Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Generering af patientafledte podocytter fra hudbiopsier

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/65364
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Nephrology and Hypertension, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg, 2Research Center on Rare Kidney Diseases (RECORD), University Hospital Erlangen

Summary

Dette manuskript beskriver en totrinsprotokol til generering af patientspecifikke podocytter fra dermale fibroblaster via episomal omprogrammering til menneskeinducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) og efterfølgende differentiering i podocytter.

Abstract

Podocytter er epitelceller, der sidder på urinstedet i den glomerulære filtreringsbarriere, der bidrager til glomerulus selektive filterfunktion. Mutationer i podocytspecifikke gener kan forårsage fokal segmental glomerulosklerose (FSGS), og podocytter påvirkes også i mange andre primære og sekundære nefropatier. På grund af deres differentierede natur er primære cellekulturmodeller begrænset til podocytter. Derfor anvendes almindeligt betinget udødeliggjorte celler. Disse betinget udødeliggjorte podocytter (ciPodocytter) har imidlertid flere begrænsninger: cellerne kan dedifferentiere i kultur, især når de når sammenløb, og flere podocytspecifikke markører udtrykkes enten kun lidt eller slet ikke. Dette sætter spørgsmålstegn ved brugen af ciPodocytter og deres anvendelighed til fysiologisk, patofysiologisk og klinisk rækkevidde. Her beskriver vi en protokol til generering af humane podocytter - inklusive patientspecifikke podocytter - fra en hudstansbiopsi ved episomal omprogrammering af dermale fibroblaster til hiPSC'er og efterfølgende differentiering til podocytter. Disse podocytter ligner in vivo podocytter meget bedre med hensyn til morfologiske egenskaber, som udviklingen af fodprocesser og ekspressionen af den podocytspecifikke markør. Endelig, men vigtigt, opretholder disse celler patienternes mutationer, hvilket resulterer i en forbedret ex vivo-model til undersøgelse af podocytsygdomme og potentielle terapeutiske stoffer i en individualiseret tilgang.

Introduction

Podocytter er specialiserede, postmitotiske nyreepitelceller, der danner nyrens glomerulære filtreringsbarriere sammen med den glomerulære kældermembran (GBM), glomerulære endotelceller og glycocalyx. Fænotypisk består podocytter af en cellekrop og primære, mikrotubulusdrevne membranforlængelser samt sekundære forlængelser kaldet fodprocesser 1,2. Den glomerulære filtreringsbarriere, der filtrerer urin fra blodet, er bygget af fenestreret endotel, GBM og en specialiseret type intercellulær krydsning, der forbinder nærliggende podocytfodprocesser, kaldet spaltemembranen af podoctyes3. Under sunde forhold bevares proteiner, der er større end albumin, fra filtreringsbarrieren på grund af deres størrelse og ladning4.

Mutationer i cytoskeletal- eller podocytspecifikke gener såvel som cirkulerende faktorer, der påvirker podocytsignalveje, er kendt for at inducere podocytudsugning, løsrivelse eller apoptose, hvilket resulterer i proteinuri og glomerulær sklerose. Især cytoskeletal omlejring, ændringer i podocytpolaritet eller beskadigelse af fodprocesser med et tilhørende tab af spaltekryds er afgørende5. På grund af deres terminalt differentierede status kan podocytter næppe udskiftes efter frigørelse af GBM. Men hvis podocytter er fastgjort til GBM, kan de stadig komme sig efter udslettelse og reformere interdigiterende fodprocesser 6,7,8. Yderligere forståelse af de begivenheder, der fører til podocytskader i forskellige glomerulære lidelser, kan give nye terapeutiske mål, der vil hjælpe med at udvikle behandlinger for disse sygdomme. Podocytskader er et kendetegn ved forskellige glomerulære sygdomme, herunder fokal segmental glomerulosklerose (FSGS), diabetisk nefropati, minimal forandringssygdom og membranøs glomerulonefropati, der kræver pålidelige podocyt ex vivo-modeller for at studere de patologiske mekanismer og potentielle behandlingsmetoder for disse sygdomme 9,10. Podocytter kan undersøges ex vivo ved klassisk primær cellekultur baseret på isolering af glomeruli ved differentiel sigtning11. På grund af den terminalt differentierede tilstand med begrænset spredningskapacitet bruger de fleste forskere imidlertid muse- eller humane ciPodocyt-cellelinjer, der udtrykker temperaturfølsomme varianter af SV40 store T-antigen. Alternativt isoleres ciPodocytter fra transgene mus, der huser SV40-mærkets udødeliggørende gen 1,12.

CiPodocytter formerer sig ved 33 °C, men går ind i vækststop og begynder at differentiere ved 37 °C13,14. Det skal erindres, at eksperimentelle data opnået med disse celler skal fortolkes med en vis forsigtighed, da cellerne genereres ved hjælp af en unaturlig genindsættelse15. Da disse celler har et udødeliggørende gen, ændres den cellulære fysiologi på grund af igangværende spredning12. Podocytcellelinjer genereret af denne tilgang er for nylig blevet stillet spørgsmålstegn ved, da mus, mennesker og rotter ciPodocytter udtrykker mindre end 5% synaptopodin og nephrin på proteinniveau samt NPHS1 og NPHS2 på mRNA-niveau sammenlignet med glomerulær ekspression16. Desuden udtrykker de fleste podocytcellelinjer ikke nephrin17,18. Chittiprol et al. beskrev også en signifikant forskel i cellemotilitet og respons på puromycin og doxorubicin i ciPodocytter16. Podocytter kan findes i urinen efter løsrivelse fra GBM i forskellige glomerulære sygdomme 19,20,21,22. Levedygtige urinpodocytter kan dyrkes ex vivo i op til 2-3 uger, men de fleste celler gennemgår apoptose23,24. Interessant nok findes podocytter ikke kun i urinen hos patienter med glomerulær sygdom, men også i urinen hos raske forsøgspersoner, sandsynligvis når de er senescerende igen med et begrænset potentiale for replikation i kultur24. Desuden er det urinafledte podocytnummer begrænset, og cellerne dedifferentierer i kultur, viser mindre fodprocesser, ændrer morfologi og vigtigst af alt har begrænset spredningskapacitet. Ekspressionen af podocytspecifikke gener er fraværende, forsvinder inden for få uger eller varierer mellem disse cellekloner. Nogle celler, der er positive for den podocytspecifikke markør, udtrykte markøren for rørformede epitelceller eller myofibroblaster og mesangialceller, hvilket tyder på dedifferentiering og/eller transdifferentiering af de dyrkede urinpodocytter24,25.

For nylig er dannelsen af ciPodocytcellelinjer afledt af urinen hos patienter og raske frivillige ved transduktion med et termofølsomt SV40 stort T-antigen og hTERT blevet beskrevet26. mRNA-ekspression for synaptopodin, nestin og CD2-associeret protein blev påvist, men podocin mRNA var fraværende i alle kloner. Ud over problemerne med urinpodocytter indeholder disse celler også det indsatte udødeliggørende gen, hvilket resulterer i de ulemper, der er diskuteret ovenfor.

I modsætning hertil har humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) en enorm kapacitet til selvfornyelse og differentiering i flere celletyper under passende forhold. Det har tidligere vist sig, at hiPSC'er kan tjene som en næsten ubegrænset kilde til podocytter27,28.

Her beskrives en totrinsprotokol til generering af patientspecifikke podocytter fra dermale fibroblaster af hudstansbiopsier med efterfølgende episomal omprogrammering til hiPSC'er og en endelig differentiering i hiPSC-afledte podocytter (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Protokol til generering af patientspecifikke hiPSC-afledte podocytter. Grafisk oversigt over protokollen til generering af patientspecifikke podocytter fra dermale fibroblaster af en hudbiopsi ved omprogrammering til hiPSC'er og differentiering til podocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Som et første skridt blev somatiske dermale fibroblaster vokset ud af en hudstansbiopsi og omprogrammeret til hiPSC'er ved hjælp af en integrationsfri metode ved elektroporation med plasmider, der udtrykker transkriptionsfaktorerne OCT3/4, KLF4, SOX2 og c-MYC 29,30,31. Opståede hiPSC-kolonier blev efterfølgende udvalgt og udvidet. Differentiering begyndte med induktion af den mesodermale afstamning ved aktivering af WNT-signalvejen efterfulgt af generering af nefronstamceller, der stadig var i stand til at proliferere. Endelig blev cellerne differentieret til podocytter. I denne procedure ændrede og kombinerede vi tidligere offentliggjorte protokoller til episomal omprogrammering til generering af hiPSC'er af Bang et al.32 og Okita et al.33 samt en protokol til differentiering af hiPSC'er i podocytter af Musah et al.28,34,35.

Faktisk havde podocytter genereret af vores protokol en fænotype tættere på podocytter in vivo, hvad angår udviklingen af et særskilt netværk af primære og sekundære fodprocesser og ekspressionen af podocytspecifikke markører, som synaptopodin, podocin og nephrin. Ved brug af hiPSC-afledte podocytter opretholdes patientens genetiske baggrund under omprogrammering og differentiering. Dette muliggør patientspecifik podocytsygdomsmodellering og opdagelse af potentielle terapeutiske stoffer ex vivo i et næsten ubegrænset celleantal. Desuden er denne protokol minimalt invasiv, omkostningseffektiv, etisk acceptabel og kan fremme nye veje til udvikling af lægemidler.

Protocol

Protokollen blev godkendt af den etiske komité ved Friedrich-Alexander Universitet Erlangen-Nürnberg (251_18B), og alle patienter og probander gav skriftligt samtykke. Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med relevante retningslinjer og regler. For sammensætningen af alle medier og opløsninger, der anvendes her, se tabel 1.

1. Udvækst af dermale fibroblaster fra en hudstansbiopsi

  1. Overfør hudstansbiopsi til et sterilt 15 ml konisk rør med 10 ml forvarmet fibroblastmedium.
  2. Fjern mediet og vask hudstansebiopsi tre gange med 5 ml sterilt, forvarmet 1x fosfatbufret saltvand (PBS). Overfør hudstansbiopsi med sterile tang til en 10 cm cellekulturplade og skær den i bredden i tre eller fire stykker med en steril skalpel, der efterlader epidermis og dermis.
  3. Overfør hvert stykke til en steril 35 mm plastcellekulturskål, og tryk den forsigtigt mod kulturskålen. Fjern overskydende medium omkring biopsistykkerne. Lad det tørre i 5-10 minutter, indtil væsken fordamper, og biopsien er fastgjort til cellekulturplasten.
  4. Tilsæt 1 ml fibroblastmedium dråbevis med en 1.000 μL pipette omkring biopsien og fyld forsigtigt op til et slutvolumen på 3 ml. Dyrk ved 37 °C, 5% CO2 i 7 dage uden at fodre og flytte fadet. Skift forsigtigt mediet til frisk, forvarmet fibroblastmedium. Efter 7 dage kan udvoksede spindellignende fibroblaster overvåges omkring hudbiopsi ved hjælp af et fasekontrastmikroskop36.
    BEMÆRK: Når forvoksede fibroblaster når skålens kant, skal du fortsætte igen fra trin 1.3 for at generere endnu et parti fibroblaster.
  5. Til udvidelse af de udvoksede fibroblaster vaskes med 2 ml forvarmet 1x PBS, fibroblasterne adskilles med 1 ml 1x trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og inkuberes i 5 minutter ved 37 °C, 5% CO2. Overfør de løsrevne celler til et 15 ml konisk rør, og vask cellekulturskålen med 2 ml frisk, forvarmet fibroblastmedium.
  6. Vask mediet samles i tuben for at neutralisere dissociationsmidlet og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten suges op, og cellepelletsen resuspenderes med 1 ml frisk, forvarmet fibroblastmedium. Tæl cellerne med et Neubauer-kammer eller en automatiseret celletæller ved hjælp af trypanblåt og frø 2,5 x 10 3 til 5 x 103 fibroblaster pr. cm2 i friske cellekulturkolber.
  7. Kolberne anbringes tilbage i inkubatoren, og cellerne fordeles jævnt ved at flytte kolberne tre gange i hver retning. Den næste dag skal du udskifte mediet med frisk, forvarmet fibroblastmedium. Skift medium to gange om ugen og opdel, når fibroblasterne når omkring 80% sammenløb.

2. Frysning af dermale fibroblaster

  1. For at fryse fibroblasterne skal du vaske dem med 5 ml forvarmet 1x PBS. Aspirer PBS og dissociere fibroblasterne med 4 ml 1x trypsin-EDTA. Kolben sættes tilbage i inkubatoren og inkuberes i 5-7 minutter ved 37 °C ved 5% CO2. Overvåg løsrivelse ved hjælp af et fasekontrastmikroskop, og bank mod siden af kolben for at løsne cellerne.
  2. Overfør de løsrevne celler til et 15 ml konisk rør. Cellekulturkolben vaskes med 5 ml frisk, forvarmet fibroblastmedium. Vaskemediet samles i det koniske rør og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C.
  3. Supernatanten suges til syn, og cellepelletsen opslæmmes med 2 ml frisk, forvarmet fibroblastmedium. Tæl cellerne og overfør 1 x 106 celler til et nyt konisk rør. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C.
  4. Supernatanten suges op, og cellepelletsen resuspenderes med 1 ml koldt fibroblastfrysemedium bestående af 90 % føtalt kalveserum og 10 % dimethylsulfoxid (DMSO). Overfør til en kryovial, anbring den i en frysebeholder og frys natten over ved -80 °C. Ved langtidsopbevaring anbringes kryoialen i en flydende nitrogentank næste dag.

3. Episomal omprogrammering af fibroblaster til generering af hiPSC'er

  1. Til episomal omprogrammering skal du bruge 1,5 x 106 fibroblaster fra passage 4 til 8. For at nå dette cellenummer skal du bruge to til tre 250 ml kolber med omkring 70% sammenløb.
  2. Dagen før omprogrammering opdeles fibroblasterne i forholdet 1: 2 for at sikre deres proliferative tilstand. Suger derfor mediet og vask kolberne med 5 ml forvarmet 1x PBS pr. kolbe. Aspirer PBS og dissociere fibroblasterne med 4 ml 1x trypsin-EDTA. Kolberne sættes tilbage i inkubatoren og inkuberes i 5-7 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Overvåg løsrivelse ved hjælp af et fasekontrastmikroskop, og bank mod siden af kolben for at løsne cellerne fra plastoverfladen.
  3. De løsrevne celler overføres til et 50 ml konisk rør, og cellekulturkolberne vaskes med 5 ml frisk, forvarmet fibroblastmedium. Vaskemediet samles i det koniske rør og centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten suges op, og cellepelletsen opslæmmes igen i 6 ml frisk, forvarmet fibroblastmedium.
  4. Forbered seks nye cellekulturkolber ved at tilsætte 5 ml frisk, forvarmet fibroblastmedium pr. kolbe. Der tilsættes 1 ml fibroblastcellesuspension til hver kolbe. Kolberne anbringes tilbage i inkubatoren, og cellerne fordeles jævnt ved at flytte kolberne tre gange i hver retning.
  5. Til episomal omprogrammering belægges to 10 cm cellekulturplader, der er egnede til hiPSC-kultur, med 4 ml kold belægningsopløsning pr. plade. Pladerne inkuberes i 1 time ved 37 °C.
    BEMÆRK: For at dyrke hiPSC'er kræves forskellige cellekulturplast og yderligere ekstracellulær matrixbelægning (se materialetabel).
  6. Mediet fjernes fra fibroblasterne og vaskes med 10 ml forvarmet 1x PBS pr. kolbe. PBS suges til og fibroblasterne adskilles med 4 ml 1x trypsin-EDTA pr. kolbe ved inkubation i 5-7 minutter ved 37 °C. Overvåg løsrivelse ved hjælp af et fasekontrastmikroskop, og bank om nødvendigt mod siden af kolben for at løsne cellerne fra plastoverfladen.
  7. Overfør de løsrevne celler til et 50 ml konisk rør. De tomme kolber vaskes med 6 ml forvarmet fibroblastmedium for at opsamle de resterende celler og samle dem i det koniske rør. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten suges til syn, og cellepelletsen opslæmmes igen i 3 ml frisk, forvarmet 1x PBS.
  8. Tæl cellerne og overfør 1,5 x 106 fibroblaster i et nyt konisk rør. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten kasseres, cellepelletsen resuspenderes i 5 ml elektroporationsmedium, og der centrifugeres igen. I mellemtiden aspireres belægningsopløsningen fra de belagte 10 cm cellekulturplader og tilsættes 7 ml forvarmet fibroblastmedium.
  9. Efter centrifugering kasseres supernatanten, og cellepelletten resuspenderes i elektroporationsmedium med en koncentration på 1,5 x 106 celler i 250 μl. 250 μL cellesuspensionen overføres til en elektroporationskuvette med en afstand på 4 mm (se materialetabel).
  10. Der fremstilles en plasmidtransfektionsblanding ved at tilsætte 4 μg af hvert plasmid (pCXLE-hOCT3/4, pCXLE-hSK, pCXLE-hMLN) til et samlet volumen på 50 μL elektroporationsmedium. Overfør til kuvetten og bland ved at svirpe forsigtigt. Elektroporat med en puls ved 280 V.
  11. Klip en pipettespids af med en steril saks, og overfør 125 μL af de elektroporerede fibroblaster til hver af de forberedte 10 cm cellekulturplader. Fordel cellerne ved at omrøre pladerne tre gange i alle retninger og læg dem tilbage i inkubatoren. Der inkuberes natten over ved 37 °C med 5% CO2 uden forstyrrelser.
  12. For at fjerne døde celler skal du udskifte mediet den næste dag med 7 ml frisk, forvarmet fibroblastmedium. Skift mediet til hiPSC-dyrkningsmediet 2 dage efter elektroporation, og udskift det hver anden dag i de næste 20 dage.

4. Udvælgelse, udvidelse og kvalitetskontrol af genererede hiPSC'er

  1. Overvåg cellerne dagligt i mindst 20 dage ved hjælp af et fasekontrastmikroskop med et 10x eller 20x mål for at observere dannelsen af hiPSC-kolonier efter elektroporation. Hvis hiPSC-kolonier er omkring 300 μm i diameter med forskellige kanter, og hiPSC'erne viser et højt kerne-til-krop-forhold, er hiPSC-kolonierne klar til udvælgelse ved plukning (figur 2B, C og figur 3).
  2. Før plukning belægges en plade med 96 huller, der er egnet til hiPSC-kultur, med 100 μL belægningsopløsning pr. hul og inkuberes i 1 time ved 37 °C. Under inkubation markeres kolonier af interesse i bunden af cellekulturskålen med en pen. Til den endelige klargøring af 96-brøndspladen fjernes belægningsopløsningen, og der tilsættes 100 μL forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632 til hvert hul.
  3. Cellerne vaskes med forvarmet 1x PBS, og der tilsættes frisk, forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632, før du vælger for at fjerne døde celler. For at vælge hiPSC-kolonier skal du bruge en målenål og opdele hiPSC-kolonierne i små stykker ved at tegne et gitter ind i hver koloni.
  4. Brug et fasekontrastmikroskop til at kontrollere, at kolonierne med succes er opdelt i stykker. Overfør dem med en 100 μL pipette til den forberedte 96-brøndplade. Hold pipetten lodret over kolonien uden at røre cellerne for at undgå ridser og tab af kolonien.
  5. 96-brøndpladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C med 5% CO2 og lad cellerne binde natten over uden forstyrrelser. Opbevar opvasken med fibroblast- og hiPSC-blandingen, hvis plukningen ikke lykkes. Fjern derfor ROCK-hæmmer Y27632 ved at ændre mediet til hiPSC-dyrkningsmediet og læg pladerne tilbage i inkubatoren.
  6. Næste dag skiftes 96-brøndpladens medium til 200 μL frisk hiPSC-dyrkningsmedium, og det skiftes hver anden dag. Overvåg 96-brøndpladen den næste dag, og markér brøndene med vellykkede plukkede kloner.
    BEMÆRK: Hvis de plukkede hiPSC-kloner ikke vælges fuldt ud efter første forsøg, og fibroblasterne kan findes i brønden, gentages plukningen fra 96-brønden eller skraber fibroblasterne af pladen.

5. Udvidelse af udvalgte hiPSC-kloner

  1. Overvåg hiPSC-klonerne ved hjælp af et fasekontrastmikroskop. Hvis de udvalgte hiPSC'er når omkring 70% sammenløb, er hiPSC-klonerne klar til udvidelse.
  2. Overtræk en plade med 48 brønde, der er egnet til hiPSC-kultur, med 250 μL belægningsopløsning pr. hul i 1 time ved 37 °C. Overtræksopløsningen erstattes med 200 μL frisk, forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632.
  3. For at løsne hiPSC'erne fra 96-brøndspladen skal du skrabe plastoverfladen med en 1.000 μL pipettespids. Overfør de løsrevne hiPSC'er fra 96-brøndspladen til en 48-brøndsplade. Skift mediet næste dag til frisk, forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium for at fjerne døde celler og ROCK-hæmmeren Y27632.
  4. Hvis hiPSC-klonerne når omkring 70% sammenløb, overføres hiPSC'erne til en 24-brønds plade. Overtræk derfor en plade med 24 brønde, der er egnet til hiPSC-kultur, med 400 μL belægningsopløsning pr. hul i 1 time ved 37 °C. Overtrækningsopløsningen erstattes med 400 μL frisk, forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632. Opsug mediet fra de 48 huller, og vask med 500 μL forvarmet 1x PBS.
  5. PBS erstattes med 100 μL enzymatisk celleløsrivelsesopløsning indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632 og inkuberes ved 37 °C i 4 min. Skyl hiPSC'erne af pladen med en 1.000 μL pipette. Overfør de dissocierede celler til et 15 ml konisk rør. Den tomme plade med 48 huller vaskes med hiPSC-dyrkningsmediet indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632 og pooles i det koniske rør.
  6. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten suges til syn, og hiPSC'erne resuspenderes i 1 ml hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632, og overføres til en plade med 24 huller. Pladen anbringes i inkubatoren ved 37 °C ved 5% CO2 og cellerne fordeles ved at omrøre pladen tre gange i alle retninger. Lad cellerne vedhæfte natten over uden forstyrrelse.
  7. Næste dag ændres mediet til hiPSC-dyrkningsmediet uden ROCK-hæmmer Y27632.
    BEMÆRK: Hvis hiPSC-kloner når omkring 70% sammenløb, overføres hiPSC'erne til en 12-brønds plade ved at gentage trin 5.4 til 5.7 med øgede volumener, der er egnede til et 12-brøndsformat. Hvis hiPSC'erne fra 12-brøndspladen når omkring 70% sammenløb, overføres hiPSC-klonerne til en 6-brøndsplade med øgede volumener til et 6-brøndsformat.

6. Frysning af udvalgte hiPSC-kloner

  1. For at fryse udvalgte hiPSC-kloner skal du aspirere mediet fra en 6-brønds plade. Brøndene vaskes med 2 ml 1x PBS. HiPSC'erne suges og adskilles med 1 ml enzymatisk celleløsrivelsesopløsning indeholdende 10 μM Y27632. Pladen sættes tilbage i inkubatoren og inkuberes i 4 minutter ved 37 °C og 5% CO2.
  2. Skyl hiPSC'erne af pladen med en 1.000 μL pipette, og overfør de løsrevne celler til et 15 ml konisk rør. Pladen vaskes med 2 ml frisk, forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632. Pool i det koniske rør og centrifuger ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten suges op, og cellepelletsen resuspenderes med 2 ml frisk, forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632.
  3. Tæl cellerne og overfør 1 x 106 celler til et nyt konisk rør. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten suges op, cellepelletsen resuspenderes i 1 ml koldt, serumfrit hiPSC-frysemedium, og der fryses i en kryovial ved hjælp af en frysebeholder natten over ved -80 °C. Ved langtidsopbevaring anbringes kryovialen i en flydende nitrogentank den næste dag.

7. HiPSC kvalitetskontrol

  1. Karakterisering af hiPSC-morfologi
    1. Kontroller den karakteristiske hiPSC-morfologi ved hjælp af et fasekontrastmikroskop med et 20x mål. Efter omprogrammering ændres cellemorfologien fra lange, spindellignende fibroblaster til små, runde hiPSC'er, hvilket giver et højt kerne-til-krop-forhold, der vokser i kolonier med forskellige grænser (figur 2C).
    2. Hvis hiPSC-kolonierne bliver for tætte, og der opstår spontan differentiering, skrabes de differentierede dele af pladen ved hjælp af en pipettespids (figur 3). Da hiPSC'er har en høj spredningshastighed, skal hiPSC-kulturerne fodres hver dag med friske, forvarmede hiPSC-fodringsmedier.
  2. Karakterisering af pluripotensmarkører ved immunofluorescensfarvning
    1. For at kontrollere de genererede hiPSC'er for pluripotensmarkør via immunofluorescensfarvning anbringes plastdæksler i en plade med 24 brønde og belægges med 250 μL belægningsopløsning i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2. Overfladebehandlingsopløsningen erstattes med 1 ml forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632.
    2. Frø 1,9 x 104 dissocierede hiPSC'er pr. 24-brønd. HiPSC'erne fastgøres natten over ved 37 °C og 5 % CO2 uden forstyrrelser. Se trin 5.4 til 5.6 for dissociation af hiPSC'erne. Næste dag udskiftes mediet med hiPSC-dyrkningssubstrat uden ROCK-hæmmer Y27632.
    3. Til farvning vaskes cellerne med 1 ml forvarmet 1x PBS og fastgøres derefter hiPSC'erne med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur. De faste hiPSC'er vaskes med 1x PBS, og uspecifikke bindingssteder blokeres med 200 μL præinkubationsopløsning pr. hul i 1 time ved stuetemperatur. Fortynd primære antistoffer Ki67 (1:300), OCT3/4 (1:200), SSEA4 (1:100) i antistoffortyndingsmiddel.
    4. Rengør en plastfolie med 70% ethanol og læg den i et farvningskammer fyldt med et vandreservoir. Anbring dråber af 30 μL primære antistoffortyndinger på folien. De faste prøver anbringes på hovedet i fortyndingen og inkuberes natten over ved 4 °C.
    5. Den næste dag vaskes prøverne tre gange med 1x PBS i 5 minutter og anbringes 30 μL dråber sekundære antistoffortyndinger (1:1.000) på rene pletter på folien. Placer dækslet gliderne på hovedet i fortyndingen. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
    6. Efter inkubation vaskes tre gange med 1x PBS i 5 min. Monter prøverne på glasglas i monteringsmediet, der indeholder DAPI. Lad det tørre natten over ved stuetemperatur og i mørke, og tag billeder af prøverne ved hjælp af et konfokalmikroskop (figur 4).
  3. Udelukkelse af bakterier og mycoplasmakontaminering
    1. For at udelukke bakteriekontaminering overføres 500 μL dissocierede hiPSC'er til 5 ml forvarmet Luria-Bertani (LB) medium. Se trin 5.4 til 5.6 for dissociation af hiPSC'erne. Der inkuberes natten over ved 37 °C. Hvis LB-mediet virker uklart, er bakterieforurening sandsynligvis forekommet. Kassér cellerne.
    2. For at udelukke mycoplasmakontaminering opsamles medium, der ikke er blevet erstattet i 2 dage, fra 6 brønde med ca. 90% sammenflydende hiPSC'er. Brug kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) til at detektere mycoplasmakontaminering. Mange kommercielle mycoplasma detektionssæt er tilgængelige til dette formål.

8. Differentiering af hiPSC'er i podocytter

  1. Forberedelse og opbevaring af vækstfaktorer
    1. For at fremstille en stamkoncentration på 10 mM Y27632 rekonstitueres 10 mg Y27632 (molekylvægt på 320,26 g/mol) i 3,12 ml sterilt vand. Der opbevares 100 μL alikvoter ved -20 °C og fortyndes 1:1.000 i cellekulturmedium for at nå en slutkoncentration på 10 μM.
    2. For at fremstille en stamkoncentration på 30 mM CHIR99021 rekonstitueres 5 mg CHIR99021 (molekylvægt på 465,34 g/mol) i 358,2 μliter steril DMSO. 50 μL alikvoter opbevares ved -20 °C og fortyndes 1:10.000 i cellekulturmedium for at nå en slutkoncentration på 3 μM.
    3. For at fremstille en stamkoncentration på 100 μg/ml activin A rekonstitueres 100 μg activin A i 1 ml 1x PBS indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA). Der opbevares 100 μL alikvoter ved -20 °C og fortyndes 1:2.000 i cellekulturmedium for at nå en slutkoncentration på 50 ng/ml.
    4. For at fremstille en stamkoncentration på 100 μg/ml knoglemorfogenprotein 7 (BMP7) rekonstitueres 100 μg BMP7 i 1 ml sterilt vand indeholdende 0,1 % BSA. Der opbevares 100 μL alikvoter ved -20 °C og fortyndes 1:2.000 i cellekulturmedium for at nå en slutkoncentration på 50 ng/ml.
    5. For at fremstille en stamkoncentration på 100 μg/ml vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) rekonstitueres 100 μg VEGF i 1 ml sterilt vand. 100 μL alikvoter opbevares ved -20 °C og fortyndes 1:4.000 i cellekulturmedium for at nå en slutkoncentration på 25 ng/ml.
    6. For at fremstille en 10 mM stamkoncentration af all-trans retinsyre rekonstitueres 10 mg all-trans retinsyre i 3,33 ml steril DMSO. Der opbevares 100 μL alikvoter ved -20 °C og fortyndes 1:100 i cellekulturmedium for at nå en slutkoncentration på 0,5 μM.
  2. Aktivering af WNT-signalvej for at inducere mesoderm-afstamning
    1. Til differentiering af hiPSC'er i hiPSC-afledte podocytter, coatcellekulturplader eller kolber, der er egnede til hiPSC-kultur med belægningsopløsning i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2. Det samlede volumen af belægningsopløsning er 1 ml pr. 6-brønds kulturplade eller 4 ml pr. 10 cm cellekulturplade.
    2. Opsug mediet og vask hiPSC'erne med forvarmet 1x PBS. PBS suges op, og der tilsættes enzymatisk celleløsrivelsesopløsning indeholdende 10 μM Y27632 ved et samlet volumen på 1 ml pr. 6-brønds kulturplade eller 4 ml pr. 10 cm cellekulturplade.
    3. Pladen sættes tilbage i inkubatoren og inkuberes i 4 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Skyl hiPSC'erne af pladen med en 1.000 μL pipette. Overfør de løsrevne celler til et konisk rør.
    4. Pladen vaskes med frisk, forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632. Saml vaskemediet i det koniske rør for at neutralisere dissociationsreagenset. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten suges op, og cellepelletsen resuspenderes med 2 ml frisk, forvarmet hiPSC-dyrkningsmedium indeholdende 10 μM ROCK-hæmmer Y27632.
    5. Tæl cellerne og frøet 1 x 104 hiPSC'er/cm2. Fordel cellerne ved at omrøre tre gange i alle retninger. HiPSC'erne fastgøres natten over ved 37 °C med 5 % CO2 uden forstyrrelser.
    6. Den næste dag udskiftes mediet med 2 ml forvarmet mesodermdifferentieringsmedium indeholdende 1x B27-tilskud, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml activin A og 10 μM ROCK-hæmmer Y27632.
  3. Differentiering i nefroncstamceller
    1. Efter 2 dage ændres mesodermmediet til 2 ml forvarmet nefronprogenitordifferentieringsmedium indeholdende 1x B27-supplement, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng / ml activin A og 50 ng / ml BMP7 pr. 6-brønds kulturplade eller 6 ml pr. 10 cm cellekulturplade. Skift mediet hver anden dag i de næste 14 dage.
      BEMÆRK: Nephron stamceller formerer sig og kan passeres og fryses efter 7 dages differentiering i nefronstamfaderekspansionsmedium.
    2. For at opdele nefronstamcellerne skal du belægge cellekulturplasten, der er egnet til hiPSC-kultur, med belægningsopløsning i 1 time ved 37 °C. Udskift belægningsopløsningen med nefronstamfaderekspansionsmedium. Opsug mediet og vask cellerne med forvarmet 1x PBS. Fjern PBS og dissociere cellerne med 1x trypsin-EDTA.
    3. Der inkuberes i 5 minutter ved 37 °C og 5% CO2. Overvåg frigørelse af cellerne ved hjælp af et fasekontrastmikroskop. Bank om nødvendigt mod siden af plasten for at løsne cellerne fra overfladen. Skyl cellerne af pladen og overfør til et konisk rør. Den tomme kolbe eller plade vaskes med samme mængde forvarmet nefronstamfader ekspansionsmedium som dissociationsreagenset.
    4. Pool vaskemediet i det koniske rør. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C. Supernatanten suges op, og cellepelletsen opslæmmes igen med 2 ml frisk, forvarmet nefronstamfaderekspansionsmedium. Tæl cellerne og frø 1,5 x 104 nefronstamceller pr. cm2 for yderligere differentiering.
      BEMÆRK: For at fryse nefronstamcellerne resuspenderes 1 x 106 celler i 1 ml koldt serumfrit kryopræserveringsmedium og overføres til en kryovial. Fryses i en frysebeholder ved -80 °C natten over og overføres til en flydende nitrogentank til langtidsopbevaring.
    5. Placer pladerne tilbage i inkubatoren og fordel cellerne jævnt ved omrøring tre gange i alle retninger. Skift mediet den næste dag til frisk, forvarmet nefronstamfader differentieringsmedium. Udskift mediet hver anden dag, indtil cellerne er differentieret i 14 dage i nefronstamfaderdifferentieringsmedium.
  4. Terminal differentiering i hiPSC-afledte podocytter
    1. Opsug mediet og tilsæt 2 ml forvarmet podocytdifferentieringsmedium indeholdende 1x B27-supplement, 1% penicillin-streptomycin, 3 μM CHIR99021, 50 ng/ml activin A, 50 ng/ml BMP7, 25 ng/μL VEGF og 0,5 μM all-transretinsyre pr. 6-brønds kulturplade eller 6 ml pr. 10 cm cellekulturplade. Pladerne anbringes tilbage i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2. Skift mediet hver anden dag i 4 dage med frisk, forvarmet podocytdifferentieringsmedium.
    2. For at holde hiPSC-podocytterne i kultur efter differentiering skal du fodre cellerne to gange om ugen med podocytvedligeholdelsesmedium indeholdende 10% føtalt kalveserum, 1% penicillin-streptomycin og 0,1% insulin-transferrin-selen.
      BEMÆRK: Terminaldifferentierede hiPSC-podocytter formerer sig ikke længere. Det er dog muligt at holde dem i cellekultur i op til 4 uger.
  5. Optøning og udvidelse af frosne nefronstamceller
    1. Overtræk en ny cellekultur plastkolbe, der er egnet til hiPSC-kultur, med belægningsopløsning i 1 time ved 37 °C og 5% CO2. Udskift belægningsopløsningen med 5 ml nefronstamfaderekspansionsmedium.
    2. Forbered et 15 ml konisk rør med 7 ml forvarmet nefronstamfaderekspansionsmedium. De frosne celler optøs ved 37 °C i vandbad uden bevægelse i ca. 20 sekunder. Tag cryovial ud af vandbadet, når halvdelen af cellerne er optøet, og der er noget is tilbage.
    3. Sprøjt kryovialen med 70% ethanol og læg den i et biosikkerhedsskab. Overfør optøede celler til det koniske rør med det forvarmede nefronstamfaderekspansionsmedium. Brug en 1.000 μL pipette og lad cellerne løbe meget langsomt ned ad rørets væg.
    4. Vask det tomme kryovialt med 1 ml nefronstamfaderekspansionsmedium for at opsamle de resterende celler og samle dem i det koniske rør. Der centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved 20 °C, og cellepelletsen resuspenderes i frisk, forvarmet nefronstamfaderekspansionsmedium.
    5. Overfør de optøede celler til den coatede kolbe, og skift mediet den næste dag til frisk, forvarmet nefronstamfader ekspansionsmedium. Før yderligere differentiering, lad cellerne formere sig i nefronstamfaderekspansionsmedium ved at skifte medium hver anden dag og fortsæt fra trin 8.3.5.

9. Karakterisering af hiPSC-afledte podocytter ved immunofluorescensfarvning

  1. For at kontrollere de differentierede podocytter for podocytspecifik markør via immunofluorescensfarvning anbringes plastdæksler i en plade med 24 brønde og belægges med 250 μL belægningsopløsning i 1 time ved 37 °C og 5 % CO2. Udskift belægningsopløsningen med 1 ml forvarmet nefronstamfaderekspansionsmedium. Frø 2,5 x 104 dissocierede nefronstamceller pr. 24-brøndplade. Se trin 8.3.2 til 8.3.4 for dissociation af nefronstamceller.
  2. Lad cellerne binde sig natten over ved 37 °C og 5% CO2 uden forstyrrelser. Udskift mediet den næste dag med forvarmet nephron stamfader differentieringsmedium.
  3. Afslut differentieringen ved at skifte medium hver anden dag, indtil cellerne er differentieret i alt 14 dage i nefronstamfaderdifferentieringsmedium og yderligere 5 dage i podocytdifferentieringsmedium.
  4. Efter den endelige differentiering vaskes cellerne med 1 ml forvarmet 1x PBS. Fastgør hiPSC-podocytterne med 4% paraformaldehyd i 10 minutter ved stuetemperatur. De faste celler vaskes med 1x PBS og blokeres uspecifikke bindingssteder med 200 μL præinkubationsopløsning pr. hul i 1 time ved stuetemperatur.
  5. Fortynd de primære antistoffer synaptopodin (1:200), podocin (1:100) og nephrin (1:25) i antistoffortyndingsmiddel, og læg dråber af 30 μL primær antistoffortynding på en ren plastfolie i et farvningskammer indeholdende et vandreservoir.
  6. Placer dækglas med faste hiPSC-podocytter på hovedet i fortyndingen. Der inkuberes natten over ved 4 °C. Næste dag vaskes tre gange med 1x PBS i 5 min. Fortynd de sekundære antistoffer (1:1.000) i 1x PBS og anbring dråber med 30 μL sekundær antistoffortynding på rene pletter på folien. Placer dækslet gliderne på hovedet i fortyndingen.
  7. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Efter inkubation vaskes tre gange med 1x PBS i 5 min. Monter prøverne på glasglas i monteringsmedium, der indeholder DAPI. Lad det tørre natten over ved stuetemperatur og i mørke. Billede prøverne ved hjælp af et konfokalmikroskop.

Representative Results

Med denne trinvise protokol, der kombinerer episomal omprogrammering og differentiering, er det muligt at generere podocytter, der bærer en patients mutation i et podocytrelevant gen. Dette muliggør analyse af sygdomsspecifikke podocytændringer ex vivo. Patientens genetiske baggrund bevares under protokollen under alle de forskellige cellestadier. Derudover kan begrænsningen af utilstrækkeligt celleantal terminalt differentierede ikke-prolifererende podocytter overvindes ved anvendelse af hiPSC-afledte podocytter. Selvom det tager flere måneder, indtil hiPSC-podocytter genereres fra udvoksede dermale fibroblaster via omprogrammering til hiPSC'er og efterfølgende differentiering til podocytter, er det muligt at fryse celler på tre forskellige trin i protokollen (figur 2). Frysning er mulig for fibroblaster, hiPSC'er og nefronstamceller efter differentiering i nefronprogenitordifferentieringsmedium i 7 dage. Derfor er generering af arbejdscellebanker og store eksperimenter mulig.

Figure 2
Figur 2: Individuelle trin i protokollen gennem et fasekontrastmikroskop. A) Udvoksede dermale fibroblaster. B) dannelse af hiPSC-kolonier efter omprogrammering. (C) Udvalgt hiPSC-kultur. (D) Mesodermceller efter 2 dages differentiering. (E) Nephron stamceller efter 14 dages differentiering i nefron stamfader differentieringsmedium. F) Terminaldifferentierede hiPSC-afledte podocytter. Skalastænger repræsenterer 300 μm (A, B, D-F) og 150 μm (C). Snefnugget fremhæver mulige frysetrin. Klik her for at se en større version af denne figur.

Da de genererede hiPSC-afledte podocytter krydser en lang protokol med drastiske ændringer med hensyn til celletype og morfologi, er cellekarakterisering obligatorisk. Cellemorfologi, som størrelse og celleform, samt vækstadfærd, kan overvåges ved hjælp af et fasekontrastmikroskop. Fibroblaster præsenterer en lang spindellignende fænotype med en størrelse på 150 μm til 300 μm (figur 2A). Efter omprogrammering forekommer kolonier med 50 μm små hiPSC'er. Disse kolonier viser forskellige grænser og hiPSC'er, der adskiller sig med et højt kerne-til-krop-forhold og øget spredningshastighed (figur 2C). Da podocytter er terminalt differentierede celler, falder proliferationshastigheden med progressiv differentiering, og cellemorfologien ændres til 300 μm store stjerneformede podocytter med fremtrædende fodprocesser (figur 2F).

Konfluens er et kritisk punkt i hiPSC-kulturen, og spontan differentiering kan forekomme, når kolonier vokser for tæt (figur 3). Disse kolonier skal fjernes inden passage ved at skrabe de berørte dele af kulturskålen.

Figure 3
Figur 3: Eksempler på hiPSC'er af forskellig kvalitet. Fasekontrastbilleder af vellykkede (A) omprogrammerede hiPSC-kolonier og (B) udvalgte hiPSC'er samt (C) spontan differentiering, (D,E) ikke-hiPSC-kolonier og (F) en for tæt hiPSC-kultur. Skalabjælker repræsenterer 300 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

De forskellige celletyper i denne protokol skal valideres med hensyn til ekspressionen af en bestemt markør. Efter omprogrammering genvinder hiPSC'er pluripotenskapacitet og udtrykker sprednings- og pluripotensmarkører som SSEA4, OCT3/4 og Ki67 (figur 4) 38,39,40. Det er kendt, at omprogrammering såvel som den lange kultur af hiPSC'er og differentiering kan føre til en unormal karyotype eller rettere fremkalde mutationer41. Derfor bør de dyrkede cellers genetiske baggrund overvåges over tid og ved forskellige passager ved g-banding og heleksomsekventering.

Figure 4
Figur 4: Karakterisering af genererede hiPSC'er ved immunofluorescensfarvning. Karakterisering af genererede hiPSC'er ved farvning for (A) den proliferative markør Ki67 samt pluripotensmarkørerne (B) OCT3/4 og (C) SSEA4. Skalabjælker repræsenterer 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Morfologisk forekommer hiPSC-afledte podocytter stjerneformede og udtrykker et tydeligt netværk af lange primære og sekundære fodprocesser sammenlignet med ciPodocytter (figur 5). HiPSC-afledte podocytter udtrykker podocytspecifikke markørproteiner som synaptopodin, nephrin og podocin (figur 6A-C)42.

Figure 5
Figur 5: Morfologi af hiPSC-afledte podocytter sammenlignet med ciPodocytter. Sammenligning af (A, B) hiPSC-afledte podocytter fra en sund donor til (C, D) ciPodocytter vedrørende cellemorfologi og filopodi ved hjælp af et fasekontrastmikroskop (A, C) og scanningelektronmikroskop (B, D). Skalastænger repræsenterer 150 μm (A,C) og 20 μm (B,D). Klik her for at se en større version af denne figur.

Derfor tillader sammenligningen af hiPSC-afledte podocytter ikke kun fra raske donorer, men også fra patienter med mutationer i podocytspecifikke gener, individualiseret karakterisering af patientens mutation ex vivo.

Figure 6
Figur 6: Karakterisering af en podocytspecifik markør i hiPSC-afledte podocytter og ciPodocytter. Sammenligning af (A-C) hiPSC-afledte podocytter fra en sund donor til (D-F) ciPodocytter vedrørende podocytspecifikke markørproteiner synaptopodin (A, D), nephrin (B, E) og podocin (C, F). Vægtbjælker repræsenterer 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1. Sammensætning af alle cellekulturmedier og opløsninger, der anvendes i undersøgelsen. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Denne cellekulturbaserede protokol kombinerer episomale omprogrammering af humane dermale fibroblaster til patientspecifikke hiPSC'er og efterfølgende differentiering i hiPSC-afledte podocytter. Dette giver os mulighed for at studere mutationsrelaterede ændringer af podocytter fra patienter med genetisk glomerulær sygdom vedrørende podocytskade. Protokollen til omprogrammering af dermale fibroblaster med en integrationsfri metode ved elektroporation er tilpasset fra det offentliggjorte arbejde af Bang et al.32 og Okita et al.33. Protokollen til differentiering af podocytter fra hiPSC'er er tilpasset fra den offentliggjorte protokol fra Musah et al.28,34,35. Der findes allerede publikationer, der beskriver dannelsen af podocytter fra hiPSC'er 27,34,35. Imidlertid er protokollen, der leveres her, optimeret og billigere med hensyn til differentiering af hiPSC'er i podocytter. Sammenlignet med den offentliggjorte protokol fra Musah et al. testede vi denne protokol på forskellige belægningsreagenser, som vitronectin, laminin silke-511 og opløselig kældermembranmatrix. Koncentrationerne af vitronectin og laminin silke-511 kunne reduceres til 2.5 μg / ml i stedet for 5 μg / ml 28,34,35. Desuden var det muligt at reducere koncentrationerne af BMP7 og activin A-to meget dyre vækstfaktorer - med 50%, fra 100 ng / ml til 50 ng / ml.

Dette muliggør billigere differentiering. Nephron stamceller fra dag 7 spredte sig stadig, og muligheden for frysning blev vist før. Vi udvidede disse celler efter optøning og før endelig differentiering i basisk medium indeholdende Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) og B27 i flere dage, hvilket reducerede omkostningerne yderligere. Ud over differentieringstrinnene beskriver denne protokol udvæksten af fibroblaster fra hudbiopsier med efterfølgende generering af patientspecifikke hiPSC'er via episomal omprogrammering. Kombinationen af disse to metoder muliggør generering af patientspecifikke podocytter. Derfor gives her en komplet trin-for-trin-protokol til generering af patientspecifikke hiPSC-afledte podocytter, som ikke blev beskrevet før så detaljeret.

Da den overordnede protokol indeholder flere forskellige celletyper, er det afgørende at karakterisere de genererede celletyper på forskellige trin. Celler er i kultur i længere tid, så kvalitetskontrol skal udføres ved forskellige passager. Når man arbejder med hiPSC'er, er daglig fodring samt celleadfærd og morfologiovervågning nødvendig. Differentieringsmediets sterilitet skal sikres ved filtersterilisering gennem et 0,2 μm filter. Hele protokollen, fra hudbiopsi til hiPSC-afledte podocytter, tager flere måneder, men det er muligt at fryse cellerne på forskellige stadier af processen. Fibroblaster, udvalgte hiPSC-kloner og proliferative nefronstamceller efter 7 dage i nefronprogenitordifferentieringsmedium kan fryses, og der kan genereres en fungerende cellebank.

Selvom hiPSC-afledte sunde podocytter udvikler et særskilt netværk af primære og sekundære fodprocesser (figur 5A, B) og udtrykker typisk podocytspecifik markør (figur 6A-C), er karakteristiske spaltemembraner, som det ses in vivo, svære at efterligne i klassiske todimensionelle cellekulturmodeller. Desuden er intercellkommunikation med andre glomerulære celletyper ikke mulig i denne monokulturindstilling.

På grund af deres terminale differentierede tilstand og manglende proliferationskapacitet er det vanskeligt at studere podocytter ex vivo. Ved hjælp af betinget udødeliggørelse af primære podocytter er det muligt at overvinde denne begrænsning ved indsættelse af en termofølsom switch, hvilket resulterer i en cellekulturmodel, hvor celler formerer sig ved 33 ° C og differentierer ved 37 ° C13,14. Selvom disse ciPodocytter har et stort potentiale for podocytforskning, er der begrænsninger, som manglen på markørekspression, dedifferentieret morfologi og manglende dannelse af fodprocesser15,16.

Differentieringen af podocytter fra patientafledte somatiske celler muliggør generering og sammenligning af syge podocytter med sunde kontrolceller ex vivo. Dette gør det muligt for os at studere podocytskader på grund af mutationer i podocytspecifikke gener. Desuden har arbejdet med hiPSC'er potentialet til at skabe tredimensionelle cellekultursygdomsmodeller, eller rettere organoider43,44. Samdyrkning af hiPSC-afledte podocytter med andre glomerulære celler, som glomerulære endotelceller eller mesangialceller, kan føre til ny indsigt i intercellekommunikation i sundhed og glomerulær sygdom.

Desuden kan karakterisering og behandling af de patientspecifikke podocytter udføres ex vivo i high-throughput analyse. Den individualiserede tilgang åbner mulighed for at undersøge nye terapeutiske mål for specifikke mutationer og udføre individualiseret medicin i fremtiden.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af det tværfaglige center for klinisk forskning (IZKF) ved Friedrich-Alexander Universitet Erlangen-Nürnberg med bevillingsnummer M4-IZKF-F009 givet til Janina Müller-Deile og af Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) under projektnavnet STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS, bevillingsnummer 01GM2202D givet til Janina Müller-Deile. Vi takker Annalena Kraus for støtten til at tage SEM-billeder.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm sterile filter Rotilab P668.1 for sterilization of differentiation medium
all-trans retinoic acid Stem Cell Technologies 72262 supplement for differentiation
B27 supplement (50 x), serum free Gibco 17504044 supplement for serum-free differentiation medium
BG iMatrix-511 Silk biogems RL511S additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Bovine serum albumin (BSA)  Roth 8076.4
CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL Greiner bio-one 82050-856 cell culture plastics suitable for fibroblast culture
CHIR99021 (5 mg) Sigma-Aldrich 252917-06-9  supplement for differentiation
Corning Matrigel hESC qualified matrix  Corning 354277 additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)
countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10283 to count cells
countess II FL  Automated Cell Counter Invitrogen to count cells
cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white Sarstedt 72380 cryovials for freezing of cells
dimethyl sulfoxide (DMSO)  Roth A994.1 for fibroblast freezing medium
DMEM/F12 (1:1) (1 x) Gibco 11320074 basic medium for differentiation
DMEM/F12 + Glutamax Gibco 10565018 basic medium for fibroblast medium
EVOS M5000 Imaging System Thermo Fisher Scientific AMF5000 phase contrast microscope
fetal bovine serum premium, inactivated (FCS) PAN Biotech P301902 serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium
fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 µL capacity, sterile Fisherbrand FB104 cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)
fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI Invitrogen 00-4959-52 mounting medium containing dapi
gauge needle (0.6 x 30 mm) BD Microlance3 300700 for separation of hiPSC colonies into small pieces
human Recombinant Activin A Protein 78001.1 Stem cell technologies supplement for differentiation
human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7) Peprotech 120-03P supplement for differentiation
human VEGF-165 Recombinant Protein Thermo Scientific PHC9394 supplement for differentiation
insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x) Gibco 41400045 supplement for podocyte maintenance medium
LB medium Roth X964.1 for sterility test of hiPSC culture
lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit Sigma Aldrich MP0035-1KT commercial mycoplasma detection kit
microscope slides Diagonal GmbH & Co.KG 21,102
microtube 1.5 mL  Sarstedt 72706400
mTeSR1 Complete Kit Stem Cell Technologies 85850 basic medium for serum-free hiPSC culture medium
nalgene freezing container Mr.Frosty Roth AC96.1  to ensure optimal freezing conditions
normal goat serum abcam ab 7481 for preincubation solution and antibody diluent
nunc 24 well plates Thermo Scientific 142485 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 48 well plates  Thermo Scientific 152640 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc 6 well plates  Thermo Scientific 140685 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc EasYDish Dishes 100 mm Thermo Scientific 150466 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate Thermo Scientific 167008 cell culture plastics suitable for hiPSC culture
nutriFreez D10 Cryopreservation Medium Sartorius 05-713-1E  serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells
Opti-MEM Gibco 11058021 electroporation medium 
pCXLE-hMLN Addgene #27079 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hOCT3/4 plasmid Addgene #27077 plasmid for episomal reprogramming
pCXLE-hSK plasmid Addgene #27078 plasmid for episomal reprogramming
penicillin-streptomycin Sigma-Aldrich P4333-100ML to avoid bacterial contamination
plastic coverslips Sarstedt   83.1840.002 for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes
ROTI Histofix Roth P087.3 commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells
RPMI 1640 + L-Glutamine Gibco 21875034 basic medium for podocyte maintenance medium
staining chamber StainTray Black lid Roth HA51.1
stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Gibco A1110501 enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs
sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x) Gibco 14190094 used for washing and coating
sterile water Roth T1432
syringe without needle 20 mL BD Plastipak 300629 to filter sterilize differentiation medium
TC dish 100 mm Sarstedt 8,33,902 sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture
TC dish 35 mm Sarstedt 8,33,900 sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy
triton X 100 Roth 3051.3 for preincubation solution 
trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter Invitrogen T10282 to count cells
trypsin-EDTA (10 x)  Biowest X0930-100 dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells
tube 15 mL Greiner bio-one 188271-N
tube 50 mL Greiner bio-one 227261
vitronectin ACF Sartorius 05-754-0002 extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture
Y-27632 dihydrochloride (10 mg) Tocris 1254 to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting
Primary antibodies
OCT4  Stem Cell Technologies 60093.1 pluripotency marker, dilution 1:200
SSEA-4 Stem Cell Technologies 60062FI.1 pluripotency marker, dilution 1:100
Ki67 Abcam ab15580 proliferation marker, dilution 1:300
synaptopodin Proteintech 21064-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:200
nephrin Progen GP-N2 podocyte-specific marker, dilution 1:25
podocin proteintech 20384-1-AP podocyte-specific marker, dilution 1:100
Secondary antibodies
goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21435 secondary anditbody, dilution 1:1000
alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed Invitrogen A31634 secondary anditbody, dilution 1:1000
donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422 secondary anditbody, dilution 1:1000
goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001 secondary anditbody, dilution 1:1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
  2. Grgic, I., et al. Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).
  3. Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub. Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).
  4. Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. Structural determinants of glomerular permeability. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).
  5. Schell, C., Huber, T. B. The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).
  6. Muller-Deile, J., Schiffer, M. Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out. Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).
  7. Boehlke, C., et al. Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement. American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).
  8. Schiffer, M., et al. Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models. Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).
  9. Kopp, J. B., et al. Podocytopathies. Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68 (2020).
  10. Wiggins, R. C. The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases. Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).
  11. Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes. Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).
  12. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).
  13. Saleem, M. A., et al. A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).
  14. Eto, N., et al. Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression. Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).
  15. Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. Culture methods of glomerular podocytes. Kidney & Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).
  16. Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).
  17. Shih, N. Y., et al. CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain. The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).
  18. Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).
  19. Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. Dipping your feet in the water: podocytes in urine. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).
  20. Camici, M. Urinary detection of podocyte injury. Biomedicine & Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).
  21. Muller-Deile, J., et al. Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 3621 (2018).
  22. Schenk, H., et al. Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb. Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).
  23. Petermann, A., Floege, J. Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity. Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).
  24. Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).
  25. Petermann, A. T., et al. Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable. Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).
  26. Sakairi, T., et al. Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).
  27. Rauch, C., et al. Differentiation of human iPSCs into functional podocytes. PLoS One. 13 (9), e0203869 (2018).
  28. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
  29. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  30. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  31. Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell. Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).
  32. Bang, J. S., et al. Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts. Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).
  33. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  34. Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).
  35. Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions. Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).
  36. Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts. Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).
  37. Hoffding, M. K., Hyttel, P. Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).
  38. Bharathan, S. P., et al. Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells. Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).
  39. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
  40. Sun, X., Kaufman, P. D. Ki-67: more than a proliferation marker. Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).
  41. Vaz, I. M., et al. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming. Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147 (2021).
  42. Reiser, J., Altintas, M. M. Podocytes. F1000Research. 5, 114 (2016).
  43. Ohmori, T., et al. Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells. Scientific Reports. 11 (1), 3982 (2021).
  44. Morizane, R., Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).

Tags

Biologi nr. 195
Generering af patientafledte podocytter fra hudbiopsier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rose, V., Müller-Deile, J.… More

Rose, V., Müller-Deile, J. Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies. J. Vis. Exp. (195), e65364, doi:10.3791/65364 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter