Summary
本プロトコルは、細胞外膜結合小胞内にパッケージされた、典型的に不溶性またはジスルフィド結合含有タンパク質を含む組換えタンパク質の細菌産生のための詳細な方法を記載する。これは、応用バイオテクノロジーや医学など、科学研究の多様な分野に適用できる可能性があります。
Abstract
短いペプチドタグを使用して、 大腸菌から膜結合小胞に複数の組換えタンパク質をエクスポートするこの革新的なシステムは、細菌の組換えタンパク質発現に関連するさまざまな問題に対する効果的なソリューションを提供します。これらの組換え小胞は、微小環境内のタンパク質を区画化し、細菌からの他の方法では困難、毒性、不溶性、またはジスルフィド結合を含むタンパク質の生成を促進します。タンパク質収量は、小胞核形成ペプチドタグの非存在下での典型的な細菌発現と比較した場合にかなり増加する。ベシクルパッケージタンパク質の放出は、培地からの単離をサポートし、活性タンパク質の長期保存を可能にします。この技術は、ベシクルパッケージ化された機能性タンパク質の収率を高め、応用バイオテクノロジーから発見科学や医学まで、さまざまなアプリケーションのダウンストリームプロセスを簡素化します。本稿および関連するビデオでは、この方法の詳細なプロトコルが提供されており、組換えタンパク質充填小胞産生を最大化するための方法論の重要なステップを強調しています。
Introduction
グラム陰性菌大腸菌は、産業規模と学術規模の両方で組換えタンパク質生産のための魅力的なシステムです。バッチで高密度に培養することは費用効果が高く、簡単であるだけでなく、大腸菌1における機能性タンパク質の生成を促進するために、広範囲の試薬、株、ツール、およびプロモーターが確立されています。さらに、合成生物学技術は現在、複雑なタンパク質の翻訳後修飾とフォールディングの適用に通常関連する障害を克服しています2。組換えタンパク質の培地への分泌を標的とする能力は、収量の向上と製造コストの削減のために魅力的です。膜小胞へのユーザー定義タンパク質の制御されたパッケージングは、応用バイオテクノロジーおよび医療産業における製品および技術の開発を支援します。これまで、大腸菌から組換えタンパク質を分泌するための広く適用可能な方法が不足していた3。
Eastwoodらは最近、大腸菌から組換えタンパク質含有小胞を産生および単離するためのペプチドタグ付けベースの方法を開発した1。 このベシクル核ペプチド(VNp)は、細胞外細菌膜小胞の生成を可能にし、選択した組換えタンパク質を標的にして標的タンパク質の精製と保存を簡素化し、振とうフラスコ培養から通常許可されるよりも大幅に高い収率を可能にします。フラスコ培養1リットルあたり3 g近くの組換えタンパク質の収量が報告されており、VNpタグを持たない同等のタンパク質で得られたものよりも>100倍高い収量です。これらの組換えタンパク質富化小胞は、培養培地から迅速に精製および濃縮することができ、安定した保存環境を提供します。この技術は、大腸菌組換えタンパク質生産における大きなブレークスルーを表しています。ベシクルは、毒性のあるジスルフィド結合を含むタンパク質を可溶性で機能的な形で区画化し、長期保存または直接処理のためのベシクルパッケージされた機能性タンパク質の単純、効率的、迅速な精製をサポートします1。
この技術が現在の技術に比べて提示する主な利点は、(1)さまざまなサイズ(1 kDa〜>100 kDa)およびタンパク質の種類への適用性です。(2)タンパク質間およびタンパク質内のジスルフィド結合形成を促進する;(3)多タンパク質複合体に適用可能;(4)さまざまなプロモーターおよび標準的なラボ大腸菌株で使用できます 。 (5)通常、発酵培養でのみ見られる振とうフラスコからのタンパク質の収量の生成。タンパク質は、(6)活性可溶性タンパク質の貯蔵のための安定した環境を提供する膜結合小胞に輸出および包装される。(7)ダウンストリームプロセッシングとタンパク質精製を簡素化します。このシンプルで費用対効果の高い組換えタンパク質ツールは、バイオテクノロジーや医療業界、そして発見科学にプラスの影響を与える可能性があります。
ここでは、数年にわたって開発された詳細なプロトコルが、VNp技術を使用して細菌から組換えタンパク質で満たされた小胞を生成するための最適条件を説明しています。蛍光タンパク質が発現しているこのシステムの実際の画像の例が示されており、生産、精製、および濃縮のさまざまな段階での小胞の存在を視覚化できます。最後に、ライブセルイメージングを使用して細菌からのVNp融合含有小胞の生成を検証する方法についてのガイダンスを提供します。
Protocol
実施される細菌作業は、各菌株の特定のバイオセーフティハザードレベルに適合する、地域、国内、および国際的なバイオセーフティ封じ込め規制に従います。
1. さまざまな VNp の選択
- VNp シーケンスを特定します。
注:本研究では、これまでに調査されたタンパク質の最大収量と小胞輸送をもたらす3つのVNp配列1 が特定されています:VNp2、VNp6、およびVNp15。特定のVNpバリアントが一部のタンパク質で他のタンパク質よりも効率的に機能する理由は現在のところ明らかではありません。したがって、目的の新しいタンパク質と各VNpバリアント(VNp2、6、または15)との間で融合を生成することをお勧めします。
VNp2: MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEA
AGKTKEGVL
VNp6: MDVFKKGFSIADEGVVVGAVEKTDQGVTEA
AEKTKEGVM
VNp15: MDVFKKGFSIADEGVVGAVE
異なるVNpアミノ末端融合体を有する目的のタンパク質の発現を可能にするプラスミドが市販されている( 材料表参照)。 - VNpをコードするcDNAの3'末端に目的の遺伝子をこれらの構築物の1つに挿入するクローニング戦略を設計するか、目的のタンパク質をコードする遺伝子の最初のATGコドンの上流に合成されたVNp cDNAを組み込むことによって既存のプラスミドを適応させます。1 で説明されている方法を使用します。
- 毒性タンパク質の場合は、抑制可能な発現プロモーターまたは非誘導発現ノイズが最小のプロモーターを含むベクターを使用してください。
- 融合タンパク質のアミノ末端にあるVNp配列タグをクローニングします。アフィニティータグ、プロテアーゼ切断配列など、および目的のタンパク質がVNpタグのカルボキシル側にあることを確認します。VNpを下流ペプチドから分離することは、-G-G-S-G-ポリペプチド配列の2つまたは3つの繰り返しなどの柔軟なリンカー領域を持つことをお勧めします(図1)。
注:細胞表面を弱め、小胞収量を低下させるペプチドグリカンを標的としない抗生物質選択のプラスミドを使用してください。カナマイシンとクロラムフェニコール( 材料の表を参照)は、この研究に使用された好ましい抗生物質でした。
2. 細菌細胞培養とタンパク質誘導
注:このプロトコルで通常使用される細菌株は、大腸菌BL21(DE3)またはW3110のいずれかです。大腸菌細胞は、リソジェニーブロス(LB)(10 g/Lトリプトン;10 g/L NaCl;5 g/L酵母エキス)または素晴らしいブロス(TB)(12 g/Lトリプトン;24 g/L酵母エキス;4 mL/L 10%グリセロール;17 mM KH2PO 4;72 mMK2HPO4、塩は別々にオートクレーブ処理)培地で培養されます(材料表参照)。タンパク質誘導およびその後の単離および精製プロセスの各ステップを示すサンプル画像を図2に示します。
- 新鮮な細菌形質転換から5 mL LBスターターを37°Cで飽和まで培養し、それらを使用して500 mLのコニカルフラスコに25 mLのTBを接種し、すべて適切な抗生物質を選択します。
- 表面積:体積比は、このシステムを最適化する上で重要な要素です。できるだけ大容量のフラスコを使用してください(例:1 Lの培養液を含む5 Lフラスコ、最適化ランでは、500 mLフラスコに25 mLの培地を使用します)。
- より大きな振とうフラスコ培養物を37°Cのインキュベーター内で、600 nmの光学濃度値(OD 600)が0.8〜1.0に達するまで200 rpm(≥25 mm軌道投射)で振とうしながらインキュベートします。
注:細胞を37°Cで増殖させる場合、ベシキュレーションが最適です。 しかしながら、いくつかの組換えタンパク質は、より低い温度での発現を必要とする。目的のタンパク質の場合、VNp6タグを使用すると、25°Cまでの温度で高収量の小胞を輸出できるため、VNp6タグを使用する必要があります。 - T7プロモーターから組換えタンパク質発現を誘導するには、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度20 μg/mL(84 μM)まで加えます( 材料表参照)。組換えタンパク質発現の誘導は、小胞の産生のために後期ログ期(すなわち、0.8〜1.0の典型的なOD600 )で起こらなければならない。
注:誘導期間の長さはタンパク質によって異なる場合があり、4時間で最大産生に達するものもあれば、一晩(18時間)で最大産生に達するものもあります。今日まで、最大の小胞輸出は一晩培養で得られている。
3. 組換え小胞分離
- 細胞を3,000 x g (4°C)で20分間遠心分離してペレット化します。
- ベシクル含有培地を滅菌して長期保存するには、透明培地を滅菌済みの界面活性剤フリーの0.45 μmポリエーテルスルホン(PES)フィルターに通します( 材料表を参照)。
注:小胞含有濾液からの生細胞の排除をテストするには、LB寒天上にプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。 - ベシクルをより小さな容量に濃縮するには、滅菌ベシクル含有培地を滅菌および界面活性剤を使用しない0.1 μm混合セルロースエステル(MCE)フィルターに通します( 材料表を参照)。
- セルスクレーパーまたはプラスチックスプレッダーを使用して0.5〜1 mLの滅菌PBSでメンブレンを穏やかに洗浄し、メンブレンから小胞を慎重に除去します。新しいマイクロ遠心チューブに移します。
注:精製された小胞は、滅菌培地またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に4°Cで保存できます。 このようにして、酵素活性を失うことなく、これらの小胞に6ヶ月間保存された組換えタンパク質の例がある。
4. 単離された小胞からの可溶性タンパク質放出
- タンパク質含有小胞が滅菌培地/緩衝液に単離されたら、装置の適切なスケジュール(例えば、6x 20秒のオンおよびオフサイクル)を使用して小胞脂質膜を超音波処理にかけ、39,000 x g (4°C)で20分間遠心分離して小胞の破片を除去します。
注:浸透圧ショックまたは界面活性剤処理は、小胞を壊すための代替として使用できますが、タンパク質の機能および/または下流のアプリケーションへの影響を考慮する必要があります。 - VNp融合が細胞質のままで培地に放出されない場合は、標準プロトコルを使用してタンパク質を単離します(例えば、細胞ペレットを5 mLの適切な抽出バッファー(20 mM tris、500 mM NaCl)に再懸濁し、超音波処理し、遠心分離によって細胞破片を除去します)。
5. タンパク質濃度測定
- 三重試料のゲル密度測定分析によりタンパク質の濃度を決定する1.ウシ血清アルブミン(BSA)ローディングスタンダードと並行して、クーマシー染色されたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲルで実行します。適切なソフトウェアを使用してゲルをスキャンし、分析します(例:Image J; 材料表を参照)。
6. 蛍光顕微鏡によるベシクル形成と単離ベシクルの可視化
注:細胞に蛍光標識されたVNp融合または膜マーカーが含まれている場合は、ライブセルイメージングを使用して小胞形成を追跡できます。あるいは、蛍光脂質色素を使用して小胞を視覚化し、産生と精製を確認することもできます。
- セルマウント
- カバーガラスに取り付ける前に、VNp フュージョン式を数時間誘導します。
- アガロースパッド法(図3A−C):細胞を薄い(<1mm)円形LBアガロース(2%)パッド上にピペットで移し、きれいなスライドガラス上にセットした。細胞が落ち着いて平衡化するのを待って、50 mm x 25 mmのカバーガラスをパッドとセルに置きます。カバーガラスをスペーサーと粘着テープで所定の位置に保持します。
- ポリエチレンイミン(PEI)法(図3D-F):20μLの0.05%PEI(dH2O中)をピペットチップでカバーガラスに広げ、3〜5分間放置して乾燥させずにガラスに結合させる。50 μLの細胞培養液を加え、5〜10分間放置して、細菌がPEIコーティングされた表面4に関連していることを確認します。カバーガラスをスライドに置く前に100μLのメディアで洗い、スペーサーと粘着テープで所定の位置に保持します。
- 取り付け小胞
- 精製したベシクルを薄い(<1 mm)円形LB-アガロース(2%)パッド上にピペットで固定し、きれいなスライドガラス上にセットしました。液体が乾いたら、50 mm x 25 mmのカバーガラスをパッドと小胞に置きます。カバーガラスをスペーサーと粘着テープで所定の位置に保持します。
- 蛍光脂質色素FM4−64は、膜5を染色することができるので、小胞を可視化するために使用することができる。FM4-64( 材料の表を参照)を精製小胞に最終濃度2 μM(ジメチルスルホキシド[DMSO]に溶解した2 mMストックから)に加え、10分間のインキュベーション後に画像化します。これは、非蛍光標識貨物5を含む小胞を同定するのに特に有用である。
- 観察された細胞の培養に使用したのと同じ培地でカバーガラスをすすぎます。
注:一部の複雑な培地(TBなど)は自家蛍光を示すことがあり、過剰なバックグラウンドシグナルが発生する可能性があります。
- イメージング小胞
注:VNp組換え小胞の顕微鏡画像の例を 図4に示します。- 油浸対物レンズを使用してスライドを倒立顕微鏡( 材料表を参照)に取り付け、2〜3分間放置して、サンプルを沈降させ、温度を平衡化させます。
注:各サンプルのすべてのライブセルイメージングは、光毒性と嫌気性ストレスの影響を最小限に抑えるために、細胞をカバーガラスに取り付けてから30分以内に完了する必要があります。このため、Z スタックよりも単一平面の画像が好まれます。 - 使用する蛍光タンパク質/色素に適した光源(発光ダイオード[LED]やハロゲン電球など、 材料表を参照)とフィルターの組み合わせを使用してください6.
- 微生物細胞および小胞のイメージングには、高倍率(すなわち、100倍または150倍)および高開口数(すなわち、NA ≥1.4)レンズを使用してください。
- 細胞および/または小胞からの蛍光シグナルを可視化するのに必要な最小光強度を決定する。これには、使用中のカメラの露出とゲインの設定を調整する必要がある場合があります。
注:現在の相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラからの典型的な露光時間は、イメージングシステムに応じて50〜200ミリ秒の間で変化します。 - 単一フレーム イメージの場合は、3 イメージの平均化を使用して、ハードウェアに依存するランダムなバックグラウンド ノイズを減らします。
- タイムラプスイメージングの場合は、個々のフレーム間に3〜5分かかります。
注:顕微鏡のセットアップによっては、長時間のタイムラプス実験中に焦点を断続的に調整する必要がある場合があります。
- 油浸対物レンズを使用してスライドを倒立顕微鏡( 材料表を参照)に取り付け、2〜3分間放置して、サンプルを沈降させ、温度を平衡化させます。
Representative Results
VNp6-mNeongreen発現コンストラクトを含むBL21 DE3大腸菌は、後期ログ期まで増殖した(図2A)。VNp6-mNeongreenの発現は、IPTGを培養液に添加することによって誘導され(20 μg/mLまたは84 μMの最終濃度)、その後、激しい振とう(200 rpm、≥25 mm軌道投射)しながら37°Cで一晩増殖させました。翌朝、培養物はmNeongreen蛍光7を示し(図2B)、遠心分離によって細菌細胞を除去した後も培地中に見えたままでした(図2C)。培養液および透明化した培地内のVNp-mNeongreenの存在をSDS-PAGEにより確認した(図2D)。mNeongreenを含む小胞を0.1 μmのMCEフィルター上に単離し(図2E)、PBSに再懸濁しました(図2F)。その後、精製された小胞をアガロースパッドにマウントし(図3A-C)、広視野蛍光顕微鏡を用いて画像化しました(図4A)。ベシクル膜の存在は、親油性蛍光色素FM4-64を用いて確認した(図4B)。mNeongreen(緑色)およびVNp6-mCherry2(マゼンタ)8に融合した内膜タンパク質CydBを発現する大腸菌細胞は、生きた細菌細胞における小胞産生および貨物挿入を示しています(図4C)。図4A、Bは広視野蛍光顕微鏡を用いて捕捉され、一方、図4Cは、前述の方法を用いて構造化照明顕微鏡(SIM)を用いて取得された9、10。
図1:クローニング戦略の設計から細胞外小胞の精製と保存までのVNpテクノロジーの概要 。 (A)代表的なVNp融合タンパク質の模式図。NH2末端におけるVNp、続いて可撓性リンカー、親和性および蛍光タグ(Tag1、Tag 2、プロテアーゼ切断部位[例えばTEV])および目的のタンパク質の適切な組み合わせ。(B) 大腸菌由来の組換えタンパク質充填膜小胞の発現および精製のためのプロトコールをまとめた模式図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:VNp6-mNg小胞の生産と精製の段階。 VNp-mNeongreen発現コンストラクトを含む 大腸菌 細胞の培養物を、IPTG誘導性融合タンパク質の発現前(A)または後(B)のいずれかの青色光で。(B)から細胞を遠心分離によって除去し、VNp-mNeongreen充填小胞を培地(C)に残した。(D) A、 B、 およびC からの同等のサンプルをSDS-PAGEおよびクマシー染色によって分析した。ベシクルを0.1 μmフィルター(E)で単離し、続いて適切な量のバッファー(F)に洗い流しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:小胞および小胞産生をイメージングするための細胞マウント手順。 (A-C)カバーガラス上に大腸菌細胞をマウントするアガロースパッド法及び(D-F)PEI法。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:VNp組換え小胞の顕微鏡画像。 緑(A)と赤(B)は、アガロースパッドにマウントされたFM4-64標識VNp6-mNeongreen含有小胞の異なるフィールドからの発光画像です。(C)mNeongreen(緑)およびVNp6-mCherry2(マゼンタ)に融合した内膜タンパク質CydBを発現する 大腸菌 細胞のイメージングは、生きた細菌細胞における小胞産生および貨物挿入を示す。(A、B)は広視野蛍光顕微鏡を使用して画像化され、(C)は構造化照明顕微鏡(SIM)を使用して取得されました。スケールバー: (A,B) = 10 μm;(C) = 1 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
上記の組換えタンパク質を製造するためのアミノ末端ペプチドタグ付き法は、単純なプロセスであり、効率的に単離および/または数ヶ月間保存できる大量のタンパク質を一貫して生成します。
このシステムを最適に使用するために必要なプロトコルの重要なステップを強調することが重要です。まず、VNp タグ1 を N 末端に配置し、その後に目的のタンパク質と適切なタグを配置する必要があります。アンピシリンなどのペプチドグリカン層を標的とする抗生物質の使用を避けることも重要です。
増殖条件に関しては、ベシクル産生を最大化するには、リッチメディア(LBまたはTB培地など)と高い表面積:体積比が必要です。細胞外小胞の産生に最適な温度は37°Cですが、目的のタンパク質の発現に通常必要な条件も考慮する必要があります。誘導温度を下げるには、VNp6を使用する必要があります。重要なのは、細胞が0.8-1.0のOD600 に達したら、20 μg/mL(84 μM)以下のIPTGを使用してT7プロモーターの誘導を達成しなければならないことです。このシステムを使用して発現されたタンパク質は、4時間または一晩の誘導後に最大ベシクル産生に達します。
このプロトコルは単純ですが、最適化が必要です。VNpバリアント融合、発現温度、および誘導期間は、目的のタンパク質によって異なる場合があります。さらに、培地からの細胞外小胞の精製およびその後の濃度を最適化する必要がある。現在の手順はスケーラブルではなく、時間がかかる可能性があります。これらがこの方法論の限界です。
VNp テクノロジには、従来の方法に比べて多くの利点があります2.これにより、多様なタンパク質の小胞輸送が可能になり、これまでに正常に発現された最大サイズは、内部に残っている小胞では175 kDa、輸出された小胞では85 kDaです。さらに、この技術は、さまざまな物理的特性と活性を持つ組換えタンパク質の収量を大幅に増加させることができます。目的のタンパク質を含む輸出された小胞は、事前にクリアされた培地から簡単なろ過によって単離することができ、その後、滅菌培地またはバッファーに4°Cで数ヶ月間保存することができます。
このシステムの用途は、発見科学から応用バイオテクノロジーや医学(機能性治療薬の製造など)まで多岐にわたります3。生産の容易さ、下流処理、および高収率はすべて、これらの分野、特に産業において魅力的な品質です。
Disclosures
著者は、競合する金銭的利益またはその他の利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
著者らは、VNpテクノロジーを説明する論文で提示されたプロトコルについて疑問を投げかけた多様なTwitterユーザーに感謝します。 図 1A は、flaticon.com のアイコンを使用して生成されました。この研究は、ケント大学とバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会(BB / T008 / 768 / 1およびBB / S005544 / 1)からの資金提供によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Melford | 69-52-3 | |
| Chloramphenicol | Acros Organics (Thermofisher Scientific) | 56-75-7 | |
| E. coli BL21 (DE3) | Lab Stock | N/A | |
| E. coli DH10β | Lab Stock | N/A | |
| Filters for microscope | Chroma | ||
| FM4-64 | Molecular Probes (Invitrogen) | T-3166 | Dissolved in DMSO, stock concentration 2 mM |
| ImageJ | Open Source | Downloaded from: https://imagej.net/ij/index.html | |
| Inverted microscope | Olympus | ||
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Melford | 367-93-1 | |
| Kanamycin sulphate | Gibco (Thermofisher Scientific) | 11815-024 | |
| LED light source for micrscope | Cairn Research Ltd | ||
| Lysogeny Broth (LB) / LB agar | Lab Stock | N/A | 10 g/L Tryptone; 10 g/L NaCl; 5 g/L Yeast Extract (1.5 g/L agar) |
| Metamorph imaging software | Molecular Devices | ||
| MF-Millipore Membrane filter (0.1 µm, MCE) | Merck | VCWP04700 | |
| Millipore Express PLUS membrane filter (0.45 µm, PES) | Merck | HPWP04700 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lab Stock | N/A | |
| Plasmids allowing expression of protein of interest with different VNp amino terminal fusions | Addgene | https://www.addgene.org/Dan_Mulvihill/ | |
| Terrific Broth (TB) | Lab Stock | N/A | 12 g/L Tryptone; 24 g/L Yeast Extract; 4 ml/L 10% glycerol; 17 mM KH2PO4 72 mM K2HPO4 |
References
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