Summary
Detta protokoll beskriver tillverkningen av ett stabilt, biologiskt relevant fantommaterial för optiska och akustiska biomedicinska avbildningsapplikationer, med oberoende avstämbara akustiska och optiska egenskaper.
Abstract
Att etablera vävnadsliknande biofotoniska fantommaterial som ger långsiktig stabilitet är absolut nödvändigt för att möjliggöra jämförelse av biomedicinska bildenheter mellan leverantörer och institutioner, stödja utvecklingen av internationellt erkända standarder och hjälpa till med klinisk översättning av ny teknik. Här presenteras en tillverkningsprocess som resulterar i ett stabilt, billigt, vävnadsliknande sampolymer-i-oljematerial för användning i fotoakustiska, optiska och ultraljudsstandardiseringsinsatser.
Basmaterialet består av mineralolja och en sampolymer med definierade CAS-nummer (Chemical Abstract Service). Det protokoll som presenteras här ger ett representativt material med en ljudhastighet c(f) = 1,481 ± 0,4 m·s-1 vid 5 MHz (motsvarar ljudets hastighet vid 20 °C), akustisk dämpning α(f) = 6,1 ± 0,06 dB·cm-1 vid 5 MHz, optisk absorption μa(λ) = 0,05 ± 0,005 mm-1 vid 800 nm, och optisk spridning μs'(λ) = 1 ± 0,1 mm-1 vid 800 nm. Materialet möjliggör oberoende inställning av de akustiska och optiska egenskaperna genom att variera polymerkoncentrationen respektive ljusspridningen (titandioxid) respektive absorberingsmedlen (oljelösligt färgämne). Tillverkningen av olika fantomdesigner visas och homogeniteten hos de resulterande testobjekten bekräftas med fotoakustisk avbildning.
På grund av dess underlätta, repeterbara tillverkningsprocess och hållbarhet, liksom dess biologiskt relevanta egenskaper, har materialreceptet högt löfte i multimodala akustisk-optiska standardiseringsinitiativ.
Introduction
Att fastställa precisionen och noggrannheten hos nya biomarkörer för optisk avbildning genom teknisk validering 1,2 är avgörande för att säkerställa att de genomförs framgångsrikt i klinisk praxis. För att uppnå detta använder tekniska valideringsstudier ofta varaktiga fysiska fantomer, vilket underlättar prestandabedömning mellan instrument och rutinmässig kvalitetskontroll. För utbredd användning av ett fantommaterial i forskning och klinisk översättning krävs ett enkelt, mycket reproducerbart tillverkningsprotokoll. Ett idealiskt biofotoniskt fantommaterial bör innehålla följande egenskaper3: (1) oberoende avstämbara egenskaper inom biologiskt relevanta områden; (2) mekanisk robusthet; 3) långsiktig stabilitet, (4) flexibilitet i geometri och arkitektur; 5) säker hantering, (6) allmänt tillgängliga ingredienser som kan köpas från vanliga vetenskapliga leverantörer; och (7) låg kostnad. För närvarande saknar biofotoniska applikationer ett standardiserat protokoll för ett allmänt accepterat fantommaterial som uppfyller de beskrivna kraven och även inkluderar avstämbara akustiska egenskaper för hybridapplikationer, såsom fotoakustisk avbildning (PAI).
Biologiskt relevanta fantommaterial som är avsedda för kombinerade optiska och akustiska tillämpningar inkluderar hydrogeler4,5, polyvinylalkohol (PVA) 6,7,8,9 och polyvinylkloridplastisol (PVCP)10,11,12,13,14,15,16 . Dessa material kännetecknas emellertid av vissa begränsningar som begränsar deras tillämpning som ett stabilt fantommaterial. Hydrogeler är till exempel benägna att uttorka, mekaniska skador och bakteriell inväxt, vilket begränsar hållbarheten17,18,19. Tillsats av kemikalier kan öka livslängden, men vanliga konserveringsmedel, såsom formaldehyd20 eller bensalkoniumklorid21, är farliga och kräver försiktighetsåtgärder vid hantering. Dessutom kan mål som innehåller vattenlösliga färgämnen diffundera inuti basmaterialet om de inte är inkapslade. PVA-kryoglar kännetecknas av högre livslängd och strukturell robusthet, men deras beredningsprocess innebär långa frys-tina cykler22. Detta kan begränsa den oberoende avstämningen av akustiska och optiska parametrar23 och kan, om det är något varierat, leda till inhomogeniteter6, vilket äventyrar reproducerbarheten. Dessutom har diffusionen av färgämnen från inneslutningar observerats efter 1 år13. PVCP har en komplex tillverkningsprocess som inkluderar höga temperaturer upp till 180-220 °C 13,14,24,25. PVCP lider också brist på en leveranskedja med vetenskapliga leverantörer26 och kan innehålla mjukgörare baserade på ftalater, vilket kan orsaka reproduktions- och utvecklingsskador27, vilket gör dem till kontrollerade ämnen i vissa länder.
Sampolymer-i-olja-kompositioner, såsom gelvax 28,29,30,31 eller blandningar baserade på termoplastiska styrenelastomerer 32,33,34,35,36, uppvisar god longitudinell stabilitet och har vävnadsliknande akustiska och optiska egenskaper 31,35,36,37 , och har därmed stor potential som en hållbar fantomkandidat i multimodala tillämpningar. Dessutom är denna klass av material kostnadseffektiv, icke-vattenabsorberande, giftfri och biologiskt inert35,38. Ljudets hastighet c(f) och den akustiska dämpningskoefficienten α(f) kan ställas in inom ett biologiskt relevant område (tabell 1) genom variation av polymerkoncentrationen 33,35,39, medan optisk absorption μa(λ) och reducerad spridning μs'(λ)-koefficienter huvudsakligen kan varieras genom tillsats av oljelösliga färgämnen eller titandioxid (TiO 2)39. respektive.
Här presenteras ett enkelt, lätt att följa protokoll för att skapa hållbara sampolymer-i-oljefantomer som är lämpliga för användning vid kalibrering av optiska, ultraljud eller fotoakustiska enheter. Alla ingredienser har definierade CAS-nummer (Chemical Abstract Service) och är lättillgängliga från vetenskapliga standardleverantörer. Potentiella svårigheter i tillverkningsförfarandet belyses och sätt att övervinna dem presenteras. Medan protokollet tillåter tillverkning av material med en rad akustiska och optiska egenskaper, ger det presenterade protokollet ett material med en ljudhastighet på ~ 1 481 m · s-1, i linje med ljudets ljudhastighet vid rumstemperatur (20 ° C) 40. Detta värde valdes som en neutral standard för att representera det stora antalet befintliga vävnadsegenskaper (tabell 1), vilket gjorde det möjligt att fastställa en konsekvent och tillförlitlig referenspunkt för jämförelse. Genom att tillhandahålla detta detaljerade protokoll strävar vi efter att bredda upptaget och tillverkningsreproducerbarheten av denna lovande fantommaterialtyp och därigenom underlätta biofotoniska, akustiska och fotoakustiska valideringsstudier och stödja rutinmässig kvalitetskontroll i prekliniska och kliniska avbildningsapplikationer.
Protocol
Tabell 1: Översikt över akustiska och optiska egenskaper i mjukdelar. Optiska egenskaper täcker ett spektrum som sträcker sig från 600 till 900 nm. Det bör noteras att dessa endast är representativa värden avsedda att ge allmän vägledning. Exakta värden kan variera beroende på experimentella förhållanden (t.ex. temperatur) och frekvens/våglängd. Litteraturen ger mer specifika värden. *Ingen specifik referens hittades. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Det givna protokollet har utvecklats för att göra ~ 120 ml fantommaterial. Komponenternas massor kan skalas för att göra olika volymer fantommaterial. Observera att för större volymer (>500 ml) kanske den föreslagna utrustningen inte kan värma fantomblandningen tillräckligt homogent. För detta ändamål bör uppvärmningsutrustningen anpassas på lämpligt sätt.
VARNING: Se alltid till att lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) bärs under hela tillverkningsprocessen. Detta kan innefatta användning av labbrockar, skyddsglasögon och skyddshandskar; hänvisa till och följa lokala säkerhetsriktlinjer. Förfarandet är anpassat från Hacker et al.39; en sammanfattning av stegen visas i figur 1.
Figur 1: Tillverkning av sampolymer-i-olja-materialet. (1) Material för optisk spridning och absorption tillsätts till mineralolja och (2) sonicated vid 90 ° C tills upplöst. (3) Polymer(er) och stabilisator tillsätts och (4) blandningen upphettas i ett oljebad till 160 °C under låg omrörning. (5) Vid upplösning av alla komponenter hälls provet i en lämplig fantomform och (6) får härda vid rumstemperatur. Denna siffra återges från Hacker et al.39. Klicka här för att se en större version av denna figur.
1. Beredning av blandningen
- Förbered Nigrosin-stamlösningen genom att tillsätta 0,4 g Nigrosin till 40 ml mineralolja. Säkerställa homogen blandning genom ultraljudsbehandling och grundlig virvelning av provet. Förvara stamlösningen vid rumstemperatur.
OBS: Stamlösningen ska alltid blandas noggrant före återanvändning. Om ett fantommaterial utan optisk spridare (TiO 2) eller absorberare (färgämne) föredras kan steg 1 och2 hoppas över. Fortsätt med steg 3. - Sonicate 0,15 g TiO 2 och 1 ml färgämneslösning i 100 ml (83,8 g) mineralolja tills alla komponenter har lösts helt (~ 60 min) (Figur 1: steg 1 och2). Ställ in ultraljudsapparaten på förhöjda temperaturer (90 ° C) om utrustningen tillåter, eftersom detta underlättar blandningsprocessen. Fortsätt med steg 3-5 under ultraljudsbehandling tid.
OBS: Om en fantom med högre absorberande och spridande egenskaper föredras, ultraljudsbehandling tid kan behöva förlängas. - Väg upp polystyren-block-poly(etylen-ran-butylen)-block-polystyren (SEBS) och lågdensitetspolyeten (LDPE) vid önskade koncentrationer (t.ex. SEBS = 25,14 g; LDPE = 6,70 g) (Figur 1: steg 3).
- Valfritt: En antioxidant kan tillsättas för att öka stabiliteten, men det är inte obligatoriskt om uppvärmningstemperaturerna inte överstiger 180 ° C.
OBS: Om löslighets- eller viskositetsproblem uppstår i ett senare skede av tillverkningsprocessen är det lämpligt att utesluta LDPE. LDPE införlivas för att öka ljudets hastighet i materialet (tabell 3); Det är dock inte obligatoriskt att skapa ett stabilt fantom. Genom att utelämna LDPE kan tillverknings- och gjutningsprocessen förenklas, men det kommer att resultera i en minskning av den efterföljande ljudhastigheten för det slutliga materialet (tabell 3).
- Valfritt: En antioxidant kan tillsättas för att öka stabiliteten, men det är inte obligatoriskt om uppvärmningstemperaturerna inte överstiger 180 ° C.
- Skapa ett oljebad med lämpliga glasvaror och silikonolja; Fäst den försiktigt på kokplattan. Se till att termoelementet förblir i silikonoljebadet och inte vidrör glasets kanter under hela proceduren (figur 2).
OBS: Se till att det termoregulatoriska tillbehöret är noggrant monterat, enligt instruktioner från utrustningstillverkaren. - Placera en magnetisk omrörningsstång med tillräcklig längd inuti oljebadet för att säkerställa jämn värmefördelning.
- Slå på kokplattan, ställ in uppvärmningstemperaturen på 160 °C och ställ omrörarens varv per minut (rpm) på 50.
- Överför LDPE och SEBS till glasbägaren som innehåller den sonikerade mineraloljan (med TiO2 och Nigrosin). För in en magnetisk omrörningsstång med tillräcklig längd i glasbägaren och överför den till mitten av oljebadet för uppvärmning av de uppmätta komponenterna. Se till att oljenivån i badet håller sig över mineraloljenivån inuti bägaren (figur 1: steg 4).
2. Uppvärmning av blandningen
- Om den tillsatta polymeren vid något tillfälle verkar flyta över mineraloljan, rör om mineraloljelösningen manuellt med en metallspatel, så att eventuell flytande polymer fördelas inuti mineraloljan. Använd värmebeständiga handskar.
- Låt blandningen stå vid 160 °C tills hela polymeren har lösts upp och lösningen verkar jämnt blandad, med en jämn och homogen konsistens (~1,5 timmar).
3. Dammsugning
OBS: För avlägsnande av luftbubblor, följ följande steg, beroende på tillgänglig utrustning.
- Placera den varma bägaren försiktigt i vakuumkammaren och dammsug proverna i 2-3 minuter på högsta inställning (lägsta vakuum). Använd en metallspatel för att försiktigt ta bort eventuella luftbubblor som ackumuleras på ytan. Om luftbubblor fortfarande finns kvar efter detta steg, värm upp blandningen igen och upprepa dammsugningssteget tills alla luftbubblor har tagits bort.
- Sätt på vakuumugnen och värm upp den till 160 °C. När den har nått önskad temperatur, överför bägaren med lösningen till vakuumugnen.
OBS: Hantera alltid bägaren med värmeskyddande handskar.- Slå på vakuumet till den högsta inställningen (lägsta vakuum) som finns tillgänglig. Om ett skumskikt har producerats ovanpå lösningen, stäng av vakuumet och ta bort bubblorna från ytan med en spatel (upprepa detta steg tills alla luftbubblor har tagits bort).
- Låt bägaren stå i vakuumugnen i 1 timme vid högsta vakuuminställning.
OBS: För att hålla vakuumugnen ren, rengör den yttre ytan av bägaren av silikonolja med en pappershandduk.
4. Häll proverna i formen
- Innan proverna hälls i provformar, avlägsna eventuella kvarvarande luftbubblor på blandningens yta med en spatel om det behövs.
- Häll försiktigt lösningen i en lämplig form, använd värmebeständiga handskar eller använd lämplig skyddsutrustning. Säkerställ jämn och stadig hällning från låg höjd för att minska risken för att luftbubblor bildas (Figur 1: steg 5). För formar med komplexa former, täck formen med ett tunt lager olja (annat än mineralolja [t.ex. ricinolja eller silikonolja]) före hällning för att underlätta avlägsnandet av det härdade provet.
OBS: Förvärmning av formarna i en ugn kan hjälpa till att uppnå högre provhomogenitet. - Ta bort eventuella luftbubblor från toppen av proverna snabbt med en metallspatel när den har hällts. Om många luftbubblor har ackumulerats i blandningen, upprepa vakuumsteget, förutsatt att formens typ och form tillåter det.
- Låt lösningen stelna till rumstemperatur. Även om mindre prover kan härda på mindre än 2 timmar, lämna proverna över natten för att eliminera risken för ofullständig härdning. Förvara proverna i rumstemperatur (figur 1: steg 6).
5. Bildinsamling
- För bildinsamling, placera fantomen i bildenhetens synfält.
- För PAI- eller ultraljudssystem, utför akustisk koppling av fantomytan till ultraljudsgivaren, till exempel med ultraljudsgel eller vatten.
OBS: Om protokollet har följts korrekt bör inga inhomogeniteter störa synfältet. Anpassade fantomhållare kan hjälpa till med repeterbar provpositionering mellan mätningar. - Om uppsamlingstemperaturen skiljer sig från fantomets lagringstemperatur, låt fantomtemperaturen stabiliseras med omgivningen.
- Hämta en bild.
6. Mätningar av materialkarakterisering
OBS: Syftet med materialkarakteriseringsmätningar är verifiering av materialets optiska och akustiska egenskaper. Det bör noteras att fantomtillverkningsprotokollet har visat hög reproducerbarhet39, så de allmänna mätprotokollen som följer tillhandahålls endast som vägledning om ytterligare verifieringsstudier önskas. De enskilda stegen i mätningarna beror på vilken karakteriseringsutrustning som används. Här användes ett system baserat på en bredbandsmetod41 (tillgänglig vid National Physical Laboratory (NPL), Storbritannien) för akustisk karakterisering och ett internt dubbelintegrerande sfärsystem (DIS) användes (baserat på 42) för optisk karakterisering. Inställningen av karakteriseringssystemen visas i kompletterande figur 1. Ytterligare detaljer om mätuppställningarna (akustisk43; optisk42,44) och mätprocedur39 finns på annan plats. Mätförfarandet bör anpassas i enlighet med varje specifikt karakteriseringssystem som används.
- Akustisk karakterisering
OBS: De akustiska karakteriseringsmätningarna är baserade på ett system som använder en 10 MHz ultraljudsgivare med centrumfrekvens (aktiv elementdiameter på 10 mm) för pulsgenerering och en bredbandshydrofon (30 mm bilaminär membranhydrofon) med aktiv elementdiameter för pulsdetektering (båda placerade i en vattentank fylld med avjoniserat vatten; mått på 112 cm x 38 cm x 30 cm3). Givaren drivs av en pulsermottagare. Vågformer förvärvas med hjälp av ett oscilloskop. Mer information om inställnings- och mätförfarandet (inklusive systemspecifika typ B-effekter på mätningarna) finns i 43.- Förbered prover som är lämpliga för mätuppställningen (t.ex. i detta fall cirkulära prover med en diameter på 7-8 cm och tjocklek på 6-9 mm). Se till att proverna har en homogen sammansättning och är fria från föroreningar, luftbubblor eller ojämnheter i ytan.
- Mät provets tjocklek med vernier-bromsok och registrera vattentankens temperatur med en kalibrerad termometer.
- Placera provet i systemet. Se till att provet är korrekt anpassat till systemets komponenter.
OBS: En automatiskt styrd provhållare baserad på ett gimbalfäste43 kan hjälpa till med exakt kontroll av provets rotation och lutning. - Samla fyra akustiska pulser för varje mätuppsättning: en referenspuls genom vatten utan prov i den akustiska banan; Överföring genom provtagning. och akustiska reflektioner som tas emot vid sändaren från provexemplarets främre och bakre ytor.
- Härleda provets akustiska egenskaper från mätningarna. Beräkna ljudets hastighet c( f ) (i m·s−1) med ekvationen (1)43.
(1)
CW visar den temperaturberoende hastigheten för ljudet av vatten, och θ1 (f), θ2 (f), θw (f) och θ s (f) är motsvarande olindade fasspektra för de frontreflekterade, bakåtreflekterade, genomgående vatten respektive genomsamplingsspänningspulserna. Materialets frekvensberoende dämpningskoefficient (α i f) kan härledas med hjälp av substitutionstekniken med två prov som visas i ekvation 2.43.
(2)
U w (f) och Us (f) är respektive spänningsmagnitudspektra för genomvatten- och genomprovspulsen, αw (f) är dämpningskoefficienten för ultraljud (i dB · cm-1) av rent vatten vid den specifika vattentankens temperatur45, och d 1 och d 2 (d2 > d1) är två provtjocklekar.
OBS: För detta protokoll bedömdes den dämpning som redovisade gränsytans förluster och dess inverkan befanns vara försumbar. - Upprepa mätningen mer än tre gånger på olika ställen på provet. Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för mätningarna för att härleda ett slutligt provvärde.
- Optisk karakterisering
OBS: För optisk testning användes ett dubbelintegrerande sfärsystem (baserat på 42), som använder två integrerande sfärer (50 mm innerdiameter) som är anslutna till två spektrometrar via två optiska fibrer. Reflektanssfären är ansluten till en ljuskälla via en tredje optisk fiber.- Förbered prover som är lämpliga för mätuppställningen (t.ex. i detta fall rektangulära prover med en bredd på 5,9 cm, höjd på 1,8 cm och tjocklek mellan 2 och 3 mm). Se till att proverna har en homogen sammansättning och är fria från föroreningar, luftbubblor eller ojämnheter i ytan.
- Slå på ljuskällan och låt den stabiliseras enligt tillverkarens anvisningar (t.ex. 15 min).
- Bestäm provets tjocklek med vernier-bromsok. Ange i tillämpliga fall våglängdsområdet och stegstorleken för mätningen (t.ex. 450–900 nm med en stegstorlek på 1 nm).
- Registrera referensmätningarna för transmissions- och reflektanssfären.
- För reflektanssfären, gör först en mätning med öppen port genom att registrera reflektansvärdet R0 med transmittanssfären borttagen och ljuskällan påslagen. Registrera sedan reflektionsvärdet R1 med en referensstandard som hålls framför reflektanssfären (ljuskällan tänd).
- För transmittanssfären, gör först en blockerad strålmätning genom att registrera transmittansvärdet T0 med de inriktade reflektans- och transmittanssfärerna och ljuskällan avstängda. Gör sedan en infallande strålmätning genom att registrera transmittansvärdet T1 med de inriktade reflektans- och transmittanssfärerna och ljuskällan påslagna.
OBS: En ren yta på sfärerna och referensstandarden måste säkerställas för mätningarna, eftersom vidhäftning av damm eller andra föroreningar kan påverka komponenternas prestanda46.
- Placera provet mellan sfärerna. Mät reflektans Rs och transmittans Ts-värden. Se till att provet inte komprimeras, eftersom det kan påverka mätnoggrannheten. Att placera en sfär på ett motoriserat steg kan hjälpa till att exakt kontrollera avståndet mellan sfärerna genom att anpassa det till den uppmätta provtjockleken.
- Beräkna den normaliserade reflektansen M R och transmittans MT-värdena med ekvationerna (3) och (4)42.
(3)
(4)
RSTD visar intensiteten som reflekteras från 99% reflektansstandarden. - Ange de uppmätta värdena i ett IAD-program (inverse adding doubling) (källkod: http://omlc.org/software/iad/)44 för att uppskatta materialets optiska egenskaper.
OBS: Baserat på tidigare rapporter kan spridningsanisotropifaktorn (g) tas som g = 0,7 och brytningsindex som n = 1,4 30. - Upprepa mätningen minst tre gånger på olika ställen längs provet. Beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för mätningarna för att härleda ett slutligt provvärde.
(1)
(2)
(3)
(4)Representative Results
Efter detta recept har tre representativa fantomdesigner skapats för fotoakustisk avbildning, riktade mot olika systemdesigner med olika optiska belysnings- och akustiska detekteringsgeometrier (figur 3A). Om fantomberedningsproceduren utförs framgångsrikt verkar fantommaterialet jämnt och homogent utan några fångade luftbubblor eller föroreningar, och inga artefakter kan ses i den resulterande bilden (här visualiserad med fotoakustisk bildbehandling; Figur 3B,C). Protokollet ger ett representativt material med en ljudhastighet c(f) = 1481 ± 0,4 m·s-1 (motsvarande ljudets ljudhastighet vid 20 °C40), akustisk dämpning α(f) = 6,1 ± 0,06 dB·cm-1 (båda vid 5 MHz), optisk absorption μa(λ) = 0,05 ± 0,005 mm-1 och optisk spridning μs'(λ) = 1 ± 0,1 mm-1 (båda vid 800 nm) (osäkerheten visar standardavvikelsen från n = 3 oberoende producerade satser av olika operatörer; alla mätningar utfördes vid rumstemperatur [20 °C]).
Den optiska spridningskoefficienten kan ställas in genom variationen av TiO 2, medan den optiska absorptionskoefficienten kan ställas in genom tillsats av vilket oljelösligt färgämne som helst, här demonstrerat med Nigrosin (tabell 2 och figur 3D). Medan värdena i tabell 2 är inriktade på lägre absorberande och spridande vävnader, såsom muskler eller bröst (tabell 1), har vi inte stött på några svårigheter med att lägga till absorberare och spridare vid högre koncentrationer. Emellertid, tillsatsen av optiska spridare/absorbatorer vid högre koncentrationer kan kräva längre ultraljudsbehandling gånger för att uppnå homogen blandning av lösningen.
Den akustiska dämpningen och ljudets hastighet kan ställas in genom variation av polymerkoncentrationen (tabell 3). Här är inställningen hittills begränsad till en ljudhastighet på ~ 1 450-1 516 m · s-1. Lägre respektive polymerkoncentrationer kan resultera i låg fysisk stabilitet hos provet, vilket leder till plastisk deformation över tid34. Högre polymerkoncentrationer resulterar i sprödhet och en ojämn struktur av materialet. Utbudet av akustiska egenskaper kan hjälpa till att efterlikna vävnader som bröst eller fett (c = 1 450–1 480 m·s−1), men kan vara otillräckligt för vävnader som muskler eller njurar (c > 1 520 m·s−1; Tabell 1).
Vanliga felkällor vid fantomberedning inkluderar otillräckligt avlägsnande av luftbubblor och inhomogen blandning av baskomponenterna (figur 4). Detta kan minimeras genom dammsugning och noggrann hällning respektive omrörning / virvelning.
Figur 2: Experimentell inställning för fantomtillverkningen. Glasbägaren som innehåller fantomingredienserna placeras i silikonoljebadet med en klämma för att undvika direkt kontakt mellan oljebadets ytor och glasbägaren. Temperaturåterkoppling på värmeplattan säkerställer noggrann temperaturkontroll. Magnetiska omrörare möjliggör blandning av både silikonolja och fantomingredienser. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa resultat från fantomtillverkningen. (A) Olika fantomkonstruktioner som visar mångsidighet för tillämpning i olika fotoakustiska bildsystem. Vänster: liten rektangulär fantom med strängar inbäddade på olika djup (0,5, 1,5 och 2,5 mm; avstånd mellan mål på 1,25 mm) utformade för att testa högupplösta bildsystem; mitten: cylindrisk fantom med två inneslutningar (interinklusionsavstånd på 12 mm) med användning av ett grönt och violett oljelösligt färgämne, utformat för testning av tomografisystem; Höger: Stor rektangulär fantom med kanaler inbäddade på olika djup (6 mm, 10 mm och 14 mm; mellanrum på 3,5 mm), utformade för att testa ett handhållet system. (B) Exempel på fotoakustisk bild av det rektangulära fantomet med inbäddade strängar, förvärvat vid 532 nm med ett kommersiellt fotoakustiskt bildsystem. c) Exempel på fotoakustisk bild av det cylindriska tomografiska fantomet, som erhålls vid 800 nm med ett kommersiellt fotoakustiskt bildsystem. (D) Fantomer med ökande optiska absorptionskoncentrationer genom att öka koncentrationerna av nigrin (koncentrationer angivna i viktprocent av den totala volymen mineralolja på bilden). Figur 3B,C återges från Hacker et al.39. Skalstänger = 10 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Vanliga fantomfel . (A,B) Fotografier som visar luftbubblor som fastnat inuti basmatrisen. (C) Otillräcklig blandning av baskomponenter leder till inhomogeniteter (röda pilar) i den resulterande fotoakustiska bilden. Skalstång = 5 mm (A). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 2: Tabellöversikt över inställning av värden för optisk absorption (μa) och spridning (μs'). Procentvärden anges i viktprocent till baslösningens totala volym (mineralolja, kolumn 1) och till fantommaterialets totala vikt (kolumn 2). Nigrosinkoncentrationerna visar den totala mängden absolut nigrosin (inte stamlösning). Alla prover inkluderade 5% butylerad hydroxitoluen som en antioxidant (valfritt). n = 3 mätningar per prov. En visuell representation av tabellen finns i Hacker et al.39. Förkortning: neg = försumbar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Tabellöversikt över inställning av akustisk dämpning (α) och ljudhastighet (c). Beskriven av effektlagen α 0 fn med α0 och n parametrar erhållna från en icke-linjär minsta kvadratpassning (n = 4 mätningar per prov). F visar frekvensen i MHz. Procentvärden anges som viktprocent till baslösningens totala vikt (mineralolja). Alla prover inkluderade 5% butylerad hydroxitoluen som en antioxidant (valfritt). En visuell representation av tabellen finns i Hacker et al.39. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande figur S1: Inställning av de akustiska och optiska karakteriseringssystem som används för verifieringar. Ett fotografi (A) och schematiskt (B) av det akustiska karakteriseringssystemet för bestämning av den akustiska dämpningskoefficienten och ljudhastigheten visas. Enskilda systemkomponenter betecknas med anteckningar HP (HydroPhone), S (Sample) och T (Transducer) i fotot och schemat. Ett fotografi (C) och schema (D) av det dubbelintegrerande sfärsystemet för utvärdering av den optiska absorptionskoefficienten och reducerad spridningskoefficient visas. Enskilda systemkomponenter betecknas med anteckningar S (prov), RS (reflektanssfär), TS (överföringssfär), OF (optisk fiber) och MS (motoriserat steg) i fotot och schemat. Denna siffra återges från Hacker et al. 39. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Här presenteras ett protokoll som syftar till att ge ett mångsidigt recept på ett stabilt, biologiskt relevant material som kan användas för att skapa fantomer för kalibreringsmätningar och standardisering över multimodala akustiska och optiska biomedicinska avbildningsapplikationer. Materialet har tidigare visat sig vara stabilt över tid39, ha hög batch-till-batch-reproducerbarhet, vara säkert att använda och bestå av lättillgängliga, kostnadseffektiva ingredienser från vetenskapliga standardleverantörer. Materialegenskaperna är oberoende avstämbara över relevanta akustiska och optiska regimer. Dessutom är det mekaniskt robust och olösligt i vatten, vilket tål grov hantering, och det är inert mot vattenbaserade kopplingsmedel som används i ultraljud / fotoakustisk forskning. Det betonades att olika fantomdesigner kan skapas med olika typer av inneslutningar, sammansatta av samma eller av olika materialtyper. Med tanke på dessa egenskaper uppfyller materialet de ovan nämnda nyckelkriterierna för ett idealiskt biofotoniskt fantom och visar viktiga fördelar jämfört med andra befintliga vävnadsliknande material3. Genom att beskriva den exakta tillverkningsprocessen hoppas vi kunna minimera variationer som uppstår från tillverkningsproceduren och därigenom optimera dess användning för kalibrering, validering och spårning av prestanda för bildsystem.
Två viktiga steg har identifierats som kritiska för tillverkningsprocessen. Först måste ingredienserna blandas noggrant och upphettas jämnt för att skapa ett homogent material. Med hjälp av en ultraljudsbehandling och magnetomrörare för blandning och ett oljebad för uppvärmning säkerställer jämn fördelning av materialkomponenter inom basmatrisen. Man måste se till att oljebadet inte når mycket höga temperaturer (>180 °C), eftersom detta kommer att resultera i oxidation av materialkomponenterna, vilket leder till gulaktig missfärgning. Manuell omrörning kan stödja blandningsprocessen och kompenserar för otillräcklig uppvärmning från gränssnittet mellan material och luft. Tiden för ultraljudsbehandling och blandning kan behöva förlängas när en högre koncentration avTiO2 och / eller polymerer används för att säkerställa en homogen sammansättning av materialet. För det andra måste luftbubblor avlägsnas för att förhindra bildandet av heterogeniteter inom basmatrisen. Även om detta kan uppnås med en vakuumpump eller ugn, bör noggrann hällning från låg höjd också praktiseras för att minimera infångning av luft i materialet.
En betydande fördel med materialet är dess termoplastiska egenskaper (härledda från SEBS-polymeren), vilket gör att det kan värmas upp och omformas utan någon betydande inverkan på dess akustiska och optiska egenskaper39. Uppvärmning måste dock utföras gradvis och noggrant, eftersom materialet lätt kan brinna och oxidera om det värms upp för snabbt. Uppvärmning blir också svårare när högre LDPE-koncentrationer används, eftersom LDPE inte uppvisar samma termoplastiska beteende som SEBS.
Flera begränsningar i protokollet kvarstår. På grund av polymerernas höga smälttemperatur (150 °C) måste fantomformar tillverkas av ett värmebeständigt material, såsom glas eller rostfritt stål. Dessutom är materialet ganska visköst i flytande tillstånd om en hög polymerkoncentration används för att ställa in de akustiska egenskaperna, vilket gör fyllningen av små bildmål svår. Slutligen är inställningen av de akustiska egenskaperna hittills begränsad till en ljudhastighet på ~ 1450-1 516 m · s-1 som stöder efterliknande vävnader som bröst eller fett (c = 1 450-1 480 m · s − 1), men kan vara otillräcklig för vävnader som muskler eller njurar (c > 1 520 m · s − 1). Samtidig förändring av akustisk dämpning bör också beaktas.
Här har vi lyft fram tillämpningen av materialet som ett stabilt fantom för ultraljud och optiska avbildningsapplikationer. Sampolymer-i-olja-material har emellertid också visat sig vara av värde i elastografitillämpningar35 och skulle potentiellt kunna möjliggöra kompatibilitet med ytterligare avbildningsmetoder, såsom magnetisk resonanstomografi. Ökad anatomisk realism hos fantomerna kan uppnås med hjälp av 3D-tryckta formar, vilket visas i liknande studier 29,47,48,49. Tidiga studier har också visat att själva materialet kan skrivas ut i 3D, vilket ytterligare utökar dess flexibilitet när det gäller bearbetning och tillverkning. Denna utveckling belyser materialets spännande framtida potential som ett allmänt använt, stabilt fantommedium för multimodala bildapplikationer.
Disclosures
Sarah Bohndiek har tidigare fått forskningsstöd från CYBERDYNE INC och iThera Medical GmbH, leverantörer av fotoakustiska bildinstrument. De andra författarna har ingen intressekonflikt relaterad till detta manuskript att avslöja.
Acknowledgments
LH finansierades av NPL:s MedAccel-program finansierat av Department for Business, Energy and Industrial Strategy's Industrial Strategy Challenge Fund. JMG fick finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, tyska forskningsstiftelsen) inom ramen för projekt GR 5824/1. JJ erkänner finansieringsstödet från Academy of Medical Sciences Springboard (REF: SBF007 \ 100007) pris. SEB erhåller stöd från Cancer Research UK under bidragsnummer C9545/A29580. AMI, BZ och SR stöddes av U.K. Department for Business, Energy & Industrial Strategy via finansiering av National Measurement System. Figur 1 och figur 2 skapades med BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-density Polyethylene (LDPE) | Alfa Aesar | 43949.30 CAS: 9002-88-4 |
6.70 g 5.8% w/w |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | 330779-1L CAS: 8042-47-5 |
83.80 g 72.5% w/w |
| Nigrosin | Sigma Aldrich | 211680-100G CAS: 11099-03-9 |
0.4 g |
| Polystyrene-block-poly(ethylene-ran-butylene)-block-polystyrene (SEBS) | Sigma Aldrich | 200557-250G CAS: 66070-58-4 |
25.14 g 21.7% w/w |
| Silicone oil for oil bath | Sigma Aldrich | 85409-1L CAS: 63148-62-9 ~1 L (depending on size of oil bath) |
|
| Titanium(IV) oxide, anatase (TiO2) | Sigma Aldrich | 232033 CAS: 1317-70-0 |
0.15 g |
| Antioxidant (optional; e.g., butylated hydroxytoluene) | Sigma Aldrich | W218405-1KG-K CAS: 128-37-0 |
may be added to prevent discolouration if higher fabrication temperatures are used |
| Oil-solule dyes for inclusions (optional) | e.g., Caligo safe wash relief inks, Cranfield Colours, Cwmbran, UK* | may be added depending on preferred absorption | |
| Bath Sonicator | Ultrawave Ltd, UK* | U500H Ultrasonic Cleaning Bath* | ideally with temperature control; recommended operating frequencies between 30-50 kHz) |
| Crystallising dish for silicone oil bath (up to +200 °C) | any suitable supplier | (ext. diameter ~140 mm for 250 mL glass beaker) | |
| Glass beaker (~250 mL); glass sample dishes/phantom mould | any suitable supplier | ||
| Hot plate with magnetic stirrer and thermoregulator (external probe thermocouple) with maximum temperature of > 200 °C | Thermo Fisher Scientific, UK* | Velp Scientifica AREC.X Digital Ceramic Hot Plate Stirrer* | |
| Laboratory scales / scientific balances accurate to 0.01 g | any suitable supplier | ||
| Metallic spatula | any suitable supplier | ||
| Vaccuum oven or vaccum chamber | Memmert, Germany (Vacuum oven)* Cole-Parmer Instrument Company, UK (Vaccum chamber)* |
VO29 (Vacuum oven) DWK Life Sciences (Kimble) Glass Vacuum Desiccator with Collar (Vaccum chamber)* |
|
| 1. Acoustic characterization system* | |||
| Hydrophone | GEC Marconi | 30 mm active element diameter bilaminar membrane hydrophone | |
| Oscilloscope | Tektronix UK, Bracknell, UK | DPO 7254 | |
| Pulser–receiver | Olympus NDT, Waltham, MA, USA | Olympus 5073PR | |
| Sample holder | Newport Spectra-Physics, Didcot, UK | Newport 605-4 Series Low-Distortion Axial Clamping Gimbal Optic Mount | may require additional adaptor for sample holding |
| Thermometer | G. H. Zeal, London, UK | UKAS-calibrated IP 39C spirit-in-glass thermometer | |
| Ultrasound transducer | Force Technology, Brondby, Denmark | Transducer of active element diameter 10 mm | |
| Vernier callipers | any suitable supplier | ||
| Water tank filled with deionized water | any suitable supplier | requires sufficent size (e.g., dimensions 112 × 38 × 30 cm3) | |
| 2.Optical characterization system* | |||
| Integrating sphere (two) | Avantes, Apeldoorn, the Netherlands | AvaSphere-50, 50 cm internal diameter | |
| Light source | Avantes, Apeldoorn, the Netherlands | Avalight-HAL-s-mini | |
| Motorized stage (optional) | Thorlabs, | Thorlabs MTS50 | |
| Optical fibres (three) | any suitable supplier | ||
| Reflectance standard | Labsphere, North Sutton, USA | 99%, white, 1.25" diameter, USRS-99-010, AS-01158-060 | |
| Spectrometer | Avantes, Apeldoorn, the Netherlands | Starline Avaspec-2048 | |
| Software | |||
| Data acqusition software (e.g., Labview) | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Data analysis software (e.g., Matlab) | Mathworks, Natick, USA | ||
| Inverse adding doubling (IAD) program | Source code: http://omlc.org/software/iad/ | ||
| *Please note that similar equipment may also be used. |
References
- Waterhouse, D. Translation of optical imaging biomarkers: opportunities and challenges. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 339-353 (2019).
- O'Connor, J. P. B., et al. Imaging biomarker roadmap for cancer studies. Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (3), 169-186 (2017).
- Hacker, L., et al. Criteria for the design of tissue-mimicking phantoms for the standardization of biophotonic instrumentation. Nature Biomedical Engineering. 6 (5), 541-558 (2022).
- Laufer, J., Zhang, E., Beard, P. Evaluation of absorbing chromophores used in tissue phantoms for quantitative photoacoustic spectroscopy and imaging. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 16 (3), 600-607 (2010).
- Cook, J. R., Bouchard, R. R., Emelianov, S. Y. Tissue-mimicking phantoms for photoacoustic and ultrasonic imaging. Biomedical Optics Express. 2 (11), 3193-3206 (2011).
- Xia, W., et al. Poly(vinyl alcohol) gels as photoacoustic breast phantoms revisited. Journal of Biomedical Optics. 16 (7), 075002 (2011).
- Manohar, S., et al. Photoacoustic mammography laboratory prototype: imaging of breast tissue phantoms. J Biomed Opt. 9, 1172 (2004).
- Blumenröther, E., Melchert, O., Wollweber, M., Roth, B. Detection, numerical simulation and approximate inversion of optoacoustic signals generated in multi-layered PVA hydrogel based tissue phantoms. Photoacoustics. 4 (4), 125-132 (2016).
- Kharine, A., et al. Poly(vinyl alcohol) gels for use as tissue phantoms in photoacoustic mammography. Physics in Medicine and Biology. 48 (3), 357-370 (2003).
- Spirou, G. M., Oraevsky, A. A., Vitkin, I. A., Whelan, W. M. Optical and acoustic properties at 1064 nm of polyvinyl chloride-plastisol for use as a tissue phantom in biomedical optoacoustics. Physics in Medicine and Biology. 50 (14), N141-N153 (2005).
- Bohndiek, S. E., Bodapati, S., Van De Sompel, D., Kothapalli, S. -R., Gambhir, S. S. Development and application of stable phantoms for the evaluation of photoacoustic imaging instruments. PLoS One. 8 (9), e75533 (2013).
- Fonseca, M., Zeqiri, B., Beard, P. C., Cox, B. T. Characterisation of a phantom for multiwavelength quantitative photoacoustic imaging. Physics in Medicine and Biology. 61 (13), 4950-4973 (2016).
- Vogt, W. C., Jia, C., Wear, K. A., Garra, B. S., Joshua Pfefer, T. Biologically relevant photoacoustic imaging phantoms with tunable optical and acoustic properties. Journal of Biomedical Optics. 21 (10), 101405 (2016).
- Dantuma, M., van Dommelen, R., Manohar, S.
- Jeong, E., et al. Fabrication and characterization of PVCP human breast tissue-mimicking phantom for photoacoustic imaging. BioChip Journal. 11, 67-75 (2017).
- Jia, C., Vogt, W. C., Wear, K. A., Pfefer, T. J., Garra, B. S. Two-layer heterogeneous breast phantom for photoacoustic imaging. Journal of Biomedical Optics. 22 (10), 1-14 (2017).
- Madsen, E. L., Hobson, M. A., Shi, H., Varghese, T., Frank, G. R. Stability of heterogeneous elastography phantoms made from oil dispersions in aqueous gels. Ultrasound in Medicine & Biology. 32 (2), 261-270 (2006).
- Culjat, M. O., Goldenberg, D., Tewari, P., Singh, R. S. A review of tissue substitutes for ultrasound imaging. Ultrasound in Medicine & Biology. 36 (6), 861-873 (2010).
- Zell, K., Sperl, J. I., Vogel, M. W., Niessner, R., Haisch, C. Acoustical properties of selected tissue phantom materials for ultrasound imaging. Physics in Medicine and Biology. 52 (20), N475-N484 (2007).
- Lazebnik, M., Madsen, E. L., Frank, G. R., Hagness, S. C. Tissue-mimicking phantom materials for narrowband and ultrawideband microwave applications. Physics in Medicine and Biology. 50 (18), 4245-4258 (2005).
- Ramnarine, K. V., Anderson, T., Hoskins, P. R. Construction and geometric stability of physiological flow rate wall-less stenosis phantoms. Ultrasound in Medicine & Biology. 27 (2), 245-250 (2001).
- Pogue, B. W., Patterson, M. S. Review of tissue simulating phantoms for optical spectroscopy, imaging and dosimetry. Journal of Biomedical Optics. 11 (4), 041102 (2006).
- Lamouche, G., et al. Review of tissue simulating phantoms with controllable optical, mechanical and structural properties for use in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 3 (6), 1381-1398 (2012).
- Bohndiek, S. E., Van de Sompel, D., Bodapati, S., Kothapalli, S. R., Gambhir, S. S. Stable phantoms for characterization of photoacoustic tomography (PAT) systems. Design and Performance Validation of Phantoms Used in Conjunction with Optical Measurement of Tissue V. 858308, 30-35 (2013).
- Fenollar, O., Sanchez-Nacher, L., Garcia-Sanoguera, D., López, J., Balart, R. The effect of the curing time and temperature on final properties of flexible PVC with an epoxidized fatty acid ester as natural-based plasticizer. Journal of Materials Science. 44, 3702-3711 (2009).
- Fonseca, M., Zeqiri, B., Beard, P., Cox, B. Characterisation of a PVCP-based tissue-mimicking phantom for quantitative photoacoustic imaging. European Conference on Biomedical Optics. , Optica Publishing Group. 953911 (2015).
- Heudorf, U., Mersch-Sundermann, V., Angerer, J.
- Maneas, E., et al. Gel wax-based tissue-mimicking phantoms for multispectral photoacoustic imaging. Biomed. Opt. Express. 9 (3), 1151-1163 (2018).
- Maneas, E., et al. Anatomically realistic ultrasound phantoms using gel wax with 3D printed molds. Physics in Medicine and Biology. 63 (1), 015033 (2018).
- Jones, C. J. M., Munro, P. R. T. Stability of gel wax based optical scattering phantoms. Biomedical Optics Express. 9 (8), 3495-3502 (2018).
- Ivory, A. M., Shah, A., Rajagopal, S., Zeqiri, B. Development and investigation of the acoustic properties of tissue-mimicking materials for photoacoustic imaging techniques. IEEE International Ultrasonics Symposium. IEEE. , 1489-1492 (2019).
- Grillo, F. W., Cabrelli, L. C., Sampaio, D. R. T., Carneiro, A. A. O., Pavan, T. Z. Glycerol in oil-based phantom with improved performance for photoacoustic imaging. 2017 IEEE International Ultrasonics Symposium. IEEE. , 1-4 (2017).
- Cabrelli, L. C., et al. Oil-based gel phantom for ultrasound and optical imaging. Biophotonics South America. SPIE. 9531, 40-46 (2015).
- Cabrelli, L. C., et al. Stable phantom materials for ultrasound and optical imaging. Physics in Medicine and Biology. 62 (2), 432-447 (2017).
- Oudry, J., Bastard, C., Miette, V., Willinger, R., Sandrin, L. Copolymer-in-oil phantom materials for elastography. Ultrasound in Medicine & Biology. 35 (7), 1185-1197 (2009).
- Suzuki, A., et al. Oil gel-based phantom for evaluating quantitative accuracy of speed of sound measured in ultrasound computed tomography. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2554-2567 (2019).
- Cabrelli, L. C., Grillo, F. W., Carneiro, A. A. O., Pavan, T. Z. Copolymer-in-oil tissue-mimicking material with tunable acoustic properties. 2016 IEEE International Ultrasonics Symposium. IEEE. , 1-4 (2016).
- Cabrelli, L. C., et al. Copolymer-in-oil phantoms for photoacoustic imaging. 2015 IEEE International Ultrasonics Symposium. IEEE. , 1-4 (2015).
- Hacker, L., et al. A copolymer-in-oil tissue-mimicking material with tuneable acoustic and optical characteristics for photoacoustic imaging phantoms. IEEE Transactions on Medical Imaging. 40 (12), 3593-3603 (2021).
- Greenspan, M., Tschiegg, C. E. Speed of sound in water by a direct method. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 59 (4), 249-254 (1957).
- Zeqiri, B., Scholl, W., Robinson, S. P. Measurement and testing of the acoustic properties of materials: a review. Metrologia. 47 (2), S156-S171 (2010).
- Pickering, J. W., et al. Double-integrating-sphere system for measuring the optical properties of tissue. Applied Optics. 32 (4), 399-410 (1993).
- Rajagopal, S., Sadhoo, N., Zeqiri, B. Reference characterisation of sound speed and attenuation of the IEC agar-based tissue-mimicking material up to a frequency of 60 MHz. Ultrasound in Medicine & Biology. 41 (1), 317-333 (2015).
- Prahl, S. A. Everything I think you should know about Inverse Adding-Doubling. Oregon Medical Laser Center, St. Vincent Hospital. 1344, 1-74 (2011).
- Pinkerton, J. M. M. The absorption of ultrasonic waves in liquids and its relation to molecular constitution. Proceedings of the Physical Society. Section B. 62 (2), 129-141 (1949).
- Hu, D., Lu, R., Huang, Y., Ying, Y., Fu, X. Effects of optical variables in a single integrating sphere system on estimation of scattering properties of turbid media. Biosystems Engineering. 194, 82-98 (2020).
- Grillo, F. W., et al. Patient-specific neurosurgical phantom: assessment of visual quality, accuracy, and scaling effects. 3D Printing in Medicine. 4 (1), 3 (2018).
- Nikitichev, D. I., et al. Construction of 3-dimensional printed ultrasound phantoms with wall-less vessels. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (6), 1333-1339 (2016).
- West, S. J., et al. Development of an ultrasound phantom for spinal injections with 3-dimensional printing. Regional Anesthesia and Pain Medicine. 39 (5), 429-433 (2014).
