Summary
Denne protokollen skisserer bruken av Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon (AMT) for å integrere gen (er) av interesse i det nukleære genomet til de grønne mikroalger Chlorella vulgaris, som fører til produksjon av stabile transformanter.
Abstract
Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon (AMT) fungerer som et mye brukt verktøy for å manipulere plantegenomer. Imidlertid viser A. tumefaciens kapasiteten til genoverføring til et mangfoldig utvalg av arter. Mange mikroalgearter mangler veletablerte metoder for pålitelig integrering av gener av interesse i deres kjernefysiske genom. For å utnytte de potensielle fordelene ved mikroalgebioteknologi er enkle og effektive genommanipulasjonsverktøy avgjørende. Her presenteres en optimalisert AMT-protokoll for den industrielle mikroalgearten Chlorella vulgaris, ved bruk av reportergrønt fluorescerende protein (mGFP5) og antibiotikaresistensmarkøren for Hygromycin B. Mutanter velges ved plating på Tris-Acetat-Phosphate (TAP) media som inneholder Hygromycin B og cefotaxim. Ekspresjon av mGFP5 kvantifiseres via fluorescens etter over ti generasjoner med subkulturering, noe som indikerer den stabile transformasjonen av T-DNA-kassetten. Denne protokollen tillater pålitelig generering av flere transgene C. vulgaris-kolonier på under to uker, ved bruk av den kommersielt tilgjengelige pCAMBIA1302-planteuttrykksvektoren.
Introduction
Agrobacterium tumefaciens, en gram-negativ jordbåren bakterie, har en unik interkingdom genoverføringsevne, og tjener den tittelen "naturlig genetisk ingeniør"1. Denne bakterien kan overføre DNA (T-DNA) fra et tumorinduserende plasmid (Ti-plasmid) til vertsceller gjennom et Type IV-sekresjonssystem, noe som resulterer i integrasjon og ekspresjon av T-DNA i vertsgenomet 1,2,3,4. I naturlige omgivelser fører denne prosessen til tumordannelse i planter, kjent som krongallsykdom. Imidlertid kan Agrobacterium også overføre T-DNA til forskjellige andre organismer, inkludert gjær, sopp, alger, kråkebolleembryoer og til og med humane celler under laboratorieforhold 5,6,7,8.
Ved å utnytte dette naturlige systemet, muliggjør Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon (AMT) tilfeldig integrering av gen (er) av interesse i en vertscelles nukleære genom ved å modifisere T-DNA-regionen av Ti-plasmidet. Til dette formål er en mye brukt AMT-planteuttrykksvektor pCAMBIA13029. Forskere kan bruke enkle kloningsarbeidsflyter i E. coli før de overfører ønsket vektor til A. tumefaciens for senere overføring til verten av interesse.
Grønne mikroalger er eukaryoter som deler mange likheter med landplanter, men er svært gjenstridige mot genetisk modifisering. Imidlertid spiller genetisk transformasjon en avgjørende rolle i både grunnleggende og bioteknologisk forskning av mikroalger. I flere mikroalgearter, spesielt Chlamydomonas reinhardtii, har genetisk transformasjon via AMT vellykket introdusert transgener som humant interleukin-2 (hIL-2), alvorlig akutt respiratorisk syndrom coronavirus 2-reseptorbindende domene (SARS-CoV-2 RBD) og to antimikrobielle peptider (AMPs) 10,11,12,13. Blant disse har Chlorella vulgaris, en mindre begeistret og raskt voksende grønn algeart, betydelig potensial for bærekraftig produksjon av karbohydrater, proteiner, kosttilskudd, pigmenter og andre høyverdige forbindelser14. Imidlertid hindrer mangelen på pålitelige verktøy for å skape transgene stammer av C. vulgaris sin kommersielle fremgang. Siden det bare har vært et begrenset antall publiserte arbeider som bruker AMT i C. vulgaris15, og gitt de betydelige forskjellene mellom plante- og mikroalgedyrking, blir optimalisering av AMT-protokollen avgjørende.
I denne studien satte forskerne inn grønt fluorescerende protein (mGFP5) nedstrøms for blomkålmosaikkviruset (CamV) 35S-promotoren og la til en histidin-tag for å bruke den som et reportergen for proteinuttrykk. Transformanter ble valgt ved hjelp av Hygromycin B, og etter subkulturering i over tjue generasjoner forble transformasjonen stabil. pCAMBIA1302-plasmidet som brukes i dette arbeidet, kan lett tilpasses for å inneholde ethvert gen av interesse. Videre kan metoden og materialene som presenteres justeres for andre grønne algearter med en aktiv CamV35S-promotor, da denne promotoren brukes til valg av hygromycin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle medier og løsninger må autoklaveres før bruk med mindre annet er angitt. Alle sentrifugerør, pipettespisser osv. skal være sterile eller autoklaverte før bruk. For enkel referanse er medieoppskriftene som brukes i denne protokollen oppført i tabell 1.
1. Fremstilling av A. tumefaciens elektrokompetente celler
- Inokuler Agrobacterium (AGL-1) i en 25 ml steril shakerkolbe av LB-medier (supplert med rifampicin, 20 mg / L-1) fra en frossen glyserolbestand og vokse over natten ved 28-30 ° C og 150 o / min.
MERK: Agrobacterium-stammen AGL-1 er (se materialtabell) resistent mot rifampicin, ampicillin, kloramfenikol og streptomycin og kan fås fra flere leverandører. - Neste dag, fortynn kulturen 1,00,000 ganger ved å tilsette 0,5 μL av nattens kultur til 50 ml autoklavert ultrarent vann og spre 10 μL av denne fortynnede kulturen på en LB-plate, og inkuber deretter ved 28-30 ° C i 1-3 dager.
- Velg en koloni og start en 20 ml overnattingskultur i LB med rifampicin ved 28-30 °C.
- Neste dag, inokuler 500 ml LB media (ingen antibiotika) i en shakerkolbe med 9 ml av natten kultur og vokse ved 28-30 ° C til OD600 når 0,5.
- Del kulturen jevnt inn i ti 50 ml sentrifugerør og avkjøl på is i 30 minutter. Forkjøl sentrifugen til 4 °C.
- Sentrifuger rørene ved 4 °C og 4000 x g i 15 minutter. Deretter fjernes så mye supernatant som mulig ved hjelp av en pipette og resuspenderer pelleten i hvert rør i 50 ml iskaldt vann.
- Sentrifuger cellene ved 4 °C og 4000 x g i 15 minutter. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 25 ml iskaldt vann i hver slange.
- Sentrifuger cellene ved 4 °C og 4000 x g i 15 minutter. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml iskald 10% (w / v) glyserol i hver tube.
- Kombiner alle rørene i ett 50 ml rør og sentrifuger cellene ved 4 °C og 4000 x g i 15 minutter. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i 400 μL iskald 10% (w / v) glyserol. Cellekonsentrasjonen bør være ca. 1-3 x 1010 celler/ml.
- Fordel cellene som 50 μL alikoter i sterile forkjølte mikrorør. Frys i flytende nitrogen og oppbevares i fryser ved -80 °C.
2. Elektroporering av A. tumefaciens
- Tilsett 50 μL AGL-1 A. tumefaciens elektrokompetente celler i en forkjølt 0,1 mm kyvette og tilsett 2 μL pCAMBIA1302 eller lignende plasmid (conc 15 ng/μL) (se materialfortegnelse).
- Elektroporat ved 2400 V ved hjelp av en elektroporator (200 Ω, kapasitansforlenger 250 μFD, kapasitans 25 μFD, eksponentielt henfall, se materialfortegnelse). Tidskonstanten skal være >4,5 ms for vellykket elektroporering med eksponentielt henfall.
- Tilsett umiddelbart 1 ml LB-medier til kyvetten og pipett forsiktig opp og ned for å blande. Overfør 1 ml resuspenderte celler til et 1,5 ml mikrorør og inkuber det ved 28-30 °C i minst 1 time for å komme seg.
- Plate cellene på LB-agar som inneholder passende antibiotika (dvs. 50 mg/l kanamycin for pCAMBIA1302 for prokaryot seleksjon).
- Inkuber ved 28-30 °C i 2-3 dager.
- Velg en koloni, dyrk over natten i LB med riktig valg (50 mg / l kanamycin for pCAMBIA1302), og kryokonserverer den plasmidholdige stammen ved bruk av 50% glyserol ved -80 ° C for fremtidig bruk.
3. AMT av C. vulgaris
MERK: Forbered C. vulgaris (UTEX 395, se materialfortegnelse) og A. tumefaciens kulturer parallelt for samdyrking. C. vulgariskulturer bør startes 3 dager før man forbereder A. tumefaciens kulturer. Protokollen ble modifisert basert på den som ble publisert av Kumar et al.7.
- Forbered C. vulgaris kultur
- C. vulgaris lagres tradisjonelt på skråninger eller vedlikeholdes i logfasekulturer under opplyste forhold. Fra en logfasekultur ved OD600 = 1,0, spred 0,5 ml på et Tris-acetatfosfat (TAP, se tabell 1) agarplater ( 1,2 % w/v agar A) og vokse i 5 dager ved 25 °C med belysning (50 μE/m2s). Dette vil gi omtrent 5 x 106 celler.
- Forbered A. tumefaciens kultur
- Dyrk A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302-stamme i en shakerkolbe ved å inokulere 10 ml LB-medier supplert med 15 mM glukose, 20 mg/l rifampicin og 50 mg/l kanamycin (se materialfortegnelse) ved bruk av glyserollageret. Inkuber ved 28-30 ° C og 250 o / min over natten.
- Inokuler 1 ml nattkultur i 50 ml LB med 15 mM glukose, 20 mg / L rifampicin og 50 mg / L kanamycin og inkuber ved 28-30 ° C og 250 rpm til OD600 når 1,0.
- Kokultivere C. vulgaris og A. tumefaciens
- For å forberede A. tumefaciens-kulturen for samdyrking, overfør den dyrkede kulturen til et 50 ml rør og sentrifuge ved 4000 x g i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten med en pipette og vask cellene to ganger med induksjonsmediet.
MERK: Induksjonsmediet som brukes er TAP-medier justert til pH 5,5 og supplert med F/2 medium spormetaller og vitaminer med 200 μM acetosyringon (AS, se materialfortegnelse). Resuspendere cellene i induksjonsmedier slik at OD600 = 0,5. - For å forberede C. vulgaris-kulturen for samtidig dyrking, tilsett 25 ml induksjonsmedier til C. vulgaris-platen som inneholder ~ 5 x 106 celler. Overfør til et 50 ml rør. Sentrifuger cellene ved 4000 x g i 15 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten.
- Bland algecellepelleten med 200 μL bakteriesuspensjonen (OD600: 0,5) og inkuber dem i en roterende shaker ved 21-25 °C ved 150 o / min i 1 time.
- Spre blandingskulturen (200 μL) på induksjonsmedieplater supplert med 15 mM glukose og inkuber ved 21-25 °C i mørket i 3 dager.
- Etter 3 dager, bruk 10 ml TAP-medier tilsatt 400 mg/l cefotaksim eller 20 mg/l tetracyklin (se materialfortegnelse) for å samle mikroalger og inkubere i mørket ved 21-25 °C i 2 dager for å eliminere A. tumefaciens fra kulturen.
- Plate 500 μL av kulturen på selektive medier, f.eks. TAP-medier supplert med 20-70 mg/l hygromycin B (ved bruk av pCAMBIA1302) og 400 mg/L-1 cefotaksim eller 20 mg/l tetracyklin. Inkuber 21-25 °C i mørket i 2 dager før de plasseres i et opplyst kammer.
MERK: Resistente kolonier vil vises 5-7 dager etter lyseksponering. - Velg enkeltkolonier fra transformasjonsplaten og strek dem på TAP-agarplater supplert med 400 mg / l cefotaksim eller 20 mg / l tetracyklin og 20-70 mg / l hygromycin B.
- For å forberede A. tumefaciens-kulturen for samdyrking, overfør den dyrkede kulturen til et 50 ml rør og sentrifuge ved 4000 x g i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern supernatanten med en pipette og vask cellene to ganger med induksjonsmediet.
4. Colony PCR (cPCR) for å bekrefte genintegrasjon i C. vulgaris transformanter
- Ekstraher genomisk DNA fra en C. vulgaris-transformant etter subkulturering minst to ganger fra en enkelt koloni ved hjelp av et plantegenomisk DNA-ekstraksjonssett (se materialtabell). Ved å bruke dette som en mal for PCR, design primere for mgfp5-regionen i T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3' og M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
- Bruk et Q5 high-fidelity DNA-polymerase-masterblandingssett (se materialtabell), utfør polymerasekjedereaksjon (PCR) for å validere transgenintegrasjon.
MERK: Følgende betingelser ble brukt for denne studien: 98 °C i 3 minutter; 35 sykluser (98 °C i 10 s, 57 °C i 30 s, 72 °C i 1 min); 72 °C i 5 minutter. Bruk pCAMBIA1302 som positiv kontroll og villtype C. vulgaris genomisk DNA som negativ kontroll.
- Bruk et Q5 high-fidelity DNA-polymerase-masterblandingssett (se materialtabell), utfør polymerasekjedereaksjon (PCR) for å validere transgenintegrasjon.
- For å bekrefte at det ikke er pCAMBIA1302 tilstede i prøven på grunn av restkontaminering av A. tumefaciens, bruk koloni-PCR. Tilsett en liten mengde transformantceller til 10 μL sterilt vann og kok ved 98 °C i 15 minutter. Bruk dette som en mal for PCR.
- Design primere for et område utenfor T-DNA på pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' og B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
MERK: Følgende betingelser ble brukt for denne studien: 94 °C i 3 minutter; 30 sykluser (94 °C i 30 s, 48 °C i 30 s, 68 °C i 5 minutter); 68 °C i 7 min. Bruk en kokt koloni av A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) som en positiv kontroll og en kokt koloni av villtype C. vulgaris som en negativ kontroll.
- Design primere for et område utenfor T-DNA på pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' og B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
- For å bekrefte at det ikke er noen A. tumerfaciens-forurensning tilstede i prøven, bruk koloni-PCR. Tilsett en liten mengde transformantceller til 10 μL sterilt vann og kok ved 98 °C i 15 minutter. Bruk dette som en mal for PCR.
- Design primere for virE2 genet som finnes på AGL-1 virulens plasmid (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' og virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
MERK: Følgende betingelser ble brukt for denne studien: 94 °C i 3 minutter; 30 sykluser (94 °C i 30 s, 53 °C i 30 s, 68 °C i 3 minutter); 68 °C i 7 min. Bruk en kokt koloni av A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) som en positiv kontroll og en kokt koloni av villtype C. vulgaris som en negativ kontroll.
- Design primere for virE2 genet som finnes på AGL-1 virulens plasmid (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' og virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
- Kjør PCR-prøver på en DNA-agarosegel sammen med en stige (1 Kbp DNA-stige, se materialtabell) for å bekrefte størrelsen på de resulterende fragmentene16.
5. Måling av fluorescens av transformanter
- Inokuler hver transformant fra en log-fase vedlikeholdskultur eller TAP-agar skråstilt til 50 ml TAP supplert med 200 mg / L-1 cefotaxim og 25 mg / L-1 hygromycin B slik at start-OD 600 = 0,1. Inokulere en kultur med villtype C. vulgaris og bare 200 mg / L-1 cefotaxim som negativ kontroll. Inkuber ved 25 °C ved 150 o/min med 150 μmol/m2s fotosyntetisk aktivt lys (se materialfortegnelse).
- Hver 24. time tar du en prøve på 300 μL og måler absorbansen og fluorescensen (eksitasjon 488 nm, utslipp 526 nm) i en 96-brønns plateleser eller UV/Vis-spektrometer og fluorometer (se materialfortegnelse). Bruk en svart plate med gjennomsiktig bunn for samtidige målinger.
6. Råproteinekstraksjon, proteinrensing og SDS-PAGE-elektroforese
- Inokulere transformant (#50) fra en logfase vedlikeholdskultur til 300 ml TAP supplert med 200 mg/L-1 cefotaksim og 25 mg/L-1 hygromycin B for å nå OD680 = 0,1. Inokulere en kultur med villtype C. vulgaris og bare 200 mg / L-1 cefotaxim som negativ kontroll. Inkuber ved 25 °C ved 150 o/min med 150 μmol/m2s fotosyntetisk aktivt lys.
- Trekk ut råproteinprøven fra transformanten (# 50) og villtypestammene ved hjelp av 5 ml lysisbuffer (se tabell 1), etterfulgt av sonikering i 4 minutter.
- Rens råproteinprøven med en Ni-NTA-harpiks gjennom 5 ml polypropylenkolonner (se materialtabell).
- Lyofiliser de 15 ml rensede proteinprøvene og resuspender dem i 1 ml lysisbuffer for SDS-PAGE-analyse17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å vise vellykket transformasjon ved hjelp av metoden ovenfor, ble C. vulgaris kokulturert med enten AGL-1 inneholdende pCAMBIA1302-plasmid eller uten plasmid (villtype og belagt på TAP-agar supplert med hygromycin B og cefotaksim (figur 1A). Platen lengst til venstre viser de transformerte koloniene som er i stand til å vokse på Hygromycin B/cefotaksimplater, og den midterste platen viser at AGL-1 av villtype ikke kan vokse på Hygromycin B/cefotaksimplatene. Platen lengst til høyre viser at når ingen seleksjon brukes (kun cefotaksim), kan C. vulgaris-transformanter og villtype vokse. Enkeltkolonier ble stripet inn på TAP-agar med hygromycin B og cefotaksim (figur 1B). Rømte kolonier fra høyre plate (figur 1B) ble inokulert på TAP-væske med hygromycin B og cefotaksim (figur 1C). På grunn av variable ekspresjonsnivåer etter tilfeldig integrering av T-DNA, ble transformanter opprinnelig gjenfunnet på plater med økende konsentrasjoner av hygromycin B fra 25-70 mg / L. En koloni fra hver plate ble dyrket i flytende TAP-medier som inneholdt samme konsentrasjon av hygromycin B sammen med villtype C. vulgaris i laveste konsentrasjon (figur 1D). Villtype C. vulgaris kan ikke vokse i nærvær av hygromycin, mens kolonier resistente opp til 70 mg / l ble oppnådd.
For å bekrefte at T-DNA-kassetten ble stabilt integrert i genomet til C. vulgaris, ble en koloni valgt fra hver av de 20, 25, 30, 50 og 70 mg / L Hygromycin B-platene hver subkulturert ved gjentatte streker på TAP-agarplater med utvalg to ganger og deretter rutinemessig subkulturert i TAP-medier over ti ganger, Navngitt Transformant # 20, # 25, # 30, # 50, # 50 og # 70 henholdsvis. Ved hjelp av disse kulturene ble begge koloni-PCR utført for å utelukke forurensning av pCAMBIA1302 i AGL1, og genomisk DNA ble ekstrahert for å bekrefte at mGFP5-genet var tilstede i C. vulgaris-genomet. I figur 2A ble koloni-PCR utført ved hjelp av primere rettet mot en 5 kbp-region utenfor T-DNA venstre og høyre grenser var i stand til å amplifisere denne regionen fra pCAMBIA1302-plasmid som en positiv kontroll, men denne regionen var ikke tilstede i noen av C. vulgaris-prøvene som indikerte at pCAMBIA1302-DNA ikke var tilstede i noen av kulturene. Villtype C. vulgaris-prøve ble brukt som negativ kontroll, og det ble ikke sett noen amplifikasjon.
Genomisk DNA ble ekstrahert fra transformanter #25, #50 og #70, og PCR ble utført, og amplifiserte en 1763 bp-region som inneholdt mgfp5-genet til T-DNA for å bekrefte integrasjon i transformantene (figur 2B). pCAMBIA1302 ble brukt som positiv kontroll, og amplifisering ble påvist i alle transformantene, noe som indikerte at mgfp5-genet var tilstede i alle transformantenes genomiske DNA. Villtype C. vulgaris ble brukt som negativ kontroll, og det ble ikke sett noen forsterkning. Figur 2C viser amplifisering av et 600 bp-fragment av virulensproteinet E2 (VirE2) som finnes i det tumorinduserende plasmidet (Ti-plasmidet) til AGl1-stammen. Den positive kontrollen, bestående av AGl1-stammen som inneholdt pCAMIA1302, ble vellykket forsterket med primere, noe som indikerer tilstedeværelsen A. tumefaciens i prøven. Imidlertid testet alle C. vulgaris-prøvene negativt for denne regionen, noe som indikerer at gjentatt subkulturering på cefotaksim vellykket eliminert forurensning av AGL1 fra kulturen. Villtype C. vulgaris-prøve ble benyttet som negativ kontroll, og det ble ikke observert forsterkning. Til sammen bekrefter disse tre testene at T-DNA inneholdende mgpf5 ble satt inn i genomet til C. vulgaris, og disse resultatene skyldtes ikke forurensning av AGL1 i prøvene eller på grunn av tilstedeværelsen av pCAMBIA1302 i cellene. Disse resultatene ble gjentatt etter 20 og ca. 100 subkulturer av transformantene som bekreftet den langsiktige integrasjonen av T-DNA i genomet.
Til slutt ble fenotypen bekreftet ved å dyrke transformantene i TAP-medier med seleksjon og måling av fluorescensen. Dette ble sammenlignet med villtype C. vulgaris. På grunn av bakgrunnsabsorbans/autofluorescens av klorofyll ble fluorescensen sammenlignet ved å normalisere dataene til villtypestammen. I figur 3A kan det observeres at det er en merkbar forskjell i vekst mellom transformantene og villtype C. vulgaris. Dette kan potensielt tilskrives de mange tilfeldige integrasjonene av T-DNA i genomet, noe som kan påvirke andre cellulære prosesser og føre til langsommere vekst. Ikke desto mindre fremhever figur 3B at til tross for lavere vekst, viser alle de utvalgte stammene høyere fluorescensnivåer når de normaliseres for celletetthet. Spesielt viste stamme #70 signifikant høyere fluorescensnivåer enn de andre, med en p-verdi på <0,01. Dette understreker viktigheten av å screene mange kolonier for å identifisere transformanter som uttrykker ønsket protein uten å påvirke den generelle vekstadferden negativt.
For å bekrefte uttrykket av mGFP5-6xHis, ble SDS-PAGE brukt til å analysere råproteinekstraktet og his-tag rensede proteiner fra både C. vulgaris (WT) og C. vulgaris transformant (#50). Deretter ble hans tag proteinrensing gjort ved hjelp av et Ni-NTA harpiks tyngdekraftsstrømningssett etter produsentens protokoll18. Figur 4 viser tilstedeværelse av mGFP5-6xH-protein (~30 kDa) i transformantprøve #50 og ingen protein i negativ kontroll (WT C. vulgaris).
Figur 1: Gjenvinning av C. vulgaris-transformanter etter AMT. (A) Etter samtidig dyrking av C. vulgaris er transformant s AGL-1 som inneholder pCAMBIA-plasmidet eller uten plasmid (kun AGL-1) på selektive plater. (B) Stripete enkeltkolonier valgt fra Hygromycin B (20 mg/L) plater på selektiv TAP-agar. (C) Rømte kolonier mangler vekst fra AGL1 eneste plate på Hygromycin B (20 mg / L) flytende medier. (D) Vekst av enkeltkolonier #25, #50 og #50 fra hygromycin-seleksjonsplater dyrket i flytende TAP-medier som inneholder hygromycin og villtype C. vulgaris som ikke kan vokse i hygromycinmedier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Påvisning av pCAMBIA1302-kontaminasjon. (A) Integrering av T-DNA i transformanter (B) og påvisning av A. tumefaciens-forurensning (C). WT indikerer villtype C. vulgaris, PC er den positive kontrollen (pCAMBIA1302) og AGL1 indikerer A. tumefaciens AGL1-stamme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vekst og fluorescens av transformantene 3 dager etter inokulering. (A) Vekst målt ved absorbans ved 680 nm. (B) Fluorescens normalisert til villtypestammen. Gjennomsnitt av 3-4 biologiske replikater, feilfelt representerer 1 σ. *p < 0,05, **p < 0,01 sammenlignet med villtype (WT). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: SDS-PAGE analyse av mGFP5-6xHans uttrykk i C. vulgaris (WT) og transformert C. vulgaris prøve #50. Ekstrakter ble fremstilt fra råolje, renset (første vask), renset (fortynnet) og renset (konsentrert) fra C. vulgaris (WT), henholdsvis felt 1-4. Rå, renset (første vask), renset (eluert) og renset (lyofilisert) fra C. vulgaris (WT), baner 5-8, henholdsvis. Den røde boksen indikerer renset GFP-6xHans protein fra transformant #70. Proteiner ble separert på et polyakrylamid 12% gel. Molekylvektene (MW) til proteinstandardene (Std.) er vist til høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn på media/buffer | Komposisjon | ||
| LB | 5 g/l gjærekstrakt, 10 g/l trypton, 5 g/l NaCl | ||
| TAPPE | 20 mM Tris base, 1,58 mM K 2 HPO 4, 2,4 mM KH 2 PO 4, 7,0 mM NH 4 Cl, 0,83 mM MgSO 4,0,34 mM CaCl 2, 1 ml / l iseddik og 1 ml / L av hver F / 2 medium spormetaller og F /2vitaminer | ||
| F/2 medium spormetaller | 22 mg/L ZnSO 4·7H 2 O, 180 mg/L MnCl 2·4H 2 O, 6,3 mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O, 14 mg/L CoCl 2·6H 2 O, 9,8 mg/L CuSO 4·5H 2 O, 3,15 g/L FeCl3·6H 2 O, 4,36 g/L Na 2 EDTA·2H 2 O | ||
| F/2 medium vitaminer | 0,1 mM vitamin B12 (cyanokobalamin), 25 mg/l biotin, 335 mg/l tiamin, 50 mM HEPES buffer pH 7,8 | ||
| Lysis Buffer | 20 mMNa 2HPO 4, 300 mM NaCl, pH7,4 | ||
Tabell 1: Medie- og bufferoppskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effektiviteten av transformasjonen er knyttet til flere forskjellige parametere. Valget av A. tumefaciens-stammer som brukes til AMT er avgjørende. AGL-1 er en av de mest invasive stammene som er oppdaget, og har derfor blitt rutinemessig brukt i plante AMT. Supplering av induksjonsmediet med glukose (15-20 mM) er også viktig for AMT-effektivitet. Tatt i betraktning at C. vulgaris kan vokse i både fototrofiske og heterotrofe forhold, blir glukose eller andre karbonkilder ofte utelatt fra mikroalgermedier for å forhindre forurensning. For eksempel er Bold's Basal Medium (BBM) det mest brukte mediet for fototrofisk dyrking av C. vulgaris19. BBM støtter imidlertid ikke A. tumefaciens vekst på grunn av mangel på en organisk karbonkilde og ammonium som nitrogenkilde den foretrekker (BBM bruker nitrat)20. Derfor ble TAP media brukt i dette arbeidet fordi det inneholder acetat som karbonkilde for C. vulgaris, glukose for A. tumefaciens og ammonium som nitrogenkilde begge arter kan bruke. TAP-agarplater gir også mye raskere vekstrater for C. vulgaris, noe som minimerer tiden for å gjenopprette transformanter etter AMT. For å indusere Ti-plasmidvirulensproteiner må 200 μM acetosyringon også tilsettes induksjonsmediet.
For å eliminere A. tumefaciens fra kulturen etter AMT, ble cefotaxim, sammen med seriepassasje, brukt. AGL-1 er resistent mot ampicillin, kloramfenikol, rifamycin og streptomycin, og det er følsomt for cefotaxim, tetracyklin, spectinomycin og kanamycin. I planter brukes cefotaxim ofte til å eliminere A. tumefaciens fordi den har en lavere fytotoksisk effekt for skuddregenerering hos mange plantearter enn andre antibiotika21. Imidlertid bekreftet vi også at tetracyklin (som koster omtrent 100 ganger mindre) kunne brukes i stedet for cefotaxim i denne protokollen når kombinert med seriepassering fra en enkelt koloni (data ikke vist). Dette er sannsynligvis fordi antibiotika som tetracyklin ville hemme proteinsyntesen i kloroplasten i planter som er avhengige av fotosyntese22. Imidlertid kan C. vulgaris vokse i mørket når den suppleres med acetat, noe som betyr at kloroplastdysfunksjon ikke nødvendigvis er giftig for denne arten under nøye utvalgte forhold.
Selv om 20 mg/l hygromycin B var tilstrekkelig til å hindre vekst av villtype C. vulgaris, ble en rekke konsentrasjoner av hygromycin B (20-70 mg/L) testet. Det er mulig at kolonier isolert fra høyere konsentrasjonsplater kan ha flere integrerte kopier av T-DNA eller T-DNA er lokalisert i et mer transkripsjonelt aktivt område av genomet, noe som resulterer i høyere ekspresjon av Hygromycin B-fosfotransferase, noe som resulterer i raskere inaktivering av herbicidet og mindre forsinkelse i kulturvekst23. Flere kopier kan være årsaken til forskjellene i intensiteten til PCR-produktene når man forsterker mgfp5 fra genomet (figur 2B). Tilstedeværelsen av GFP-6xH-protein i den rensede prøven under SDS-PAGE-analyse (figur 4, bane 8) og fraværet i villtypestammen (figur 4, bane 4) bekrefter at AMT og pCAMBIA1302 kan brukes til vellykket ekspresjon og stabil integrasjon av transgen i C. vulgaris.
I dette arbeidet utviklet og optimaliserte vi en protokoll for pålitelig C. vulgaris UTEX 395-transformasjon ved hjelp av A. tumefaciens AGL-1 og et pCAMBIA-systemplasmid. Siden alle stammer og plasmider som trengs for dette arbeidet er tilgjengelige fra flere forskjellige kilder, vil denne metoden være lett å replikere i ethvert laboratorium. Som en av de viktigste industrielle stammene av mikroalger, vil en standard referansemetode for pålitelig AMT være avgjørende for å konstruere C. vulgaris for bioteknologiske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det ble ikke oppgitt interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke professor Paul Hooykaas for vennlig levering av pCAMBIA1302-vektoren og Agrobacterium tumefaciens AGL1 fra Institute of Biology Leiden, Leiden University, Nederland. Forfatterne vil også takke Eva Colic for hennes hjelp til å dyrke fluorescerende transformanter. Dette arbeidet ble finansiert av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada og Mitacs Accelerate-programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb Plus DNA ladder | FroggaBio | DM015 | |
| Acetosyringone | Fisher Scientific | D26665G | |
| Agrobacterium tumefaciens | Gold Biotechnologies | Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas | Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA |
| Biotin | Enzo Life Sciences | 89151-400 | |
| CaCl2·2H2O | VWR | BDH9224-1KG | |
| Cefotaxime | AK Scientific | J90010 | |
| Chlorella vulgaris | University of Texas at Austin Culture Collection of Algae | Strain: UTEX 395 | Wildtype strain |
| CoCl2·6H2O | Sigma Aldrich | C8661-25G | |
| CuSO4·5H2O | EMD Millipore | CX2185-1 | |
| FeCl3·6H2O | VWR | BDH9234-500G | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652662 | Main unit equipped with PC module. |
| GeneJET Plant Genome Purification Kit | Thermo Scientific | K0791 | |
| Glacial acetic acid | VWR | CABDH3093-2.2P | |
| Glycerol | BioBasic | GB0232 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H-3375 | |
| Hygromycin B | Fisher Scientific | AAJ6068103 | |
| K2HPO4 | VWR | BDH9266-500G | |
| Kanamycin | Gold Biotechnologies | K-250-25 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| MgSO4·7H2O | VWR | 97062-134 | |
| MnCl2·4H2O | JT Baker | BAKR2540-01 | |
| Na2CO3 | VWR | BDH7971-1 | |
| Na2EDTA·2H2O | JT Baker | 8993-01 | |
| Na2MoO4·2H2O | JT Baker | BAKR3764-01 | |
| NaCl | VWR | BDH7257-7 | |
| NaH2PO4 H2O | Millipore Sigma | CA80058-650 | |
| NaNO3 | VWR | BDH4574-500G | |
| NEBExpress Ni Resin | NewEngland BioLabs | NEB #S1427 | |
| NH4Cl | VWR | BDH9208-500G | |
| pCAMBIA1302 | Leiden University | Gift from Prof. Paul Hooykaas | pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator) |
| Polypropylene Columns (5 mL) | QIAGEN | 34964 | |
| Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL | Bio-Rad | 1610363 | |
| Rifampicin | Millipore Sigma | R3501-1G | |
| SunBlaster LED Strip Light 48 Inch | SunBlaster | 210000000906 | |
| Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer | BioTEK | S4MLFPTA | |
| Tetracycline | Thermo Scientific Chemicals | CAAAJ61714-14 | |
| TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610185 | |
| Thiamine | TCI America | T0181-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tryptone | BioBasic | TG217(G211) | |
| Vitamin B12 (cyanocobalamin) | Enzo Life Sciences | 89151-436 | |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | |
| ZnSO4·7H2O | JT Baker | 4382-01 |
References
- Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
- Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
- Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
- Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W.
- Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
- de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G.
- Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
- Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
- Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, 0257089 (2021).
- Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239 (2021).
- Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36 (2018).
- Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).
- Bio-Rad Laboratories Inc. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed. , (2023).
- NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. New England Biolabs Inc. , Available from: https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
- Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262 (2019).
- Morton, E. R., Fuqua, C.
- Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
- Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
- Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458 (2021).
