Une approche de vision industrielle pour les flux de travail de microscopie électronique à transmission, l’analyse des résultats et la gestion des données

Summary

Ici, nous présentons un protocole permettant d’utiliser un logiciel de vision industrielle pour stabiliser les processus dynamiques pendant l’imagerie TEM, tout en indexant simultanément plusieurs flux de métadonnées sur chaque image dans une chronologie navigable. Nous démontrons comment cette plateforme permet l’étalonnage et la cartographie automatisés de la dose d’électrons au cours d’une expérience.

Abstract

La microscopie électronique à transmission (MET) permet aux utilisateurs d’étudier les matériaux à leur échelle atomique fondamentale. Les expériences complexes génèrent régulièrement des milliers d’images avec de nombreux paramètres qui nécessitent une analyse longue et compliquée. AXON synchronicity est une solution logicielle de synchronisation de vision industrielle (MVS) conçue pour résoudre les problèmes inhérents aux études TEM. Une fois installé sur le microscope, il permet la synchronisation continue des images et des métadonnées générées par le microscope, le détecteur et les systèmes in situ au cours d’une expérience. Cette connectivité permet l’application d’algorithmes de vision industrielle qui appliquent une combinaison de corrections spatiales, de faisceaux et numériques pour centrer et suivre une région d’intérêt dans le champ de vision et fournir une stabilisation immédiate de l’image. En plus de l’amélioration substantielle de la résolution offerte par une telle stabilisation, la synchronisation des métadonnées permet l’application d’algorithmes de calcul et d’analyse d’images qui calculent des variables entre les images. Ces métadonnées calculées peuvent être utilisées pour analyser les tendances ou identifier les principaux domaines d’intérêt dans un ensemble de données, ce qui permet d’obtenir de nouvelles connaissances et de développer des capacités de vision industrielle plus sophistiquées à l’avenir. L’un de ces modules qui s’appuie sur ces métadonnées calculées est l’étalonnage et la gestion des doses. Le module de dose fournit un étalonnage, un suivi et une gestion de pointe de la fluence électronique (e-/Å 2·^s-1) et de la dose cumulative (e^-/Ų) qui est délivrée à des zones spécifiques de l’échantillon pixel par pixel. Cela permet une vue d’ensemble complète de l’interaction entre le faisceau d’électrons et l’échantillon. L’analyse des expériences est rationalisée grâce à un logiciel d’analyse dédié dans lequel les ensembles de données composés d’images et de métadonnées correspondantes sont facilement visualisés, triés, filtrés et exportés. Combinés, ces outils facilitent des collaborations efficaces et des analyses expérimentales, encouragent l’exploration de données et améliorent l’expérience microscopique.

Introduction

Les microscopes électroniques à transmission (MET) et leurs capacités ont énormément bénéficié des progrès réalisés dans les caméras, les détecteurs, les porte-échantillons et les technologies informatiques. Cependant, ces progrès sont entravés par des flux de données déconnectés, des limites de l’exploitation humaine et une analyse fastidieuse des données ^1,2. De plus, les expériences in situ et operando adaptent les TEM en laboratoires nanométriques en temps réel, permettant d’étudier des échantillons dans des environnements gazeux ou liquides tout en appliquant simultanément une gamme de stimuli externes ^3,4,5. L’adoption de flux de travail aussi complexes n’a fait qu’amplifier ces limites, et l’augmentation de la taille et de la complexité de ces flux de données qui en résulte est un sujet de préoccupation croissante. Ainsi, l’accent est de plus en plus mis sur l’utilisation de l’actionnabilité de la machine pour trouver, accéder, interagir et réutiliser les données, une pratique connue sous le nom de principes FAIR⁶. La publication de données de recherche conformément au concept des principes FAIR a reçu une attention favorable de la part des agences gouvernementales du monde entier^7,8, et l’application des principes FAIR à l’aide d’un logiciel de vision industrielle est une étape clé de leur adoption.

Une plate-forme logicielle de synchronisation de vision industrielle (MVS) a été développée en réponse aux problèmes spécifiques inhérents à la réalisation et à l’analyse d’expériences TEM complexes et riches en métadonnées (en particulier les expériences in situ et operando)⁹. Une fois installé sur le TEM, le logiciel MVS se connecte, intègre et communique avec la colonne de microscope, les détecteurs et les systèmes in situ intégrés. Cela lui permet de collecter en permanence des images et d’aligner ces images avec leurs métadonnées expérimentales, formant ainsi une base de données consultable complète, une chronologie de l’expérience du début à la fin (Figure 1). Cette connectivité permet au logiciel MVS d’appliquer des algorithmes qui suivent et stabilisent intelligemment une région d’intérêt (ROI), même lorsque les échantillons subissent des changements morphologiques. Le logiciel applique les ajustements nécessaires aux corrections de scène, de faisceau et numériques pour stabiliser le retour sur investissement grâce à ses fonctions de contrôle de la dérive et d’assistance à la mise au point . En plus d’enrichir les images avec les métadonnées brutes produites à partir des différents systèmes expérimentaux, le logiciel peut produire de nouvelles métadonnées informatiques en utilisant des algorithmes d’analyse d’images pour calculer des variables entre les images, ce qui lui permet de corriger automatiquement la dérive de l’échantillon ou les changements de focus.

Les images TEM et les métadonnées associées recueillies au moyen du logiciel MVS sont organisées sous la forme d’une chronologie expérimentale qui peut être ouverte et visualisée par n’importe qui au moyen de la version gratuite hors ligne du logiciel d’analyse, Studio (ci-après appelé le logiciel d’analyse)¹⁰. Au cours d’une expérience, le logiciel MVS synchronise et enregistre trois types d’images de la caméra ou du détecteur du microscope, qui sont affichées en haut de la chronologie sous la visionneuse d’images : acquisition unique (images individuelles à acquisition unique acquises directement à partir du logiciel TEM), raw (images du flux en direct du détecteur ou de la caméra qui n’ont fait l’objet d’aucune correction numérique de dérive; ces images peuvent avoir été corrigées physiquement via mouvement de la scène ou déplacement du faisceau) et corrigé de la dérive (images du flux en direct du détecteur ou de la caméra qui ont été dérivées numériquement). Les données collectées au cours d’une expérience ou d’une session peuvent être affinées en sections plus petites ou en extraits de données, appelés collections, sans perte de métadonnées intégrées. À partir du logiciel d’analyse, les images, les piles d’images et les métadonnées peuvent être directement exportées dans une variété d’images au format ouvert et de types de feuilles de calcul pour analyse à l’aide d’autres outils et programmes.

Le cadre de contrôle, de stabilisation et d’intégration des métadonnées du microscope permis par le logiciel MVS permet également la mise en œuvre de programmes ou de modules de vision industrielle supplémentaires, conçus pour atténuer les limitations des flux de travail TEM actuels. L’un des premiers modules développés pour tirer parti de cette plate-forme de synchronisation est l’étalonnage de la dose d’électrons et le suivi spatial des zones exposées au faisceau dans l’échantillon. Toutes les images TEM sont formées à partir de l’interaction entre l’échantillon et le faisceau d’électrons. Cependant, ces interactions peuvent également entraîner des impacts négatifs et inévitables sur l’échantillon, tels que la radiolyse et les dommages par heurts 11,12, et nécessitent un équilibre délicat entre l’application d’une dose d’électrons suffisamment élevée pour générer l’image et la minimisation des dommages causés par le faisceau ^13,14.

Bien que de nombreux utilisateurs s’appuient sur les mesures de courant d’écran pour estimer la dose d’électrons, il a été démontré que cette méthode sous-estime largement le courant de faisceau^{réel 15}. Les valeurs de dose qualitatives peuvent être obtenues via le courant d’écran sur le même microscope avec les mêmes réglages, mais la reproduction de ces conditions de dose à l’aide de microscopes ou de réglages différents est très subjective. De plus, tout ajustement des paramètres d’imagerie effectué par l’utilisateur au cours de l’expérience, tels que la taille du spot, l’ouverture, le grossissement ou l’intensité, nécessite une mesure distincte du courant d’écran pour calculer la dose résultante. Les utilisateurs doivent soit limiter rigoureusement les conditions d’imagerie utilisées au cours d’une expérience donnée, soit mesurer et enregistrer méticuleusement chaque condition de lentille utilisée, ce qui complique considérablement et étend l’expérience au-delà de ce qui est réalisable pour le fonctionnement normal du microscope^16,17.

Dose, appelé logiciel de dose pour ce protocole, est un module logiciel d’étalonnage de dose qui utilise un support d’étalonnage dédié conçu pour permettre des mesures de courant automatisées. Une coupelle de Faraday, l’étalon-or pour un étalonnage précis du courant de faisceau¹⁵, est intégrée à la pointe du support d’étalonnage. Le logiciel MVS effectue une série d’étalonnages du courant de faisceau et de la zone de faisceau pour chaque condition d’objectif et intègre ces valeurs sur les images au niveau des pixels.

Dans cet article vidéo, les protocoles logiciels MVS conçus pour améliorer tous les domaines du flux de travail TEM sont présentés à l’aide d’échantillons de nanomatériaux représentatifs. Un échantillon de nanoparticules de zéolite sensible au faisceau¹⁴ est utilisé pour démontrer les flux de travail d’étalonnage et de gestion des doses. Nous réalisons une expérience de chauffage in situ représentative en utilisant un échantillon de nanocatalyseur Au/FeO_x ^18,19 qui subit des changements morphologiques importants lorsqu’il est chauffé. Cette expérience in situ met en évidence les algorithmes de stabilisation du logiciel et sa capacité à rassembler plusieurs flux de métadonnées, ce qui constitue un défi inhérent aux études in situ et operando. Bien que cela ne soit pas décrit dans le protocole, en raison de sa sensibilité unique à la dose d’électrons, nous discutons d’exemples représentatifs de l’utilité du logiciel pour les études EM liquides (protocoles pour lesquels des protocoles ont déjà été rapportés dans la littérature^20,21,22), et comment ces techniques peuvent être appliquées pour améliorer la compréhension de l’effet de la dose sur les expériences EM liquide. Enfin, nous montrons comment l’analyse des données est rationalisée à l’aide du logiciel d’analyse hors ligne pour visualiser, filtrer et exporter une variété de fichiers d’images, de vidéos et de données dans d’autres formats accessibles.

Figure 1 : Exemples d’interface utilisateur pour les logiciels MVS et d’analyse. (A) Le volet de visualisation et le panneau de commande de l’image du logiciel de synchronisation. Une connexion entre le TEM et le logiciel de synchronisation est établie en activant le bouton Connecter, qui diffuse les images et les métadonnées du microscope dans le logiciel de synchronisation. À partir de la visionneuse d’images, l’opérateur peut effectuer diverses opérations assistées par vision industrielle, telles que Drift Correct et Focus Assist. Il offre également la possibilité d’appliquer des images de balises et une session de révision sans perturber la collecte de données. (B) Capture d’écran du logiciel d’analyse d’image mettant en évidence l’emplacement du port de vue d’image, de la chronologie et du panneau Métadonnées et analyse. Le logiciel d’analyse est accessible à tout moment au cours d’une expérience pour examiner les images acquises jusqu’à ce point de temps à l’aide du bouton Session de révision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocol

1. Méthode 1: Étalonnage de dose du microscope électronique à transmission pour les modes d’imagerie TEM et TEM à balayage (STEM)

1. Allumez le picoampèremètre et laissez-le chauffer pendant au moins 30 minutes avant de commencer un étalonnage de dose. Chargez le support d’étalonnage de dose dans le TEM et connectez le support d’étalonnage au picoampèremètre à l’aide du câble de connexion rapide.
2. Avec le microscope en mode TEM , ouvrez les valves de la colonne et localisez le trou fiduciaire de 35 μm sur le porte-dose (Figure 2). Lancez l’application logicielle MVS et sélectionnez Dose (Calibration Automation) parmi les options d’expérience.
   REMARQUE: L’emplacement du trou fiduciaire est enregistré par le logiciel après l’étalonnage initial, ce qui permet au logiciel de localiser automatiquement sa position pour les étalonnages futurs.
3. Cliquez sur l’icône Connecter (Figure 1A) et sélectionnez le microscope pour activer la connexion entre le TEM et le logiciel MVS. Une fois connectées, les images de la caméra/détecteur seront visibles dans la visionneuse d’images du logiciel.
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire d’optimiser la hauteur eucentrique, et le bord du trou fiduciaire peut sembler flou en raison de l’épaisseur de la pointe. Cela n’affectera pas les mesures actuelles.
4. Accédez à l’onglet Dose, puis à Calibrage de la dose. Sélectionnez le processus d’étalonnage de la zone de dose, suivez les instructions du logiciel et entrez les valeurs configurables par l’utilisateur demandées (telles que les paramètres d’ouverture et de monochromateur). Une fois l’étalonnage de la zone de dose terminé, sélectionnez le processus d’étalonnage du courant de dose et suivez les instructions du logiciel.
5. Répétez le processus d’étalonnage (étape 1.4) pour chaque taille de spot, ouverture ou réglage de monochromateur qui peut être utilisé pendant l’expérience.
6. Lorsque le processus d’étalonnage pour le mode TEM est terminé, étalonner la dose d’électrons pour le mode STEM en répétant l’étape 1.4.
   REMARQUE: Le mode STEM ne nécessite pas que l’étalonnage de la zone de dose soit effectué.
7. Lorsque tous les étalonnages souhaités sont terminés, cliquez sur Fermer la session, retirez le support d’étalonnage de dose et revenez à l’écran de démarrage du logiciel MVS.

2. Méthode 2 : Détermination du seuil de dose à l’aide du MVS et du logiciel de dose

1. Chargez une grille TEM standard avec un échantillon (des nanoparticules de zéolite ZSM-5 disponibles dans le commerce ont été utilisées dans cet exemple) dans un support TEM standard. Insérez le support dans le TEM et localisez une région d’intérêt (nanoparticules de zéolite cristalline).
2. Ouvrez l’application logicielle MVS et sélectionnez Autre.
   REMARQUE : Des informations supplémentaires sur l’échantillon (par exemple, l’identificateur et la description de l’échantillon, le nom de l’opérateur et les notes d’expérience) peuvent être ajoutées au champ Paramètres expérimentaux.
3. Répétez l’étape 1.3 pour vous connecter au logiciel MVS et accédez à l’onglet Métadonnées d’image dans l’interface du logiciel MVS pour sélectionner les métadonnées suivantes à superposer sur le flux d’images affiché en direct : Grossissement, Dose maximale et Débit de dose. D’autres métadonnées peuvent être incluses si l’utilisateur le souhaite. Une capture d’écran de l’interface du logiciel MVS montrant les contrôles de gestion des doses est fournie dans le dossier supplémentaire 1.
4. Ouvrez l’onglet Dose et sélectionnez Gestion des doses et Activer la surveillance des doses pour activer le suivi automatisé des doses d’électrons. Sélectionnez Afficher la couche de dose pour afficher la superposition de couleur de dose.
5. Définissez les valeurs du niveau de dose élevé et du débit de dose élevé et appuyez sur Save (dans cet exemple, des valeurs de 60 000 e-/Å 2 et 500 e^-/Ų·s, respectivement, ont été utilisées).
6. Accédez à l’onglet Paramètres , sélectionnez Dose et définissez les valeurs Opacité de la carte de navigation de dose et Opacité de superposition d’image de dose (dans cet exemple, des valeurs de 0,50 et 0,30, respectivement, ont été utilisées).
7. Dans la fenêtre Live Image Viewer , activez la correction de dérive en cliquant sur Drift Correct.
8. Accédez à l’onglet Vue des données et tracez les valeurs de métadonnées Défocalisation et Quotient de focalisation sur l’axe Y.
   Remarque : Toutes les valeurs de métadonnées disponibles peuvent être tracées en temps réel pendant l’expérience à partir de la table de vue de données.
9. Activez Focus Assist, puis sélectionnez Calibrate Focus pour exécuter l’étalonnage automatisé Focus Assist. Une fois la routine Calibrate Focus terminée, fermez l’onglet Vue des données.
10. Ouvrez l’onglet Analyse d’image dans le logiciel MVS et activez les options Live FFT et Quadrants 1 & 2 .
11. À l’aide des commandes logicielles du microscope, ajustez les conditions du faisceau de sorte que le flux d’électrons soit ~500 e-/Ų·s. et déplacez-vous vers une nouvelle région de l’échantillon et centrez le retour sur investissement de l’échantillon dans la vue en direct du logiciel MVS.
    REMARQUE: Lorsque vous effectuez de grands mouvements de scène, le contrôle de la dérive et l’assistance à la mise au point se désactivent automatiquement et doivent être réactivés une fois le nouveau retour sur investissement sélectionné.
12. Notez les conditions de dose dans le logiciel à l’aide de la fonction Tag . Mettez en surbrillance l’icône Tag et entrez le texte souhaité pour indiquer une série spécifique d’images dans la timeline. Les images seront marquées avec ce texte jusqu’à ce que l’icône Balise soit désélectionnée.
13. Maintenir un débit de dose constant tout en imageant en continu le même retour sur investissement jusqu’à ce que les pics correspondant à la structure atomique dans le diagramme FFT aient disparu.
14. Réduisez l’agrandissement, ouvrez l’onglet Gestion des doses et activez Afficher la couche de dose pour superposer une carte de dose codée par couleur.
    REMARQUE : Cette fonction fournit une référence visuelle des zones de l’échantillon qui ont été exposées au faisceau d’électrons et de leur exposition relative à la dose. La mise en évidence de ces zones dans des images individuelles avec le curseur indiquera leurs valeurs de dose respectives.
15. Déconnectez-vous et terminez la session en désélectionnant Connexion, puis sélectionnez Fermer la session. Enregistrez une copie des données de session dans une source externe pour éviter que les données enregistrées dans le logiciel MVS ne soient écrasées lors d’expériences ultérieures (fichier supplémentaire 2).

3. Méthode 3 : Analyse des métadonnées et des tendances et exportation des données à l’aide du logiciel d’analyse

1. Lancez le logiciel d’analyse (le logiciel hors ligne permettant d’afficher les jeux de données entièrement synchronisés) et ouvrez le fichier de session d’expérience en le sélectionnant dans la bibliothèque de fichiers.
   REMARQUE : Les utilisateurs peuvent également accéder au logiciel d’analyse via l’icône Session de révision dans le logiciel MVS pendant une expérience.
2. Affichez les images corrigées de dérive en activant l’onglet DC sous le port d’affichage de l’image et sélectionnez les superpositions de données souhaitées en cochant leurs cases de données de superposition respectives dans l’onglet Métadonnées d’image (dans cet exemple, Microscope, Date/Heure, Débit de dose, Dose maximale et Agrandissement ont été utilisés). D’autres métadonnées peuvent être tracées selon les souhaits de l’utilisateur.
3. Cochez la case Chronologie de la dose maximale et du débit de dose pour ajouter un graphique de ces valeurs à la chronologie. Mettez en surbrillance ou faites défiler ces tracés graphiques pour mettre à jour l’image affichée dans la fenêtre d’affichage. Accédez à une variété d’outils via les onglets Notes, Analyse d’image, Boîte à outils et Vue de données.
   1. Accédez à la FFT de chaque image via l’onglet Analyse d’image et cliquez sur FFT en direct pour mettre à jour la FFT tout en faisant défiler les images.
   2. Utilisez la décoloration des pics FFT pour déterminer le moment où la structure de la zéolite perd sa cristallinité. Enregistrez la valeur de dose maximale enregistrée avec cette image.
4. Utilisez l’option Filtrer pour filtrer facilement des jeux de données volumineux en jeux de données plus petits et partageables sans perdre leurs métadonnées associées. Ouvrez le panneau de filtre et ajustez les curseurs de sorte que seules les données avec un débit de dose égal ou supérieur à ~500 e^-/Ų·s soient sélectionnées, et enregistrez la nouvelle collection sous le nom Étude du seuil de dose.
   Remarque : Des filtres peuvent être appliqués pour n’importe lequel des types de métadonnées associés.
5. Exportez les images et les métadonnées de la session vers d’autres types de fichiers enrichis de barres d’échelle et de superpositions de métadonnées.
   1. Mettez la collection en surbrillance dans le volet Bibliothèque et sélectionnez Publier en cliquant avec le bouton droit sur la sélection. Dans la fenêtre Publier , sélectionnez les options souhaitées pour l’exportation du type de fichier.
   2. Sélectionnez l’onglet Données corrigées de dérive et appliquez des superpositions de toutes les métadonnées souhaitées et de la FFT (positionnez la superposition FFT comme vous le souhaitez ; des exemples d’images exportées avec la FFT sont présentés à la figure 3).
6. Exportez la série d’images en tant que fichier vidéo à l’aide de la même option de publication . Sélectionnez les images en les mettant en surbrillance dans le scénario, en utilisant les options de filtre ou en exportant le fichier de base de données complet. Sélectionnez le format vidéo, la fréquence d’images et l’emplacement du fichier souhaités. Un film de l’expérience de dégradation de la zéolite obtenue à l’aide d’un TEM de 200 kV est fourni dans le dossier supplémentaire 3.
7. Exportez les métadonnées séparément des images acquises sous forme de fichier CSV en sélectionnant l’option Métadonnées (CSV) lors de la publication.
   REMARQUE : Les images brutes et corrigées de dérive sont exportées en tant que fichiers CSV distincts (fichier supplémentaire 4 et fichier supplémentaire 5).

4. Méthode 4: Etude de chauffage in situ de l’or sur des nanoparticules d’oxyde de fer

1. Dropcast un nanocatalyseur (Au/FeO_x) en suspension dans de l’éthanol sur une puce électronique de chauffage in situ , un support d’échantillon mico-électro-électromécanique (MEM), et laissez-le sécher à l’air. Montez l’échantillon dans le support de chauffage in situ , insérez le support avec l’échantillon dans le TEM et connectez le support au bloc d’alimentation à l’aide du câble fourni. Localisez un exemple de retour sur investissement à l’aide des contrôles TEM.
   REMARQUE: Cette expérience a utilisé un support de chauffage entièrement intégré au logiciel MVS, ce qui permet d’intégrer les métadonnées de température aux images.
2. Sélectionnez l’option de workflow appropriée dans le logiciel MVS (dans cet exemple, le workflow Fusion a été utilisé, mais d’autres supports de chauffage du fabricant peuvent être utilisés en sélectionnant Autre).
3. Suivez les instructions du flux de travail pour confirmer la connexion électrique entre le support et la puce électronique chauffante en chargeant le fichier d’étalonnage et en effectuant une vérification de l’appareil.
4. Connectez le microscope au logiciel MVS, comme indiqué précédemment aux étapes 2.3 à 2.10 (dans cet exemple, les valeurs de métadonnées pour le débit de dose, la dose maximale, la corrélation de correspondance, le taux de dérive et la température du canal A ont été sélectionnées) et centrez le retour sur investissement de l’échantillon dans le champ de vision.
5. Ouvrez l’onglet Fusion AX , configurez et appliquez une température.
6. Cliquez sur le bouton Channel A Setup (Configuration du canal A ) pour accéder aux paramètres de contrôle de la température. Sélectionnez la fonction Température et le mode de contrôle manuel .
7. Cliquez sur le bouton Expérimenter pour accéder aux contrôles expérimentaux. Réglez la vitesse de rampe à 10 °C/s et l’objectif à 600 °C. Cliquez sur Appliquer pour commencer l’expérience.
   REMARQUE : l’expérience peut être interrompue ou arrêtée à tout moment à l’aide des boutons d’accès rapide situés dans le coin inférieur droit du logiciel MVS, sans ouvrir l’onglet Fusion AX .
8. Une fois la température réglée de 600 °C atteinte, ouvrez l’onglet Fusion AX et sélectionnez Expérimenter. Modifiez le taux de rampe à 2 °C et l’objectif à 800 °C. Cliquez sur Appliquer pour commencer l’expérience.
   REMARQUE : La procédure d’application d’une rampe de chauffage dépend du système de chauffage in situ utilisé. Les étapes décrites ci-dessus pour appliquer la rampe de température s’appliquent au système utilisé dans cet exemple.
9. Mettez en surbrillance tous les événements ou points d’intérêt au cours de l’expérience à l’aide de la fonction de marquage, comme illustré à l’étape 2.10. Continuez à imager l’échantillon et ajustez le profil de température comme vous le souhaitez. Lorsque vous avez terminé, cliquez sur Terminer la session et enregistrez le fichier de données à l’aide du logiciel d’analyse (une partie du fichier de base de données dont il est question dans les résultats représentatifs est fournie en tant que fichier supplémentaire 6).
10. Ouvrez le logiciel d’analyse pour revoir la session. Tracez la température, le facteur de morphing du modèle, le débit de dose et la dose cumulée dans la chronologie. Exportez des images et des films comme vous le souhaitez en suivant les étapes décrites aux étapes 3.6 et 3.7. Les images et les vidéos peuvent être exportées avec ou sans les superpositions de cartes de dose (Figure 4).

Representative Results

Ce travail met en évidence l’utilité de l’acquisition de données à l’aide du logiciel MVS pour l’imagerie TEM et les expériences in situ. L’alignement du microscope et la configuration de l’état ont été effectués et sélectionnés à l’aide des commandes par défaut du fabricant de la GDT. Après la configuration initiale, les protocoles présentés dans cet article vidéo ont été réalisés via le logiciel MVS. Une TEM de 300 kV a été utilisée pour toutes les expériences présentées dans le protocole vidéo et les données représentatives, à l’exception des données de comparaison sur la zéolite qui ont été acquises à l’aide d’un FEG froid de 200 kV (figure 3D-F et tableau 1). Toutes les métadonnées ont été collectées et alignées automatiquement sur leurs images respectives par le logiciel MVS.

Après avoir lancé le logiciel et sélectionné le flux de travail approprié dans le menu, une connexion au microscope est établie en activant le bouton Connecter dans la barre d’outils à l’extrême gauche de la visionneuse d’images, comme illustré à la figure 1A. Lorsque le bouton Connecter est mis en surbrillance, les images et les métadonnées associées du microscope sont automatiquement diffusées dans le logiciel MVS et apparaissent dans le volet d’affichage de l’image. Ces images et leurs métadonnées associées sont enregistrées chronologiquement dans une chronologie qui peut être ouverte, examinée et analysée sans interrompre l’enregistrement de nouvelles données dans la chronologie (Figure 1B). Le streaming peut être interrompu par l’utilisateur à tout moment en désactivant l’icône Connecter .

Une fois la connexion activée, d’autres flux de travail qui dépendent de l’infrastructure logicielle MVS sont accessibles. Dans les exemples présentés dans ce protocole vidéo, un étalonnage de dose doit être effectué avant d’utiliser les autres fonctions du logiciel MVS. L’étalonnage de dose est un processus automatisé contrôlé par le logiciel MVS; il utilise un support d’étalonnage de dose de coupelle Faraday dédié pour mesurer le courant et la surface du faisceau pour la combinaison de paramètres. Le support d’étalonnage de la coupelle Faraday, illustré à la figure 2, se connecte à un picoampèremètre externe, qui mesure avec précision le courant du faisceau. Une fois inséré dans le microscope, le trou d’alignement fiduciaire est centré et les conditions de faisceau souhaitées à étalonner (tailles de points, ouvertures et grossissements) sont entrées dans le logiciel. Le logiciel effectue une série d’étapes d’étalonnage pour chaque combinaison des conditions sélectionnées. Pendant l’étalonnage de la dose, le support se déplace automatiquement entre la coupelle collectrice de courant de Faraday intégrée et le trou traversant. La mesure de courant pour chaque combinaison de conditions de lentilles est mesurée sur la coupelle de Faraday par le picoampèremètre. Ensuite, le logiciel traduit l’étape pour centrer le faisceau dans le trou traversant et la surface du faisceau est déterminée par des algorithmes de vision industrielle. Cette série de mesures établit un profil de la relation entre l’intensité/luminosité et la surface du faisceau. Cela permet au logiciel d’extrapoler la zone du faisceau lorsque le réglage intensité/luminosité est ajusté au cours d’une expérience, quel que soit le champ de vision. Les valeurs de dose cumulée et de débit de dose sont calculées à l’aide de ces mesures du courant de faisceau et de la surface du faisceau, et un fichier d’étalonnage de dose est généré. Ce processus définit essentiellement une « empreinte » de dose pour le TEM et ses conditions de lentilles individuelles. Une fois la dose calibrée pour la MET, l’utilisateur est en mesure de fonctionner normalement et d’ajuster librement le grossissement et l’intensité sans perte d’information sur la dose ou de prise manuelle^{de notes 17}. Une fois l’étalonnage terminé, le support d’étalonnage de dose est retiré, ce qui permet à l’échantillon d’être inséré normalement. Le processus d’étalonnage pour les modes TEM et STEM prend normalement moins de 10 minutes.

Après avoir étalonné les conditions de dose, un échantillon de nanoparticules de zéolite (ZSM-5) acheté dans le commerce a été imagé dans des conditions de débit de dose élevé afin de déterminer la dose seuil (cumulative) à laquelle l’échantillon est trop endommagé pour fournir des informations structurelles. Les nanoparticules ZSM-5 ont été suspendues dans de l’éthanol et projetées sur une grille TEM en cuivre conventionnelle. Ils ont été imagés en continu à 300 kV en mode TEM en utilisant une taille de point de 3 et une ouverture de condensateur de 100 μm. Le débit de dose lu par le logiciel MVS dans des conditions de débit de dose élevé était de 519 e^-/Ų·s. Les nanoparticules dans le champ de vision ont été imagées en continu jusqu’à ce que les pics de la FFT disparaissent, indiquant une dégradation de la structure cristalline, comme le montrent la figure 3A-C et le fichier supplémentaire 3. Des superpositions (qui peuvent être ajoutées pendant une expérience en direct ou par la suite dans le logiciel d’analyse) ont été appliquées aux images TEM pour indiquer la date et l’heure, le débit de dose, la dose maximale (cumulative) et l’agrandissement. Le débit de dose a été maintenu constant pendant les expériences, la dose cumulée (dose maximale) augmentant en fonction du temps. Les pics FFT ont commencé à disparaître après 42 s d’imagerie continue (Figure 3B). A 1 min et 20 s et une dose cumulée de ~60 000 e^-/Ų, les pics FFT avaient complètement disparu (Figure 3C).

Pour montrer que cette méthode d’étalonnage génère des mesures quantitatives de dose qui peuvent être appliquées à d’autres microscopes fonctionnant dans des contextes différents, le même processus d’étalonnage et la même expérience de dégradation de la zéolite ont été menés à l’aide d’un pistolet à émission de champ froid (FEG) TEM de 200 kV et d’une taille de point de 1. Ce microscope a été étalonné en utilisant la même procédure décrite dans la méthode 1, et la même expérience décrite dans la méthode 2 a été réalisée en utilisant les nouveaux paramètres de taille et d’ouverture du spot. Les réglages du faisceau ont été ajustés de manière à ce que la différence de débit de dose appliqué entre les deux expériences soit négligeable (499 e-/Å 2·s contre 519 e^-/Ų·s). Comme le montre la figure3 D-F et résumé dans le tableau 1, les taches FFT disparaissent complètement après 1 min et 50 s d’imagerie continue et une dose cumulée de 58 230 e-/Ų, ce qui correspond aux valeurs obtenues dans la première expérience.

Un exemple de la façon dont le logiciel MVS peut bénéficier d’expériences in situ a été montré en effectuant une expérience de chauffage. Un échantillon représentatif de nanocatalyseur, Au/FeO_x (synthétisé selon une procédure publiée¹⁹), a été choisi comme exemple de système car il subit des changements morphologiques et structurels dynamiques à haute température. Cette mobilité induite par la température rend difficile le maintien du retour sur investissement centré dans le champ de vision en raison du mouvement de l’échantillon et de la dilatation thermique de l’échantillon lui-même lors des changements de température¹⁸. Lorsque les fonctions Drift Correct et Focus Assist sont activées, l’échantillon a été imagé sur une période de ~30 s à 800 °C. À des températures élevées, les nanoparticules d’or dans l’Au/FeO_x ont migré le long de la surface du support d’oxyde de fer et se sont frittées pour former des particules plus grosses, comme le montre la figure 4 et sous forme de film dans le dossier supplémentaire 7. La figure 5 montre une série d’instantanés TEM (figure 5A-F) d’une région poreuse dans un nanocatalyseur Au/FeO_x, enregistrés à divers points temporels (figure 5G) au cours d’une expérience de chauffage in situ. La valeur de dérive coordonnée du retour sur investissement a été automatiquement calculée par le logiciel. Les valeurs coordonnées de dérive et de température des images au cours de la série sont illustrées graphiquement à la figure 5G. Comme prévu, la dérive coordonnée de l’échantillon augmente à mesure que le profil de température augmente, passant d’un taux de ~9 nm/min à ~62 nm/min, et commence à diminuer vers une stabilisation lorsque la température est maintenue constante. Malgré ce taux élevé de dérive et les changements dans la morphologie de l’échantillon, des images à haute résolution sont facilement obtenues pendant l’augmentation de la température, révélant un mouvement dans la région poreuse, comme le montre le dossier supplémentaire 8. Reportez-vous au fichier supplémentaire 9 pour obtenir des instructions de téléchargement et les spécifications de l’ordinateur.

Figure 2 : Étalonnage et suivi de la dose d’électrons. (A) La dose est étalonnée à l’aide d’un porte-échantillon dédié qui contient un collecteur de courant positionné sur le plan d’échantillonnage pour les mesures de courant de faisceau. (B) Illustration des caractéristiques de la conception de la pointe : À gauche : coupe de Faraday; Milieu: trou fiduciaire; À droite : trou traversant (C). La dose d’électrons appliquée peut être visualisée dans le logiciel à l’aide de cartes codées par couleur pour indiquer différentes expositions à la dose dans une image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Dégradation induite par la dose d’électrons des nanoparticules de zéolite (ZSM-5). (A-C) Instantanés pris sur une période de 1 min et 20 s montrant les données de dégradation obtenues avec un FEG de 300 kV et un débit de dose mesuré de 519 e-/Ų·s; la zéolithe se dégrade en 1 min et 20 s. (D-E) Instantanés pris sur une période de 1 min et 50 s montrant les données de dégradation obtenues avec un TEM FEG froid de 200 kV et un débit de dose électronique de 499 e-/Ų·s; les encarts montrent que la tache FFT s’estompe avec le temps. La barre d’échelle est de 60 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : AXON synchronicity applique des algorithmes de vision industrielle pour suivre et stabiliser des échantillons évoluant dynamiquement. Les métadonnées générées au cours de l’expérience peuvent être tracées le long de la chronologie, ce qui permet à l’utilisateur de coupler rapidement une image avec ses métadonnées associées lorsqu’il fait défiler la série d’images générée pendant l’expérience. (A-H) Images d’un échantillon de nanocatalyseur (Au/FeO_x) à 800 °C enregistrées sur une période de 28 s avec (A-D) et sans (E-H) la superposition de carte de dose. Les zones rouges dans la superposition indiquent les régions d’exposition à des doses cumulatives élevées, et les zones jaunes indiquent les régions d’exposition plus faible. La mise en surbrillance d’un pixel individuel indique la dose cumulée pour ce pixel. Les flèches blanches dans les panneaux E-H indiquent deux particules qui fusionnent au cours de l’expérience, et la flèche orange indique la trajectoire d’une particule d’or en mouvement. (I) La chronologie de l’expérience générée par le logiciel d’analyse pour la série d’images illustrée dans A-H. Les points orange en haut de la chronologie indiquent des images brutes (non corrigées numériquement) et les points bleus indiquent des images corrigées par dérive. Les barres verticales orange indiquent les points de la timeline correspondant aux images affichées des panneaux A-H. La barre d’échelle est de 40 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Instantanés TEM d’une région poreuse au sein d’un nanocatalyseur Au/FeOx à différents moments. Le logiciel MVS stabilise et centre l’échantillon même lors de taux de dérive élevés, tels que ceux qui se produisent lors d’une rampe de température grâce à l’application de corrections de scène, de déplacement de faisceau et numériques, comme indiqué par les algorithmes de vision industrielle. (A-F) Instantanés TEM d’une région poreuse dans un nanocatalyseur Au/FeOx, enregistrés à divers points temporels (G) au cours d’une expérience de chauffage in situ. Le taux de dérive du ROI est automatiquement calculé et enregistré lors d’une expérience par le logiciel MVS. Comme indiqué en (G), à mesure que le profil de température est modifié (la ligne bleue), le taux de dérive (ligne orange) augmente à mesure que la température augmente et diminue lorsque la température est maintenue constante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Microscope Type	300 kV FEG TEM	200 kV Cold FEG TEM
Taille du spot/condenseur 2 Ouverture	3/100 μm	1/100 μm
Débit de dose	519 e-/A2•s1	499 e-/A2•s1
Perte de structure mesurée par FFT (Dose accumulée)	60 270 e-/A2	58 230 e-/A2

Tableau 1 : Comparaison sommaire des résultats de dégradation de la zéolite obtenus à partir de différents microscopes.

Fichier supplémentaire 1 : Capture d’écran de l’interface du logiciel MVS avec l’onglet de gestion des doses ouvert. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Fichier de base de données du logiciel MVS de l’expérience de dégradation de la zéolite induite par faisceau. Ce logiciel de visualisation/analyse peut être téléchargé gratuitement. Veuillez consulter le dossier supplémentaire 9 pour obtenir des instructions de téléchargement et les spécifications de l’ordinateur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Film de dégradation de la zéolite induite par le faisceau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Fichier CSV 1 (dégradation de la zéolite : données brutes [correction mécanique uniquement]) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5 : fichier CSV (dégradation de la zéolite : correction de la dérive [correction mécanique + numérique]) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Fichier de base de données du logiciel MVS nanocatalyseur expérience de chauffage in situ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 7 : Film du nanocatalyseur à 800 °C avec superpositions de dose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 8 : Film du nanocatalyseur pendant une rampe de température avec des valeurs de dérive coordonnées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 9 : Instructions pour télécharger le logiciel d’analyse gratuit. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

L’interprétation des résultats expérimentaux de la TEM dépend souvent de nombreux paramètres expérimentaux interconnectés, tels que les réglages du microscope, les conditions d’imagerie et, dans le cas d’expériences operando ou in situ, les modifications de l’environnement ou des stimuli ^1,23. L’analyse précise de grands ensembles de données TEM, sur lesquels ces paramètres peuvent être continuellement modifiés, exige une attention particulière de la part de l’opérateur pour enregistrer avec précision chaque condition et chaque réglage pour chaque image dans un journal de laboratoire ou une autre source de documentation externe. À mesure que les ensembles de données de GDT gagnent en taille et en complexité, la tenue manuelle des dossiers devient ingérable et des informations clés peuvent être omises ou mal enregistrées. Le logiciel MVS décrit ici consolide les métadonnées générées au cours d’une expérience à partir du microscope, du détecteur/caméra et d’autres systèmes (tels que les porte-échantillons in situ) et les aligne avec leurs images respectives.

En plus de la consolidation des métadonnées, le logiciel applique des algorithmes de vision industrielle pour suivre et stabiliser le champ de vision grâce à une combinaison de corrections spatiales, de faisceaux et numériques à l’aide de ses fonctions Drift Correct et Focus Assist . Lorsque la fonction Drift Correct est activée, une image de « modèle » de corrélation croisée est générée à l’aide de la première image extraite dans le logiciel MVS. Le modèle est ensuite comparé aux images entrantes pour calculer la direction et l’ampleur de la dérive ou du mouvement de l’échantillon. Avec ces informations, le logiciel MVS applique automatiquement les corrections nécessaires pour conserver les caractéristiques de l’image au même endroit en ajustant au moins l’un des trois paramètres suivants: emplacement de la scène, déplacement du faisceau ou de l’image et correction d’image numérique. La fonction Focus Assist utilise une combinaison d’algorithmes pour attribuer une valeur de mise au point, appelée score de mise au point à chaque image, et ces scores sont comparés pour déterminer l’ampleur et la direction du réglage de la mise au point à appliquer pour maintenir la mise au point de l’échantillon. En mode d’imagerie STEM, le logiciel MVS tente de maximiser le contraste grâce à une version propriétaire de la variance normalisée pour attribuer le score de mise au point. En mode TEM, une somme radiale d’intensité est calculée dans la FFT et utilisée pour calculer le score de mise au point. La capacité du logiciel MVS à optimiser la mise au point est limitée lorsqu’il ne peut pas calculer avec précision le score de mise au point correct pour une image. Cela se produit généralement lorsque le microscope est mal aligné ou que l’échantillon est significativement flou pendant l’étalonnage, empêchant le logiciel de calculer correctement la valeur correcte du score de mise au point de départ. Le logiciel MVS peut avoir des difficultés à calculer le score de mise au point pour les échantillons avec des franges de réseau bien définies, car les franges de réseau dans la FFT peuvent « submerger » l’algorithme de notation de mise au point; Ainsi, si un échantillon sort de la mise au point, le score de mise au point peut ne pas refléter avec précision le changement de mise au point. Inversement, travailler à de faibles grossissements ou avec un échantillon qui a un signal FFT faible peut également rendre difficile le calcul d’un bon score de mise au point. Pour atténuer ces difficultés, le logiciel MVS contient un certain nombre d’algorithmes supplémentaires qui peuvent être sélectionnés par l’utilisateur pour calculer le score de mise au point si les paramètres par défaut ne conviennent pas à l’échantillon. Ceux-ci doivent être testés et appliqués au cas par cas pour déterminer les meilleurs algorithmes pour une expérience donnée.

Les changements morphologiques dans la structure de l’échantillon au fil du temps sont pris en compte à l’aide d’un facteur de morphing de modèle. Ce filtre est réglable par l’opérateur, de sorte que les algorithmes d’enregistrement tiennent compte des changements morphologiques au fil du temps. En outre, le logiciel surveille l’image continue, les paramètres du microscope et les paramètres de la caméra ou du détecteur pour mettre à jour automatiquement le modèle lorsqu’il est déclenché par des modifications de la structure de l’échantillon et après toute modification induite par l’opérateur des paramètres du microscope, de la caméra ou du détecteur. Comme le montrent la figure 4, la figure 5, le fichier supplémentaire 7 et le fichier supplémentaire 8, le logiciel MVS fournit une stabilisation efficace et immédiate, permettant une imagerie haute résolution d’échantillons en mouvement ou en changement dynamiques. Bien que le logiciel soit capable de contrôler des taux très élevés de dérive ou de mouvement d’échantillon, tels que ceux qui se produisent lors de l’application d’une rampe de chauffage au cours d’une expérience in situ, il existe des limites aux corrections de scène maximales ou aux déplacements de faisceau que le logiciel peut contrôler si l’échantillon se déplace ou dérive très rapidement. Cette limite est fonction du taux de mise à jour de l’image, de la taille du champ de vision et du taux de dérive. Pour un champ de vision et un taux de mise à jour de l’image donnés, il existe un taux de dérive maximal qui peut être corrigé, et si les mouvements physiques ne peuvent pas suivre, le processus peut se terminer ou devenir instable. À partir des modèles d’enregistrement générés lorsque des fonctionnalités telles que Drift Correct sont appliquées, des métadonnées calculées supplémentaires peuvent être générées. Par exemple, la corrélation de correspondance est un enregistrement numérique de l’ampleur du changement entre les modèles d’une série et est utilisée pour identifier les points d’une chronologie expérimentale dans laquelle l’échantillon a changé. Une valeur de corrélation de correspondance élevée correspond à un échantillon qui a subi des modifications de sa morphologie, et une valeur de corrélation de correspondance faible correspond à un échantillon dont la structure reste relativement statique. La corrélation de correspondance est particulièrement utile pour les études in situ car elle peut être tracée graphiquement, ce qui permet à l’utilisateur de localiser rapidement les images de la série correspondant à un changement significatif de l’échantillon. Il est important, cependant, de comprendre que des valeurs de corrélations de correspondance élevées peuvent également correspondre à des changements dans les conditions d’imagerie, tels que le déplacement de la scène ou la modification du grossissement, si ces actions sont effectuées alors que la fonction de correction de la dérive reste active.

Le flux de travail d’étalonnage présenté ici utilise un support d’étalonnage unique et une routine d’étalonnage semi-automatisée pour étalonner avec précision le faisceau dans diverses conditions de lentille avec une intervention minimale de l’opérateur. La routine d’étalonnage de la dose est accessible via le logiciel MVS installé sur le TEM. Le logiciel MVS lit automatiquement les paramètres pertinents du microscope pour enregistrer toutes les mesures à référence pour des expériences ultérieures. Sur certains TEM, il n’est pas possible de lire les réglages d’ouverture ou de monochromateur, et ceux-ci doivent être saisis dans les paramètres du logiciel MVS par l’opérateur pendant les étalonnages et pendant l’utilisation. Des rappels sont intégrés au logiciel pour vous aider à maintenir ces paramètres d’entrée de l’opérateur à jour en suivant les instructions du programme. Le développement d’un support avec un collecteur de courant intégré, plutôt que de s’appuyer sur un support intégré ailleurs dans la colonne du microscope, est un choix de conception délibéré. Cela permet au collecteur de courant d’être positionné sur le même plan qu’un échantillon, éliminant ainsi les erreurs de mesure du courant causées par la déviation du faisceau ou les différences dans l’absorption des électrons par les ouvertures à différentes positions du faisceau. Le logiciel MVS suit une routine automatisée pour mesurer le courant et la surface du faisceau pour toute combinaison de conditions de lentille. Le logiciel peut ensuite corréler ces étalonnages mesurés avec la caméra ou le courant de l’écran et extrapoler tout changement de grossissement, etc. à la surface du faisceau pendant l’expérience. Une fois générés, ces fichiers d’étalonnage peuvent être utilisés immédiatement et sont automatiquement enregistrés pour une utilisation ultérieure si le logiciel détecte les mêmes paramètres utilisés lors d’une session ultérieure. Bien que la longévité du fichier d’étalonnage varie d’un microscope à l’autre, les auteurs ont constaté qu’ils sont capables d’utiliser les mêmes fichiers d’étalonnage pendant plusieurs mois sans observer de changements substantiels aux valeurs actuelles. Il existe des routines intégrées surveillant le profil d’émission des armes à feu pour aider à maintenir la pertinence de ces étalonnages, en particulier sur les pistolets à émission FEG à froid.

La normalisation des mesures de dose entre les microscopes et le suivi automatisé de l’exposition du faisceau d’un échantillon sont des fonctions essentielles du logiciel MVS, car elles permettent des comparaisons quantitatives des conditions de dose entre les expériences à effectuer sur différents systèmes de microscope. La dégradation induite par la dose d’un échantillon de zéolite (ZSM-5), obtenue au cours d’expériences identiques utilisant différents microscopes, entraîne la disparition complète des taches FFT après une dose électronique cumulative ou seuil maximale (~60.000 e-/Å 2 lors de l’application d’un débit de dose de ~500 e^-/Ų·s) pour les deux configurations. Ces résultats comparatifs démontrent que le logiciel de dose facilite les mesures de dose quantitatives reproductibles. La petite différence dans la dose cumulée à laquelle la disparition complète du point FFT est observée pour chaque expérience est probablement le résultat des différentes tensions d’accélération utilisées par les deux microscopes, avec des tensions d’accélération plus faibles entraînant plus de voies de dommages par rayonnement, et des tensions d’accélération plus élevées entraînant généralement plus de dommages par knock-on²⁴. Les résultats de la littérature pour la dose critique de nanoparticules ZSM-5 vont de 9 000 à 14 000 e^-/Ų en utilisant les premières disparitions de taches FFT, plutôt que la disparition complète de toutes les taches FFT^25,26. Dans nos résultats, la première disparition du point FFT correspond à une dose cumulée d’environ 25 000 e^-/Ų. Les études précédentes se sont appuyées sur des mesures de courant obtenues à l’aide d’un écran au phosphore, ce qui est bien documenté pour sous-estimer les mesures de courant de faisceau par rapport à une tasse de Faraday¹⁵. La dose critique déterminée peut varier d’un facteur de deux ou plus, selon le pic de FFT utilisé pour suivre la dose. Cela indique que les fréquences spatiales plus élevées se dégradent en premier et peuvent entraîner des valeurs différentes en fonction de l’accès à la zone utilisée lors des mesures (nos résultats se sont concentrés sur les taches FFT du cristal de zéolite entier, plutôt que sur des caractéristiques structurelles spécifiques)^25,26. Ces différences dans les techniques et l’étalonnage actuel expliquent la différence de valeurs entre les deux expériences rapportées dans nos résultats et les études de littérature antérieures.

Bien que les interactions entre les doses d’électrons soient un facteur important dans de nombreuses expériences TEM, les études in situ et spécifiquement liquide-EM sont particulièrement sensibles à ses effets. La radiolyse des liquides par le faisceau d’électrons entraîne une cascade d’espèces chimiquement réactives qui peuvent interagir avec l’échantillon, compliquant l’analyse. Le débit de dose ou la fluence utilisée au cours d’une expérience EM liquide et la dose cumulative peuvent avoir une influence sur la concentration d’espèces radicalaires générées par radiolyse^{liquide 27,28}. Ainsi, la collecte et l’enregistrement des métadonnées cumulatives des doses et des débits de dose tout au long d’une expérience permettent une corrélation directe entre les images et l’historique des doses d’un échantillon, et constituent un moyen plus précis d’élucider et de contrôler l’impact du faisceau d’électrons dans ces expériences. Bien que cela ne soit pas couvert par ce protocole, un exemple de l’utilité des caractéristiques de gestion de la dose pour la ME liquide est présenté à la figure 6.

Figure 6 : Croissance induite par faisceau de nanoparticules d’or au cours d’une expérience EM liquide in situ. (A) Vue d’ensemble STEM à faible grossissement de la croissance des particules résultante avec une superposition de couleur de la carte des doses cumulées dans toute la région. Les zones rouges dans la superposition indiquent les régions d’exposition à forte dose cumulative et les zones jaunes indiquent les régions où l’exposition est plus faible. La mise en surbrillance d’un pixel individuel avec le curseur ou le dessin d’une boîte sur une zone à l’aide des outils de dessin inclus indique la dose cumulée pour ce pixel ou cette zone. La barre d’échelle est de 2 μm. (B,C) Images STEM à fort grossissement des zones indiquées par les cases orange (b,c) dans A. La zone b, exposée à une dose cumulée plus élevée (10,811 e-/Å 2) contient des particules plus grosses que celles trouvées dans la zone c, qui a été exposée à une dose cumulée plus faible (0,032 e^-/Å ²). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les métadonnées sur le débit de dose enrichi et les doses cumulées simplifient l’analyse des voies de croissance et de dégradation des nanomatériaux dose-dépendantes. La figure 6 montre la réduction induite par faisceau d’une solution d’ions chlorure d’or aurique (HAuCl₃) dans l’eau au cours d’expériences liquide-EM. À partir de la superposition de la carte de dose en couleur de la figure 6A, il est facile de visualiser que la dose cumulative d’électrons influence la taille et la forme résultantes des nanoparticules 29,30,31,32. L’aperçu des STIM à faible grossissement montre les régions exposées à une dose cumulative élevée (rouge) et faible (jaune). Les particules dans la région exposée à des doses plus élevées sont plus grosses que celles dans les régions exposées à des doses cumulatives plus faibles. Étant donné que les métadonnées de dose sont directement intégrées dans chaque image au niveau des pixels, les effets complexes de la dose d’électrons dans les expériences liquide-EM peuvent maintenant être systématiquement analysés d’une manière qui n’était jamais réalisable auparavant.

Dans ce protocole, nous avons démontré que le logiciel MVS fournit une solution complète pour étalonner, surveiller et suivre à la fois la dose d’électrons et la dose totale délivrée à un échantillon pixel par pixel. Cette capacité ouvre la voie à un nouveau paradigme pour l’imagerie d’échantillons sensibles à la dose et la compréhension des interactions avec les faisceaux d’électrons. C’est particulièrement excitant pour les expériences liquide-EM, car cela permettra une interrogation plus efficace sur le rôle que joue la dose d’électrons et améliorera la reproductibilité expérimentale. Nous espérons que ce nouveau cadre permettra la collecte précise de l’information sur le débit de dose et les doses accumulées, facilitera le partage de ces données avec la communauté pour une interprétation plus précise des résultats de la GDT et fera progresser la collaboration scientifique et le partage des données en permettant la production de rapports et l’analyse des principaux rapports et analyses de FAIR.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARM200F CFEG	JEOL		Transmission Electron Microscope (200 kV)
AXON DOSE Calibration Holder	Protochips, Inc.	AXA-FC-TFS	Dose calibration and management hardware package for ThermoFisher ScientificTEM
AXON DOSE Software:  Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-DOSE-01-1YR	Dose calibration and management software
AXON Studio Software: Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	No Part Number. Available to download at  success.protochips.com	Offline analysis software for AXON datasets.  A free copy of the AXON Studio software is available for down load at:  success.protochips.com
AXON Synchronicity Core	Protochips, Inc.	AXON-CORE	Hardware component of the synchronization software.
AXON Synchronicity Software:  Version 10.6.5.3	Protochips, Inc.	AX-MOD-SYNCPRO-01-1YR	Synchronization software
Fusion In-Situ Heating E-chip	Protochips, Inc.	E-FHDC-VO-10	Sample Support E-chip with carbon film.  Used with in situ heating system
Fusion Select In Situ Heating System	Protochips, Inc.	FFAD-6200-EXP	In-situ MEMs heating system for ThermoFisher Scientific TEM.
Gold(III) chloride (50% gold basis) hydrate 50790	Sigma Aldrich	27988-77-8	Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Iron (III) Oxide 310050 (Fe2O3)	Sigma Aldrich	1309-37-1	Used to prepare Au/FeOx nanocatalyst.  Coprecipitation synthesis procedure followed in C. Sze et al. Materials Letters. 36 (1–4), 11–16 (1998)
Titan ChemiSTEM	ThermoFisher Scientific		Transmission Electron Microscope (300 kV)
Zeolite ZSM-5	Zeolyst	CBV 8014	Nanocatalyst sample:  80 SiO2/Al2O3 Mole Ratio