬세한 특성으로 인해 캐뉼러 삽입 중에 조심스럽게 다루지 않으면 구멍이 뚫리고 출혈이 발생하기 쉽습니다. 또한 PV로 인한 혈액 손실은 문맥압을 감소시켜 PV 캐뉼라 삽입을 더 어렵게 만듭니다. 또한, 문맥 정맥벽의 손상은 간내 혈관계에 공기 색전을 도입할 수 있습니다. 따라서 PV 캐뉼라 생성 과정에서 정밀하고 주의를 기울이는 것은 합병증의 위험을 최소화하는 데 중요합니다.
PV 캐뉼러 삽입 중에 카테터 변위 위험은 특히 미끄러운 재료가 있는 캐뉼라를 사용할 때 일반적인 관심사입니다. 폴리프로필렌에 비해 폴리우레탄 캐뉼라를 사용하는 것이 PV 캐뉼라에 더 유리합니다. 폴리 우레탄의 부드럽고 유연한 특성은 잠재적으로 재료 특성에 기인 할 수있는 카테터 변위 또는 손실의 위험을 크게 줄입니다. 또한 부드러운 캐뉼라를 사용하면 혈관 내피층이 손상될 가능성이 최소화됩니다. 이 연구에서는 세 가지 유형의 혈관 접근 캐뉼라, 즉 24G 폴리프로필렌, 26G 폴리프로필렌 및 2Fr 폴리우레탄을 PV 캐뉼러에 대해 비교했습니다. 이러한 옵션 중에서 26G 및 2Fr 폴리우레탄 캐뉼러는 모두 마우스 PV 크기와 더 나은 호환성을 보여주었습니다. 26G 캐뉼라는 더 나은 해부학적 호환성을 나타내었지만 외경이 0.66mm인 2Fr 폴리우레탄 캐뉼라는 고유한 재료 특성으로 인해 의도한 용도에 적합한 것으로 간주되어 의도하지 않은 카테터가 PV에서 빠질 위험을 효과적으로 최소화했습니다.
삽입의 실용성과 관련하여 다양한 기술이 테스트되었습니다. 한 가지 방법은 clamp PV의 근위 및 말단부를 고정하고 가는 가위로 작은 구멍을 뚫고 PV 캐뉼라를 삽입합니다. 이 기술은 동시 작업에 대한 복잡성과 요구 사항으로 인해 추가 사람의 참여가 필요합니다. 결과적으로 한 명의 미세 외과 의사가 독립적으로 절차를 수행하는 것은 불가능합니다. 따라서 내부 바늘과 외부 캐뉼라가있는 카테터가 필요합니다. 앞서 설명한 바와 같이 시중에서 판매되는 뻣뻣하고 매끄러운 26G 폴리프로필렌 캐뉼라를 사용하면 캐뉼라를 플러싱 시스템에 연결할 때 미끄러져 기포가 형성될 위험이 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 바늘 카테터의 26G 바늘을 길고 유연한 폴리우레탄 2Fr 캐뉼라에 삽입하여 자체 구축한 "바늘 유도 튜브 시스템"이 고안되었습니다. 이 접근 방식은 (1) 카테터 삽입 시스템, (2) 길고 유연한 튜브, (3) 유리한 재료 특성의 세 가지 주요 이점을 제공합니다. 그러나 이 단계에서 전진하는 동안 바늘 끝이 PV 벽에 닿지 않도록 주의하는 것이 중요한데, 이는 용기 벽에 돌이킬 수 없는 손상을 줄 수 있기 때문입니다.
BD 캐뉼러는 혈관벽의 손상, 카테터의 변위 및 삽입 과정의 실용성이라는 동일한 세 가지 문제를 제시했습니다. 궁극적으로, 1 Fr 폴리 우레탄 캐뉼라는 유리한 재료 특성으로 인해 UT-03 폴리 프로필렌 캐뉼라보다 더 적합한 것으로 간주되었습니다. UT-03 캐뉼라 (0.30 mm)의 외경이 약간 작음에도 불구하고 1 Fr 감열 폴리 우레탄 튜브 (0.33 mm)에 비해 폴리 우레탄 소재는 단단하고 구부러지기 쉽습니다. 반면에 1 Fr 캐뉼라는 부드럽고 유연하여 더 쉽게 삽입할 수 있으므로 우리가 선호하는 선택이 되었습니다. 그러나 BD 크기가 매우 작고 더 큰 2 Fr 캐뉼라를 수용할 수 없는 경우 UT-03 캐뉼라가 실행 가능한 대안으로 남아 있습니다. 이러한 경우 BD에서 캐뉼라가 변위되는 것을 방지하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다.
문헌 검토(표 5)에 요약된 바와 같이, 대부분의 실험자 19,41,42,46은 1 - 3 mL/min/g 간의 문맥 유속을 사용했습니다. 그러나, 유속은 생리문맥압을 4 - 10 mmHg 범위로 유지하도록 조절되어야 한다(28). 높은 PV 압력은 정현파 팽창 및 혈관 박리를 유발할 수 있습니다. 낮은 PV 압력과 낮은 PV 유량은 후속 중간 구역에서 중심 주위 괴사와 함께 낮은 유량의 저산소화를 초래할 수 있습니다. PV 유량의 조작은 PV 압력을 조절하는 기능을 수행하며, 이는 사용된 캐뉼라와 간의 크기에 따라 달라질 수 있으므로 PV 유량을 약간 조정해야 합니다. 그래서 본 연구에서는 간 1mL/min/g의 유속으로 관류를 시작함과 동시에 혈압 변환기를 이용하여 PV 압력을 모니터링하여 유속을 조절하여 생리학적 PV 압력을 유지하였다.
NEVLP 모델을 개발하는 동안, 세척된 적혈구를 관류액에 첨가하여 관류된 간으로의 산소 공급을 더욱 개선하려는 시도가 이루어졌다. 그럼에도 불구하고, 큰 챔버 및 저장소에서 적혈구의 현저한 침전이 관찰되었고, 이로 인해 관류 동안 장기로의 산소 운반체의 전달이 감소했다. 또한, 적혈구의 손상은 실리콘 튜브를 압축하여 관류액을 구동하는 연동 관류 펌프의 기계적 작용으로 인해 발생했습니다. 두 가지 이유 모두 이 실험에서 적혈구를 사용하지 않기로 한 우리의 결정을 촉진했습니다. 퍼플루오로카본계 산소 운반체는 이러한 문제를 해결할 수 있다(47).
관류 동안 간 이식편의 생존력을 평가하기 위해, 마우스 담즙액을 3시간 간격으로 수집하였다. 그럼에도 불구하고 마우스 담즙액의 점도가 높기 때문에 카테터를 통해 담즙을 수집하기가 어렵습니다. 이것은 초기에 BD에 배치된 미세 1 Fr 폴리우레탄 카테터에 의해 유도된 모세관력에 의해 보상된다. 그러나 실험 첫 1시간 이내에 약 20μL의 담즙액만 수집할 수 있었습니다. 캐뉼라를 통해 배액하는 대신, 담낭의 역행 충전이 관찰되었습니다.
12시간 관류 기간이 끝날 때 담낭은 기계 관류 동안 활성 담즙 생성을 시사하는 투명한 담즙액으로 채워졌습니다. 이것은 담낭에 더 큰 튜브를 삽입함으로써 잠재적으로 상쇄될 수 있습니다.
그 동안 간세포 및 소엽 구조의 조직학적 손상을 평가하여 보존 결과를 결정했습니다. 동일한 간 내에서도 보존이 불균일하다는 것이 관찰되었습니다. 구조적 변화의 불균일성은 관류가 간 전체에 걸쳐 이질적이었음을 시사합니다(그림 5, 그림 6, 그림 7). 또한, 조직학적 소견은 기계 관류 동안 최소 12시간 동안 마우스 간 이식편의 구조적 무결성을 보존하는 것이 실행 가능하다는 증거를 제공합니다. 그러나 온전한 간 조직학의 존재는 평가에 도움이 될 뿐 간의 기능과 생존 가능성을 결정적으로 결정할 수는 없습니다. 세포 손상의 궁극적인 징후인 괴사는 후기 단계까지 쉽게 관찰되지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 조직학적 평가에만 의존하는 것은 간의 기능적 상태와 생존 가능성에 대한 포괄적인 이해를 제공하지 못할 수 있습니다. 기능 분석, 생화학적 마커 및 대사 활성 평가를 포함하여 간의 전반적인 상태를 확인하기 위해서는 기타 보완 분석 및 평가가 필요합니다.
12시간의 관류 후에 양호한 보존이 달성되었다. 그러나 장기 복구에 필요한 관류 시간을 더 연장하려면 몇 가지 문제를 해결해야 합니다. 첫째, 12시간을 초과하는 장기 관류 기간을 달성하려면 단순히 깨끗한 조건이 아닌 멸균 상태를 유지해야 한다는 점에 유의해야 합니다. 그러나 이러한 초기 실험에서는 무균 상태를 보장하면 절차에 추가적인 복잡성이 발생할 수 있으므로 무균 조건보다는 깨끗한 조건을 유지하는 데 중점을 두었습니다. 둘째, 더 긴 관류는 축적된 독성 대사 폐기물을 제거하기 위해 Herman Tolboom22에 의해 설명된 대로 투석 장치를 추가해야 할 수 있습니다. 그들은 총 부피가 55 - 60 mL 인 시스템을 사용하여 4 시간 동안 10 g의 쥐 간을 관류했습니다. 이 연구에서는 무게가 약 1g인 마우스 간의 크기가 작음에도 불구하고 총 부피가 300mL인 비교적 큰 저장소를 사용했습니다. 이 구성으로 인해 50배의 추가 희석 계수가 발생했습니다. 놀랍게도, 이 설정으로 12시간 관류 기간 동안 해로운 영향이 관찰되지 않았습니다. 셋째, 더 긴 관류는 Dondossola et al.47 및 Jägers et al.48에 의해 설명된 바와 같이 적절한 산소 공급을 보장하기 위해 기껏해야 인공 헤모글로빈 형태의 산소 운반체를 추가해야 합니다.
NEVLP를 기반으로 한 "비 허혈성"간 이식의 개발은 의심 할 여지없이 허혈 재관류 손상의 문제를 해결하거나 예방하기위한 새로운 아이디어와 방법을 가져 왔습니다. 그러나 NEVLP는 장기 보존을 개선하기 위한 매우 유망한 개념이며 장기 보존을 장기 복구로 확장하기 위한 잠재적 적용입니다47.
현재 기계 관류의 세 가지 다른 기술이 실험적 및 임상적으로 사용됩니다. 주요 차이점은 작동 온도입니다: 저체온 기계 관류, 아노마더 기계 관류 및 정상 체온 기계 관류(표 2). 다른 차이점으로는 보존 용액, 관류액 용액 및 산소 운반체 첨가의 선택이 있습니다(표 5).
NEVLP는 (1) 장기가 정상 온도로 유지되고 (2) 산소가 공급되며 (3) 대사 적으로 완전히 공급되기 때문에 주로 유리합니다. 이 시스템은 진단 평가, 중재 요법 및 궁극적으로 장기 복구를 위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다49. 그러나 NEVLP는 생체 외 장기 지원 기술에 큰 도전을 제기합니다. NEVLP의 과제는 거의 생리적 상태를 반영하는 것입니다. 최근까지 크기가 작고 표준 평가 기준이 없기 때문에 제한된 수의 설치류 NEVLP 연구 만 수행되었습니다 (25,26,27,28,29,30,31).
여기에서 마우스 모델이 12시간의 보존 시간을 허용하는 유효한 모델임을 입증했습니다. 이에 비해 대부분의 쥐 연구에서는 6시간 이하의 관류 시간을 보고했습니다28,33. 또한, 작은 동물의 사용은 풍부한 시약의 가용성과 낮은 실험 비용으로 인해 큰 동물에 비해 분자 연구에 유리합니다. 예를 들어, 마우스는 현재 ATG 유전자 패밀리의 녹아웃 모델을 테스트하기 위해, 특히 간에서 허혈-재관류 손상의 신호 전달 경로를 연구하기 위해 바람직한 옵션이다 8,50.
NEVLP에 관한 쥐 간에 대한 실험은 정상 체온 기계 관류 보존이 저온 보존에 비해 간세포 손상 감소 및 이식 후 조기 생존율 향상과 관련이 있음이 밝혀졌습니다 31,40,51,52,53,54. 쥐 간을 사용하는 NEVLP는 관류액에 약물이나 세포를 첨가하는 연구에도 적합합니다. 인상적인 예는 Wnt 신호 전달 경로를 통해 간 이식편의 품질을 개선하기 위해 정상 체온 기계 관류와 결합된 헴 옥시게나제-1 변형 중간엽 줄기 세포를 사용한 Xuan Tian26의 연구입니다. Haojie Wang (39 세)은 최근 연구에서 골수 중간 엽 줄기 세포를 관류액에 첨가하면 단시간 관류를 위해 쥐의 NEVLP 품질을 크게 향상시킬 수 있음을 확인했습니다. DCD 간을 사용한 연구에서 NEVLP와 결합된 골수 중간엽 줄기 세포는 간 정현파 울혈과 내피 손상을 억제했습니다. 중간엽 줄기세포의 첨가는 간내 대식세포 활성화 및 세포간 부착을 방지하였다. 또한, 중간엽 줄기세포의 첨가는 간 관류 및 미세순환을 개선하여 내피의 산화질소 균형을 조절하였다.
마우스는 NEVLP와 관련하여 특히 형질전환 또는 유전자 변형 간에 초점을 맞춘 분자 연구의 맥락에서 쥐보다 뚜렷한 이점을 제공합니다. 그러나, 동물의 크기가 작기 때문에, 이 시술은 미세외과의(37)에게 더 크지만 다루기 쉬운 도전을 제기한다.
조직학적 평가를 위한 등급 시스템
조직학적 평가는 관류 조건이 이식편의 형태학적 완전성에 미치는 영향을 결정하는 데 결정적입니다.
스즈키 점수는 간 병리를 평가하는 연구에서 일반적으로 사용되지만, 이 점수 시스템은 생체 외 간 보존에서 관찰된 특정 결과를 적절하게 포착하지 못할 수 있다는 점에 주목했습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 보존된 간 조직의 포괄적인 평가를 향상시키기 위해 4가지 추가 기준이 도입되었습니다(표 4). 첫째, 핵 pyknosis 평가의 포함은 세포 손상을 나타내는 귀중한 매개 변수로 작용하기 때문에 구현되었습니다. 둘째, 간소엽의 손상을 의미하는 혈관 및 간세포 박리의 평가가 추가 기준으로 통합되었습니다. 마지막으로, 정현파에서 적혈구의 존재 등급은 이질적인 홍조 및 관류의 지표로 활용되었습니다. 이러한 보충 기준을 통합함으로써 보존된 간 조직의 상태에 대한 보다 미묘하고 정확한 평가가 달성되어 생체 외 간 보존의 효과에 대한 더 깊은 이해를 제공했습니다.
간세포 공포화(55 )는 기질 사용, 에너지 소비, 미세소관 붕괴 및 단백질 합성 억제의 변화 후에 발생한다. 간세포의 핵은 큰 액포에 의해 세포 주변으로 이동해야합니다. 이 과정에는 종종 핵 pyknosis가 동반됩니다. 이 연구에서, 12시간의 정상 체온 기계 관류는 불균일한 관류를 시사하는 대조군과 비교하여 간세포의 다른 정도의 공포화를 유도했습니다.
간세포 코드 사이에 확장된 정현파의 존재는 이 연구에서 두드러졌습니다. 이 현상은 주로 간정맥 유출 폐쇄로 인해 발생하며, 이는 간 실질 내에서 혈관 정체 및 울혈을 유발합니다. 이 마우스 간 모델에서 장기의 작은 크기로 인해 일관된 문맥 관류 압력을 유지하는 것과 관련된 문제는 관찰된 간 정현파의 확장에 기여할 수 있습니다.
괴사성 변화는 일반적으로 세포 클러스터, 지역 영역 또는 특정 영역에서 나타납니다. 잘 관류된 간맥주위 영역은 중심 주위 영역에 비해 간세포의 상대적으로 더 나은 보존을 나타냈다. 쥐 간20에서 입증된 바와 같이 이중 혈관 간 관류는 간동맥의 크기가 작기 때문에 마우스 간에서 더 큰 도전을 제시합니다. 결과적으로, 관찰된 마우스 간의 불균일한 관류는 적어도 부분적으로 이러한 제한에 기인할 수 있습니다.
이러한 관찰은 NEVLP를 받는 마우스 간에만 국한된 것이 아니라 명시적으로 설명되지는 않지만 다른 NEVLP 연구의 조직학적 이미지에서도 시각화할 수 있습니다.
마우스 NEVLP의 중요성과 잠재적 응용
마우스 간의 NEVLP는 어렵지만 실현 가능한 절차입니다. NEVLP의 유익한 효과의 기초가 되는 메커니즘을 밝히기 위해 이 기술을 최대한 활용하기 위해서는 더 많은 노력이 필요합니다. 우리의 지식을 향상시키면 이 기술의 점진적인 진화가 촉진되어 장기 보존을 넘어 "장기 복구" 영역으로 전환됩니다.
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Disclosures
공개할 재정적 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 논문을 쓰는 동안 나는 많은 지원과 도움을 받았다. 특히 제 수술 중 훌륭한 협력과 환자 지원에 대해 팀 동료 XinPei Chen에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
References
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B.
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. 3rd Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N.
- van der, V. alk J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) - farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von,, Horn, C., Zlatev, H., Pletz, J., Lüer, B., Minor, T. Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William's E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
