Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Opdræt af kålhvid sommerfugl (Pieris rapae) under kontrollerede forhold: Et casestudie med tungmetaltolerance

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65383
Automatic Translation
1, 1,2
1Deptartment of Ecology, Evolution and Behavior, University of Minnesota, 2Biology, Sweet Briar College

Summary

Dette papir præsenterer en detaljeret protokol til opdræt af kålhvid sommerfugl under kontrollerede laboratorieforhold med en kunstig kost, som muliggør præcise manipulationer af tidlig ernæring og toksineksponering. De repræsentative resultater viser, hvordan tungmetaltoksicitet kan analyseres med denne protokol.

Abstract

Den kålhvide sommerfugl (Pieris rapae) er et vigtigt system til anvendt skadedyrsbekæmpelse forskning og grundforskning i adfærdsmæssig og ernæringsmæssig økologi. Kålhvide kan let opdrættes under kontrollerede forhold på en kunstig diæt, hvilket gør dem til en modelorganisme i sommerfugleverdenen. I dette papir bruges en manipulation af tungmetaleksponering til at illustrere grundlæggende metoder til opdræt af denne art. Den generelle protokol illustrerer, hvordan sommerfugle kan fanges i marken, tilskyndes til at lægge æg i drivhusbure og overføres som larver til kunstig kost. Metoderne viser, hvordan sommerfugle kan markeres, måles og studeres for en række forskningsspørgsmål. De repræsentative resultater giver en idé om, hvordan kunstige kostvaner, der varierer i komponenter, kan bruges til at vurdere sommerfuglens ydeevne i forhold til en kontroldiæt. Mere specifikt var sommerfugle mest tolerante over for nikkel og mindst tolerante over for kobber med en tolerance over for zink et sted i midten. Mulige forklaringer på disse resultater diskuteres, herunder nikkel hyperakkumulering i nogle sennep værtsplanter og nylige beviser i insekter, at kobber kan være mere giftigt end tidligere værdsat. Endelig gennemgår diskussionen først variationer i protokollen og anvisninger til fejlfinding af disse metoder, før man overvejer, hvordan fremtidig forskning yderligere kan optimere den kunstige diæt, der anvendes i denne undersøgelse. Samlet set giver denne protokol ved at give en detaljeret videooversigt over opdræt og måling af kålhvider på kunstig kost en ressource til brug af dette system på tværs af en lang række undersøgelser.

Introduction

Den lille kålhvide sommerfugl (Pieris rapae, herefter "kålhvid") er en kosmopolitisk skadedyrsart af sennepsafgrøder, såsom kål, broccoli og raps 1,2,3. Samtidig er kålhviden et kraftfuldt system til forskning i biologi og en almindeligt anvendt sommerfuglemodel, da de let kan opdrættes og manipuleres i kontrollerede laboratorieforsøg 4,5. Forskning i kålhvide sommerfugle har givet kritisk indsigt med hensyn til værtssøgning 6,7,8, nektarressourceforbrug9,10,11, valg af partner og seksuel selektion 12,13,14, vingemønsterudvikling og evolution15,16,17 og reaktioner på nye og skiftende Miljøer18,19. Mange af disse indsigter er afhængige af det faktum, at kålhvide kan opdrættes på kunstige kostvaner 4,20,21, som præcist kan manipuleres til at afspejle dårlige ernæringsforhold 22,23, økologisk relevante forurenende niveauer 24,25,26,27 eller overgange til nye værtsplanter28,29. Denne undersøgelse bruger et eksperiment om eksponering for tungmetaller til at illustrere grundlæggende metoder til opdræt af kålhvide sommerfugle på en kunstig diæt i laboratoriet og vigtige præstationsmål for larver og voksne. Mange aspekter af disse metoder gælder for andre sommerfugle 30,31 og møl32,33,34, der kan opdrættes på en kunstig kost.

I dette papir bruges et eksperiment om metaltolerance til at illustrere de generelle metoder til opdræt af kålhvide sommerfugle. Tungmetaller er et almindeligt menneskeskabt forurenende stof, der stammer fra nedbrydning af menneskelige produkter, industrielle processer og arvforurening fra historisk brug i pesticider, maling og andre produkter35,36,37,38. Mange tungmetaller, herunder bly, kobber, zink og nikkel, kan bevæge sig fra jord og vand til plantevæv 39,40,41,42, og metaller i støv kan deponeres på planteblade43,44,45, hvilket resulterer i flere eksponeringsveje for phytophagous insektlarver. Tungmetaleksponering tidligt i livet kan have negative virkninger på dyrs udvikling, især på neuralt væv, og høje niveauer kan være dødelige 35,36,46,47,48. En række undersøgelser har vist de negative virkninger af metaleksponering på udviklende insekter, herunder både skadedyr og gavnlige insekter 49,50,51. Det store antal tungmetalforurenende stoffer og det faktum, at de ofte forekommer sammen i menneskelige miljøer52, betyder, at der er behov for præcise laboratoriemetoder, hvor forskere kan udsætte udviklende insekter for forskellige niveauer og kombinationer af forskellige metaller for at forstå og afbøde deres miljøpåvirkninger.

Dette arbejde kontrasterer virkningerne af almindelige metaller på kålhvid overlevelse og udvikling med fokus på kobber (Cu), zink (Zn) og nikkel (Ni), tre almindelige forurenende stoffer i menneskelige miljøer. For eksempel indeholder forbs fra landdistrikterne Minnesota vejkanter op til 71 ppm Zn, 28 ppm Cu og 5 ppm Ni53. Dette eksperiment manipulerer niveauerne af disse metaller i kunstige kostvaner af kålhvide sommerfugle på niveauer, der svarer til og overstiger de niveauer, der ses i miljøet. En kunstig diæt bruges til at kontrastere disse metallers relative toksicitet og forudsiger, at kålhvide ville være mere følsomme over for metalforurenende stoffer, der ikke er en integreret del af deres fysiologi (nikkel) i forhold til dem, der forekommer, omend på små niveauer, i enzymer og væv (kobber og zink; Figur 1). Hele vejen igennem giver denne tekst metodologiske detaljer og ledsagende videovisualiseringer for at illustrere opdræts- og forskningsmetoderne i dette vigtige sommerfuglemodelsystem.

Protocol

Denne forskning blev udført under USDA APHIS tilladelse P526P-13-02979.

1. Indsamling af eksperimentelle sommerfugle

  1. Fang voksne kvindelige sommerfugle med et insektnet fra luften. Kålhvide findes generelt i åbne, forstyrrede levesteder med nektarplanter og værtsplanter (i familien Brassicaceae) til stede.
    1. Søg, når solen er fremme, og temperaturen er varm. For at målrette hunner skal du kigge efter personer, der flagrer langsomt, tæt på jorden og lander på planter for at "tromme" (smage) bladene med deres foretarsi.
  2. Opret kvinder i bur for at høste æg.
    BEMÆRK: Markindsamlede hunner har i gennemsnit parret sig med en eller to hannerpå 12 år og bør begynde at lægge frugtbare æg kort tid efter fangst. Vildtfangede hunner har brug for naturligt lys til oviposit og parring, så placer buret i et drivhus eller vindueskarme.
  3. Hushunner med en værtsplante til at høste æg.
    BEMÆRK: Kvinder accepterer en række værtsplanter, herunder grønkål, radise, grønkål, collards og Arabidopsis, men sikrer, at planterne ikke er blevet behandlet med pesticider.
    1. Præsenter værtsplanterne enten i potter eller i beholdere med vand for at opretholde bladtrykket, såsom stængler af grønkål i blomstervandrør.
    2. Hvis forskeren ønsker at indsamle æg og overføre dem direkte til kosten, skal du først bruge et elastik til at fastgøre et værtsplanteblad til toppen af en plastikkop vand og derefter strække et stykke parafilm rundt om kanthunnerne, der rører bladet, vil oviposit på parafilmen (se5).
  4. Sørg for, at buret også indeholder noget, der holder den relative luftfugtighed høj, for eksempel gennem daglig vanding af en potteplante eller befugtning af et håndklæde, især under tørre forhold. Hvis potteplanter vandes i buret, skal du sørge for, at der er et håndklæde under gryden, da sommerfugle kan sidde fast i poolende vand.
  5. Foder sommerfuglene med en 10% fortyndet honningvandsopløsning præsenteret på en gul svamp, som sommerfugle hurtigt lærer at bruge, især hvis de er anbragt hos erfarne individer.
    1. For at tilskynde sommerfugle til at fodre fra svampe, skal du placere dem direkte på føderen, især efter let sprøjtning med en vandflaske, hvilket ofte får dem til at stikke deres proboscis ud.
    2. For at oprette føderen skal du først skylle de gule eller orange svampe grundigt og derefter skære dem i små firkanter, der passer ind i 60 mm plastik petriskåle. Skift foderautomaterne dagligt og rengør svampene i en mild blegemiddelopløsning efterfulgt af grundig skylning for at forhindre skimmelvækst.

2. At lave kunstige kostvaner

  1. Brug først opskriften i tabel 1 eller andre relevante kilder til at bestemme den relevante opskrift på et eksperiment. Foretag nødvendige ændringer, der er specifikke for målarterne eller eksperimentet. Udskriv en opskrift, der skal følges, mens du vejer ingredienser.
  2. Vej alle de tørre ingredienser, undtagen agar, i en beholder. Sørg for, at ingredienserne sættes tilbage på deres respektive opbevaringssted, idet det bemærkes, at flere ingredienser opbevares ved 4 ° C. Anbring den vejede, tørre ingrediensblanding i en blender med 5 ml hørfrøolie.
  3. Følg nedenstående trin for hver diætbatch.
    1. 15 g finmasket agar blandes med 400 ml destilleret vand i et bægerglas med en størrelse på mindst 1 liter. Mikrobølgeovn, indtil agaren er tæt på kogning, med fine bobler i hele blandingen, omrør blandingen hver 30-60 s for at forhindre kogning.
    2. Til denne varme agarblanding tilsættes 400 ml destilleret vand i vandhanetemperatur for at bringe det til en passende temperatur til blanding med de tørre ingredienser, da vitaminblandingen er varmefølsom.
    3. Tilsæt agarblandingen til blenderen og bland grundigt, skrab blenderens kanter om nødvendigt.
  4. Når agaren opvarmes, skal du placere mindst fireoghalvfjerds ounce diætkopper på disken med kanterne rørende. Efter grundig blanding af kosten hældes blandingen fra blenderen i diætkopper, og sørg for, at kosten dækker bunden af hver kop.
  5. Når kosten er afkølet, skal du placere låg på kopperne, mærke diætkopperne med diættype, stable dem på bakker og opbevare i op til 1 måned ved 4 ° C indtil brug.

3. Overførsel og opdræt på kunstig kost

  1. Husets værtsplante efterlader sommerfugleæg i 30 oz deli-kopper med et maskedæksel i et klimakammer på 24 °C. Efter 1 uge skal du kontrollere kopperne - sikre, at larverne klækkes og i slutningen af første eller tidlige anden instar fase, et godt tidspunkt for overførsel til den kunstige kost.
  2. Overfør larverne til den kunstige diæt med en pensel, desinficer den med blegemiddelspray og en vandskylning mellem larverbeholdere. Overfør tre larver i hver 4 oz kop. Mens den kunstige kost er energitæt og kan understøtte høje tætheder af larver, skal du undgå at pakke larver i kopper, da sygdomme og skimmelsvamp kan sprede sig i kopper med høj larvetæthed.
  3. Placer kopperne i en plastikbeholder på deres sider, så frass falder til bunden af kopperne og væk fra kosten, hvilket reducerer skimmel og sygdomsrisiko.
    1. Opbevar diætkopperne under kontrollerede temperaturforhold med lave til moderate lysniveauer. Overvåg kopperne for skimmel og sygdom hver 1-2 dag ved at kigge gennem de klare koplåg.
    2. Kopper med skimmel eller sygdom kan sættes i karantæne eller fryses for at forhindre spredning til andre kopper.

4. Fremkomst og håndtering af voksne

  1. Lad larverne forpuppe sig og dukke op i kostkopperne. Når voksne dukker op, skal du give dem et par timer for deres vinger at hærde, før du fjerner dem til markering. Fjern voksne sommerfugle fra kopperne med rene hænder ved forsigtigt at tage fat i deres vinger, og bemærk, at det er et mere stabilt greb at gribe alle fire vinger tættere på deres krop.
  2. For at markere sommerfuglene skal du holde tørre individer ved hovedet og brystkassen og bruge en fintippet sharpie til let at markere et tal på bagvingen.
    1. Køn individer ved hjælp af en kombination af vingemarkeringer og kønsorganer; Hunnerne har generelt to sorte pletter på deres dorsale forvinge og mørkere, mere gullige bagvinger, mens hannerne generelt har en mindre sort plet på den dorsale forvinge på en lysere hvid baggrund54.
    2. I betragtning af at denne farve viser individuel og sæsonbestemt variation, skal du bekræfte kønnet ved hjælp af abdominale træk-mænd har to klemmer i den distale ende af deres mave og en smallere mave generelt, mens kvinder har en enkelt kønsåbning.
  3. Overfør de voksne til voksglasinkonvolutter ved at åbne konvolutten med den ene hånd, holde sommerfuglen ved hovedet og brystkassen, glide den ind i konvolutten og gribe vingerne gennem konvolutten med den anden hånd.
    1. Sørg for, at alle fire vinger er lukket normalt inden for konvolutten.
    2. Hold sommerfuglene under kolde forhold (5-6 °C) i op til 1 uge før forsøg, men lad mindst 1 dag akklimatisere, når de tages ud af køleskabet.

5. Resultatmål

  1. For at måle vingetræk på døde individer skal du fjerne sommerfuglens vinger ved at holde brystkassen i den ene hånd og bruge tang til at fjerne hver vinge ved bunden. Placer vingerne fladt i en lysboks og tag billeder til senere målinger.
  2. For at få estimater af frugtbarhed skal du huse de voksne i parringsbure, hvilket giver mindst 1 dag til reproduktiv modning af mænd og 1 dag til parring. Ofre hunner på bestemte tidspunkter for ægtællinger gennem dissektion, eller saml æg hver dag på værtsplanter.
  3. For at estimere ægbelastninger skal du fjerne kvindens underliv, placere den i 1x PBS-buffer og skære en slids langs den ventrale side.
    1. Brug tang til at adskille indmaden fra neglebåndet, og træk derefter æggestokkene væk fra tarmen, trachaer og andet indhold i maven.
    2. Uncurl de fire krøllede ovarioler i hver af de to æggestokke, og bemærk, hvor modne, æggeblomme og afskallede æg overgår til umodne follikler. Brug en tæller til at hjælpe med at tælle de samlede modne æg, der generelt spænder fra 0-200 æg.
  4. For at bestemme parringsstatus for en dissekeret kvinde skal du åbne bursa copulatrix og adskille spermatoforerne indeni. Når spermatoforer fordøjes, udvikler de generelt en "hale" og er indlejret i hinanden.

6. Casestudie

BEMÆRK: Voksne hvide hvidkålsfugle blev indsamlet fra naturen i 2014 for at grundlægge forsøgspopulationerne. Voksne hunner stammer fra nær Davis, Californien (N = 8 grundlæggende hunner).

  1. Boliger sommerfuglene
    1. Hus hunnerne i "BugDorm" mesh bure (61 cm x 61 cm x 61 cm) under naturligt lys i et drivhus. Giv et organisk blad af værtsplantekål (Brassica oleracea) til ovipositionering.
    2. For at opretholde fugtigheden i burene skal du inkludere en lille potteplante (Cosmos), vandet dagligt, placeret oven på et håndklæde i hvert bur.
    3. Saml æg dagligt ved at overføre blade med nye æg til 473 ml plastikkopper med huller i låget og læg dem i et klimakammer.
    4. Giv sommerfugle ad libitum adgang til en 10% honningvandsopløsning (fremstillet ved fortynding af økologisk honning med destilleret vand), der er tilgængelig gennem en gul svamp i en lille petriskål, der skiftes dagligt.
  2. Forberedelse af kunstige kostvaner
    1. Forbered kunstige kostvaner til kålhvide larver ved hjælp af ændringer af tidligere udviklede Lepidoptera-diæter4. Et parti diæt indeholdt 50 g hvedekim, 27 g kasein, 10 g cellulose, 24 g saccharose, 15 g kålmel, 9 g Wesson saltblanding, 12 g Torula-gær, 3,6 g kolesterol, 10,5 g Vanderzant-vitaminblanding, 1,1 g methylparaben, 1,5 g sorbinsyre, 3 g ascorbinsyre og 0,175 g streptomycin (se materialetabel).
    2. De tørre ingredienser forvejes til flere diætbatcher (tabel 1) og blandes grundigt for at øge homogeniteten på tværs af diættyper, før de opdeles i separate batcher til blanding med metalopløsninger.
    3. Anbring de tørre ingredienser i en blender med linolie og den tilsvarende metalblanding.
      BEMÆRK: Linolie blev brugt i dette forsøg, da det blev solgt af en tidligere udbyder af insektfoder. Nu anvendes organisk hørfrøolie udelukkende, som er fremstillet af den samme plante, men er mindre tilbøjelige til at indeholde tilsætningsstoffer som kommercielle udbydere af linolie.
    4. Hæld den tilberedte diæt i 118 ml (4 oz) plastik deli kopper. Brug opløselige metalsalte til at tilføje fokale metaller til kunstige kostvaner. Mål for metalkoncentrationer baseret på tidligere observationer af metalindholdet i planter (f.eks. nikkelakkumulering 55,56,57 eller vejforurening af planter 58,59,60) og tolerance for metaller i andre Lepidoptera 49,50,51.
    5. Opløs metalsalte i 500-1.000 ml destilleret vand, inden du tager de tilsvarende mængder for at tilføje til kunstig kost. For eksempel, for at lave 100 ppm nikkeldiæt, tilsættes 317,6 ml 1 M NiCl2-opløsning til den kunstige diæt før blanding for at give en endelig diætkoncentration på 100 mg / g Ni tørvægt (ca. 53 mg / g vådvægt). Denne mængde oversættes til en gennemsnitlig målt koncentration på 109,6 ppm (tabel 2) baseret på induktivt koblet plasmaatomemissionsspektroskopi.
      BEMÆRK: Niveauerne af metaller blev estimeret af University of Minnesota's Research Analytical Labs med seks prøver.
  3. Vedligeholdelse
    1. De æg, der høstes på værtsplanterne, opbevares i klimakamre ved 23 °C i fotoperioderne kl. 14:10 i 7 dage. Derefter overføres de tidlige anden instar larver til den kunstige kost.
    2. Ved overførsel fordeles larverne jævnt fra en given plante på tværs af de fire diættyper for at undgå at forvirre partier af larver med diættype. Overfør larverne (N = 346 i alt) som to individer pr. 118 ml diætkop for at reducere sygdomsforekomsten fra overbelægning og give rigelig plads til, at voksne til sidst kan lukke.
    3. Stans huller (tre pr. låg) i lågene på opdrætskopperne. Anbring kopperne i plastikbeholdere på størrelse med en skotøjsæske til opdræt, hvor de forskellige diæter er spredt for at undgå systematiske virkninger af placeringen i opdrætskammeret.
    4. Opbevar larvernes kopper i klimakamre ved 23 °C på 14:10 fotoperioder (med beholdere med vand i bunden af kammeret for at holde luftfugtigheden omkring 50% -60%, overvåget med en luftfugtighedssensor til hjemmet). I tilfælde af at kopperne blev mugne (ca. otte kopper i alt i dette casestudie), fjern kopperne fra kammeret og fjern disse personer fra eksperimentet.
    5. Lad larverne forpuppe sig og dukke op i opdrætsbægrene (N = 162 i alt).
      BEMÆRK: For opdrætsforholdene i denne undersøgelse var udviklingstiden fra ægudtagning til voksen fremkomst i gennemsnit ca. 25-30 dage (fra 20-40 dage, f.eks. 25,28).
    6. Når pupperne nærmer sig voksen fremkomst, skal du kontrollere kopperne dagligt for nyligt lukkede individer og fjerne voksne med tørrede vinger. Mærk de voksne på bagvingerne med deres tilsvarende individuelle nummer (tildelt ved larveoverførsel) ved hjælp af en fintippet sort sharpie. Bestem hver enkelt persons køn og markér på en glassinuskuvert sammen med deres nummer og fremkomstdato. Læg de voksne sommerfugle i glassine kuverter og opbevar ved -20 ° C indtil videre behandling.
      BEMÆRK: En lille brøkdel af nye voksne viser vingedeformiteter, der ville forstyrre flyvning og voksenoverlevelse (5% -8%); Disse personer er udelukket fra overlevelsesanalyser for disse eksperimenter.
  4. Måling og dataanalyse
    1. Mål overlevelsen som overlevelse fra anden instar (når larverne blev placeret på diæt) til voksen fremkomst.
      BEMÆRK: Denne undersøgelse fokuserede på overlevelses- og udviklingstid som mål for ydeevne på de forskellige diæter.
    2. Mål udviklingstiden som antallet af dage mellem overførsel til diæt og voksen fremkomst i klimakammeret.
    3. Til dataanalyse skal du køre to sæt modeller, der omfattede interaktioner mellem metallet og koncentrationen.
      BEMÆRK: Da begge interaktioner var signifikante (F 2.194 = 4,56, p = 0,01 for udviklingstid og X2 = 12,1, p = 0,002 for overlevelse), fortsatte undersøgelsen med separat analyse af hvert metal.
    4. For at analysere overlevelse skal du køre chi-square tests for hvert metal for at teste virkningerne af metaldosis (behandlet som fire kategorier) på overlevelse til voksenalderen med vinger helt intakte.
    5. Når der påvises en signifikant effekt af dosis, skal du udføre en opfølgende chi-square for at sammenligne hvert niveau med kontroldiet. For at analysere udviklingstiden (fra overførselstidspunktet til fremkomsten som voksen) skal du teste for virkninger af sex på udviklingstiden.
      BEMÆRK: Da der ikke var nogen effekt af køn på udviklingstiden (p > 0,10) for noget metal i dette eksperiment, droppede vi det fra overvejelse i modellen.
    6. Kør en separat ANOVA for hvert metal for at teste for effekten af de fire koncentrationer på udviklingstiden. Desuden køres t-test for hver koncentration i forhold til kontrollen for at bestemme minimumskoncentrationen, hvor der ses en præstationseffekt.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev JMP v16 anvendt til alle analyser. Alle rådata er tilgængelige på Mendeley61.

Representative Results

Overblik
Kunstig kost kan bruges til at opdrætte kålhvide sommerfugle under standardbetingelser for at teste virkningerne af visse diætingredienser på sommerfuglens ydeevne. I dette arbejde blev kunstig kost brugt til at undersøge toksiciteten af forskellige metaller, der findes i værtsplanter, der vokser i forurenede områder (figur 1). Larver blev opdrættet på kost, der indeholdt stigende koncentrationer af tre forskellige metaller (figur 2; specifikke metodologiske detaljer præsenteret i afsnit 6 i protokollen). Sommerfuglens overlevelse og udvikling var mere påvirket af kobber og zink og mindst påvirket af nikkel (figur 3 og figur 4) med en følsomhed, der kan sammenlignes med andre undersøgelser med sommerfugle og møl opdrættet på kunstig kost (figur 5).

Overlevelse
Sommerfuglelarver blev overført til kunstig kost indeholdende kobber, nikkel, zink eller kontrol, hvor hver metaltype varierede i koncentration på tre niveauer (tabel 3). Et repræsentativt billede af larver ved en stigende dosis toksin er vist i figur 2. Der var ingen effekt af metalkoncentration på overlevelse for nikkel, men der var en signifikant effekt for både kobber og zink (tabel 3 og figur 3). Post-hoc chi-square sammenligninger viste, at zink viste et fald i overlevelse i forhold til kontrolkosten på kun det højeste niveau af zink (1.000 ppm, post-hoc sammenligning X12 = 8,41, p = 0,004; Figur 1). Kobber viste også et signifikant fald i overlevelse kun på de højeste anvendte niveauer (500 ppm, X12 = 7,00, p = 0,008), selv om der var en ikke-signifikant gavnlig stigning i overlevelse på de to laveste niveauer (50 ppm og 100 ppm; Figur 3).

Udviklingstid
Der var en signifikant effekt af kobber- og zinkkoncentration på udviklingstiden (tabel 4 og figur 4). Da kobberkoncentrationen steg, var der en stigning i udviklingstiden med en signifikant afvigelse fra kontrollen, der startede ved 50 ppm (p = 0,027; Figur 3). Da zinkkoncentrationen steg, var der en stigning i udviklingstiden med en signifikant afvigelse fra kontrollen, der startede ved 100 ppm (p = 0,03; Figur 4). Der var en tendens til, at stigende nikkel resulterede i længere udviklingstider (p = 0,08; Tabel 4), og sammenligninger af hver diæt med kontrollen viste signifikante effekter startende ved 100 ppm (p = 0,022; Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Observerede niveauer af fokalmetaller i sommerfuglevæv og værtsplanter. (Data fra62.) Niveauer af kobber, nikkel og zink er vist for Pieris sommerfuglevæv (opdrættet på bok choy i laboratoriet) og vildtindsamlede sennep (Bertorea sp.). Biler angiver de niveauer, der ses i planteblade langs stærkt trafikerede veje53. Niveauerne af metaller i kunstige kostvaner, der anvendes i denne undersøgelse, er rapporteret i tabel 1; Point repræsenterer midler, og fejlbjælker repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Billede af kålhvide larver overført samme dag til kunstige kostvaner med stigende koncentration af et toksin. Dette billede viser larver fra en dosis-respons undersøgelse (præsenteret i 28 ved hjælp af tørret plantemateriale til den giftige plante Aristolochia). Foto af ESR. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Variation i overlevelse på tværs af metaldiæter med stigende koncentrationer. Stjerner indikerer signifikant afvigelse i overlevelse i forhold til kontrolkosten. De nøjagtige metalkoncentrationer i kosten er angivet i tabel 2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Virkninger af metalkoncentration på udviklingstiden. Stjernerne angiver den laveste metalkoncentration, for hvilken der er en signifikant forskel i forhold til kontrollen (ved hjælp af en t-test). De nøjagtige metalkoncentrationer i kosten er angivet i tabel 2. Point repræsenterer middelværdier, og fejlbjælker repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Sammenfatning af metaltolerance hos andre Lepidoptera. Vist er sammensatte overlevelsesdata plottet fra 11 eksisterende undersøgelser 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68. Responsvariablen er niveauet (i ppm) af metalkoncentration, hvor negative virkninger på overlevelse først ses. Sommerfugle angiver resultater fra denne undersøgelse og bemærker, at toleranceværdierne for nikkel var højere end dem, der blev målt i denne undersøgelse. Point repræsenterer middelværdier, og fejlbjælker repræsenterer standardfejl. Klik her for at se en større version af denne figur.

Ingrediens Vej som g Ml
Hvedekim tørre ingredienser 50
Cellulose tørre ingredienser 10
Kålmel tørre ingredienser 15
Kasein tørre ingredienser 27
Saccharose tørre ingredienser 24
Wesson Salt Mix tørre ingredienser 9
Torula gær tørre ingredienser 12
Kolesterol tørre ingredienser 3.6
Vitamin Mix tørre ingredienser 10.5
Methylparabener tørre ingredienser 0.75
Sorbinsyre tørre ingredienser 1.5
Askorbinsyre tørre ingredienser 3
Streptomycin tørre ingredienser 0.175
Hørfrøolie våde ingredienser 5
Agar Agar 15

Tabel 1: Opskrift på kunstig kost. Vist er vægten (og volumenerne) af ingredienser i et parti kål hvid sommerfugl kost. De tørre ingredienser (og hørfrøolie) fremstilles separat fra agarblandingen (opløst i 400 ml kogende vand og derefter bragt til en køligere temperatur med 400 ml stuetemperaturvand).

Kost type Kobber (ppm) Nikkel (ppm) Zink (ppm)
Kobber-"100 ppm" 96.1 1.75 69.9
Nikkel-"100 ppm" 7.29 109.6 68.9
Zink-"100 ppm" 7.96 1.06 186.2
Zink-"500 ppm" 6.51 1.16 708
Kontrol 5.89 0.59 59.3

Tabel 2: Mål for metaller i kost. Vist er de gennemsnitlige niveauer af kobber, nikkel og zink i en delmængde af de kunstige kostvaner, der anvendes i undersøgelsen. Diætnavnet ("type" i analysen) vises til venstre, hvor værdier i anførselstegn er det beregnede niveau. Målkoncentrationen er angivet i anførselstegn. En delmængde af diæter, der blev brugt i undersøgelsen, blev analyseret for at sikre, at de beregnede værdier var på mål med realiserede værdier; Det skal bemærkes, at der ofte er en lille grad af variation i sammensætningen af kostkomponenter, og hver rapporteret linje repræsenterer kun en replikat.

Metal Pearson X32 P
Kobber (N = 118) 17.82 0.0005
Nikkel (N = 152) 3.45 0.33
Zink (N = 152) 12.52 0.006

Tabel 3: Virkninger af metalkoncentration på overlevelse. Vist er resultaterne af en chi-square test for hvert metal, kontrasterende tre koncentrationer af metal i forhold til en kontroldiæt.

Metal F P
Kobber (N = 61) F3,57 = 9,84 <0.0001
Nikkel (N = 75) F3,71 = 2,35 0.079
Zink (N = 64) F3,60= 3,79 0.015

Tabel 4: Virkninger af metalkoncentration på udviklingstiden. Vist er resultaterne af individuelle ANOVA'er for hvert metal.

Tilgængelighed af data:

Alle data er tilgængelige på Mendeley61.

Discussion

I denne forskning blev kålhvide sommerfugle (Pieris rapae) opdrættet på en kunstig diæt for at undersøge forskelle i tungmetaltoksicitet. Dermed giver denne undersøgelse generelle metoder til opdræt og laboratorieundersøgelser af dette let at manipulere sommerfuglesystem. Denne diskussion overvejer først mere generelle spørgsmål om de metoder, der gennemgås her, gennemgår derefter vores videnskabelige resultater, før vi slutter med refleksioner over komponenterne i den kunstige kost.

Den protokol, der gennemgås her, giver trin i en generel opdrætsmetode for kålhvide sommerfugle, men der er mange punkter i denne protokol, der kan justeres. For eksempel, mens casestudiet, der præsenteres her, bruger svampe til fodring, har andre forskere haft held med tandvæger og silkeblomster fyldt med honningvand5. Mens den nuværende undersøgelse bruger honningvand som mad, har andre forskere brugt sukkeropløsninger og endda Gatorade. Hvis pupper skal vejes eller flyttes til andre betingelser for fremkomst (f.eks. Inducering af diapause og behov for køleopbevaring i 1 måned), kan forskeren let fjerne dem fra kopperne ved at spritte dem med vand for at fugte deres silkevedhæftninger og gribe dem med fjertang og derefter hænge dem igen ved hjælp af dobbeltsidet tape. Hvis forskere har brug for mere fleksibilitet med hensyn til, hvornår voksne sommerfugle flyttes ind i bure for voksen adfærd, kan de holdes i køleskabet i flere uger, men de skal fodres. Hver flere dage skal sommerfuglene tages ud for at blive fodret med en fortyndet honningvandopløsning. Under indendørs belysning kan dette gøres ved at bruge en nål til at rulle deres proboscis ud i maden. I slutningen af voksenpræstationen kan der træffes en bred vifte af fitnessforanstaltninger på kålhvide sommerfugle. Kropsstørrelse kan måles som den våde eller tørre masse af larver på bestemte stadier, pupper eller voksne (ofret eller holdt i glassinhylstre) eller ved måling af vingelængde i programmet ImageJ (se 12,24,25,28). Hunnernes livstidsfrugtbarhed kan måles gennem daglige ægsamlinger på værtsplanter 25,69,70, og størrelsen af specifikke træk kan måles som en præstationsmåling; For eksempel massen eller volumenet af hjernen eller de enkelte hjerneområder 62,71,72 eller masse- eller proteinindholdet i brystkassen eller flyvemusklen 62,70. Endelig kan voksne bruges i adfærdsstudier til at teste et vilkårligt antal spørgsmål, der undersøger effekten af diætmanipulation på foder eller ovipositionsvalg27,73.

Hvis opdrætsprotokollen ikke fungerer som forventet, er der et par aspekter, der skal fejlløses. For det første kan man spørge, om lysniveauerne er høje nok til at fremkalde normal voksenadfærd. Mens laboratorietilpassede linjer af Pieris vil lægge æg under fluorescerende lys, er det eneste kunstige lys, der fungerer for vildtypelinjer, kraftige bredspektrede drivhuslys. Naturligt lys i drivhuse, vindueskarme eller udendørs fungerer bedst for at fremkalde parring og æglægningsadfærd. For det andet, hvis æg ikke klækkes, eller hvis larver dør tidligt i udviklingen, er der et par ting at overveje. Værtsplantematerialet skal være økologisk, idet det bemærkes, at "økologiske" planter fra butikker undertiden behandles med kemikalier, der kan dræbe larver, så det er ofte bedst at opdrætte ens egne værtsplanter. Hvis værtsacceptraten er lavere, kan yngre blade med højere kvælstofindhold forsøges, præsentere potteplanter i stedet for individuelle blade og sikre, at hunner parres. Kvinder accepterer såning af Brassica, selv små spirer, der er 2 uger gamle. Paraffinmetoden fungerer godt til at overføre æg til forskellige forhold, men det skal bemærkes, at acceptraten har tendens til at være lavere end hele planter. For det tredje skal alle komponenter i kosten være af høj kvalitet og ikke udløbet. Hørfrøolie bør udskiftes årligt og opbevares i køleskabet24,25. Hvedekim, vitaminblandingen og antibiotika bør også holdes kølige. For det fjerde kan man overveje at justere opsætningen af kostkoppen. Et vilkårligt antal engangsplastkoptyper kan bruges til opdræt, fra 1 oz til 15 oz. Vi har fundet ud af, at 4 oz er en god størrelse til at give mulighed for voksen fremkomst og pakker pænt ind i vores klimakamre. Huller, der stikkes i lågene, giver mulighed for luftstrøm, men for mange huller kan tørre kosten under forhold med lav luftfugtighed, så dette tal skal muligvis justeres. For det femte skal forholdene i klimakammeret muligvis justeres i kombination med kopforholdene. Hvis forholdene er for tørre, kan værtsplanter med æg tørre ud, før larver kan overføres, og kopper med kost kan tørre ud, før sommerfugle dukker op. På den anden side, hvis forholdene er for våde, kan kopperne rumme skimmel og sygdom. Forskere skal muligvis justere luftstrømmen i kopper ved hjælp af netlåg eller mere eller mindre huller i lågene. Et andet almindeligt problem er kammerlys, der er lyse nok til at forårsage temperatursvingninger i kopperne og opbygning af kondens; Brug af lysdæmpere er en nem mulighed for larveopdræt.

Med hensyn til forskningsspørgsmålene i dette papir fandt denne undersøgelse, at kålhvide var relativt mere følsomme over for kobber end nikkel eller zink. Kobber havde signifikant negativ indvirkning på udviklingstiden ved koncentrationer så lave som 50 ppm (figur 3 og tabel 3) og på overlevelse ved 500 ppm (figur 4, tabel 4). I modsætning hertil var der ingen negative virkninger af nikkel på overlevelsen (op til 500 ppm; Figur 3) eller negative virkninger på udviklingstiden ved 100 ppm (figur 4). Kålhvide var ret tolerante over for zink, med overlevelseseffekter set kun ved 1.000 ppm (figur 3) og negative virkninger på udviklingstid startende ved 100 ppm (figur 4). Baseret på de relativt større koncentrationer af zink i sommerfuglevæv og sennep (deres værtsplante; Figur 1), forventedes det, at der ville blive set en relativt større tolerance over for zink. Imidlertid var følsomheden over for kobber og tolerancen for nikkel noget uventet i betragtning af de meget lave niveauer af nikkel i sommerfuglevæv (figur 1) og nødvendigheden af kobber som mikronæringsstof. Disse uventede fund diskuteres nedenfor efter at have overvejet tolerancen for disse metaller i andre sommerfugle og møller.

For at sammenligne de nuværende data med metalfølsomhed målt i andre Lepidoptera blev der udarbejdet data fra eksisterende undersøgelser om minimumskoncentrationen, hvor tungmetaller negativt påvirkede overlevelsen 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; disse undersøgelser fokuserede på møl, især skadedyrsarter (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.). Alle de målte følsomhedsværdier i denne undersøgelse ligger tæt på det interval, der er målt for disse andre arter (figur 5). Imidlertid synes målet for nikkeltolerance i denne undersøgelse at være højere end forventet - mens der ikke var en signifikant effekt af overlevelse ved 500 ppm, fandt den tidligere undersøgelse af Pieris rapae også en meget høj tolerance for nikkel (signifikante virkninger startende ved 1.000 ppm56) på trods af lave niveauer i deres væv naturligt (figur 1). Målingen af kobberfølsomhed i denne undersøgelse synes også at være i den lave ende for undersøgelser af Lepidoptera. Mens brugen af en kunstig diæt tillader en bekvem og kontrolleret sammenligning af relativ metalfølsomhed, er det vigtigt at bemærke, at komponenter i kosten kan ændre målingen af absolut metalfølsomhed. For eksempel kan C-vitamin i kosten opveje metalinduceret oxidativt stress74, eller antibiotika i kosten kan ændre eventuelle virkninger af mikrober på behandlingen af metaller75. En interessant linje i fremtidig forskning ville være systematisk at manipulere sådanne diætkomponenter for at teste effekter på metaltoksicitet, især givet spørgsmål om den funktionelle rolle af lepidopteran tarmmikrober 76,77 og nektarkomponenter, der kan have antioxidantegenskaber78. Desuden kan variation i kostbehov på tværs af arter gøre interspecifikke sammenligninger udfordrende, og kunstige kostbaserede metoder bør suppleres med manipulationer af værtsplanter.

Disse sommerfugle er særligt tolerante over for nikkel og følsomme over for kobber. Tidligere forskning har bemærket, at mange planter i sennepsfamilien, som omfatter planter begunstiget af Pieridae, hyperakkumulerer nikkel som en defensiv mekanisme mod planteædere 55,56,63,79,80,81. Denne hyperakkumulering er over 1.000 ppm i plantevæv, hvilket er størrelsesordener større end hvad der ses i de fleste planter (figur 1). Det er muligt, at Pieris har en særlig høj tolerance for nikkel på grund af tidligere udvælgelse af sådanne nikkelakkumulatorer, som tidligere spekuleret26. Mens kobber er blevet mindre hyppigt undersøgt som et mikronæringsstof i insektdiet, er der nogle tegn på, at det spiller en lille rolle i reproduktion og immunitet, skønt primært i blodfødende insekter (f.eks. 82,83). Det er muligt, at kobber spiller en mindre vigtig fysiologisk rolle i sommerfugle end hos andre dyr 84,85,86, i overensstemmelse med nyere arbejde, der fremhæver, hvordan kobber kan være så bekymrende for et forurenende stof for insekter som bly, cadmium og kviksølv (f.eks. 87,88,89). Mens Pieris har vist sig at undgå kobberforurening ved lave niveauer90, har kobberets mobilitet i planter (f.eks. Flytning til blade og blomster) også markeret det som et metalforurenende stof af bekymring91.

Mens disse resultater giver interessante data om disse metallers relative toksicitet for kålhvide sommerfugle, sigter dette papir også mod at være til generel brug som en detaljeret visuel illustration af metoder til opdræt af dette kraftfulde system. Kålhvide er lette at opdrætte og manipulere i kontrollerede laboratorieeksperimenter 4,5, hvilket letter undersøgelser af værtssøgning 6,7,8, fouragering9,10,11 og seksuel selektion12,13,14. Evnen til at opdrætte disse sommerfugle på en kunstig diæt er nøglen til at skabe fælles haveforhold til sammenligninger og manipulere næringsstoffer, toksiner og endda nye værtsplanter. Det er dog vigtigt at bemærke, at denne kunstige diæt ikke nødvendigvis er den optimale kunstige diæt for denne art og sandsynligvis kan forbedres med fremtidige manipulationer. For eksempel blev saltblandingen i denne diæt (og andre lepidopteranske diæter) oprindeligt udviklet til hvirveldyr og har højere calciumniveauer end hvad de fleste insekter har brug for92,93. Således har nogle af vores opdrætsbestræbelser lavet brugerdefinerede saltblandinger med lavere calciumniveauer (f.eks. 62), og andre gør brug af "Becks saltblanding", hvilket kan være mere passende for mange insektarter94. I vores egne manipulationer fandt vi også, at sommerfugle klarede sig bedre med relativt mindre hvedekim og relativt mere cellulose sammenlignet med oprindelige koncentrationer4. Et område, der kræver yderligere opmærksomhed, er lipidkilden og koncentrationen i kosten. For eksempel har tidligere arbejde vist, at skift fra linolie (anvendt i denne undersøgelse) til fosfolipider øgede parringshastigheder og vækstrater for Pieris på kunstige kostvaner95. Tilskud af specifikke fedtsyrer i kunstige kostvaner kan have yderligere positive virkninger96,97. Optimering af den kunstige kost af Pieris98,99 skaber muligheder for at løse interessante spørgsmål om ernæringsøkologi 100,101,102, evolutionær økologi og økotoksikologi. Disse kunstige diætmetoder giver forskere mulighed for at behandle spørgsmål om specifikke lipiders rolle i kognitiv evolution 103, prætilpasning til toksiner28, kostkomponenter, der reducerer toksiciteten af forurenende stoffer 104 eller støkiometriske interaktioner mellem næringsstoffer105.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for støtten fra bachelorassistenter under opdragelsen til dette arbejde, især Regina Kurandina og Rhea Smykalski. Carolyn Kalinowski hjalp med at udarbejde litteratur om metaltoksicitet i andre Lepidoptera. Dette arbejde blev muliggjort af et sommerforskningsstipendium fra University of Minnesota Department of Ecology, Evolution and Behavior.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-L Pyrex beaker Fisher Scientific 07-250-059
500 mL graduated cylinder Fisher Scientific 03-007-43
60-mm plastic petri dish lid Fisher Scientific 08-757-100B
Ascorbic Acid Frontier 6015
Blender Amazon - Ninja Store BL610 Professional
Cabbage Flour Frontier 1086
Casein Frontier 1100
Celluose Frontier 3425
Cholsterol Sigma C3045
Cups for rearing (4 oz) Wasserstrom 6094583 purchase with matching lids
Fine Mesh Agar Sigma
Flaxseed Oil amazon B004R63VI6
Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch Amazon - Yimaa Direct B08BZ969DK
Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES) Amazon - Wizard Coin Supply B0045FG90G
Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6") Amazon B07SK6P94S
Methyl Paraben Frontier 7685
Ohaus Portable Scale Fisher Scientific 02-112-228
Organic Honey Amazon B07DHQQFGM
Photo studio portable lightbox Amazon B07T6TNYJ1
Plastic bin, shoebox size Amazon B09L3B3V1R
Plastic disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-680-50
Sorbic Acid Sigma S1626
Spatulas Fisher Scientific 14-357Q
Streptomycin Sigma S9137
Sucrose Target
Torula Yeast Frontier 1720
Vanderzant vitamin mix Frontier F8045
Weigh boats Fisher Scientific 01-549-750
Wesson Salt Mix Frontier F8680
Wheat Germ Frontier G1659
Wooden handled butterfly net, 12" hoop Amazon - Educational Science B00O5JDLVC
Yellow sponges Amazon-Celox B0B8HTHY5B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Snyder, L. D., Gomez, M. I., Mudrak, E. L., Power, A. G. Landscape-dependent effects of varietal mixtures on insect pest control and implications for farmer profits. Ecological Applications. 31 (2), 2246 (2021).
  2. Shelton, A., Andaloro, J. T., Barnards, J. Effects of cabbage looper, imported cabbageworm, and diamondback moth on fresh market and processing cabbage. Journal of Economic Entomology. 75 (4), 742-745 (1982).
  3. Cartea, M. E., Padilla, G., Vilar, M., Velasco, P. Incidence of the major Brassica pests in northwestern Spain. Journal of Economic Entomology. 102 (2), 767-773 (2009).
  4. Troetschler, R. G., Malone, C. M., Bucago, E. R., Johnston, M. R. System for rearing Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae) on a noncruciferous artificial diet developed for Manduca sexta (Lepidoptera: Sphingidae). Journal of Economic Entomology. 78 (6), 1521-1523 (1985).
  5. Webb, S., Shelton, A. Laboratory rearing of the imported cabbageworm. New Yorks Food and Life Sciences Bulletin. 122, 1-6 (1988).
  6. Root, R. B., Kareiva, P. M. The search for resources by cabbage butterflies (Pieris rapae): ecological consequences and adaptive significance of Markovian movements in a patchy environment. Ecology. 65 (1), 147-165 (1984).
  7. Hern, A., Edwards-Jones, G., McKinlay, R. G. A review of the pre-oviposition behaviour of the small cabbage white butterfly, Pieris rapae (Lepidoptera: Pieridae). Annals of Applied Biology. 128 (2), 349-371 (1996).
  8. Renwick, J. A. A., Radke, C. D. Sensory cues in host selection for oviposition by the cabbage butterfly, Pieris-Rapae. Journal of Insect Physiology. 34 (3), 251-257 (1988).
  9. Lewis, A. C. Memory constraints and flower choice in Pieris rapae. Science. 232 (4752), 863-865 (1986).
  10. Kandori, I., Ohsaki, N. The learning abilities of the white cabbage butterfly, Pieris rapae, foraging for flowers. Researches on Population Ecology. 38, 111-117 (1996).
  11. Alm, J., Ohmeiss, T. E., Lanza, J., Vriesenga, L. Preference of cabbage white butterflies and honey-bees for nectar that contains amino-acids. Oecologia. 84 (1), 53-57 (1990).
  12. Espeset, A., et al. Anthropogenic increases in nutrients alter sexual selection dynamics: a case study in butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 598-608 (2019).
  13. Tigreros, N. Linking nutrition and sexual selection across life stages in a model butterfly system. Functional Ecology. 27 (1), 145-154 (2013).
  14. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. In the eyes of the beholders: female choice and avian predation risk associated with an exaggerated male butterfly color. American Naturalist. 176 (6), 768-784 (2010).
  15. Stoehr, A. M., Goux, H. Seasonal phenotypic plasticity of wing melanisation in the cabbage white butterfly, Pieris rapae L. (Lepidoptera: Pieridae). Ecological Entomology. 33 (1), 137-143 (2008).
  16. Stoehr, A. M., Walker, J. F., Monteiro, A. Spalt expression and the development of melanic color patterns in pierid butterflies. Evodevo. 4 (1), 6 (2013).
  17. Stoehr, A. M., Wojan, E. M. Multiple cues influence multiple traits in the phenotypically plastic melanization of the cabbage white butterfly. Oecologia. 182 (3), 691-701 (2016).
  18. Ryan, S. F., et al. Global invasion history of the agricultural pest butterfly Pieris rapae revealed with genomics and citizen science. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (40), 20015-20024 (2019).
  19. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R. Patterns of phenotypic plasticity in common and rare environments: a study of host use and color learning in the cabbage white butterfly Pieris rapae. American Naturalist. 173 (5), 615-631 (2009).
  20. Kono, Y. Rearing Pieris rapae crucivora Boisduval (Lepidoptera: Pieridae) on artificial diets. Applied Entomology and Zoology. 3 (2), 96-98 (1968).
  21. Parra, J. R. The Evolution of Artificial Diets and their Interactions in Science and Technology. Insect Bioecology and Nutrition for Integrated Pest Management. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2012).
  22. Morehouse, N. I., Rutowski, R. L. Developmental responses to variable diet composition in a butterfly: the role of nitrogen, carbohydrates and genotype. Oikos. 119 (4), 636-645 (2010).
  23. Rotem, K., Agrawal, A. A., Kott, L. Parental effects in Pieris rapae in response to variation in food quality: adaptive plasticity across generations. Ecological Entomology. 28 (2), 211-218 (2003).
  24. Shephard, A. M., et al. Assessing zinc tolerance in two butterfly species: consequences for conservation in polluted environments. Insect Conservation and Diversity. 13 (2), 201-210 (2020).
  25. Shephard, A. M., Zambre, A. M., Snell-Rood, E. C. Evaluating costs of heavy metal tolerance in a widely distributed, invasive butterfly. Evolutionary Applications. 14 (5), 1390-1402 (2021).
  26. Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Nickel exposure has complex transgenerational effects in a butterfly. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 1008-1017 (2018).
  27. Philips, K. H., Kobiela, M. E., Snell-Rood, E. C. Developmental lead exposure has mixed effects on butterfly cognitive processes. Animal Cognition. 20 (1), 87-96 (2017).
  28. Sikkink, K. L., et al. Tolerance of novel toxins through generalized mechanism simulating gradual host shifts of butterflies. American Naturalist. 195 (3), 485-503 (2020).
  29. Pentzold, S., et al. excretion and avoidance of cyanogenic glucosides in insects with different feeding specialisations. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 66, 119-128 (2015).
  30. Lampert, E. C., Dyer, L. A., Bowers, M. D. Dietary specialization and the effects of plant species on potential multitrophic interactions of three species of nymphaline caterpillars. Entomologia Experimentalis et Applicata. 153 (3), 207-216 (2014).
  31. Genc, H., Nation, J. L. An artificial diet for the butterfly Phyciodes phaon (Lepidoptera: Nymphalidae). Florida Entomologist. 87 (2), 194-198 (2004).
  32. Brinton, F., Proverbs, M., Carty, B. Artificial diet for mass production of the codling moth, Carpocapsa Pomonella (Lepidoptera: Olethreutidae)1. The Canadian Entomologist. 101 (6), 577-584 (1969).
  33. Metwally, H. M., et al. Low cost artificial diet for rearing the greater wax moth, Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) as a host for entomopathogenic nematodes. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 22 (1), 15 (2012).
  34. Carpenter, J. E., Bloem, S. Interaction between insect strain and artificial diet in diamondback moth development and reproduction. Entomologia Experimentalis et Applicata. 102 (3), 283-294 (2002).
  35. Jaiswal, A., Verma, A., Jaiswal, P. Detrimental effects of heavy metals in soil, plants, and aquatic ecosystems and in humans. Journal of Environmental Pathology Toxicology and Oncology. 37 (3), 183-197 (2018).
  36. Kumar, A., et al. Lead toxicity: Health hazards, influence on food chain, and sustainable remediation approaches. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (7), 2179 (2020).
  37. Gall, J. E., Boyd, R. S., Rajakaruna, N. Transfer of heavy metals through terrestrial food webs: a review. Environmental Monitoring and Assessment. 187, 201 (2015).
  38. Mohammed, A. S., Kapri, A., Goel, R. Heavy Metal Pollution: Source, Impact, and Remedies. Biomanagement of Metal-Contaminated Soils. , Springer. 1-28 (2011).
  39. Mitra, A., Chatterjee, S., Voronina, A. V., Walther, C., Gupta, D. K. Lead toxicity in plants: a review. Lead in Plants and the Environment. , Springer. 99-116 (2020).
  40. Perugini, M., et al. Heavy metal (Hg, Cr, Cd, and Pb) contamination in urban areas and wildlife reserves: Honeybees as bioindicators. Biological Trace Element Research. 140 (2), 170-176 (2011).
  41. Rycewicz-Borecki, M., McLean, J. E., Dupont, R. R. Bioaccumulation of copper, lead, and zinc in six macrophyte species grown in simulated stormwater bioretention systems. Journal of Environmental Management. 166, 267-275 (2016).
  42. Zulfiqar, U., et al. Lead toxicity in plants: Impacts and remediation. Journal of Environmental Management. 250, 109557 (2019).
  43. Spliethoff, H. M., et al. Estimated lead (Pb) exposures for a population of urban community gardeners. Environmental Geochemistry and Health. 38, 955-971 (2016).
  44. Li, C. C., et al. Foliar dust as a reliable environmental monitor of heavy metal pollution in comparison to plant leaves and soil in urban areas. Chemosphere. 287, 132341 (2022).
  45. Ram, S. S., et al. Plant canopies: bio-monitor and trap for re-suspended dust particulates contaminated with heavy metals. Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change. 19, 499-508 (2014).
  46. Karri, V., Schuhmacher, M., Kumar, V. Heavy metals (Pb, Cd, As and MeHg) as risk factors for cognitive dysfunction: A general review of metal mixture mechanism in brain. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 203-213 (2016).
  47. Tong, S., von Schirnding, Y. E., Prapamontol, T. Environmental lead exposure: a public health problem of global dimensions. Bulletin of the World Health Organization. 78 (9), 1068-1077 (2000).
  48. Liu, J. H., Lewis, G. Environmental toxicity and poor cognitive outcomes in children and adults. Journal of Environmental Health. 76 (6), 130-138 (2014).
  49. Gintenreiter, S., Ortel, J., Nopp, H. J. Effects of different dietary levels of cadmium, lead, copper, and zinc on the vitality of the forest pest insect Lymantria-Dispar L (Lymantriidae, Lepid). Archives of Environmental Contamination and Toxicology. 25, 62-66 (1993).
  50. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. Testing the joint effects hypothesis of elemental defense using Spodoptera exigua. Journal of Chemical Ecology. 41 (2), 168-177 (2015).
  51. Coleman, C. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Extending the elemental defense hypothesis: Dietary metal concentrations below hyperaccumulator levels could harm herbivores. Journal of Chemical Ecology. 31 (8), 1669-1681 (2005).
  52. Kaushal, S. S., et al. Making 'chemical cocktails'-Evolution of urban geochemical processes across the periodic table of elements. Applied Geochemistry. 119, 104632 (2020).
  53. Shephard, A. M., et al. Traffic patterns, more than adjacent land use, influence element content of roadside forbs for insect pollinators. Ecological Solutions and Evidence. 3 (4), 12195 (2022).
  54. Scott, J. A. The Butterflies of North America: A Natural History and Field Guide. , Stanford University Press. (1992).
  55. Boyd, R. S. High-nickel insects and nickel hyperaccumulator plants: A review. Insect Science. 16 (1), 19-31 (2009).
  56. Boyd, R. S., Martens, S. N. Nickel hyperaccumulated by thlaspi-montanum var montanum is acutely toxic to an insect herbivore. Oikos. 70 (1), 21-25 (1994).
  57. Cempel, M., Nickel, G. A review of its sources and environmental toxicology. Polish Journal of Environmental Studies. 15 (3), 375-382 (2006).
  58. Aslam, J., Khan, S. A., Khan, S. H. Heavy metals contamination in roadside soil near different traffic signals in Dubai, United Arab Emirates. Journal of Saudi Chemical Society. 17 (3), 315-319 (2013).
  59. Mitchell, T. S., et al. Traffic influences nutritional quality of roadside plants for monarch caterpillars. Science of the Total Environment. 724, 138045 (2020).
  60. Voegborlo, R., Chirgawi, M. Heavy metals accumulation in roadside soil and vegetation along a major highway in Libya. Journal of Science and Technology. 27 (3), 86-97 (2007).
  61. Snell-Rood, E., Kobiela, M. Data for: Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. , Mendeley Data. (2023).
  62. Snell-Rood, E. C., Espeset, A., Boser, C. J., White, W. A., Smykalski, R. Anthropogenic changes in sodium affect neural and muscle development in butterflies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10221-10226 (2014).
  63. Boyd, R. S., Moar, W. J. The defensive function of Ni in plants: response of the polyphagous herbivore Spodoptera exigua (Lepidoptera: Noctuidae) to hyperaccumulator and accumulator species of Streptanthus (Brassicaceae). Oecologia. 118 (2), 218-224 (1999).
  64. Cheruiyot, D. J., Boyd, R. S., Moar, W. J. Exploring lower limits of plant elemental defense by cobalt, copper, nickel, and zinc. Journal of Chemical Ecology. 39 (5), 666-674 (2013).
  65. Davis, M. A., Boyd, R. S., Cane, J. H. Host-switching does not circumvent the Ni-based defence of the Ni hyperaccumulator Streptanthus polygaloides (Brassicaceae). South African Journal of Science. 97 (11-12), 554-557 (2001).
  66. Dubovskiy, I. M., Grizanova, E. V., Ershova, N. S., Rantala, M. J., Glupov, V. V. The effects of dietary nickel on the detoxification enzymes, innate immunity and resistance to the fungus Beauveria bassiana in the larvae of the greater wax moth Galleria mellonella. Chemosphere. 85 (1), 92-96 (2011).
  67. Jhee, E. M., Boyd, R. S., Eubanks, M. D. Nickel hyperaccumulation as an elemental defense of Streptanthus polygaloides (Brassicaceae): influence of herbivore feeding mode. New Phytologist. 168 (2), 331-343 (2005).
  68. Zhou, J. L., Shu, Y. H., Zhang, G. R., Zhou, Q. Lead exposure improves the tolerance of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae) to cypermethrin. Chemosphere. 88 (4), 507-513 (2012).
  69. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Reproductive tradeoffs of learning in a butterfly. Behavioral Ecology. 22 (2), 291-302 (2011).
  70. Snell-Rood, E. C., Davidowitz, G., Papaj, D. R. Plasticity in learning causes immediate and trans-generational changes in allocation of resources. Integrative and Comparative Biology. 53 (2), 329-339 (2013).
  71. Snell-Rood, E. C., Papaj, D. R., Brain Gronenberg, W. size: A global or induced cost of learning. Brain Behavior and Evolution. 73 (2), 111-128 (2009).
  72. Snell-Rood, E. C., et al. Nutritional constraints on brain evolution: Sodium and nitrogen limit brain size. Evolution. 74 (10), 2304-2319 (2020).
  73. Jaumann, S., Snell-Rood, E. C. Adult nutritional stress decreases oviposition choosiness and fecundity in female butterflies. Behavioral Ecology. 30 (3), 852-863 (2019).
  74. Sahiti, H., Bislimi, K., Bajgora, A., Rexhepi, A., Dalo, E. Protective effect of vitamin C against oxidative stress in common carp (Cyprinus carpio) induced by heavy metals. International Journal of Agriculture and Biosciences. 7 (2), 71-75 (2018).
  75. Rothman, J. A., Leger, L., Graystock, P., Russell, K., McFrederick, Q. S. The bumble bee microbiome increases survival of bees exposed to selenate toxicity. Environmental Microbiology. 21 (9), 3417-3429 (2019).
  76. Hammer, T. J., Janzen, D. H., Hallwachs, W., Jaffe, S. P., Fierer, N. Caterpillars lack a resident gut microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (36), 9641-9646 (2017).
  77. Hammer, T. J., Sanders, J. G., Fierer, N. Not all animals need a microbiome. FEMS Microbiology Letters. 366 (10), (2019).
  78. Baker, H. G., Baker, I. Coevolution of Animals and Plants. , University of Texas Press. 100-140 (1975).
  79. Boyd, R. S., Davis, M. A., Wall, M. A., Balkwill, K. Metal concentrations of insects associated with the South African Ni hyperaccumulator Berkheya coddii (Asteraceae). Insect Science. 13 (2), 85-102 (2006).
  80. Boyd, R. S., Wall, M. A., Jaffre, T. Nickel levels in arthropods associated with Ni hyperaccumulator plants from an ultramafic site in New Caledonia. Insect Science. 13 (4), 271-277 (2006).
  81. Kramer, U. Metal hyperaccumulation in plants. Annual Review of Plant Biology. 61, 517-534 (2010).
  82. Cardoso-Jaime, V., Broderick, N. A., Maya-Maldonado, K. Metal ions in insect reproduction: a crosstalk between reproductive physiology and immunity. Current Opinion in Insect Science. 52, 100924 (2022).
  83. Rivera-Perez, C., Clifton, M. E., Noriega, F. G. How micronutrients influence the physiology of mosquitoes. Current Opinion in Insect Science. 23, 112-117 (2017).
  84. Lee, J. H. Micronutrient deficiency syndrome: zinc, copper and selenium. Pediatric Gastroenterology, Hepatology & Nutrition. 15 (3), 145-150 (2012).
  85. Nube, M., Voortman, R. L. Human micronutrient deficiencies: linkages with micronutrient deficiencies in soils, crops and animal nutrition. Combating Micronutrient Deficiencies: Food-Based Approaches. , CABI International. Wallingford, UK. 289-311 (2011).
  86. Wysocka, D., Snarska, A., Sobiech, P. Copper-An essential micronutrient for calves and adult cattle. Journal of Elementology. 24 (1), 101-110 (2019).
  87. Oliveira, C. S., et al. Toxic metals that interact with thiol groups and alteration in insect behavior. Current Opinion in Insect Science. 52, 100923 (2022).
  88. Mogren, C. L., Trumble, J. T. The impacts of metals and metalloids on insect behavior. Entomologia Experimentalis et Applicata. 135 (1), 1-17 (2010).
  89. Hladun, K. R., Di, N., Liu, T. X., Trumble, J. T. Metal contaminant accumulation in the hive: Consequences for whole-colony health and brood production in the honey bee (Apis mellifera L.). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (2), 322-329 (2016).
  90. Elbassiouny, S. A. Changes in food-related behavioral-patterns of some phytophagous insect species following exposures to an antifeedant. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica. 26 (3-4), 483-496 (1991).
  91. Hladun, K. R., Parker, D. R., Trumble, J. T. Cadmium, copper, and lead accumulation and bioconcentration in the vegetative and reproductive organs of Raphanus sativus: Implications for plant performance and pollination. Journal of Chemical Ecology. 41, 386-395 (2015).
  92. Nation, J., Robinson, F. Concentration of some major and trace elements in honeybees, royal jelly and pollens, determined by atomic absorption spectrophotometry. Journal of Apicultural Research. 10 (1), 35-43 (1971).
  93. Herbert Jr, E. W., Shimanuki, H. Mineral requirements for brood-rearing by honeybees fed a synthetic diet. Journal of Apicultural Research. 17 (3), 118-122 (1978).
  94. Beck, S. D., Chippendale, G., Swinton, D. Nutrition of the European corn borer, Ostrinia nubilalis. VI. A larval rearing medium without crude plant fractions. Annals of the Entomological Society of America. 61 (2), 459-462 (1968).
  95. Junnikkala, E. Rearing Pieris-Brassicae (L.) on a phospholipid and vitamin-supplemented semi-artificial diet. Annales Zoologici Fennici. 17 (1), 39-42 (1980).
  96. Hixson, S. M., et al. Long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids have developmental effects on the crop pest, the Cabbage White Butterfly Pieris rapae. PLoS One. 11 (3), e0152264 (2016).
  97. Turunen, S. Lipid utilization in adult Pieris brassicae with special reference to the role of linolenic acid. Journal of Insect Physiology. 20 (7), 1257-1269 (1974).
  98. Vanderzant, E. S. Development, significance, and application of artificial diets for insects. Annual Review of Entomology. 19, 139-160 (1974).
  99. Cohen, A. C. Insect Diets: Science and Technology. , CRC Press. (2003).
  100. Balluffi-Fry, J., Leroux, S. J., Champagne, E., Vander Wal, E. In defense of elemental currencies: can ecological stoichiometry stand as a framework for terrestrial herbivore nutritional ecology. Oecologia. 199 (1), 27-38 (2022).
  101. Coogan, S. C. P., Raubenheimer, D., Zantis, S. P., Machovsky-Capuska, G. E. Multidimensional nutritional ecology and urban birds. Ecosphere. 9 (4), 02177 (2018).
  102. Raubenheimer, D., Simpson, S. J., Mayntz, D. Nutrition, ecology and nutritional ecology: toward an integrated framework. Functional Ecology. 23 (1), 4-16 (2009).
  103. Arien, Y., Dag, A., Zarchin, S., Masci, T., Shafir, S. Omega-3 deficiency impairs honey bee learning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (51), 15761-15766 (2015).
  104. Man, K. Y., et al. Use of biochar as feed supplements for animal farming. Critical Reviews in Environmental Science and Technology. 51 (2), 187-217 (2021).
  105. Shephard, A. M., Knudsen, K., Snell-Rood, E. C. Anthropogenic sodium influences butterfly responses to nitrogen-enriched resources: implications for the nitrogen limitation hypothesis. Oecologia. 201 (4), 941-952 (2023).

Tags

Biologi nr. 198
Opdræt af kålhvid sommerfugl (<em>Pieris rapae</em>) under kontrollerede forhold: Et casestudie med tungmetaltolerance
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E.… More

Snell-Rood, E. C., Kobiela, M. E. Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance. J. Vis. Exp. (198), e65383, doi:10.3791/65383 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter