Summary
Se creó un sistema normotérmico de perfusión hepática ex vivo (NEVLP) para hígados de ratón. Este sistema requiere experiencia en microcirugía, pero permite resultados de perfusión reproducibles. La capacidad de utilizar hígados de ratón facilita la investigación de vías moleculares para identificar nuevos aditivos de perfusión y permite la ejecución de experimentos centrados en la reparación de órganos.
Abstract
Este protocolo presenta un sistema NEVLP optimizado libre de eritrocitos utilizando hígados de ratón. La preservación ex vivo de hígados de ratón se logró mediante el empleo de cánulas modificadas y técnicas adaptadas de equipos comerciales convencionales de perfusión ex vivo . El sistema se utilizó para evaluar los resultados de preservación después de 12 h de perfusión. Los ratones C57BL / 6J sirvieron como donantes de hígado, y los hígados fueron explantados canulando la vena porta (PV) y el conducto biliar (BD), y posteriormente enjuagando el órgano con solución salina heparinizada tibia (37 ° C). Luego, los hígados explantados se transfirieron a la cámara de perfusión y se sometieron a perfusión normotérmica oxigenada de máquina (NEVLP). Las muestras de perfusión de entrada y salida se recogieron a intervalos de 3 h para el análisis de perfusión. Al finalizar la perfusión, se obtuvieron muestras de hígado para el análisis histológico, con integridad morfológica evaluada mediante Suzuki-Score modificado a través de tinción de Hematoxilina-Eosina (HE). Los experimentos de optimización arrojaron los siguientes hallazgos: (1) los ratones que pesaban más de 30 g se consideraron más adecuados para el experimento debido al mayor tamaño de su conducto biliar (BD). (2) una cánula de poliuretano de 2 Fr (diámetro exterior = 0,66 mm) fue más adecuada para canular la vena porta (PV) en comparación con una cánula de polipropileno. Esto se atribuyó al agarre mejorado del material de poliuretano, lo que resultó en un deslizamiento reducido del catéter durante la transferencia del cuerpo a la cámara del órgano. (3) para la canulación del conducto biliar (BD), se encontró que una cánula de poliuretano de 1 Fr (diámetro exterior = 0,33 mm) era más efectiva en comparación con la cánula de polipropileno UT - 03 (diámetro exterior = 0,30 mm). Con este protocolo optimizado, los hígados de ratón se conservaron con éxito durante 12 h sin un impacto significativo en la estructura histológica. La tinción de hematoxilina-eosina (HE) reveló una arquitectura morfológica bien conservada del hígado, caracterizada por hepatocitos predominantemente viables con núcleos claramente visibles y dilatación leve de sinusoides hepáticos.
Introduction
El trasplante de hígado representa el tratamiento estándar de oro para las personas con enfermedad hepática terminal. Lamentablemente, la demanda de órganos de donantes supera la oferta disponible, lo que lleva a una escasez significativa. En 2021, aproximadamente 24,936 pacientes estaban en la lista de espera para un injerto de hígado, mientras que solo 9,234 trasplantes se realizaron con éxito1. La disparidad significativa entre la oferta y la demanda de injertos hepáticos destaca la necesidad apremiante de investigar estrategias alternativas para ampliar el grupo de donantes y mejorar la accesibilidad de los injertos hepáticos. Una forma de ampliar el grupo de donantes es utilizar donantes marginales2. Los donantes marginales incluyen aquellos con edad avanzada, esteatosis moderada o grave. Aunque el trasplante de órganos marginales puede producir resultados favorables, los resultados generales siguen siendo subóptimos. Como resultado, el desarrollo de estrategias terapéuticas dirigidas a mejorar la función de los donantes marginales está actualmente en marcha 3,4.
Una de las estrategias es utilizar la máquina de perfusión, especialmente la perfusión normotérmica oxigenada de máquina, para mejorar la función de estos órganos marginales5. Sin embargo, todavía hay una comprensión limitada de los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos beneficiosos de la perfusión normotérmica oxigenada de la máquina (NEVLP). Los ratones, con su abundante disponibilidad de cepas modificadas genéticamente, sirven como modelos valiosos para investigar las vías moleculares. Por ejemplo, la importancia de las vías de autofagia en la mitigación de la lesión por isquemia-reperfusión hepática ha sido cada vez más reconocida 6,7. Una vía molecular importante en la lesión por isquemia-reperfusión hepática es la vía miR-20b-5p/ATG78. Actualmente, hay una serie de cepas de ratón knockout ATG y knock-out condicional disponibles, pero no hay cepas de rata correspondientes9.
Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo era generar una plataforma NEVLP miniaturizada para injertos hepáticos de ratón. Esta plataforma facilitaría la exploración y evaluación de posibles estrategias modificadas genéticamente destinadas a mejorar la funcionalidad del hígado del donante. Además, era esencial que el sistema fuera adecuado para la perfusión a largo plazo, permitiendo el tratamiento ex vivo del hígado, comúnmente conocido como "reparación de órganos".
Teniendo en cuenta la disponibilidad limitada de datos in vitro relevantes sobre la perfusión hepática en ratones, la revisión de la literatura se centró en estudios realizados en ratas. Se realizó una búsqueda sistemática de literatura que abarca de 2010 a 2022 utilizando palabras clave como "perfusión hepática normotérmica", "ex vivo o in vitro" y "ratas". Esta búsqueda tuvo como objetivo identificar las condiciones óptimas en roedores, lo que nos permitió determinar el enfoque más adecuado.
El sistema de perfusión consiste en un depósito amortiguador de vidrio sellado con camisa de agua, una bomba de rodillos peristáltica, un oxigenador, una trampa de burbujas, un intercambiador de calor, una cámara de órganos y un sistema de tubos de ciclo cerrado (Figura 1). El sistema garantiza un mantenimiento preciso de una temperatura de perfusión constante de 37 °C utilizando una máquina termostática dedicada. La bomba de rodillos peristálticos impulsa el flujo del perfusión en todo el circuito. El circuito de perfusión se inicia en el depósito aislado con camisa de agua. Posteriormente, el perfusato se dirige a través del oxigenador, que recibe una mezcla de gases de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono de una botella de gas dedicada. Después de la oxigenación, el perfusato pasa a través de la trampa de burbujas, en la que cualquier burbuja atrapada es redirigida de nuevo al depósito por la bomba peristáltica. El perfusión restante fluye a través del intercambiador de calor y entra en la cámara del órgano, desde donde regresa al depósito.
Aquí, informamos nuestras experiencias estableciendo un NEVLP para hígados de ratón y compartimos los resultados prometedores de un experimento piloto realizado utilizando el medio oxigenado sin portadores de oxígeno.
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Protocol
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones y directrices alemanas actuales para el bienestar animal y las directrices ARRIVE para la presentación de informes de investigación con animales. El protocolo de experimentación animal fue aprobado por el Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Turingia, Alemania (Número de aprobación: UKJ - 17 - 106).
NOTA: Se utilizaron ratones machos C57BL/6J con un peso de 34 ± 4 g (media ± error estándar de la media [SEM]) como donantes de hígado. Se mantuvieron en condiciones ambientales controladas (50% de humedad y 18 - 23 ° C) con acceso gratuito a comida de ratón estándar y agua. Durante todo el procedimiento quirúrgico, se mantuvo una frecuencia respiratoria superior a 60 respiraciones/min y la temperatura corporal se mantuvo por encima de 34 °C.
1. Preparación
- Configuración de la tabla de operaciones
- Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y consumibles para fines de esterilización.
- Encienda todos los equipos, incluida la tabla de calentamiento y la electrocoagulación.
- Introducir una jeringa de 50 ml con 25 ml de solución salina heparinizada (2.500 U/L) en una incubadora tibia (37 °C).
- Coloque los instrumentos quirúrgicos, la sutura de seda 6 - 0, el aplicador de algodón pequeño estéril, la solución salina veterinaria (500 ml) y las esponjas de gasa no tejida (10 cm x 10 cm) en la mesa de operaciones apropiadamente.
- Coloque una aguja de 26 G en la mesa de operaciones para crear un pequeño orificio en la tapa del tubo de microcentrífuga de 0,5 ml para recibir el tubo biliar para la recolección de bilis.
- Coloque la cánula (cánula de poliuretano 1 Fr o cánula de polietileno UT - 03) y un tubo de microcentrífuga esterilizado de 0,5 ml para la recolección de bilis en la mesa de operaciones.
- Cánula de vena porta hecha a sí misma
- Sujete la cánula 2 Fr con fórceps y perfore la pared con una aguja de 30 G a una distancia de 1 cm del extremo de la cánula. Empuje la aguja a través de la cánula hasta que la punta de la aguja se haga visible.
- Recorte la punta de la cánula dando como resultado un triángulo afilado.
- Preparación de solución salina heparinizada
- Preparar 25 mL de solución salina heparinizada con una concentración final de 2.500 UI/mL.
- Retire todas las burbujas de aire y coloque la jeringa en la incubadora a 40 °C.
- Demostración del sistema de perfusión
- Consulte la Figura 1 para conocer los componentes principales del sistema de perfusión de la máquina.
- Configuración de la cámara del órgano
- Consulte la figura 2 para el diseño de la cámara del órgano.
- Configuración del sistema de perfusión
- Active el programa de gráficos de laboratorio para el monitoreo de la presión.
- Conecte el calibrador de presión y el sensor de presión a nivel de la cámara del órgano.
- Ajuste el calibrador de presión para que lea 0 mmHg y compruebe el valor correspondiente en el software de control de presión.
- Ajuste el calibrador de presión para que lea 20 mmHg y vuelva a comprobar el valor correspondiente en el software de control de presión.
- Encienda el baño maría y precaliente la cámara del órgano a 40 °C.
- Enjuague todo el sistema de plomería dos veces con agua desionizada destilada durante 30 minutos cada una, asegurando la eliminación completa de la solución desinfectante.
- Inicie la circulación de la solución desinfectante en todo el sistema durante una duración de 20 minutos para garantizar una desinfección completa.
- Encienda la mezcla de gases (95% de oxígeno (O2) y 5% de dióxido de carbono (CO2).
- Relleno de perfusión
- Complementar 250 ml de medio E de Williams con 50 ml de suero bovino fetal, 3 ml de penicilina/estreptomicina (1 mg/ml), 0,17 ml de insulina (100 IE/ml), 0,34 ml de heparina (5000 U/ml) y 0,07 ml de hidrocortisona (100 mg/2 ml) para preparar el medio E de Williams completo.
- Agregue volúmenes iguales (150 ml) de perfusión al depósito y a la cámara del órgano para cebar el sistema.
NOTA: Se debe prestar especial atención a mantener la esterilidad durante el proceso de llenado. El perfusato se bombea constantemente a través de estos dos componentes clave de la máquina de recirculación cerrada de perfusión. - Encienda la bomba peristáltica a velocidad media (15 ml/min) para cebar el sistema de perfusión con el medio oxigenado.
2. Explantación hepática
- Preparación preoperatoria
- Pesa al animal. Preparar el analgésico buprenorfina (0,3 mg/ml) (0,05 mg/kg peso vivo).
- Conecte la cámara de inducción con la toma de corriente. Girar el oxígeno a 0,5 L/min. Convertir el isoflurano al 3%.
- Coloque al animal en la cámara hasta que se alcance la anestesia profunda (reflejo de enderezamiento positivo).
- Use una micro jeringa para aplicar una dosis de analgesia adaptada al peso corporal por vía subcutánea.
- Use una afeitadora eléctrica para recortar el pelaje de la piel abdominal.
- Transfiera el ratón a la mesa de operaciones y encienda el vaporizador de isoflurano al 2,5% para mantener la anestesia. Confirme la profundidad de la anestesia probando el reflejo interdigital del dedo del pie.
- Preparación del abdomen del ratón.
- Coloque el ratón en posición supina.
- Prueba del reflejo interdigital para confirmar dos veces la profundidad apropiada de la anestesia. Fije las cuatro extremidades con cinta adhesiva.
- Desinfecte ambos lados del abdomen hasta la línea axilar media usando tres rondas consecutivas de yodo-alcohol. Use una gasa esterilizada no tejida para cubrir el área alrededor del campo quirúrgico.
- Haga una incisión transversal de 3 cm 1 cm por debajo de la xifoidea en el área abdominal del ratón con tijeras para bebés Metzenbaum y fórceps quirúrgicos.
- Extienda la incisión de la piel bilateralmente a la línea medioaxilar en ambos lados.
- Haga con cuidado una incisión longitudinal de 2 cm a lo largo de la línea alba con tijeras de resorte.
- Corte a través de la capa muscular abdominal con electrocoagulación y tijeras de resorte Vannas.
- Coloque cuidadosamente un trozo de gasa húmeda para proteger el hígado de la electrocoagulación.
- Use una sutura de seda 6 - 0 con la aguja redonda para retraer el proceso xifoide para una mejor exposición del ligamento coronario.
- Use dos retractores de costillas para exponer completamente la cavidad abdominal del ratón.
- Mueva cuidadosamente el intestino delgado fuera de la cavidad abdominal con un hisopo de algodón húmedo para exponer completamente el hilio.
- Preparación del colédoco
- Transecto de los ligamentos falciforme, frénico y gastrohepático con tijeras afiladas.
- Libere cuidadosamente el conducto biliar común con pinzas curvas finas sin dientes.
NOTA: El conducto biliar común se daña muy fácilmente y se rompe. Una vez que se rompe, no se puede canular. Debido a la dirección de la posición anatómica, es mejor usar pinzas curvas. - Coloque dos bucles de sutura de seda 6 a 0 sobre el conducto biliar común en preparación para el siguiente paso.
- Canulación del colédoco
- Perfore cuidadosamente el conducto biliar con una aguja de 30 G. Use pinzas curvas puntiagudas para agrandar el orificio pequeño y ajustarlo a la canulación del conducto biliar.
- Use pinzas de canulación de vasos para agarrar la cánula del conducto biliar y empujarla hacia el conducto biliar.
- Asegure dos veces la cánula con los bucles de sutura preestablecidos 6 - 0.
NOTA: Durante la canulación se siente resistencia por bilis. Si la fuerza no está bien controlada, la cánula será empujada fuera del tracto biliar por la presión del flujo de salida de bilis. Ajuste cuidadosamente la profundidad de la cánula. Si es demasiado profundo, puede dañar el conducto biliar, y si no es lo suficientemente profundo, puede salirse. - Observe el flujo de bilis en la cánula después de una canulación exitosa.
- Preparación de la vena porta
- Sujete la vena porta con fórceps planos y libere cuidadosamente el tejido conectivo con fórceps curvos. No tire con fuerza para evitar causar desgarro de la vena porta. Una vez que la vena porta está dañada, es difícil volver a canular la vena porta.
- Diseccionar el PV justo superior a la bifurcación y colocar el primer asa de sutura usando una sutura de seda 6 - 0 en PV cerca de la confluencia para su uso posterior.
- Coloque el segundo asa de sutura para la fijación posterior de la PV lo más cerca posible del hilio hepático.
- Canulación de la vena porta
- Use un clip arterial para cerrar la vena porta distal.
- Con mucho cuidado, perfore la vena porta con una de las cánulas de la vena porta anteriores. El flujo sanguíneo se puede observar claramente dentro de la cánula después de una punción exitosa.
- Asegure la cánula PV con el asa de sutura 6 - 0 precolocada.
- Enrojecimiento del hígado
- Aumentar el isoflurano al 5% y sacrificar al ratón con una sobredosis de inhalación de isoflurano.
- Tome la solución salina de heparina precalentada de la incubadora. Retire todas las burbujas de aire formadas dentro de la solución salina heparinizada.
- Fije la jeringa con solución salina heparinizada precalentada en la bomba de la jeringa.
- Conecte el tubo de extensión de la bomba de la jeringa a la cánula de la vena porta, ajuste la velocidad a 2 ml / min y comience el lavado del hígado.
- Observe el color del hígado al final del procedimiento de lavado. Extirpe el hígado una vez que el color se vuelva amarillo homogéneo.
- Transección del diafragma, vena cava inferior suprahepática, vena cava infrahepática, arteria hepática, vena porta distal y cualquier tejido conectivo restante.
- Coloque el hígado en la placa de Petri.
3. Conexión hepática y de cámara
- Transferencia hepática
- Transfiera cuidadosamente el hígado a la cámara del órgano con una placa de Petri.
- Mantenga una pequeña cantidad de solución salina en la placa de Petri para evitar que el hígado se seque.
NOTA: La vena porta y el conducto biliar se pueden torcer fácilmente durante este procedimiento, lo que puede afectar la perfusión hepática y la recolección de bilis.
- Conexión de cánula de la vena porta
- Infunda lentamente solución salina normal en la cánula de la vena porta con una jeringa para evacuar las burbujas de aire en la cánula.
- Conecte la cánula de la vena porta en el tubo de salida de perfusión en la cámara del órgano.
- Conexión de la cánula del conducto biliar
- Guiar la cánula del conducto biliar del ratón a través de la válvula de una tapa de goma que está conectada a la cámara del órgano.
- Inserte la cánula del conducto biliar en un microtubo de 0,5 ml preparado previamente con un pequeño orificio en la tapa.
- Coloque el microtubo sobre arcilla fuera de la cámara del órgano.
4. Ajuste el caudal según la presión fotovoltaica
- Encienda la bomba peristáltica a partir de 1 ml/min.
- Compruebe la lectura de la presión de la vena porta para ajustar el caudal.
- Mantenga la presión de la vena porta en el rango fisiológico entre 7 - 10 mmHg ajustando el caudal.
NOTA: El caudal nominal puede variar ligeramente dependiendo del uso y posicionamiento de los tubos.
5. Recogida de muestras
- Obtenga muestras de perfusión de entrada del tubo de entrada de la vena porta y muestras de perfusión de salida de la cámara del órgano en intervalos de 3 horas.
- Recoger muestras de todos los lóbulos hepáticos para su análisis histológico al final del período de perfusión de 12 h.
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Representative Results
Establecimiento del procedimiento quirúrgico
Se utilizaron un total de 17 animales para este experimento: 14 ratones se emplearon para optimizar el proceso de obtención de órganos, incluida la canulación de la vena porta (PV) y el conducto biliar (BD), mientras que se utilizaron 3 ratones para validar el procedimiento (Tabla 1). Los resultados histológicos (Figura 3) se compararon para facilitar la identificación de la condición óptima de perfusión.
Selección de perfusato
Para este estudio se seleccionó un medio de cultivo de hepatocitos previamente utilizado10,11. El medio E de William fue diseñado inicialmente por Williams y Gunn como un medio reducido en suero para el cultivo prolongado in vitro de células epiteliales hepáticas de ratas maduras12. Sin embargo, también ha encontrado utilidad en el apoyo al crecimiento y mantenimiento de los hepatocitos de roedores13. El suero fetal bovino (FBS) es un suplemento de cultivo celular ampliamente empleado debido a su rica composición de nutrientes esenciales y factores de crecimiento que facilitan el crecimiento, la proliferación y la viabilidad celular14. Se utilizó el medio E completo de William como perfusato (Tabla 2), que se complementa con suplementado con 20% de suero bovino fetal, 1% de penicilina/estreptomicina, 5.000 U/L de heparina, 50 U/L de insulina y 0,010 g/L de hidrocortisona.
Selección de cánula
El procedimiento de canulación implicó primero canular el conducto biliar (BD) para la recolección de líquido biliar, seguido de la canulación de la vena porta (PV). Para la canulación BD, se utilizó inicialmente un tubo de polipropileno UT-03 con un diámetro exterior de 0,3 mm y un diámetro interior de 0,18 mm. Sin embargo, debido a las preocupaciones con respecto al daño potencial de BD y el mayor riesgo de desplazamiento involuntario del catéter asociado con la punta UT-03 recortada y rígida, se dio preferencia a los tubos de poliuretano 1 Fr. Los tubos de poliuretano, con su material más suave y su deslizamiento reducido, se consideraron más adecuados para la canulación de BD.
Inicialmente, se utilizó una cánula intravenosa de polipropileno de 26 G para canular la vena porta (PV). Sin embargo, la extracción de la aguja y la posterior fijación de la cánula al tubo de perfusión dio lugar a la formación de burbujas, que tenían el potencial de obstruir los sinusoides intrahepáticos. Para superar este problema, se construyó una cánula permanente utilizando una aguja de 30 G insertada en el 1 cm distal de una cánula de poliuretano de 2 Fr. Esta "cánula guiada por aguja" hecha por él mismo se insertó en la PV distal por encima de la confluencia. A medida que el catéter se colocó dentro del PV, la aguja se retiró lentamente mientras avanzaba simultáneamente el tubo. El extremo de la cánula de fabricación propia estaba conectado al tubo de perfusión dentro de la cámara. El uso de un material blando en esta técnica de canulación proporcionó una ventaja al reducir el riesgo de lesiones en la pared posterior del recipiente.
Estudios de validación
Las muestras de perfusión de entrada y salida se sometieron a la determinación de los niveles de pH y potasio. Los resultados obtenidos (Figura 4) fueron luego comparados con los hallazgos reportados en publicaciones recientes15,16,17. Tres hígados de ratón fueron perfundidos con oxigenado y suplementados con medio E de William durante 12 h. A lo largo de este período, se registró continuamente una presión de perfusión estable de 7 a 10 mmHg. El pH medio fue relativamente estable a lo largo de las 12 h de perfusión y osciló entre 7,3 y 7,7. Los niveles medios de potasio también se mantuvieron estables durante todo el período de perfusión y oscilaron entre 5,9 y 6,8 mmol/L (Figura 4). El caudal fotovoltaico se mantuvo dentro de un rango de 0,8 - 1,2 ml / min / g dependiendo del uso y posicionamiento de los tubos de la bomba durante los procedimientos experimentales. Todos los resultados observados en la perfusión hepática de ratón demostraron similitudes con las observaciones previamente informadas en la perfusión hepática de rata (Tabla 3).
Se recogieron muestras de tejido de tres hígados (N = 3) y se sometieron a 12 h de perfusión utilizando el protocolo optimizado para la tinción de HE, seguido de una exploración completa de portaobjetos. Cada lóbulo hepático se calificó utilizando una puntuación Suzuki modificada (Tabla 4). La puntuación clásica de Suzuki18 se incrementó incorporando tres parámetros adicionales: picnosis de núcleos, desprendimiento de vasos y presencia de eritrocitos en sinusoides y vasos grandes. Cada parámetro se calificó como ausente (0), leve (1), moderado (2) y grave (3). Se consideró que una puntuación final de 0 a 7 reflejaba una buena conservación, 8 a 14 se tomaba como una preservación moderada y 14 a 21 indicaba una mala conservación.
La preservación de los hígados de ratón se evaluó en función de la puntuación modificada de Suzuki. Dos expertos médicos realizaron una evaluación independiente de la morfología de los siete lóbulos de los tres hígados (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Se calculó el promedio de las siete puntuaciones del lóbulo para cada lóbulo hepático; Las puntuaciones más bajas indican un hígado mejor conservado. Las evaluaciones realizadas por los expertos mostraron un alto grado de concordancia. En particular, aunque se observaron ligeras discrepancias en las puntuaciones asignadas por los dos expertos en la evaluación de la picnosis de los núcleos, estas variaciones no afectaron significativamente los resultados generales de la puntuación.
En el mejor de los casos, el parénquima hepático estaba relativamente intacto con una estructura lobular típica bien conservada, apenas distinguible de un hígado normal. Los hepatocitos parecían viables con membranas celulares claramente visibles y núcleos redondos. Sin embargo, algunos núcleos se sometieron a picnosis, y algunos sinusoides hepáticos estaban ligeramente dilatados, lo que resultó en una puntuación de 4. (Figura 3, Figura 6)
En el peor de los casos, la estructura lobular estaba distorsionada, con vasos separados del parénquima y necrosis parenquimatosa confluente. A nivel celular, la vacuolización celular y la picnosis de los núcleos se hicieron evidentes, especialmente en la región pericentral. Además, se observó vacuolización leve a moderada. Hasta el 30 % de los hepatocitos estaban sometidos a necrosis, lo que resultó en una puntuación máxima de 14. (Figura 3, Figura 7)
Tabla 1: Establecimiento paso a paso de un modelo de perfusión hepática de ratón. Se observaron varias complicaciones durante el proceso de establecimiento debido a las diferencias en el tamaño de la cánula, el material y el posicionamiento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Comparación de métodos de preservación de órganos in vitro 15,17,19,20,21,22. La optimización de la selección de perfusión, la selección del portador de oxígeno y la comparación de componentes nutricionales es crucial en diversas condiciones de almacenamiento. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 3: Hemodinámica y análisis de gases en sangre en ratas normales y ratas NEVLP 11,15,16,17,18,20,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31. La información proporcionada describe selectivamente las características hemodinámicas del hígado de rata y los parámetros clave de la perfusión normotérmica in vitro. Específicamente, la perfusión hepática de rata puede considerarse óptima cuando la presión fotovoltaica generalmente varía de 4 a 10 mmHg, y la presión parcial de oxígeno en el perfusiónto que ingresa a la PV varía de 80 a 550 mmHg, cumpliendo con los criterios necesarios para una exitosa perfusión hepática in vitro en ratas. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 4: Puntuación Suzuki modificada. La puntuación Suzuki modificada utilizada en este estudio amplía la puntuación clásica de Suzuki incorporando tres parámetros adicionales: picnosis de núcleos, desprendimiento de vasos y presencia de eritrocitos en sinusoides y vasos grandes. A cada parámetro se le asignó una calificación en una escala de 0 (ausente), 1 (leve), 2 (moderado) o 3 (grave). La puntuación total, que va de 0 a 8, indica una buena conservación; 9 a 16 sugiere una preservación moderada, y 17 a 24 indica una preservación deficiente. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 5: Selección del medio de perfusión, el volumen de perfusión y la presión de perfusión basada en un estudio de la literatura de NEVLP en ratas (2010-2022)3,8,10,14,17,19,27,30,31,32,33,34,35,36 ,37,38,
39,40,41,42,43,44,45. La perfusión con máquina norterámica en hígado de rata puede exhibir variabilidad entre los estudios en términos del tipo específico y el volumen de perfuto utilizado, así como la duración de la perfusión. Diferentes estudios pueden emplear diferentes enfoques, como diálisis o perfusión de alto volumen, durante períodos prolongados. Sin embargo, a pesar de estas diferencias, parámetros como la presión portal, el caudal de la vena porta y la presión parcial de oxígeno en el perfusiónto generalmente demuestran una variación mínima entre los diversos métodos empleados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Figura 1: Diagrama esquemático del sistema de perfusión. Los componentes clave son la cámara del órgano, la máquina termostática, la bomba de rodillos, el oxigenador y el depósito. El perfusato es bombeado desde el depósito por una bomba peristáltica a un oxigenador. Hay un flujo de gas ininterrumpido de 95% O2 y 5% CO2 en el oxigenador. El perfusato pasa a través de la trampa de burbujas, donde cualquier burbuja de aire presente en el perfusiónto se captura y se bombea de vuelta al depósito. El perfusión restante fluye a la cámara del órgano, donde el tubo está conectado a la vena porta. El flujo de salida de perfusión de la cámara del órgano se dirige de vuelta al depósito por la bomba peristáltica. Se conecta un tubo de drenaje biliar a la cámara del órgano para recoger la bilis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Primer plano de la cámara de perfusión. La cámara de perfusión de órganos comprende una entrada y salida de perfusión, una trampa de burbujas, un intercambiador de calor y un puerto de recolección de bilis. El monitoreo en tiempo real de la presión de la bomba de perfusión se realiza utilizando un sensor de presión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados histológicos de hígados de ratón normales y perfundidos. (A) Morfología normal del hígado de ratón (control). (B) Ejemplo de morfología mejor conservada visualizada por tinción HE después de 12 h de perfusión. (C). Ejemplo de morfología peor conservada visualizada por tinción HE después de 12 h de perfusión. La flecha negra indica vacuolización, la flecha roja apunta a la dilatación sinusoidal, la flecha amarilla muestra la picnosis de los núcleos y la flecha verde especifica el desprendimiento vascular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de perfusión. Ph (A) y niveles de potasio (B). Ambos parámetros son estables a lo largo de los tiempos de observación de 12 h, lo que indica condiciones de perfusión constantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Daño hepático menor que resulta en una puntuación Suzuki modificada 4-7. Después de 12 horas de NEVLP, se realizó una evaluación semicuantitativa de la morfología hepática. Las muestras de cada lóbulo hepático se evaluaron y calificaron por separado, lo que resultó en un rango y una puntuación media para cada hígado, siendo la puntuación más alta posible de 4. Morfología hepática bien conservada con una puntuación que oscila entre 4-7 dependiendo del lóbulo hepático (media = 5) (Puntuación 0-7: morfología hepática bien conservada, puntuación 8-14 morfología moderadamente preservada, puntuación 15-21: morfología hepática mal conservada) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Daño hepático moderado que resulta en una puntuación Suzuki modificada 7-14. Evaluación semicuantitativa de la morfología hepática después de 12 horas de perfusión normotérmica oxigenada de la máquina según la puntuación de Suzuki modificada. Morfología moderadamente conservada con una puntuación que varía de 7 a 14 (media = 11). (Puntuación 0-7: morfología hepática bien conservada, puntuación 8-14 morfología moderadamente preservada, puntuación 15-21: morfología hepática mal conservada) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Daño hepático leve - moderado que resulta en una puntuación Suzuki modificada 5-11. La perfusión no homogénea dio lugar a una morfología preservada de menor a moderada en diferentes lóbulos hepáticos, con puntuaciones que variaron de 5 a 11 (media = 8). (Puntuación 0-7: morfología hepática bien conservada, puntuación 8-14 morfología moderadamente preservada, puntuación 15-21: morfología hepática mal conservada) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Pasos críticos en el protocolo
Los dos pasos cruciales en la explantación hepática son la canulación de la vena porta (PV) y la posterior canulación del conducto biliar (BD). Estos pasos son de suma importancia para garantizar el éxito de la recuperación de órganos y los procedimientos posteriores de perfusión o trasplante.
Desafíos y soluciones
La canulación PV presenta tres desafíos: lesión de la pared del vaso, desplazamiento del catéter y viabilidad del proceso de inserción. La naturaleza delicada de la pared del vaso fotovoltaico lo hace susceptible a la punción y al sangrado posterior si no se maneja con cuidado durante la canulación . Además, cualquier pérdida de sangre de la PV reduce la presión portal, lo que hace que la inserción de la cánula PV sea más difícil. Además, una lesión en la pared venosa portal puede introducir émbolos de aire en el sistema vascular intrahepático. Por lo tanto, ejercer precisión y precaución durante el proceso de canulación fotovoltaica es crucial para minimizar el riesgo de complicaciones.
Durante la canulación fotovoltaica, el riesgo de desplazamiento del catéter es una preocupación común, particularmente cuando se usan cánulas con materiales resbaladizos. En comparación con el polipropileno, el uso de cánulas de poliuretano es más favorable para la canulación fotovoltaica. La naturaleza suave y flexible del poliuretano reduce significativamente el riesgo de desplazamiento o pérdida del catéter, potencialmente atribuido a sus propiedades materiales. Además, el uso de una cánula suave minimiza la probabilidad de dañar la capa endotelial de los vasos sanguíneos. En el estudio, se compararon tres tipos de cánulas de acceso vascular, a saber, polipropileno 24 G, polipropileno 26 G y poliuretano 2 Fr, para la canulación PV. Entre estas opciones, las cánulas de poliuretano de 26 G y 2 Fr demostraron una mejor compatibilidad con el tamaño del ratón PV. Mientras que la cánula 26 G mostró una mejor compatibilidad anatómica, la cánula de poliuretano 2 Fr con un diámetro exterior de 0,66 mm se consideró adecuada para la aplicación prevista debido a sus propiedades materiales únicas, minimizando efectivamente el riesgo de desplazamiento involuntario del catéter de la PV.
En cuanto a la viabilidad de la inserción, se probaron diferentes técnicas. Una forma es sujetar los extremos proximal y distal de la PV, cortar un pequeño orificio con tijeras finas e insertar la cánula PV. Esta técnica requiere la participación de una persona adicional debido a la complejidad y el requisito de acciones simultáneas. En consecuencia, no es factible que un solo microcirujano realice el procedimiento de forma independiente. Por lo tanto, se necesita un catéter con una aguja interna y una cánula externa. Como se describió anteriormente, el uso de la cánula de polipropileno 26 G rígida y lisa disponible comercialmente conlleva el riesgo de deslizarse y arriesgarse a la formación de burbujas de aire al conectar la cánula al sistema de lavado. Para abordar estas preocupaciones, se ideó un "sistema de tubo guiado por aguja" autoconstruido insertando una aguja de 26 G de un catéter de aguja en una cánula de poliuretano 2 Fr larga y flexible. Este enfoque ofrece tres ventajas clave: (1) un sistema de inserción de catéter, (2) un tubo largo y flexible, y (3) propiedades favorables del material. Sin embargo, durante este paso, es crucial tener precaución para evitar que la punta de la aguja entre en contacto con la pared fotovoltaica mientras avanza, ya que esto podría causar daños irreversibles a la pared del recipiente.
La canulación de BD presentó los mismos tres desafíos: lesión de la pared del vaso, desplazamiento del catéter y viabilidad del proceso de inserción. En última instancia, la cánula de poliuretano 1 Fr se consideró más adecuada que la cánula de polipropileno UT - 03 debido a sus propiedades materiales favorables. A pesar del diámetro exterior ligeramente menor de la cánula UT - 03 (0,30 mm) en comparación con el tubo de poliuretano termosensible 1 Fr (0,33 mm), el material de poliuretano es rígido y menos propenso a doblarse. Por otro lado, la cánula 1 Fr, al ser suave y flexible, ofrece una inserción más fácil y, por lo tanto, se convirtió en nuestra opción preferida. Sin embargo, en los casos en que el tamaño BD es excepcionalmente pequeño y no puede acomodar la cánula más grande de 2 Fr, la cánula UT - 03 sigue siendo una alternativa viable. En tales casos, se debe prestar especial atención para evitar el desplazamiento de la cánula del BD.
Como se resume en la revisión de la literatura (Tabla 5), la mayoría de los experimentadores 19,41,42,46 utilizaron un caudal portal de 1 - 3 mL/min/g de hígado. Sin embargo, el caudal debe ajustarse para mantener la presión portal fisiológica en el rango de 4 - 10 mmHg28. La presión PV alta puede causar dilatación sinusoidal y desprendimiento vascular. La baja presión fotovoltaica y el bajo caudal fotovoltaico pueden dar lugar a una hipooxigenación de bajo flujo con necrosis posterior de zona media a pericentral. La manipulación del caudal fotovoltaico cumple la función de regular la presión fotovoltaica, que puede variar según la cánula utilizada y el tamaño del hígado, lo que requiere ajustes menores en el caudal fotovoltaico. Entonces, en este estudio, la perfusión se inició a una velocidad de flujo de 1 ml / min / g de hígado, y al mismo tiempo, la presión PV se monitoreó utilizando un transductor de presión arterial para mantener la presión fotovoltaica fisiológica ajustando la tasa de flujo.
Durante el desarrollo del modelo NEVLP, se intentó mejorar aún más el suministro de oxígeno al hígado perfundido mediante la adición de glóbulos rojos lavados al perfusión. Sin embargo, se observó una sedimentación significativa de eritrocitos en la cámara grande y el reservorio, reduciendo así el suministro de portadores de oxígeno al órgano durante la perfusión. Además, el daño a los eritrocitos fue causado por la acción mecánica de la bomba de perfusión peristáltica, que impulsa el perfusión comprimiendo un tubo de silicio. Ambas razones facilitaron nuestra decisión de no usar glóbulos rojos en este experimento. Los portadores de oxígeno a base de perfluorocarbonos pueden ser capaces de resolver estos problemas47.
Para evaluar la viabilidad del injerto hepático durante la perfusión, se recogió líquido biliar de ratón a intervalos de 3 h. Sin embargo, es difícil recolectar bilis a través del catéter debido a la alta viscosidad del líquido biliar del ratón. Esto se compensa inicialmente con las fuerzas capilares inducidas por el catéter fino de poliuretano 1 Fr colocado en el BD. Sin embargo, solo se pudieron recolectar alrededor de 20 μL de líquido biliar dentro de la primera hora del experimento. En lugar de drenar a través de la cánula, se observó un llenado retrógrado de la vesícula biliar.
Al final del período de perfusión de 12 h, la vesícula biliar se llenó con líquido biliar claro, lo que sugiere una producción activa de bilis durante la perfusión de la máquina. Esto puede ser potencialmente contrarrestado colocando un tubo más grande en la vesícula biliar.
Mientras tanto, se evaluó el daño histológico de la estructura hepática celular y lobular para determinar el resultado de la preservación. Se observó que incluso dentro del mismo hígado, la preservación no era homogénea. La falta de homogeneidad de los cambios estructurales sugiere que la perfusión fue heterogénea en todo el hígado (Figura 5, Figura 6, Figura 7). Además, los hallazgos histológicos proporcionan evidencia de que es viable preservar la integridad estructural del injerto hepático de ratón durante un tiempo mínimo de 12 horas durante la perfusión de la máquina. Sin embargo, la presencia de histología hepática intacta solo puede ayudar en la evaluación, pero no puede determinar definitivamente la función y la viabilidad del hígado. Cabe señalar que la necrosis, como la manifestación última del daño celular, puede no ser fácilmente observable hasta una etapa posterior. Por lo tanto, confiar únicamente en la evaluación histológica puede no proporcionar una comprensión completa del estado funcional y la viabilidad del hígado. Se requieren otros ensayos y evaluaciones complementarias para determinar el estado general del hígado, incluidos ensayos funcionales, marcadores bioquímicos y evaluación de la actividad metabólica.
Se logró una buena conservación después de 12 horas de perfusión. Sin embargo, extender aún más el tiempo de perfusión según sea posible para la reparación de órganos requiere abordar algunos problemas. En primer lugar, cabe señalar que lograr duraciones de perfusión a largo plazo superiores a 12 horas requeriría mantener condiciones estériles en lugar de solo condiciones limpias. Sin embargo, en estos experimentos iniciales, la atención se centró en mantener condiciones limpias en lugar de condiciones estériles, ya que garantizar la esterilidad introduciría complejidades adicionales al procedimiento. En segundo lugar, una perfusión más larga posiblemente requeriría agregar una unidad de diálisis, como lo describe Herman Tolboom22, para eliminar los productos de desecho metabólicos tóxicos que se acumulan. Utilizaron un sistema con un volumen total de 55 - 60 ml para perfundir un hígado de rata de 10 g durante 4 h. En este estudio, se utilizó un reservorio relativamente grande con un volumen total de 300 ml a pesar del pequeño tamaño del hígado de ratón, que pesa aproximadamente 1 g. Esta configuración dio como resultado un factor de dilución adicional de 50 veces. Sorprendentemente, no se observaron efectos perjudiciales durante el período de perfusión de 12 horas con esta configuración. En tercer lugar, una perfusión más prolongada también requeriría la adición de portadores de oxígeno, en el mejor de los casos en forma de hemoglobina artificial para garantizar un suministro adecuado de oxígeno, como lo describen Dondossola et al.47 y Jägers et al.48.
El desarrollo del trasplante hepático "no isquémico" basado en NEVLP sin duda ha aportado nuevas ideas y métodos para resolver o incluso prevenir el problema de la lesión por isquemia-reperfusión. Sin embargo, NEVLP es un concepto muy prometedor para mejorar la preservación de órganos y su aplicación potencial para extender la preservación de órganos a la reparación de órganos47.
Actualmente, tres técnicas diferentes de perfusión de máquina se utilizan experimental y clínicamente. La diferencia clave es la temperatura de trabajo: perfusión de máquina hipotérmica, perfusión de máquina subnomaterna y perfusión de máquina normotérmica (Tabla 2). Otras diferencias incluyen la elección de la solución de preservación, la solución de perfusión y la adición de portadores de oxígeno (Tabla 5).
NEVLP es principalmente una ventaja porque (1) el órgano se mantiene a su temperatura normal, (2) está oxigenado y (3) se suministra metabólicamente completamente. El sistema proporciona una excelente plataforma para la evaluación diagnóstica, la terapia de intervención y, en última instancia, la reparación de órganos49. Sin embargo, NEVLP plantea un gran desafío para la tecnología de soporte de órganos ex vivo. El desafío para NEVLP es reflejar la condición casi fisiológica. Hasta hace poco, debido al pequeño tamaño y la falta de criterios de evaluación estándar, solo se realizó un número limitado de estudios de NEVLP con roedores 25,26,27,28,29,30,31.
Se ha demostrado aquí que el modelo de ratón es un modelo válido que permite un tiempo de conservación de 12 horas. En comparación, la mayoría de los estudios en ratas han reportado tiempos de perfusión de 6 horas o menos28,33. Además, el uso de animales pequeños es una ventaja para los estudios moleculares en comparación con los animales grandes debido a la disponibilidad de abundantes reactivos y los menores costos experimentales. Por ejemplo, los ratones son actualmente una opción preferible para probar modelos knockout de la familia de genes ATG, especialmente para estudiar las vías de señalización de la lesión por isquemia-reperfusión en el hígado 8,50.
Los experimentos en hígados de rata con respecto a NEVLP han revelado que la preservación de la perfusión de la máquina normotérmica se asocia con un daño hepatocelular reducido y una mejor supervivencia temprana después del trasplante en comparación con la preservación en frío 31,40,51,52,53,54. NEVLP utilizando hígados de rata también es adecuado para estudiar las adiciones de fármacos o células al perfusión. Un ejemplo impresionante es el estudio de Xuan Tian26, que utilizó células madre mesenquimales modificadas con hemo oxigenasa-1 combinadas con perfusión de máquina normotérmica para mejorar la calidad de los injertos hepáticos a través de la vía de señalización Wnt. Haojie Wang39 ha confirmado en su reciente estudio que la adición de células madre mesenquimales de médula ósea al perfusato puede mejorar en gran medida la calidad de NEVLP en ratas para la perfusión a corto plazo. En su estudio utilizando hígados DCD, las células madre mesenquimales de la médula ósea combinadas con NEVLP inhibieron la congestión sinusoidal hepática y la lesión endotelial. La adición de células madre mesenquimales impidió la activación intrahepática de macrófagos y la adhesión intercelular. Además, la adición de células madre mesenquimales regula el equilibrio endotelina-1 / óxido nítrico endotelial para mejorar la perfusión hepática y la microcirculación.
Los ratones ofrecen una clara ventaja sobre las ratas cuando se trata de NEVLP, particularmente en el contexto de estudios moleculares centrados en hígados transgénicos o modificados genéticamente. Sin embargo, debido al pequeño tamaño del animal, el procedimiento plantea un desafío mayor pero manejable para el microcirujano37.
Sistema de clasificación para la evaluación histológica
La evaluación histológica es decisiva para determinar el impacto de las condiciones de perfusión sobre la integridad morfológica del injerto.
Si bien la puntuación Suzuki se utiliza comúnmente en estudios que evalúan la patología hepática, se ha observado que este sistema de puntuación puede no capturar adecuadamente los hallazgos específicos observados en la preservación hepática ex vivo. Para abordar esta limitación, se introdujeron cuatro criterios adicionales para mejorar la evaluación integral del tejido hepático preservado (Tabla 4). En primer lugar, se implementó la inclusión de la evaluación de la picnosis nuclear, ya que sirve como un parámetro valioso indicativo de daño celular. En segundo lugar, se incorporó como criterio adicional la evaluación del desprendimiento de vasos y hepatocitos, que significa daño al lóbulo hepático. Por último, la clasificación de la presencia de eritrocitos en los sinusoides se utilizó como indicador de enrojecimiento y perfusión heterogéneos. Al incorporar estos criterios suplementarios, se logró una evaluación más matizada y precisa de la condición del tejido hepático preservado, proporcionando una comprensión más profunda de los efectos de la preservación hepática ex vivo.
La vacuolización de hepatocitos55 ocurre después de alteraciones en el uso del sustrato, el gasto de energía, la desintegración de los microtúbulos y la inhibición de la síntesis de proteínas. El núcleo del hepatocito se ve obligado a desplazarse hacia la periferia de la célula por grandes vacuolas. Este proceso suele ir acompañado de picnosis nuclear. En este estudio, 12 h de perfusión de máquina normotérmica condujeron a diferentes grados de vacuolización de los hepatocitos en comparación con el control que sugiere una perfusión no homogénea.
La presencia de sinusoides dilatados entre los cordones hepatocitos fue notable en este estudio. Este fenómeno surge principalmente de la obstrucción del flujo venoso hepático, lo que lleva a la estasis vascular y la congestión dentro del parénquima hepático. En este modelo de hígado de ratón, los desafíos asociados con el mantenimiento de una presión de perfusión portal consistente debido al pequeño tamaño del órgano pueden contribuir a la dilatación observada de los sinusoides hepáticos.
Los cambios necróticos generalmente se manifiestan en grupos de células, áreas regionales o zonas específicas. El área periportal bien perfundida exhibió una preservación relativamente mejor de los hepatocitos en comparación con el área pericentral. La perfusión hepática de doble vaso, como se demostró en hígados de rata20, presenta un mayor desafío en hígados de ratón debido al pequeño tamaño de la arteria hepática. En consecuencia, la perfusión no homogénea observada del hígado de ratón puede atribuirse, al menos en parte, a esta limitación.
Estas observaciones no son exclusivas de hígados de ratón sometidos a NEVLP, sino que también se pueden visualizar en imágenes histológicas de otros estudios de NEVLP, aunque pueden no describirse explícitamente.
Importancia y aplicaciones potenciales de Mouse NEVLP
NEVLP de hígados de ratón es un procedimiento desafiante pero factible. Se necesitan más esfuerzos para hacer el mejor uso de esta tecnología para dilucidar el mecanismo subyacente al efecto beneficioso de NEVLP. Mejorar nuestro conocimiento facilitará la evolución progresiva de esta tecnología, haciendo la transición más allá de la preservación de órganos hacia el ámbito de la "reparación de órganos".
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Disclosures
No hay conflictos de intereses financieros que revelar.
Acknowledgments
A lo largo de la redacción de este documento, he recibido un gran apoyo y asistencia. Me gustaría agradecer especialmente a mi compañero de equipo XinPei Chen por su maravillosa colaboración y apoyo paciente durante mi operación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100x15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT - 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
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