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Bioengineering

Mise en place simple d’une niche de moelle osseuse ostéogénique vascularisée à l’aide d’hydrogels de poly(éthylène glycol) (PEG) préfabriqués dans une microplaque d’imagerie

Published: May 19, 2023 doi: 10.3791/65413
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Obstetrics, University Hospital Zurich, University of Zurich, 2Ectica Technologies AG

Summary

Un modèle in vitro de la niche vasculaire de la moelle osseuse est établi en ensemençant des cellules mésenchymateuses et endothéliales sur des hydrogels PEG 3D préfabriqués. Les réseaux endothéliaux, les composants ECM et l’activité ALP des niches varient en fonction du facteur de croissance utilisé. La plateforme peut être utilisée pour des modèles avancés de cancer.

Abstract

L’os et la moelle osseuse sont des organes hautement vascularisés et structurellement complexes, et sont des sites de cancer et de formation de métastases. Des modèles in vitro récapitulant les fonctions spécifiques aux os et à la moelle osseuse, y compris la vascularisation, compatibles avec le dépistage de médicaments sont hautement souhaitables. De tels modèles peuvent combler le fossé entre les modèles in vitro bidimensionnels (2D) simplistes et structurellement non pertinents et les modèles in vivo plus coûteux et éthiquement difficiles. Cet article décrit un test de co-culture tridimensionnel (3D) contrôlable basé sur des matrices de poly(éthylène glycol) (PEG) techniques pour la génération de niches de moelle osseuse ostéogéniques vascularisées. La conception de la matrice PEG permet le développement de cultures cellulaires 3D grâce à une simple étape d’ensemencement cellulaire ne nécessitant aucune encapsulation, permettant ainsi le développement de systèmes de co-culture complexes. De plus, les matrices sont transparentes et préfabriquées sur des plaques d’imagerie à fond de verre à 96 puits, ce qui rend le système adapté à la microscopie. Pour le test décrit ici, les cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine (hBM-MSCs) sont d’abord cultivées jusqu’à ce qu’un réseau cellulaire 3D suffisamment développé soit formé. Par la suite, des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine exprimant la GFP (HUVEC) sont ajoutées. Le développement de la culture est suivi d’une microscopie à fond clair et d’une microscopie à fluorescence. La présence du réseau hBM-MSC favorise la formation de structures vasculaires qui, autrement, ne se formeraient pas et qui restent stables pendant au moins 7 jours. L’étendue de la formation de réseaux de type vasculaire peut facilement être quantifiée. Ce modèle peut être adapté à une niche ostéogénique de moelle osseuse en complétant le milieu de culture avec la protéine morphogénétique osseuse 2 (BMP-2), qui favorise la différenciation ostéogénique des hBM-MSC, évaluée par une activité accrue de la phosphatase alcaline (PA) au jour 4 et au jour 7 de la co-culture. Ce modèle cellulaire peut être utilisé comme plate-forme pour cultiver diverses cellules cancéreuses et étudier comment elles interagissent avec les niches vasculaires spécifiques aux os et à la moelle osseuse. De plus, il convient à l’automatisation et aux analyses à haut contenu, ce qui signifie qu’il permettrait le dépistage de médicaments anticancéreux dans des conditions de culture hautement reproductibles.

Introduction

L’os et la moelle osseuse sont des organes structurellement et fonctionnellement complexes essentiels à la santé humaine. Cela se traduit par l’existence de niches distinctes qui régulent l’hématopoïèse et le maintien osseux1. Il est maintenant largement admis que dans la moelle osseuse saine, le maintien et l’expansion des cellules souches hématopoïétiques et squelettiques, ainsi que leur progéniture, sont contrôlés par des niches distinctes. Ces niches comprennent divers types de cellules, notamment les cellules ostéolignées, les cellules souches mésenchymateuses, les cellules endothéliales et périvasculaires, les cellules neuronales et gliales, les adipocytes, les ostéoclastes, les macrophages et les neutrophiles2. Sans surprise, ces niches principalement associées au système vasculaire sont également impliquées dans le développement de divers types de leucémie3 et sont le site de métastases pour différents cancers4. En raison de ses rôles spécifiques dans la formation osseuse, le remodelage et l’entretien osseux (moelle), le système vasculaire associé aux os a des structures spécialisées distinctes différentes du système vasculaire trouvé ailleurs dans le corps 5,6,7. Ainsi, les médicaments anti-angiogéniques ou modulateurs vasculaires appliqués par voie systémique peuvent avoir des effets différents dans ces environnements spécialisés8. Par conséquent, des modèles permettant d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans le maintien des propriétés physiologiques des os et de la moelle osseuse, la régénération osseuse et la régénération de la moelle osseuse et les réponses aux traitements thérapeutiques sont hautement souhaitables.

Les cultures tissulaires bidimensionnelles classiques (2D) et les études in vivo utilisant des modèles animaux ont fourni des informations précieuses sur les rôles des différentes cellules et acteurs moléculaires impliqués dans le développement de l’os et de la moelle osseuse 9,10. Les modèles qui permettent des expériences à haut débit avec des cellules humaines pertinentes pourraient améliorer notre compréhension de la façon de moduler certains paramètres dans ces systèmes très complexes.

Au cours de la dernière décennie, des principes dérivés de l’ingénierie tissulaire ont été utilisés pour générer des modèles tissulaires 3D11,12. Ceux-ci se sont principalement appuyés sur l’encapsulation de cellules pertinentes pour les tissus dans des biomatériaux pour établir des mono- ou co-cultures 3D13. Parmi les biomatériaux les plus utilisés figurent la fibrine 14, le collagène 15 et le Matrigel16,17, qui sont tous hautement biocompatibles et offrent des conditions appropriées pour la croissance de nombreux types de cellules. Ces biomatériaux ont la capacité de générer des modèles in vitro qui récapitulent des aspects clés des différentes niches vasculaires trouvées in vivo18. De plus, l’utilisation de dispositifs microfluidiques pour générer des modèles vasculaires perfusés d’os et de moelle osseuse a contribué à la génération de modèles in vitro de plus grande complexité 19,20,21,22.

La difficulté de contrôler la composition et d’ingénierie des propriétés des biomatériaux naturels a inspiré le développement d’analogues synthétiques qui peuvent être rationnellement conçus avec des propriétés physiques, chimiques et biologiques prévisibles23,24. Nous avons développé des hydrogels à base de poly(éthylène glycol) (PEG) entièrement synthétique à base de facteur XIII (FXIII), qui sont fonctionnalisés avec des peptides RGD et des sites de clivage de la métalloprotéase matricielle (MMP) pour faciliter la fixation cellulaire et le remodelage25,26. La conception modulaire de ces biomatériaux a été utilisée avec succès pour optimiser les conditions de formation de modèles d’os et de moelle osseuse vascularisés en 3D27,28.

Pour tester un plus grand nombre de conditions de culture différentes et de nouveaux traitements, des modèles avec une capacité de débit plus élevée sont nécessaires. Nous avons récemment montré que la réticulation FXIII de notre hydrogel PEG peut être contrôlée par un processus électrochimique tel qu’un gradient de rigidité d’hydrogel en profondeur est formé29. Lorsque des cellules sont ajoutées au-dessus de ces hydrogels, elles migrent vers l’intérieur et se développent progressivement en réseaux cellulaires 3D hautement interconnectés30. L’élimination de la nécessité d’encapsuler des cellules dans l’hydrogel, qui est généralement présent avec d’autres échafaudages 3D, simplifie non seulement la conception expérimentale, mais permet également l’ajout séquentiel de différents types de cellules à différents moments pour générer des systèmes de co-culture complexes. Ces hydrogels sont disponibles préfabriqués sur des plaques d’imagerie à fond de verre à 96 puits, ce qui rend l’établissement de cultures 3D réalisable par des protocoles d’ensemencement cellulaire manuels et automatisés. La transparence optique des hydrogels PEG rend la plateforme compatible avec la microscopie.

Nous présentons ici une méthode simple pour la génération et la caractérisation de niches ostéogéniques vascularisées au sein de cette plateforme plug-and-play synthétique prête à l’emploi. Nous montrons que le développement des réseaux vasculaires peut être stimulé avec un facteur de croissance couramment utilisé pour induire l’ostéogenèse in vitro, la protéine morphogénétique osseuse-2 (BMP-2), tandis que la différenciation ostéogénique peut être évitée par la supplémentation en facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF-2)27,31. Les réseaux formés sont différents par rapport aux réseaux stimulés par FGF-2 en termes d’apparence générale, ainsi que de distribution cellulaire et ECM. De plus, nous avons surveillé l’induction ostéogénique en utilisant la phosphatase alcaline comme marqueur. Nous démontrons l’expression accrue de ce marqueur au fil du temps et comparons l’expression à celle des réseaux stimulés par FGF-2 en utilisant des méthodes qualitatives et quantitatives. Enfin, nous démontrons la pertinence des niches générées de ce modèle pour deux applications potentielles. Tout d’abord, nous avons effectué un test de sensibilité aux médicaments de preuve de concept en ajoutant du bévacizumab à des niches préformées et en surveillant la dégradation des réseaux vasculaires en sa présence. Deuxièmement, nous avons ajouté des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et d’ostéosarcome U2OS à des niches ostéogéniques préformées, montrant que les niches peuvent être utilisées pour étudier les interactions entre les cellules cancéreuses et leur environnement.

Protocol

La figure 1 résume les sections de protocole suivantes.

1. Établir la monoculture stromale 3D

  1. Préparez la suspension cellulaire hBM-MSC.
    1. Cultiver des CSM-hBM à un niveau de confluence de 70 % à 90 % dans les MEMα additionnés de 10 % de FBS, de 1 % de pénicilline-streptomycine et de 5 ng/mL de FGF-2 dans un incubateur à 37 °C et de 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée. Les cellules peuvent être utilisées jusqu’au passage 6.
    2. Lavez les cellules avec du PBS et détachez-les en utilisant 0,05% de trypsine-EDTA pendant 3-5 min à 37 °C. Arrêter le processus de détachement en rinçant avec un milieu basal (MEMα complété par 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine). Recueillir les cellules en suspension dans un tube à centrifuger conique de 50 mL.
    3. Comptez les cellules à l’aide d’un hématocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé et déterminez le nombre total de cellules dans la suspension.
    4. Enduire les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min. Retirez délicatement le surnageant.
    5. Resuspendre les cellules dans un volume approprié de milieu basal pour atteindre une concentration de 1 x 107 cellules/mL de solution mère.
    6. Préparer des tubes à centrifuger coniques de 50 mL contenant le volume requis de milieu basal complété par les facteurs de croissance respectifs (FGF-2 et BMP-2 à des concentrations définies, p. ex. 0 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL ou 200 ng/mL). Par puits, 200 μL sont nécessaires. Si l’ensemencement cellulaire doit être effectué à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé, tenez également compte du volume mort de l’instrument. Pour l’ensemencement cellulaire manuel, un excès de volume de 10% est suffisant.
    7. Ajouter les CSM-hBM de la solution mère à une dilution de 1:66,67 pour obtenir une concentration de 1,5 x 105 cellules/mL.
  2. Préparez l’assiette pour l’ensemencement.
    1. Retirez le film adhésif en polypropylène recouvrant la plaque d’hydrogel à 96 puits.
    2. Aspirer soigneusement le tampon de stockage recouvrant les hydrogels. Pour cette tâche, utilisez une laveuse de microplaques; Cependant, la manutention manuelle est possible.
      1. Lorsque vous utilisez un aspirateur manuel ou une pipette multicanal, placez l’embout contre la paroi du puits et descendez lentement vers le bord du puits intérieur tout en aspirant le tampon. Cela évitera d’endommager la surface de l’hydrogel.
      2. Lors de l’utilisation d’une laveuse de plaques automatisée, placez les buses d’aspiration à au moins 3,8 mm du support de plaque (cela correspond à 0,8 mm de la bague intérieure de la plaque d’hydrogel) et vers le bord du puits. Reportez-vous au manuel du fabricant pour obtenir des instructions plus détaillées et pour obtenir les dessins de plaque de la plaque d’hydrogel à 96 puits.
  3. Ajouter 200 μL/puits de la suspension cellulaire préparée à l’étape 1.1.7 après avoir bien mélangé pour assurer une répartition homogène des cellules. Pendant l’ensemencement, pour éviter une sédimentation inégale des cellules dans une région du substrat, ne pas incliner la plaque. Pour l’ensemencement manuel, mélanger périodiquement la suspension cellulaire (après avoir ensemencé trois puits) pour garder le mélange homogène. Pour l’ensemencement automatisé, mélanger avec une pipette sérologique immédiatement avant la distribution afin de distribuer des volumes contenant un nombre égal de cellules.
  4. Maintenir les cultures à 37 °C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée.
  5. Surveiller le développement des cultures par microscopie à fond clair avec un objectif 5x comme souhaité. Acquérir des images de référence environ 30 minutes après l’ensemencement pour évaluer le nombre de cellules ajoutées.

2. Mise en place de la co-culture 3D de cellules stromo-endothéliales

  1. Préparer la suspension cellulaire GFP-HUVEC.
    1. Préparer les fioles pour la culture HUVEC en les enrobant d’une solution composée de 150 μg/mL de collagène I à queue de rat dans de l’acide acétique 0,02 M pendant 30 min à 37 °C. Rincer une fois avec du PBS avant utilisation.
    2. Cultiver les GFP-HUVECs à un niveau de confluence de 80% à 100% dans EGM-2 complété par 10% FBS dans un incubateur à 37 °C et 5% CO2 dans une atmosphère humidifiée. Les cellules peuvent être utilisées jusqu’au passage 7.
    3. Laver les cellules avec du PBS et les détacher en utilisant 0,05% de trypsine-EDTA pendant 2-3 min à 37 °C. Arrêter le processus de détachement en rinçant avec un milieu basal (MEMα complété par 10% FBS et 1% pénicilline-streptomycine). Recueillir les cellules en suspension dans un tube à centrifuger conique de 50 mL.
    4. Compter les cellules à l’aide d’un hématocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé et déterminer le nombre total de cellules présentes dans la suspension.
    5. Enduire les cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min. Retirez délicatement le surnageant.
    6. Resuspendre les cellules dans un volume approprié de milieu basal pour atteindre une concentration de 1 x 107 cellules/mL de solution mère.
    7. Préparer des tubes à centrifuger coniques de 50 mL contenant le volume requis de milieu basal complété par les facteurs de croissance respectifs (FGF-2 et BMP-2 à des concentrations définies, p. ex. 0 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL, 100 ng/mL ou 200 ng/mL) comme décrit pour les CSM-hBM à l’étape 1.1.6.
    8. Ajouter les GFP-HUVECs de la solution mère à une dilution de 1:66,67 pour obtenir une concentration de 1,5 x 105 cellules/mL, comme décrit pour les CSM-hBM à l’étape 1.1.7.
  2. Aspirer le milieu de la plaque contenant la monoculture stromale, comme décrit pour l’élimination du tampon à l’étape 1.2.2.
  3. Ajouter 200 μL/puits de la suspension cellulaire GFP-HUVEC préparée à l’étape 2.1.8 comme décrit pour l’addition hBM-MSC à l’étape 1.3.
  4. Incuber à 37 °C et 5% de CO2 en atmosphère humidifiée. Changez le milieu tous les 3-4 jours.
  5. Surveiller le développement de la culture par microscopie à fond clair et à fluorescence en utilisant un objectif 5x comme souhaité. Maintenir les cultures jusqu’au jour 4 ou au jour 7 de la co-culture pour les caractérisations précoces ou intermédiaires, respectivement, ou selon les besoins.

3. Procédure de caractérisation 1 : Quantifier la formation du réseau de cellules endothéliales

  1. Aux points temporels souhaités, acquérir le signal GFP des GFP-HUVECs avec la microscopie à fluorescence en utilisant des paramètres appropriés pour la quantification (c.-à-d. meilleure mise au point, contraste élevé et faible grossissement [par exemple, 5x] pour des champs de vision plus grands).
  2. Prétraiter également toutes les images acquises le même jour (par exemple, en utilisant Fiji32) pour améliorer encore le contraste. Notez que le signal GFP peut devenir plus faible avec le temps de culture; Par conséquent, les images acquises à des jours différents peuvent nécessiter un traitement différent.
    1. Si vous utilisez Fiji ou ImageJ, ouvrez toutes les images de canal GFP du même point temporel et ouvrez le menu Luminosité et contraste . Sélectionnez une image qui représente une condition intermédiaire (pas le signal le plus sombre ni le signal le plus lumineux) et réglez automatiquement le contraste en sélectionnant Auto. Sélectionnez Définir, puis cochez Propager à toutes les autres images ouvertes.
    2. Évaluez visuellement si la plage sélectionnée automatiquement correspond à toutes les images du point de temps actuel, puis réajustez et repropagez manuellement à toutes les images si nécessaire.
    3. Enregistrez les images ajustées en tant que fichiers TIF et répétez les étapes 3.2.1 et 3.2.2 pour les autres points de temps acquis.
  3. Appliquez un filtre de flou médian (par exemple, rayon 3 pour les images 2048x2048) à toutes les images pour éviter la reconnaissance d’artefacts en aval et, ainsi, faciliter l’identification précise du réseau. Réduisez la taille en classant (2x2) et enregistrez toutes les images prétraitées en tant que fichiers TIF couleur RVB en niveaux de gris dans un dossier pour la quantification. Ces étapes peuvent être effectuées manuellement ou en mode batch à l’aide de macros que les auteurs partageront sur demande.
  4. Analysez toutes les images du dossier créé aux étapes 3.1 à 3.3 à l’aide du mode Traitement par lots de l’analyseur d’angiogenèse pour ImageJ33. Notez qu’en fonction de la taille des images et de la mémoire de travail disponible, cela peut prendre quelques minutes par image.
  5. Valider les résultats de quantification en examinant les superpositions des structures reconnues et des images originales. Si l’algorithme reconnaît des structures artificielles, où seules quelques cellules ou aucune cellule ne peuvent être vues dans l’image originale, ajustez les paramètres de prétraitement et réanalysez les images originales, ou excluez ces zones problématiques et / ou répliquez les images de l’analyse.
  6. Normaliser les valeurs obtenues à une surface de 1 mm2 en multipliant les valeurs de chaque échantillon par le rapport de la surface analysée à 1mm2. Cette étape est particulièrement importante si des images de différentes tailles sont utilisées.
  7. Extraire de l’analyse divers paramètres du réseau, tels que la longueur totale du réseau, le nombre de jonctions, le nombre de segments, le nombre de segments isolés, l’intervalle de ramification et la taille moyenne du maillage, et les utiliser pour caractériser le réseau endothélial à différents points temporels et dans différentes conditions de culture.

4. Procédure de caractérisation 2 : Évaluation des dépôts ECM

  1. Aux points temporels souhaités, évaluer les dépôts d’ECM à l’aide de l’immunofluorescence. Ajouter des anticorps primaires contre diverses molécules ECM dans 100 μL du milieu de culture au cours des 6 dernières heures de culture ou après la fixation, comme décrit ci-dessous.
    1. Laver les cultures une fois avec 200 μL/puits de PBS pendant 5 min à TA, et les fixer avec 100 μL/puits de paraformaldéhyde à 4% sous une hotte chimique pendant 30 min à TA. Notez qu’il est conseillé de fixer tous les puits d’une plaque en même temps, car les cultures environnantes peuvent être endommagées lors de cette étape. Laver les cultures fixes avec 200 μL/puits de PBS à TA trois fois pendant 5 minutes à chaque fois, et stocker à 4 °C dans 200 μL/puits de PBS, ou passer immédiatement à l’étape suivante.
    2. Avant d’incuber avec des anticorps primaires contre les molécules ECM après fixation, incuber les cultures fixées avec 200 μL/puits de BSA à 1% dans du PBS comme solution de blocage pendant 30 min à TA.
      1. Aspirer la solution bloquante et incuber avec 100 μL/puits de la solution d’anticorps primaires dans 1 % de BSA dans du PBS pendant une nuit à 4 °C. Laver avec 200 μL/puits de PBS trois fois pendant 5 min, au moins 3 h et 5 min, respectivement, à TA.
        REMARQUE: La longue étape de lavage est nécessaire pour la diffusion complète de l’anticorps non lié hors de l’hydrogel.
    3. Pour faciliter la pénétration de la solution de coloration secondaire, y compris les contre-colorants intracellulaires, perméabiliser les cultures en utilisant 0,3% de Triton X-100 et 1% de BSA dans du PBS pendant 30-90 min à TA, en fonction de la densité cellulaire des cultures.
      REMARQUE : Pour la coloration à base d’anticorps des molécules intracellulaires, cette étape doit être effectuée avant l’incubation avec l’anticorps primaire décrit à l’étape 4.1.2.
    4. Préparer des solutions de coloration secondaire contenant les anticorps secondaires respectifs et les contre-colorants souhaités (p. ex., une coloration nucléaire telle que DAPI et une coloration cytosquelettique telle que la phalloïdine-rhodamine).
      1. Préparer un tampon de coloration composé de 0,1 % de Triton X-100, de 1 % de BSA dans du PBS et de contre-colorants (p. ex. 1 μg/mL de DAPI et 1:4 000 de phalloïdine-rhodamine), et ajouter les anticorps secondaires respectifs aux dilutions recommandées.
      2. Ajouter 100 μL/puits de solution de coloration secondaire et incuber pendant la nuit à 4 °C. Semblable à la procédure après l’incubation de l’anticorps primaire, laver avec 200 μL / puits de PBS trois fois pendant 5 minutes, au moins 3 h et 5 minutes, respectivement, à TA.
    5. Pour la résolution 3D des structures, acquérir des piles confocales en commençant par le fond du verre avec un pas z de 2,5 μm atteignant une hauteur finale de 500 μm, utiliser un objectif 10x et un zoom numérique 0,75x. Pour générer une reconstruction 3D du signal GFP et F-actine aux Fidji, définissez un seuil distinct sur chaque canal avant de créer un composite et de générer la reconstruction à l’aide de Fiji 3D Viewer.
    6. Pour la visualisation de l’ECM déposé à partir des immunomarquages, acquérir des piles confocales d’une hauteur de 100 μm avec un z-step de 5 μm, un objectif 10x et un zoom numérique 1,5x. Générez des projections d’intensité maximale et ajustez la luminosité et le contraste pour chaque canal séparément aux Fidji avant de créer un composite.
  2. Effectuer des colorations directes de couleur de l’environnement extracellulaire.
    1. Ajouter 200 μL/puits de solution de coloration Picrosirius Red dans les puits fixés au paraformaldéhyde et incuber pendant 1 h à TA.
    2. Ensuite, lavez les puits colorés cinq fois avec de l’eau distillée, puis lavez deux fois par jour ou tous les deux jours pendant 3-4 jours tout en surveillant le nettoyage de la couleur de l’échantillon. Maintenir les plaques à 4 °C pendant les longues étapes de lavage (c.-à-d. tout ce qui dépasse 6 h).
    3. Obtenez des images des échantillons colorés à l’aide d’un microscope à fond clair équipé d’une caméra couleur et maintenez une balance des blancs égale dans toutes les conditions. Pour obtenir une vue d’ensemble des échantillons, utilisez un faible grossissement (par exemple, 2,5x) pour balayer l’ensemble du puits. Si le microscope n’est pas livré avec un logiciel prenant en charge l’assemblage automatisé, faites-le manuellement (par exemple, en utilisant Pairwise Stitching à Fiji34).
      REMARQUE: Les puits précédemment utilisés pour l’immunofluorescence peuvent être utilisés à cette fin, à condition que l’acquisition de l’image de fluorescence soit terminée.
    4. Suivez les mêmes étapes que celles décrites pour la coloration rouge Picrosirius aux étapes 4.2.1 à 4.2.3 pour effectuer la coloration, le lavage et l’imagerie du rouge Alizarin.

5. Procédure de caractérisation 3 : Évaluation de la différenciation ostéogénique par le suivi de l’activité de l’ALP

  1. À différents points de fin de culture (p. ex. jour 4 et jour 7 de co-culture), évaluer quantitativement l’activité de l’ALP en utilisant la coloration au phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle (BCIP)/tétrazolium bleu nitro (NBT).
    1. Laver les cultures une fois avec 200 μL/puits de PBS avant d’incuber avec la solution de substrat BCIP/NBT, qui doit être préparée en suivant les instructions du fabricant. Incuber à 37 °C tout en surveillant périodiquement le développement des couleurs. Une fois que la couleur commence à se développer dans des conditions non ostéogéniques, laver immédiatement une fois avec 200 μL/puits de PBS avant de fixer avec 4% de paraformaldéhyde, comme décrit à l’étape 4.1.1.
    2. Acquérir des images couleur des échantillons colorés, comme décrit à l’étape 4.2.3 pour la coloration rouge Picrosirius.
  2. À différents points de fin de culture (par exemple, jour 4 et jour 7 de co-culture), quantifier l’activité ALP dans les lysats cellulaires.
    1. Laver les cultures trois fois avec 200 μL/puits de PBS avant d’incuber avec 200 μL/puits de trypsine-EDTA à 0,25 % à 37 °C. Toutes les 10 minutes, agiter les cultures en pipetant vigoureusement de haut en bas pour faciliter la digestion, et surveiller la morphologie de la culture avec un microscope de culture cellulaire standard.
    2. Une fois qu’une suspension liquide unicellulaire sans structures cellulaires allongées dans les puits est obtenue (généralement après 20-30 min), transférer les échantillons dans des tubes de 2 mL, ajouter 200 μL de milieu basal MSC pour inhiber la trypsine, et centrifuger à 500 x g pendant 5 min pour granuler les cellules récupérées. Décanter le surnageant et congeler les pastilles à −80 °C, ou passer directement à l’étape 5.2.3.
    3. Décongeler les pastilles cellulaires obtenues à l’étape 5.2.2, et incuber avec 500 μL de tampon de lyse constitué de 0,56 M de 2-Amino-2-méthyl-1-propanol, 0,2% de Triton X-100, pH 10, pendant 30 min sur glace. Ensuite, centrifuger à 16 100 x g pendant 10 minutes à 4 °C et conserver les échantillons sur la glace. Après les mesures décrites à l’étape 5.2.7, congeler les échantillons à -20 °C ou −80 °C, ou procéder directement à la quantification de l’ADN, comme décrit à l’étape 5.2.8.
      REMARQUE: Le tampon de lyse peut être préparé à l’avance, filtré stérile et stocké à 4 ° C.
    4. Préparer le réactif ALP constitué de 20 mM de sel disodique de phosphate de 4-nitrophényle hexahydraté et de 4 mM de MgCl2dans un tampon de lyse.
      NOTE: Il est préférable de préparer cette solution fraîche le jour de la quantification.
    5. Sans déranger les débris granulés, distribuer 50 μL du surnageant de lysat cellulaire préparé à l’étape 5.2.3 dans les puits d’une plaque de culture tissulaire standard transparente à 96 puits en double en doubles. Ajoutez un tampon de lyse à deux puits en tant que contrôles vides.
    6. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 μL/puits de réactif ALP aux puits remplis à l’étape 5.2.5. Secouer brièvement la plaque et incuber à 37 °C pendant 10 min à l’abri de la lumière. Les puits avec une activité ALP plus élevée apparaîtront en jaune. Arrêter la réaction en ajoutant 100 μL/puits de 1 M de NaOH à l’aide d’une pipette multicanal.
    7. Lire la densité optique à 410 nm à l’aide d’un lecteur de plaques. Faites la moyenne des doublons techniques et soustrayez la moyenne des contrôles vides.
    8. Effectuer la quantification de l’ADN pour normaliser l’activité ALP déterminée dans les étapes précédentes par rapport au nombre total de cellules. Ici, une méthode basée sur des mesures de fluorescence est décrite, mais toute autre méthode de quantification de l’ADN dans les lysats cellulaires est compatible avec le test. Préparer les réactifs et les étalons d’ADN requis pour la quantification de l’ADN à l’aide de trousses disponibles dans le commerce conformément aux instructions du fabricant.
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser un tampon de lyse pour préparer les normes ADN.
    9. Si les échantillons utilisés pour la quantification de l’ALP décrits à l’étape 5.2.3 ont été congelés, les décongeler, les centrifuger à 16 100 x g pendant 2 min à 4 °C et les placer sur de la glace. Sans déranger les débris granulés, distribuer 50 μL du surnageant de lysat cellulaire dans les puits d’une plaque noire de 96 puits en double. Congeler les échantillons à -20 °C ou −80 °C et répéter les quantifications ALP et ADN si nécessaire. Ajoutez les normes d’ADN en double.
    10. Avec une pipette multicanal, ajoutez 50 μL de colorant l’ADN, incuber et lire l’intensité de fluorescence selon les instructions du fabricant. À l’aide des valeurs standard de la courbe, déterminer et appliquer la conversion des valeurs d’intensité mesurées aux concentrations d’ADN.
    11. Normaliser les valeurs ALP obtenues à l’étape 5.2.7 en les divisant par la concentration d’ADN respective de chaque échantillon.

6. Application 1 : Réalisation d’essais de sensibilité aux médicaments

  1. Lorsque les réseaux endothéliaux sont complètement développés (généralement au jour 4 des co-cultures de cellules stromo-endothéliales), ajoutez des composés anti-angiogéniques, tels que le bevacizumab, aux cultures dans le milieu de culture frais et testez leur activité au fil du temps et dans différentes conditions (par exemple, différentes concentrations de FGF-2 ou BMP-2).
    1. Préparer un milieu de culture frais contenant les mêmes facteurs de croissance que ceux utilisés pour les cultures respectives jusqu’à ce point.
      1. Préparer une solution témoin composée du diluant du composé d’intérêt (p. ex. pour le bévacizumab : 60 mg/mL de α-tréhalose dihydraté, 0,4 mg/mL de Tween20, 5,8 mg/mL de phosphate de sodium monobasique et monohydraté, et 1,2 mg/mL de phosphate de sodium dibasique anhydre) et la filtrer stérile.
      2. Ajouter le composé d’intérêt à la concentration désirée (p. ex. 10 μg/mL de bévacizumab) et un volume égal de solution témoin dans le milieu de culture désigné pour les conditions d’essai et de contrôle, respectivement.
  2. Aspirer le milieu de culture et ajouter 200 μL/puits du milieu fraîchement préparé à l’étape 6.1.1. Incuber pendant une durée appropriée pour le composé à tester (p. ex. pour le bevacizumab : 2 jours). Surveiller le développement de la culture et caractériser les réseaux endothéliaux comme décrit à la rubrique 3. Évaluer l’efficacité du composé dans l’inhibition de l’angiogenèse ou l’ablation des structures préformées à l’aide des images GFP et des paramètres quantitatifs du réseau extraits de l’analyse décrite à l’étape 3.7.

7. Application 2 : Établir des systèmes avancés de coculture avec divers types de cellules cancéreuses

  1. Au jour 4 de la co-culture, lorsque les réseaux endothéliaux sont principalement établis, ajoutez d’autres types de cellules, telles que les cellules cancéreuses MDA-MB-231 ou U2OS, aux cultures dans le milieu de culture frais.
    1. Étiqueter les cellules cancéreuses à l’aide d’un colorant vivant compatible avec les cellules conformément aux instructions du fabricant afin de pouvoir les distinguer des HUVECs marqués GFP et des hBM-MSC non marqués dans les co-cultures.
    2. Préparer une suspension de cellules cancéreuses à une concentration de 1,5 x 104 cellules/ml dans un milieu de culture frais contenant les mêmes facteurs de croissance que ceux utilisés pour les cultures respectives jusqu’à ce point.
  2. Surveiller le développement de la culture et la localisation des cellules cancéreuses au besoin.
    REMARQUE : Selon le type de cancer, l’activité et l’environnement, il peut s’écouler quelques jours avant qu’ils atteignent les structures vasculaires dans les co-cultures de cellules stromo-endothéliales (par exemple, 2 jours pour MDA-BM-231 et U2OS). Par conséquent, l’imagerie accélérée pour visualiser les interactions entre le cancer et les cellules vasculaires doit être programmée en conséquence.

Representative Results

Les cultures de niche vasculaire ont été établies en ensemençant séquentiellement des CSM-hb et des HUVECs GFP sur des hydrogels préfabriqués à base de PEG avec un gradient de rigidité dans une plaque d’imagerie à 96 puits (Figure 1). Les cultures ont été surveillées longitudinalement par microscopie à épifluorescence vivante et caractérisées à des moments sélectionnés. Le compartiment extracellulaire a été évalué par coloration directe de la couleur et coloration à base d’anticorps. L’activité de l’ALP a été quantifiée après récupération et lyse des cellules des niches générées. De plus, nous démontrons la pertinence de cette plateforme pour les tests de sensibilité aux médicaments anti-angiogéniques et comme base pour les modèles de co-culture du cancer.

Des co-cultures de CSM-hb et de HUVECs exprimant la GFP ont été établies en ensemençant 3 x 104 cellules/puits en l’absence de facteurs de croissance ou en présence de FGF-2 ou de BMP-2 à 50 ng/mL, comme décrit dans le protocole. Dès le début, des différences entre les cultures ont pu être observées à la fois à partir des images en fond clair et en fluorescence montrant uniquement les GFP-HUVEC (Figure 2A). En observant les mêmes zones longitudinalement, des différences dans le développement des cultures ont pu être notées, comme un développement plus rapide en présence de FGF-2. En général, les cultures semblaient moins développées en l’absence de tout facteur de croissance, avec moins de cellules de l’un ou l’autre type se propageant et la présence de zones acellulaires. En revanche, les images en champ clair ont montré les cultures les plus denses en présence de BMP-2. Cependant, des réseaux vasculaires se sont formés dans des conditions contenant des facteurs de croissance, et les réseaux les plus étendus et interconnectés ont été formés avec FGF-2. Ces différences observées ont également pu être quantifiées à l’aide de l’analyseur d’angiogenèse pour ImageJ. En effet, la longueur totale du réseau était la plus élevée en présence de FGF-2 et la plus faible en l’absence de facteurs de croissance (Figure 2B). Le nombre de jonctions indiquant des embranchements dans les réseaux a suivi la même tendance que la longueur totale (figure 2C). À l’inverse, les deux conditions contenant un facteur de croissance comportaient beaucoup moins de segments isolés, ce qui indique une interconnectivité plus élevée, que la condition sans facteur de croissance (figure 2D). De plus, l’imagerie confocale 3D a révélé une pénétration plus forte des cellules endothéliales en termes de profondeur dans l’état stimulé par FGF-2 (Figure 2E).

Les co-cultures hBM-MSC/GFP-HUVEC ont été maintenues pendant 7 jours en présence de FGF-2 ou BMP-2 avant d’être fixées et colorées pour les composants ECM. Des colorations immunocytochimiques suivies d’une microscopie confocale à balayage laser ont montré des différences frappantes dans la morphologie de la culture en fonction du type de supplémentation en facteur de croissance (Figure 3A). Avec FGF-2, la culture a été organisée en structures microvasculaires condensées, qui étaient denses dans les cellules endothéliales et mésenchymateuses, tandis qu’en présence de BMP-2, les CSM-hBM couvraient une zone beaucoup plus grande, comme en témoignent les zones plus étendues F-actine positive et GFP-négative. Les protéines ECM fibronectine et collagène I ont été localisées de manière similaire, tandis que la laminine et le collagène IV étaient plus concentrés autour des structures endothéliales. Cependant, cette concentration accrue autour des structures endothéliales était beaucoup plus prononcée en présence de FGF-2 qu’en présence de BMP-2. En plus des colorations à base d’anticorps, des colorations directes ont été effectuées pour évaluer l’état fibrotique global de l’ECM (coloration rouge Picrosirius; Figure 3B), ainsi que le dépôt de Ca sur l’ECM (coloration rouge alizarine ; Figure 3C) des niches formées. La coloration Picrosirius Red était plus forte et plus étendue dans les niches cultivées avec BMP-2, et la coloration rouge Alizarin a suivi la même tendance.

Ensuite, les cultures ont été caractérisées en termes de potentiel ostéogénique en évaluant l’activité de l’ALP en tant que marqueur ostéogénique précoce. Le jour 4 et le jour 7 de la co-culture, les cellules ont été récupérées des niches en digérant les hydrogels avec de la trypsine. Pour quantifier l’activité de l’ALP, les cellules récupérées ont été lysées et un test pNPP a été effectué. Les valeurs obtenues ont été normalisées par rapport à l’ADN total de chaque échantillon afin de tenir compte des différences potentielles dans le nombre de cellules entre les conditions. En effet, de petites différences entre le contenu en ADN des conditions ont pu être observées, et le moins de cellules ont été récupérées de la maladie sans aucun facteur de croissance (non montré). L’activité normalisée de l’ALP, cependant, variait grandement d’une condition à l’autre, avec une tendance à l’augmentation de l’activité avec des concentrations plus élevées de BMP-2 et un plateau à 100 ng / mL (Figure 4A, B). Les niveaux d’activité les plus faibles ont été identifiés pour la condition contenant 50 ng/mL de FGF-2. Bien que des tendances similaires aient pu être observées pour les deux points temporels évalués, toutes les valeurs ont augmenté de façon significative au fil du temps en culture du jour 4 au jour 7. En plus du test quantitatif, l’activité ALP a pu être visualisée qualitativement à l’aide d’une coloration directe basée sur la conversion du substrat BCIP/NBT. Une coloration pourpre plus étendue et plus intense a été observée en présence de BMP-2 par rapport au FGF-2 (figure 4C).

Pour démontrer deux applications potentielles des niches ostéogéniques caractérisées, une étude de sensibilité aux médicaments de preuve de concept et des co-cultures contre le cancer ont été réalisées. Pour le dosage de sensibilité au médicament, le bévacizumab ou une solution témoin composée du diluant de la formulation de bevacizumab a été ajouté au milieu de culture contenant du BMP-2 frais. Le jour 4, lorsque les réseaux établis ont été formés en présence de 50 ng/mL de BMP-2, la solution témoin ou le milieu contenant du bévacizumab a été ajouté pendant le changement de milieu régulier, et les cultures ont été surveillées à l’aide de l’imagerie par fluorescence. L’ajout de 10 μg/mL de bévacizumab a entraîné la rétraction ou l’ablation du réseau précédemment formé, tandis que la condition de contrôle comportait encore des réseaux étendus 2 jours après le changement de milieu (Figure 5A,B). Ces changements pourraient également être quantifiés en suivant la longueur totale des réseaux à l’aide de l’analyseur d’angiogenèse pour ImageJ sur des images de fluorescence acquises quotidiennement (Figure 5C). Alternativement, le bevacizumab ou tout autre composé pourrait également être ajouté dès le début de la co-culture pour évaluer leur influence sur la formation des réseaux. Dans le cas du bevacizumab, cela a complètement inhibé la formation de réseaux endothéliaux (non illustré).

Pour la deuxième application, des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 ou d’ostéosarcome U2OS ont été ajoutées aux co-cultures du jour 4 à une densité de 1,5 x 103 cellules/puits dans un milieu de culture frais contenant 50 ng/mL de BMP-2. Pour les distinguer des HUVECs marqués GFP et des hBM-MSC non marqués, les cellules cancéreuses ont été incubées avec CellTrace FarRed juste avant l’ensemencement sur les niches ostéogéniques. Les cultures ont été surveillées par microscopie à fluorescence; Au début, la plupart des cellules cancéreuses localisaient près de la surface du substrat, mais après 2 jours, elles pouvaient être trouvées plus près des couches contenant les co-cultures vasculaires. Ainsi, le jour 2 a été choisi comme point de départ de la microscopie time-lapse pour montrer la dynamique des interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules de la niche vasculaire. Fait intéressant, on pouvait voir les cellules MDA-MB-231 s’approcher et s’éloigner des structures endothéliales et, par conséquent, sondaient ou remodelaient peut-être leur environnement (Figure 5D). En utilisant CellTrace FarRed comme étiquette pour les cellules cancéreuses, la GFP comme étiquette pour les HUVEC et une coloration supplémentaire pour la F-actine, tous les types de cellules ont pu être distingués à l’aide de la microscopie confocale à balayage laser (Figure 5E).

Figure 1
Figure 1 : Une approche simple pour la génération fiable de niches vascularisées et ostéogéniques. Les hydrogels synthétiques préfabriqués avec un gradient de rigidité en profondeur permettent la génération de cultures 3D via un ensemencement cellulaire séquentiel sans avoir besoin d’une encapsulation directe. Les CSM-hBM sont pré-cultivées pendant 3 jours avant que les HUVECs exprimant la GFP ne soient ajoutés. Les cultures sont surveillées en acquérant longitudinalement des signaux de fond clair et GFP. À certains moments, les niches sont évaluées davantage pour leur dépôt ECM et leur état ostéogénique. L’activité de la phosphatase alcaline est évaluée par coloration directe de la couleur et en récupérant les cellules des niches et en effectuant un test pNPP sur les lysats cellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Stimulation des réseaux de type vasculaire avec FGF-2 ou BMP-2. (A) Des images en fond clair et en fluorescence (GFP) ont été acquises le jour 2, le jour 4 et le jour 6 de la co-culture de cellules cultivées en l’absence de facteurs de croissance ou en présence de FGF-2 ou BMP-2, tous deux à 50 ng / mL. Barre d’échelle : 400 μm. (B-D) Paramètres quantifiés des réseaux GFP-HUVEC imagés au jour 4 de la co-culture, analysés à l’aide de l’analyseur d’angiogenèse pour ImageJ. Les données sont représentées sous forme d’écart type moyen ±. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de GraphPad Prism 9.5.1. Une ANOVA unidirectionnelle ordinaire avec le test de comparaisons multiples de Dunnett a été réalisée avec n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Reconstructions tridimensionnelles générées à partir d’empilements confocaux (hauteur totale : 547,5 μm; pas z : 2,5 μm) des signaux GFP et F-actine pour les conditions stimulées FGF-2- (rangée du haut) et BMP-2- (rangée inférieure). Barre d’échelle: 300 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Induction de l’étalement hBM-MSC délocalisé et du dépôt ECM par BMP-2. (A-C) Les co-cultures de 7 jours cultivées en présence de FGF-2 ou BMP-2 ont été soumises à (A) immunofluorescence ou (B,C) coloration directe. (A) Les cultures ont été colorées pour la F-actine et les protéines ECM fibronectine, laminine, collagène I et collagène IV. Les images représentent les projections d’intensité maximale des piles confocales (hauteur totale : 100 μm ; z-step : 5 μm). Barre d’échelle: 200 μm. (B,C) Les cultures ont été colorées à l’aide de (B) Picrosirius Red et (C) Alizarin Red. La rangée du haut représente des aperçus cousus et entiers des images acquises à un grossissement de 2,5x (barre d’échelle : 1 000 μm), tandis que la rangée du bas représente un champ de vision acquis à un grossissement de 5x (barre d’échelle : 400 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Évaluation biochimique de l’activité ALP induite par BMP-2 par coloration directe des couleurs. (A,B) L’activité ALP a été déterminée dans les lysats cellulaires de cultures cultivées en l’absence de facteurs de croissance ou en présence de BMP-2 à différentes concentrations ou de FGF-2 à 50 ng/mL pendant (A) 4 jours ou (B) 7 jours de co-culture. L’activité ALP est normalisée à la teneur en ADN de chaque échantillon de lysat. Les données sont représentées sous forme d’écart type moyen ±. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de GraphPad Prism 9.5.1. Une ANOVA unidirectionnelle ordinaire avec le test de comparaisons multiples de Dunnett a été réalisée avec n = 5; P < 0,0001. (C) Coloration directe de l’activité ALP dans des niches cultivées en présence de 50 ng/mL FGF-2 ou BMP-2 pendant 7 jours de co-culture. Les images du côté gauche représentent des aperçus cousus d’images acquises à un grossissement de 2,5x (barre d’échelle : 1 000 μm), tandis que les images de droite représentent un champ de vision acquis à un grossissement de 5x (barre d’échelle : 400 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Utilisation de niches ostéogènes et vascularisées dans des modèles avancés de cancer. (A) Les signaux GFP des cultures cultivées en présence de BMP-2 ont été imagés le jour 4 de la co-culture avant qu’une solution témoin (à gauche) ou du bévacizumab à 10 μg/mL (à droite) ne soient ajoutés pendant 2 jours, après quoi les cultures ont été imagées à nouveau (jour 6 de la co-culture). Barre d’échelle: 600 μm. (B) Des images à plus fort grossissement des cultures traitées au bévacizumab sont présentées en A. Barre d’échelle: 250 μm. (C) La longueur totale des réseaux endothéliaux comme indiqué dans A a été quantifiée à l’aide de l’analyseur d’angiogenèse pour ImageJ à partir d’images acquises quotidiennement; n ≥ 3. (D) Des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 marquées par CellTrace FarRed ont été ajoutées aux co-cultures de 4 jours cultivées en présence de BMP-2, et des images accélérées ont été acquises à partir de 2 jours après l’ajout de cellules cancéreuses. Barre d’échelle: 100 μm. (E) Projections d’intensité maximale de cheminées confocales (hauteur totale: 70 μm; pas z: 2,4 μm) de co-cultures triples générées comme décrit dans D et fixées et colorées pour la F-actine. À gauche : niches mettant en vedette des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231; à droite : niches avec des cellules d’ostéosarcome U2OS. Barres d’échelle pour les images de gauche : 200 μm ; Barres d’échelle pour les images à droite : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ici, nous décrivons un protocole pour l’établissement d’un modèle in vitro de niches osseuses et médullaires hautement vascularisées dans une matrice 3D entièrement synthétique et contrôlable basée sur PEG, qui a une variété d’applications dans la recherche en biologie osseuse et de la moelle osseuse, l’ingénierie tissulaire et la recherche sur le cancer. Ce modèle s’appuie sur un hydrogel synthétique à base de PEG qui est fonctionnalisé avec des peptides RGD et des sites de clivage MMP et est coulé avec un gradient de densité en profondeur sur des plaques d’imagerie à fond de verre à 96 puits30. Il a été démontré que cette plate-forme plug-and-play permet l’établissement de réseaux cellulaires 3D hautement interconnectés sans avoir besoin d’encapsuler des cellules dans l’hydrogel. Semblable au protocole d’encapsulation cellulaire décrit précédemment, dans ce travail, nous montrons le remodelage du substrat par un ECM inhérent à la cellule28 pour créer un microenvironnement spécifique au type de cellule. Ainsi, avec cette méthode, les tests de dépistage de médicaments et les analyses à haute teneur peuvent être facilement effectués dans des conditions de culture 3D organotypiques hautement reproductibles. Les plaques à fond de verre à 96 puits et les hydrogels optiquement transparents rendent la plate-forme compatible avec l’automatisation de la manipulation des liquides et la microscopie à haut débit.

La première étape dans la génération d’une niche de moelle osseuse vasculaire ostéogénique est la pré-culture de hBM-MSCs sur l’hydrogel PEG pendant au moins 3 jours. Pendant ce temps, ils se fixent à l’hydrogel, le pénètrent et commencent à établir des contacts cellule-cellule et un dépôt ECM. Avant d’ensemencer les hBM-MSC, le tampon de stockage doit être retiré. Comme l’hydrogel est situé à l’intérieur d’un puits interne dans le puits standard de la plaque d’imagerie de 96 puits, il est sécuritaire d’insérer l’extrémité d’aspiration le long du côté du puits jusqu’à ce qu’elle touche l’anneau intérieur du puits. Une pompe à vide peut être utilisée pour l’aspiration si elle est réglée à la force d’aspiration la plus faible possible. Alternativement, une laveuse de plaques automatisée avec la hauteur de la buse ajustée à au moins 0,8 mm au-dessus de l’anneau de puits interne peut être utilisée pour aspirer le tampon de la plaque d’hydrogel. L’utilisation de l’automatisation pour la manipulation des liquides peut minimiser les dommages à la surface de l’hydrogel et conduire à une plus grande reproductibilité des cultures résultantes. De petits défauts sur la surface de l’hydrogel deviennent visibles une fois que les cellules se déposent sur l’hydrogel et apparaissent sur un plan focal inférieur dans les zones d’hydrogel défectueuses. Par conséquent, l’acquisition d’images de référence au jour 0 sert de bon contrôle de qualité pour l’homogénéité de l’ensemencement cellulaire et l’intégrité de la surface de l’hydrogel. Bien que les petits défauts de surface d’hydrogel n’empêchent pas l’utilisation ultérieure du puits, les cellules ont tendance à se regrouper sur les zones défectueuses et peuvent se développer en motifs non représentatifs ou atteindre plus rapidement le verre inférieur, où elles se développent en monocouche. Ces artefacts doivent être notés lors de l’utilisation ou de l’évaluation de ces puits. Des considérations similaires s’appliquent à tout changement de milieu effectué pendant toute la durée de l’essai.

La deuxième étape du protocole implique l’ajout de GFP-HUVECs à la monoculture hBM-MSC préformée (jour 0 de co-culture). L’ECM déposé par le hBM-MSC fournit un excellent échafaudage pour la croissance des cellules endothéliales, qui dans ce travail, même en présence d’un milieu conditionné hBM-MSC, ne pouvaient former que des amas de cellules rondes sur les hydrogels (non représenté). Lors de l’ensemencement sur les cultures hBM-MSC, les HUVECs intègrent et forment des structures en forme de microvaisseaux comparables à celles observées dans les co-cultures générées par encapsulation cellulaire27,28. En règle générale, des réseaux microvasculaires 3D bien développés se forment dans les 4 jours suivant la co-culture, ce qui peut être surveillé longitudinalement par l’utilisation de HUVEC marqués GFP. Ces structures peuvent être maintenues pendant au moins 7 jours en culture, ce qui signifie qu’il y a suffisamment de temps pour suivre les changements dans l’organisation du réseau vasculaire en réponse aux traitements, tels que le dépistage des médicaments anti-angiogéniques. Les éléments morphologiques du réseau endothélial peuvent être quantifiés en mode batch en segmentant les images GFP à l’aide d’outils bien établis, tels que le plugin Angiogenesis Analyzer d’ImageJ33, et leurs paramètres peuvent être utilisés pour évaluer, par exemple, l’efficacité des médicaments et la pharmacodynamique.

Un avantage significatif du modèle cellulaire décrit pour de nombreuses applications potentielles est sa plasticité. Le simple fait de compléter le milieu de culture avec différents facteurs de croissance peut changer l’apparence de la co-culture. Par exemple, la présence de BMP-2 tout au long de la période de monoculture et de co-culture crée une niche vasculaire ostéogénique, montrant une activité accrue de l’ALP, un dépôt de calcium extracellulaire, ainsi qu’un assemblage et un dépôt d’ECM. Au contraire, en présence de FGF-2, les marqueurs ostéogéniques sont absents, et la co-culture forme moins d’associations cellulaires latérales mais montre une croissance cellulaire 3D plus prononcée. Le fait que FGF-2 supprime l’activité ALP alors que BMP-2 provoque une activité ALP plus forte par rapport à l’absence de traitement par facteur de croissance est conforme aux observations précédentes27. Pourtant, malgré ces grandes différences dans la composante stromale hBM-MSC, l’étendue du réseau microvasculaire était très similaire pour les deux conditions traitées par facteur de croissance dans ce travail. Dans les cultures témoins, seuls quelques réseaux vasculaires courts se sont formés, représentant peut-être une niche de moelle osseuse mal vascularisée. Cela suggère qu’en changeant simplement le type, la concentration et le moment des facteurs de croissance ajoutés au milieu de culture, une gamme de niches de moelle osseuse vascularisée bien définies, comme cela serait nécessaire pour les études comparatives, pourrait être produite. Cependant, pour assurer des résultats reproductibles, il est important de noter que la progression et la morphologie de la culture peuvent varier en fonction de l’historique des cellules utilisées (p. ex., le numéro de passage et la méthode de détachement utilisés pendant l’entretien de routine de la culture), et il est conseillé de contrôler ces facteurs pendant la conception de l’essai.

Ici, comme première application de ce modèle, nous démontrons la sensibilité des réseaux microvasculaires modifiés au traitement avec 10 μg/mL de bévacizumab. Il est notamment important de confirmer que l’algorithme utilisé peut reconnaître avec précision le réseau endothélial, car les artefacts sont souvent générés dans des images avec des réseaux peu développés. Si tel est le cas, les paramètres utilisés pour le traitement de l’image (avant et pendant la segmentation) doivent être affinés, souvent par essais et erreurs.

Comme deuxième application, nous présentons un modèle de co-culture avancé formé par l’ensemencement séquentiel de cellules mésenchymateuses, endothéliales et cancéreuses. Ce modèle permet d’étudier les interactions entre les cellules cancéreuses, le stroma et le système vasculaire de la moelle osseuse, qui peuvent être des facteurs importants lors des métastases. De plus, ce modèle pourrait être utilisé pour les applications de criblage de médicaments et le test de composés avec des cibles au-delà de l’angiogenèse.

Dans les cultures 2D, les cellules ne reçoivent pas de signaux physiologiques microenvironnementaux, n’acquièrent pas de morphologies cellulaires naturelles et, par conséquent, se différencient différemment des cellules dans les environnements 3D natifs35. Lorsqu’elles sont cultivées dans des hydrogels 3D techniques, les cellules déposent une ECM inhérente dès le début, qui fournit des sites d’adhésion et peut être activement remodelée28,36. Ici, pour établir un modèle 3D simplifié pour les applications de criblage, des cellules formant des vaisseaux ont été ensemencées à la surface d’hydrogels artificiels et ont permis d’établir des réseaux vasculaires en l’absence de perfusion. Les évaluations basées sur l’imagerie ont été menées sur des projections 2D des cellules endothéliales contribuant aux structures vasculaires. Cependant, seules les images confocales ont révélé la croissance moins prononcée des réseaux vasculaires 3D dans les échantillons stimulés par BMP-2 par rapport aux échantillons stimulés par FGF-2. Cela suggère que la longueur des structures vasculaires formées a été sous-estimée, tandis que leur connectivité a été surestimée. De plus, les interactions entre les cellules périvasculaires et endothéliales et la formation de lumière vasculaire n’ont pas été étudiées. Ces aspects, en particulier en termes de réponses au traitement de la toxicomanie, nécessiteront une attention accrue. Enfin, des protocoles affinés pour établir d’abord des réseaux vasculaires 3D étendus et ensuite seulement induire leur différenciation ostéogénique seraient souhaitables pour générer plus de modèles physiologiques d’os et de moelle osseuse.

Dans l’ensemble, le modèle présenté ici est très polyvalent et peut être facilement adapté à des applications spécifiques. Par exemple, des cellules mésenchymateuses et endothéliales provenant de différentes sources pourraient être utilisées. On sait que les CSM du tissu adipeux et les CSM du cordon ombilical expriment des facteurs angiogéniques différents de ceux des CSM-BM, et qu’elles peuvent facilement être substituées en tant que composant stromal alternatif37. Des cellules endothéliales isolées de niches de moelle osseuse déjà définies pourraient également être utilisées à la place des HUVEC. On pourrait également établir la co-culture avec des cellules mésenchymateuses et endothéliales de moelle osseuse correspondantes dérivées du patient pour des applications de médecine personnalisée, comme cela a été récemment suggéré pour les co-cultures musculaires vascularisées38. De plus, la conception de la plaque d’hydrogel permet la surveillance longitudinale de la culture avec la microscopie à fond clair et la microscopie à fluorescence, offrant ainsi à l’utilisateur la possibilité de raccourcir ou de prolonger le temps de culture en fonction de l’application. Alternativement, les densités cellulaires utilisées pour l’ensemencement pourraient être ajustées en conséquence pour accélérer ou retarder la formation du réseau cellulaire si des temps d’observation plus courts ou plus longs sont nécessaires que ceux de ce protocole. Dans tous les cas, la prudence est nécessaire pour éviter la prolifération cellulaire dans des structures en forme de feuilles, ce qui peut entraîner la contraction de l’hydrogel et un éventuel décollement cellulaire.

Enfin, un large éventail de tests peut être effectué à l’aide de ce modèle. En plus de l’immunofluorescence et de la microscopie effectuées dans des cultures vivantes ou fixes, les cultures 3D peuvent être digérées par voie enzymatique et les cellules peuvent être récupérées et soumises à tout type de test biochimique. Ici, nous démontrons la détermination de l’activité ALP et la quantification de la teneur en ADN dans les lysats cellulaires à l’aide de tests colorimétriques / fluorométriques, mais le système est compatible avec de nombreuses autres techniques, y compris la PCR, l’ARNseq et la protéomique. Si la sensibilité du test souhaité n’est pas très élevée, on peut regrouper des échantillons de plus d’un puits pour augmenter la quantité d’échantillon disponible pour le test. Si l’application souhaitée nécessite une dissolution plus rapide du gel, l’agitation orbitale de la plaque peut être appliquée en combinaison avec de plus petits volumes de la solution digestive pour assurer la formation de vortex dans les puits, en supposant que tous les puits de la plaque seront utilisés de cette manière (les cultures vivantes sont sensibles à une manipulation aussi dure). En résumé, nous présentons ici un protocole qui, s’il est utilisé tel que décrit, garantit la génération d’un modèle in vitro qui récapitule les aspects clés des niches vasculaires ostéogéniques mais qui est également suffisamment polyvalent pour être modifié pour des applications sur mesure.

Disclosures

Ectica Technologies AG est le fabricant de la plaque de puits d’hydrogel 3DProSeed et a des intérêts commerciaux. Benjamin R. Simona et Martin Ehrbar sont actionnaires d’Ectica Technologies AG.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Riccardo Urbanet pour son assistance technique avec les dispositifs de manipulation de liquides et Rodi Odabasi pour son soutien avec la microscopie à épifluorescence. Ces travaux ont été financés par le Fonds national suisse de la recherche scientifique (numéros de subvention 310030E_202429 et 205321_204318) et Ectica Technologies AG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-072
2 mL microtubes Eppendorf 30120094
2-Amino-2-methyl-1-propanol Sigma A9199
3DProSeed hydrogel well plate Ectica Technologies ECT.PS1.001.096
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate Sigma 71768
Alizarin Red S Sigma A5533
Anti-Collagen IV antibody Abcam ab6311
Anti-Laminin 1+2 antibody Abcam ab7463
Automated plate washer Agilent Biotek ELχ50
Automated washer/dispenser Agilent Biotek MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette
Bevacizumab Evidentic ID PS-E07-2019-00119 A009
BMP-2 Peprotech 120-02C
BSA AppliChem A1391
Centrifuge Eppendorf 5415 R To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis
Confocal laser scanning microscope Leica Stellaris 5
Conical 50 mL centrifuge tubes TPP 91050
DAPI Sigma D9542
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody Biolegend 406406
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody Biolegend 405312
EGM-2 Lonza CC-3162
Epifluorescence microscope Leica DMI6000B
FBS Gibco 10500-064
FGF-2 Peprotech 100-18B
Fibronectin (IST-9) Santa Cruz sc-59826
GFP-HUVECs PELOBiotech PB-CAP-0001GFP
hBM-MSCs - - Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359
Inverted microscope Zeiss 200M
Magnesium chloride Sigma M8266
MDA-MB-231 breast cancer cell line - Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center
MEMα Gibco 22571-038
Multimode imaging reader Agilent Biotek Cytation 1 For automated imaging
Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance Agilent Biotek Cytation 5 For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis
Paraformaldehyde Artechemis US 040
PBS Gibco 10010-015
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Phalloidin-rhodamine Invitrogen R415
Picro-Sirius Red Solution Abcam ab246832
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit ThermoFisher Scientific P7589
Recombinant Anti-Collagen I antibody Abcam ab260043
SIGMAFAST BCIP/NBT Sigma B5655-25TAB
Sodium hydroxide Sigma 1064981000
Sodium phosphate dibasic, anhydrous Sigma S-0876
Sodium phosphate monobasic, monohydrate Merck 1.06346
Triton X-100 Sigma T8787
Tween20 AppliChem A4974
U2OS osteosarcoma cell line - Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich 
α-trehalose dihydrate Sigma 90208

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References

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Bioingénierie numéro 195 Hydrogel moelle osseuse niche vasculaire angiogenèse ostéogenèse microenvironnement in vitro criblage phénotypique de médicaments microenvironnement tumoral
Mise en place simple d’une niche de moelle osseuse ostéogénique vascularisée à l’aide d’hydrogels de poly(éthylène glycol) (PEG) préfabriqués dans une microplaque d’imagerie
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Krattiger, L. A., Mitsi, M., Simona, … More

Krattiger, L. A., Mitsi, M., Simona, B. R., Ehrbar, M. Simple Establishment of a Vascularized Osteogenic Bone Marrow Niche Using Pre-Cast Poly(ethylene Glycol) (PEG) Hydrogels in an Imaging Microplate. J. Vis. Exp. (195), e65413, doi:10.3791/65413 (2023).

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